Summary
Hier stellen wir VirWaTest vor, eine einfache, erschwingliche und tragbare Methode zur Konzentration und Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort.
Abstract
Viren, die von Menschen und Tieren ausgeschieden werden, können Wasserquellen kontaminieren und eine Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellen, wenn dieses Wasser zum Trinken, zur Bewässerung von Lebensmitteln, zum Waschen usw. verwendet wird. Der klassische Fäkalbakterienindikator überprüft nicht immer das Vorhandensein viraler Krankheitserreger, so dass der Nachweis viraler Krankheitserreger und Viralindikatoren relevant ist, um Maßnahmen zur Risikominderung zu ergreifen, insbesondere in humanitären Szenarien und in Gebieten. wo wasserübertragene Virusausbrüche häufig auftreten.
Derzeit stehen mehrere kommerzielle Tests zur Quantifizierung von Fäkalindikatorbakterien (FIB) zur Prüfung am Einsatzort zur Verfügung. Solche kommerziellen Tests sind jedoch nicht für den Nachweis von Viren verfügbar. Der Nachweis von Viren in Umweltwasserproben erfordert die Konzentration mehrerer Liter auf kleinere Volumina. Darüber hinaus beruht der Nachweis von Viren, sobald es konzentriert ist, auf Methoden wie nukleinsäureextraktion und molekularer Detektion (z. B. Polymerase-Kettenreaktion [PCR]-basierte Assays) der viralen Genome.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Konzentration von Viren aus 10 L Wasserproben sowie die Extraktion von viralen Nukleinsäuren am Einsatzort mit einfachen und tragbaren Geräten. Dies ermöglicht die Prüfung von Wasserproben am Einsatzort für mehrere Viren und ist in humanitären Szenarien sowie in jedem Kontext nützlich, in dem kein ausgestattetes Labor zur Verfügung steht. Alternativ ermöglicht die Methode die Konzentration von Viren in Wasserproben und den Versand des Konzentrats an ein Labor bei Raumtemperatur zur weiteren Analyse.
Introduction
In den ersten Phasen humanitärer Notfälle sind der Zugang zu sauberer Wasserversorgung, sanitären Einrichtungen und Hygiene für das Überleben der Betroffenen von entscheidender Bedeutung. Daher ist die Überwachung der Wasserqualität eine Priorität, um Ausbrüche auf dem Wasser zu verhindern. Es ist allgemein bekannt, dass kontaminiertes Wasser häufig der Ursprung von Krankheiten ist, aber es ist oft schwierig, die Quellen von Virusausbrüchen wie dem Hepatitis-E-Virus (HEV) zu bestimmen, selbst wenn herkömmliche Labormethoden zur Verfügung stehen. Die Kontrolle der Wasserqualität basiert auf der Quantifizierung von FIB1,2,3,4. Es wurde jedoch ausführlich dokumentiert, dass es keinen Zusammenhang zwischen dem Fehlen von FIB und dem Vorhandensein von viralen, wasserübertragenen Krankheitserregern wie Rotavirus (RoV), Norovirus (NoV) oder HEV5,6gibt. Daher kann die Verwendung der auf FIB basierenden Wasserqualitätskriterien zu einer Unterschätzung der Risiken führen, die mit dem Vorhandensein von wasserbasierten Viruserregern verbunden sind. Die Überwachung von Indikatorviren wie humanen Adenoviren (HAdV) oder spezifischen Krankheitserregern wäre hilfreich bei der Definition der Exposition gegenüber virusviralen Krankheitserregern und der Identifizierung der potenziellen Quelle einer infektion beim Menschen7,8, 9,10 und bei der Validierung der Wirksamkeit von sanitären Maßnahmen11.
Bisher beruhte der Nachweis von Viren in diesen Szenarien auf qualifiziertes Personal und komplexe Logistik. VirWaTest (virwatest.org) zielt auf die Entwicklung einer einfachen, erschwinglichen und tragbaren Methode zur Konzentration und anschließenden Detektion von Viren aus Wasserproben am Einsatzort ab.
Die Viruskonzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung von 10 L Wasserproben, durch die Viren in kleineren Bänden12,13zurückgewonnen werden. Die Flocken werden gesammelt und einem Puffer hinzugefügt, der die Viren liert und verhindert, dass die Nukleinsäuren abgebaut werden, wenn sie nicht mehr als 2 Wochen bei Raumtemperatur gelagert werden.
Die Nukleinsäureextraktionsmethode basiert auf der Verwendung von magnetischen Partikeln, an die die Nukleinsäuren adsorbiert werden. Sie können mit einer magnetischen Pipette, an die sich die Partikel anheften, von einem Waschpuffer in einen anderen und schließlich in den Elutionspuffer übertragen werden. Die erhaltenen viralen Nukleinsäuresuspensionen können an ein Referenzlabor geliefert werden, wo der Nachweis mit molekularen Methoden auf PCR-Basis durchgeführt werden kann. Für jede Nukleinsäureextraktion werden zwei verschiedene Mengen getestet, um eine enzymatische Hemmung, die von der Probe ausgeht, auszuschließen. Alternativ können bei minimaler Geräteverfügbarkeit PCR-Tests am Einsatzort durchgeführt werden. Der gesamte Prozess ist so konzipiert, dass er unabhängig von einem Netzteil durchgeführt wird (Abbildung 1).
Ein quantitativer PCR-Test zum Nachweis von HAdV, der vom Menschen ausgeschieden und in Abwasserproben in hohen Konzentrationen gefunden wurde, wurde angepasst, um am Einsatzort ausgeführt zu werden. HAdV werden als menschliche fäkalvirale Indikatoren verwendet. Eine PCR zur Quantifizierung von MS2-Bakteriophagen wurde ebenfalls angepasst, da MS2 in VirWaTest als Prozesskontrolle eingesetzt wird. Die Methode kann für die Erkennung von Viren von Interesse angepasst werden.
Nach der Entwicklung wurde die VirWaTest-Methode von den Anwendern in zwei verschiedenen Einstellungen in der Republik Zentralafrika (RCA) und Ecuador angewendet und gibt Feedback zur Anwendung des Protokolls in realen Situationen.
Unserer Kenntnis nach ist dies das erste Verfahren, das die Konzentration und Detektion von Viren am Einsatzort ermöglicht, unabhängig von stromversorgung, großen Geräten und Gefrier-/Kühlbedingungen. Es wird empfohlen, zwei Wiederholungen jeder Wasserprobe zu sammeln, um robuste Ergebnisse zu erzielen.
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Protocol
1. Vorbereitung und Verpackung
HINWEIS: Die zu verpackenden Materialien/Ausrüstungen sind in Tabelle 1aufgeführt. Verwenden Sie Handschuhe, um die für die Prozesskontrolle erforderlichen Reagenzien, die Konzentrationsreagenzien, die Nukleinsäureextraktionsreagenzien und die Nachweisreagenzien zu handhaben. Tragen Sie Schutzbrillen, um die reagenzien zu handhaben, die für die Nukleinsäureextraktion erforderlich sind.
- Prozesssteuerung
- Vorbereiten der MS2-Bakterienbestandskultur (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) mit 1 x 1010 PFU/ml im Labor nach dem ISO-Verfahren 10705-1:199514.
- Dann, aliquot 10 l der Suspension pro Rohr enthält 1 x 108 PFU in 10 ml Rohre und lassen Sie das Wasser bei 37 °C verdampfen. Verwenden Sie ein Rohr pro Wasserprobe.
- Bereiten Sie zusätzlich ein Rohr mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser pro entnommener Probe zu.
- Konzentrationsreagenzien
- Für die vorflockulierte Magermilchlösung (PSM) verwenden Sie die folgenden Mengen, um fünf 10 L Wasserproben zu konzentrieren.
- Bereiten Sie ein Kunststoffrohr mit 5 g Magermilch vor.
- Bereiten Sie eine Reißverschluss-Plastiktüte mit 16,66 g Meersalz vor.
- Bereiten Sie eine Plastikflasche mit 500 ml destilliertem Wasser vor.
- Bereiten Sie die reagenzien vor, die für die pH-Einstellung erforderlich sind. Verwenden Sie die folgenden Mengen, um den pH-Wert des PSM und von fünf 10 L Wasserproben anzupassen.
- 5 g Zitronensäure 1-Hydrat in ein 10 ml Kunststoffrohr geben.
VORSICHT: Zitronensäure verursacht schwere Reizungen, wenn sie mit den Augen in Berührung kommt. Wenn dies geschieht, spülen Sie das Auge vorsichtig mit Wasser für mehrere Minuten. Wenn die Reizung anhält, suchen Sie ärztlichen Rat. - 2 g Natriumhydroxid in ein 10 ml Kunststoffrohr geben.
VORSICHT: Natriumhydroxid kann schwere Hautverbrennungen und Augenschäden verursachen. Wenn geschluckt, spülen Sie den Mund. Erbrechen nicht induzieren. Wenn es in Kontakt mit den Augen kommt, spülen Sie vorsichtig mit Wasser für einige Minuten. Dann suchen Sie ärztlichen Rat. - 25 ml steriles destilliertes Wasser in einen Kunststoffbehälter geben.
- 50 ml steriles destilliertes Wasser in einen Kunststoffbehälter geben.
- 5 g Zitronensäure 1-Hydrat in ein 10 ml Kunststoffrohr geben.
- Bereiten Sie den Probenkonditionierungsbeutel für die Flockung, die Konservierungslösung zur Konservierung der Nukleinsäuren und den neutralisierenden Beutel vor, um das ausrangierte Wasser und die Materialien zu neutralisieren. Verwenden Sie die folgenden Mengen für jede zu prüfende 10-L-Wasserprobe.
- 15 g Meersalze und 8 g Zitronensäure 1-Hydrat in eine Reißverschluss-Plastiktüte für den Konditionierungsbeutel geben.
- Fügen Sie 2 ml Lysepuffer (Materialtabelle) und 0,3 ml Nukleinsäurekonservierungsmittel (Materialtabelle) zu einem 5 ml-Rohr hinzu.
VORSICHT: Lysispuffer enthält Guanidinthiocyanat und Triton X-100. Der Kontakt mit Säure befreit giftiges Gas, und es ist schädlich, wenn es geschluckt, eingeatmet oder mit der Haut in Berührung kommt. Wenn geschluckt, spülen Sie den Mund. Erbrechen nicht induzieren. Wenn es in Kontakt mit der Haut kommt, mit viel Wasser waschen. Dann suchen Sie ärztlichen Rat. Nukleinsäurekonservierungsmittel verursacht Haut- und Augenreizungen und ist schädlich, wenn sie geschluckt werden. Wenn es in Kontakt mit der Haut oder den Augen kommt, spülen Sie mit reichlich Wasser für mehrere Minuten. In jedem Fall, vor allem, wenn geschluckt und gefühlunwohl, suchen Sie ärztlichen Rat. - 40 g Waschmittelpulver in vier Plastiktüten mit Reißverschluss geben.
VORSICHT: Pulverwaschmittel verursacht Augenreizungen. Wenn es in Kontakt mit den Augen kommt, spülen Sie mit reichlich Wasser für mehrere Minuten. Wenn Die Reizung anhält oder geschluckt wird, suchen Sie einen Arzt auf.
- Für die vorflockulierte Magermilchlösung (PSM) verwenden Sie die folgenden Mengen, um fünf 10 L Wasserproben zu konzentrieren.
- Nukleinsäureextraktionsreagenzien
- Legen Sie 50 l magnetische Partikel (Materialtabelle) und 1 ml Ethanol 96% in ein 5 ml-Rohr, das den Bindungspuffer bildet.
VORSICHT: Der magnetische Partikelpuffer enthält Natriumazid, das ein giftiges Gas bildet, wenn es mit Säuren oder Schwermetallionen in Berührung kommt und bei Aufnahme oder hautkontakt toxisch ist. Wenn Sie aufgenommen werden oder mit der Haut in Berührung geraten, spülen Sie den Mund oder die Haut mit reichlich Wasser ab und suchen Sie ärztlichen Rat. Ethanol ist eine leicht entzündliche Flüssigkeit und Dampf und verursacht schwere Augenreizungen. Von Hitze, heißen Oberflächen, Funken und jeder anderen Zündquelle fernhalten. Wenn es in Kontakt mit der Haut oder den Augen kommt, spülen Sie mit reichlich Wasser. Bei Einnahme großer Wassermengen und/oder beim Einatmen in die Frischeluft gehen. In jedem Fall, suchen Sie ärztlichen Rat. - Fügen Sie die Waschpuffer 1, 2 und 3(Materialtabelle)zu drei 2 ml-Rohren hinzu.
VORSICHT: Waschpuffer enthalten Guanidiniumthiocyanat und Guanidiniumchlorid, die schädlich sind, wenn sie eingeatmet oder geschluckt werden und haut und augenreizend sind. Der Kontakt mit Säuren setzt sehr giftiges Gas frei. Wenn sie mit der Haut oder den Augen in Kontakt kommen, spülen Sie mit reichlich Wasser ab. Wenn geschluckt, spülen Sie den Mund mit reichlich Wasser. Erbrechen nicht induzieren. Suchen Sie immer ärztlichen Rat. - Fügen Sie 120 l Elutionspuffer (Materialtabelle) zu einem 0,5 ml-Rohr hinzu.
- Legen Sie 50 l magnetische Partikel (Materialtabelle) und 1 ml Ethanol 96% in ein 5 ml-Rohr, das den Bindungspuffer bildet.
- HAdV- und MS2-Detektionsreagenzien
HINWEIS: Zwei verschiedene Nukleinsäureextraktionsreaktionen können gleichzeitig in jedem PCR-Test analysiert werden, wenn ein 8-Well-Thermocycler verwendet wird. Für alle PCR-Assays bereiten Sie molekularbiologisches Wasser vor, das in 1,5 ml-Röhren eingeflossen ist.-
HAdV-Erkennung
- Bereiten Sie eine Mischung vor, die 10 l mit 22,5 -M AdF-Vorwärtsprimer, 10 l mit 22,5 -M AdR-Reverse-Primer und 5 l mit 11,25 -M AdP-Sonde enthält (Tabelle 2).
- Fügen Sie 2,5 l der Mischung zu den Rohren 1 bis 8 eines Rohrstreifens hinzu. Lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen, schließen Sie die Rohre und halten Sie sie vor dem Licht geschützt.
- Schneiden Sie den Streifen, der ihn teilt, in zwei Streifen: Rohre 1-5 und Rohre 6-8.
- Bereiten Sie eine serielle Verdünnung von DNA-Suspensionen vor, die die Nukleotidsequenz des amplifizierten HAdV-Bereichs enthalten. Lufttrockene 1 l Suspensionen mit 1 x 105, 1 x 107und 1 x 109 GC/ml in Rohre 6-8.
HINWEIS: Bewahren Sie die Rohre mit den Primern, der Sonde und den luftgetrockneten Suspensionen vor Licht schutz.
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MS2-Erkennung
- Bereiten Sie eine Mischung vor, die 10 l mit 25 'M Pecson-2F-Vorwärtsprimer, 10 'L von 25 'M Pecson-2R-Reverseprimer und 2,5 'L von 25'M PecP-2-Sonde enthält (Tabelle2).
- Fügen Sie 2,25 l der Mischung zu den Rohren 1 bis 8 eines Rohrstreifens hinzu. Lassen Sie es bei Raumtemperatur trocknen, schließen Sie die Rohre und halten Sie sie vor dem Licht geschützt.
- Schneiden Sie den Streifen, der ihn teilt, in zwei Streifen: Rohre 1-5 und Rohre 6-8.
- Fahren Sie wie in Schritt 1.4.1.4 vor, verwenden Sie jedoch stattdessen eine Standardaufhängung für MS2.
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HAdV-Erkennung
2. Virale Konzentration
HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe zu jeder Zeit während der Probenentnahme, Reagenzienzubereitung, Flockung, Flockensammlung und Abfallentsorgungsverfahren. Tragen Sie während der Reagenzzubereitung eine Schutzbrille.
- Beispielsammlung
- Sammeln Sie eine 10 L Wasserprobe in einem flachen Boden Eimer mit einem Deckel. Sammeln Sie mindestens zwei Replikationen für jede Probe.
HINWEIS: Es ist wichtig, klare Eimer zu verwenden, um das Pellet zu visualisieren. Wenn die Wasserprobe schwebtes Material (z.B. Sand, Algen) enthält, lassen Sie es sedimentieren und sammeln Sie dann den Wasserüberstand in einem neuen Eimer. - Registrieren Sie das gesammelte Volumen sowie den Ort und das Abholdatum für jede Wasserprobe.
- Legen Sie einen magnetischen Rührer, der mit einer Batterie verbunden ist, unter eine Eimerstütze und legen Sie den Eimer mit der Wasserprobe auf seine Stütze.
HINWEIS: Achten Sie auf eine flache Oberfläche an einem frischen Ort und halten Sie die Eimer, die die Wasserproben enthalten, vor direkter Sonneneinstrahlung.
- Sammeln Sie eine 10 L Wasserprobe in einem flachen Boden Eimer mit einem Deckel. Sammeln Sie mindestens zwei Replikationen für jede Probe.
- Reagenzienzubereitung
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pH-Anpassungsreagenzien
- Gießen Sie das Zitronensäurepulver und die Natriumhydroxidpellets in die Töpfe mit 25 bzw. 50 ml destilliertem Wasser.
- Vorsichtig von Hand schütteln, bis die Zitronensäure und das Natriumhydroxid vollständig gelöst sind.
VORSICHT: Gießen Sie das Wasser nicht über die Natriumhydroxidpellets. Stattdessen gießen Sie die Natriumhydroxidpellets über das Wasser.
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Vorflocculated Magermilch
- Legen Sie einen Stand-up-Beutel auf einen Magnetrührer und gießen Sie 500 ml destilliertes Wasser hinein. Lassen Sie einen Rührmagneten in die Tasche und schalten Sie den Magnetrührer ein.
- Den Inhalt eines Meersalzbeutels und eines Magermilchrohrs in den Stand-up-Beutel gießen und 5 min bei mittlerer Geschwindigkeit rühren, um sie aufzulösen.
- Fügen Sie der PSM-Lösung 3 ml Zitronensäure mit einer Pasteur-Pipette hinzu, um sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 3,4 und 3,6 liegt. Messen Sie den pH-Wert der PSM-Lösung mit pH-Indikatorstreifen. Fügen Sie kleinere Mengen an Zitronensäure und Natriumhydroxid hinzu, wenn der pH-Wert näher an 3,5 kommt.
- Schalten Sie den Magnetrührer aus und stellen Sie sicher, dass die Flocken sichtbar sind. Verwenden Sie eine Taschenlampe, um die Flocs zu visualisieren.
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pH-Anpassungsreagenzien
- Flockung
- Lassen Sie einen Rührmagneten ins Wasser, stellen Sie den Magnetrührer mit maximaler Geschwindigkeit ein und schalten Sie ihn ein. Stellen Sie sicher, dass sich der Rührmagnet zu drehen beginnt.
- 10 ml destilliertes Wasser in ein Prozesskontrollrohr geben. Invertieren Sie die Röhre ein paar Mal, um den Virusbestand zu rehydrieren und die Lösung in das Wasser zu gießen.
- Gießen Sie den Inhalt eines Probe-Konditionierungsbeutels in das Wasser und rühren Sie 5 min.
- Messen Sie den pH-Wert der Wasserprobe mit pH-Indikatorstreifen. Fügen Sie der Wasserprobe ein paar Tropfen Zitronensäure oder Natriumhydroxid hinzu, um sicherzustellen, dass der pH-Wert zwischen 3,4 und 3,6 liegt. Fügen Sie kleinere Mengen an Zitronensäure und Natriumhydroxid hinzu, wenn der pH-Wert näher an 3,5 kommt.
- Fügen Sie 100 ml der PSM-Lösung mit einem 100 ml-Container hinzu.
- Versiegeln Sie den Eimer mit dem Deckel, stellen Sie den Magnetrührer mit minimaler Geschwindigkeit ein und lassen Sie das Wasser 8 h rühren.
- Schalten Sie den Magnetrührer aus und lassen Sie das Wasser noch mindestens 5 h, damit sich die Flocken absetzen können.
- Floc-Kollektion
- Bauen Sie ein Siphoning-System, das aus einem Pipettenregler, zwei Pipetten und einem Kunststoffrohr besteht, um den Wasserüberstand zum Entladen des Wassers auf den Flocken zu aspirieren.
- Schließen Sie eine 10 ml Bandendpipette an den Pipettenregler an. Befestigen Sie dann die Spitze der Pipette am Kunststoffrohr.
- Entfernen Sie den Filter einer 10 ml-Open-Tip-Pipette mit einer Pinzette und befestigen Sie die Pipette am Kunststoffrohr.
- Legen Sie einen leeren Eimer auf den Boden.
- Tauchen Sie die Spitze der Open-Tip-Pipette in das Wasser. Achten Sie darauf, es in der Nähe der Wasseroberfläche zu halten, um zu vermeiden, dass die Flocken gestört werden. Aspirieren Sie den Wasserüberstand, bis er die Tape-End-Pipette erreicht.
- Kneifen Sie das Kunststoffrohr an das Ende, das an der Tape-End-Pipette befestigt ist, und lösen Sie es von der Pipette.
- Legen Sie das Rohr in einen leeren Eimer. Lassen Sie den Druck auf das Rohr los, damit das Wasser in den leeren Eimer fließen kann.
- Kneifen Sie das Kunststoffrohr, um den Wasserfluss zu stoppen, wenn der Wasserstand im Begriff ist, den Rührmagneten zu erreichen, und bewegen Sie die Pipette vom Eimer weg.
- Schütteln Sie den Eimer, um die Flocken wieder aufzuhängen, und gießen Sie sie in eine 500 ml Stand-up-Plastiktüte. Lassen Sie die Flocs mit 1 h mehr zufrieden sein.
- Saugen Sie den Wasserüberstand vorsichtig mit einer 50 ml Pipette und einem manuellen Pipettenregler, um eine Störung der Flocken zu vermeiden.
- Die Flocken mit einer 100 ml Pipette aspirieren und in ein 50 ml graduiertes Zentrifugenrohr übertragen. Notieren Sie sich das Endvolumen des Probenkonzentrats und übertragen Sie 1 ml davon in ein 5 ml-Rohr, das die Konservierungslösung enthält, wobei eine Pasteur-Pipette verwendet wird.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Zentrifugenrohr abgestuft wird, damit das Endvolumen der konzentrierten Probe so genau wie möglich gemessen und registriert werden kann. - Führen Sie die Nukleinsäureextraktion im Feld durch. Alternativ können Sie die Konservierungslösung, die die Viren enthält, bis zu 15 Tage bei 20-30 °C aufbewahren oder zur weiteren Analyse an ein Referenzlabor liefern.
- Bauen Sie ein Siphoning-System, das aus einem Pipettenregler, zwei Pipetten und einem Kunststoffrohr besteht, um den Wasserüberstand zum Entladen des Wassers auf den Flocken zu aspirieren.
- Abfallentsorgung und Materialwiederverwendung
- Fügen Sie den Inhalt eines neutralisierenden Agentenbeutels in den Eimer ein, der das ausrangierte Wasser enthält. Mischen Sie das Wasser, und dann, lassen Sie es noch für 30 min.
- Entsorgen Sie das behandelte Wasser als allgemeinen Abfall.
- Legen Sie die Pipetten und das Kunststoffrohr in den Eimer. Füllen Sie den Eimer mit Wasser und gießen Sie den Inhalt eines neutralisierenden Agentenbeutels ein.
- Waschen Sie sie für mindestens 30 min, um sie zu sterilisieren und spülen Sie sie mit reichlich sauberem Wasser, um alle verbleibenden Neutralisationsmittel zu entfernen.
3. Nukleinsäureextraktion
HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe und tragen Sie während des Nukleinsäureextraktionsverfahrens immer eine Schutzbrille.
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Magnetische Rpipettenbedienung
- Machen Sie sich mit der Bedienung der magnetischen Pipette vertraut, bevor Sie die Extraktion durchführen.
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Nukleinsäureextraktion
- Ordnen Sie die Rohre, die die für die Extraktion erforderlichen Reagenzien enthalten, in einem Rack an, von links nach rechts: Bindungspuffer, Waschpuffer und Elutionspuffer. Legen Sie die entsprechende Anzahl von Rohren entsprechend der Anzahl der zu analysierenden Proben oder Replikationen fest.
- 1 ml Probenkonzentrat mit einer Einweg-Pasteurpipette in das Rohr mit dem Bindungspuffer geben. Invertieren Sie das Rohr 8x bis 10x, um die Lösung zu homogenisieren.
- Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 10 min beim kontinuierlichen Mischen, entweder mit einem solarbetriebenen Orbital oder manuell.
- Sammeln Sie die magnetischen Partikel mit der magnetischen Pipette und einer sauberen Spitze, die für die drei Waschpuffer wiederverwendet werden kann.
- Lassen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr mit 500 l Waschpuffer 1. Waschen Sie sie, indem Sie die Lösung mit der Spitze für 30 s sanft schütteln und sammeln.
- Übertragen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr, das 600 l Waschpuffer 2 enthält. Waschen Sie sie, indem Sie die Lösung mit der Spitze für 30 s sanft schütteln und sammeln.
- Übertragen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr, das 200 l Waschpuffer 3 enthält. Waschen Sie sie, indem Sie die Lösung mit der Spitze für 30 s sanft schütteln und sammeln.
- Lassen Sie die magnetischen Partikel in das Rohr, das den Elutionspuffer enthält, und entsorgen Sie die Spitze.
- Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 5 min beim kontinuierlichen Mischen, mit dem solarbetriebenen Orbital.
HINWEIS: Das Mischen der magnetischen Partikel im Elutionspuffer ist ein entscheidender Schritt. Bei Fehlen eines Orbitals, während der Inkubationszeit kontinuierlich von Hand mischen. - Ersetzen Sie die Spitze auf der magnetischen Pipette durch eine neue und sammeln Sie die magnetischen Partikel aus dem Elutionspuffer. Achten Sie darauf, die magnetischen Partikel vollständig aus dem Elutionspuffer zu entfernen, da sie molekulare Detektionsmethoden stören können.
- Entsorgen Sie die Spitze mit den partikeln, die daran befestigt sind. Fahren Sie mit der PCR-Analyse fort, versenden Sie den Elutionspuffer an ein Referenzlabor oder lagern Sie den Elutionspuffer bei 4 °C zur weiteren Analyse.
4. Virale Erkennung mit einem batteriebetriebenen Acht-Rohr-Echtzeit-Thermocycler
HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe und tragen Sie während des Nukleinsäurenachweises immer eine Schutzbrille. Ersetzen Sie die Handschuhe für neue, wenn Sie ein neues PCR-Experiment durchführen, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
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HAdV quantitative PCR
- Fügen Sie den Rohren 2, 4 und 5 14 L nukleasefreies Wasser hinzu.
- Fügen Sie den Röhren 1-5 4 l PCR-Mix hinzu.
- Fügen Sie 14 l Nukleinsäureextraktion von Probe A zu Tube 1 und 14 l von Probe B zu Tube 3 hinzu.
- Fügen Sie 2 l extrahierte Nukleinsäuren aus Probe A zu Tube 2 und 2 l von Probe B zu Tube 4 hinzu. Schließen Sie den Fünfrohrstreifen.
- Fügen Sie den Rohren 6, 7 und 8 14 L nukleasefreies Wasser hinzu.
- Fügen Sie 4 l dieser Mischung zu den Rohren 6, 7 und 8 hinzu, und schließen Sie sie.
- Legen Sie beide Streifen in den Thermocycler und wählen Sie den entsprechenden Lauf aus (Tabelle 3).
- Entsorgen Sie das Wasserrohr und bewahren Sie die extrahierte Nukleinsäure möglichst an einem frischen, lichtgeschützten Ort auf, falls eine zweite Prüfung durchgeführt werden muss.
- Reinigen Sie die Mikropipetten, das Rack, das Arbeitsmaterial und das gesamte Material ordnungsgemäß mit einem Nukleinsäurereiniger, und entsorgen Sie die Plastiktüte mit der verwendeten Spitze, Handschuhe n. Chr. und Schläuchen.
VORSICHT: Nukleinsäureentferner ist eine sehr brennbare Flüssigkeit und Dampf. Atmen Sie den Sprühnebel nicht ein und vermeiden Sie jeglichen Kontakt der Flüssigkeit mit den Augen oder der Haut. Ansonsten sofort mit reichlich Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. - Sammeln Sie die Ergebnisse und analysieren Sie die erhaltenen Daten.
-
MS2 quantitative PCR
- Fügen Sie den Rohren 2, 4 und 5 14 L nukleasefreies Wasser hinzu.
- Fügen Sie den Röhrchen 1-5 4 l PCR-Mix und 0,5 l Reverse-Transkriptase-Enzym hinzu.
- Fügen Sie 14 l Nukleinsäureextraktion von Probe A zu Tube 1 und 14 l von Probe B zu Tube 3 hinzu.
- Fügen Sie 1 l extrahierte Nukleinsäuren aus Probe A zu Tube 2 und 1 l von Probe B zu Tube 4 hinzu. Schließen Sie den Fünfrohrstreifen.
- Fügen Sie den Rohren 5, 6, 7 und 8 15,5 l nukleasefreies Wasser hinzu und schließen Sie sie.
- Fügen Sie den Röhrchen 6, 7 und 8 4 l PCR-Mix und 0,5 l Reverse-Transkriptase-Enzym hinzu.
- Legen Sie beide Streifen in den Thermocycler und wählen Sie den entsprechenden Lauf aus (Tabelle 3).
- Fahren Sie wie in den Schritten 4.1.8 bis 4.1.10 beschrieben vor.
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Representative Results
Methodenentwicklung
Dieses Verfahren wurde im Labor für Viren Kontaminanten von Wasser und Lebensmitteln in Zusammenarbeit mit GenIUL und Oxfam Intermin entwickelt. Es besteht aus drei verschiedenen Schritten. Die erste, die virale Partikelkonzentration, ist eine Anpassung einer Magermilchflockungsmethode, die zuvor beschrieben wurde12,17,18. Die ursprüngliche Methode wurde so modifiziert, dass sie unabhängig von einer Stromversorgung ist, einfacher und ohne Zentrifugationsschritte.
Die Wiederherstellung der VirWaTest-Konzentrationsmethode wurde in HAdV- und MS2-Bakteriophage-spiked-Grundwasserproben getestet. Die virale Wiederherstellung der VirWaTest-Konzentrations- und Extraktionsmethode wurde auf 3,01 % bis 18,02 % für MS2 und 17,52 % bis 44,22 % für HAdV geschätzt. Diese Wiedereinziehungen wurden aus den Werten berechnet, die durch quantitative PCR während der Entwicklung des Verfahrens im Vergleich zu den Anfangskonzentrationen von HAdV und MS2 in den Wasserproben erzielt wurden, nachdem sie mit bekannten Konzentrationen dieser Virusbestände spiking wurden.
Die VirWaTest magnetische Nukleinsäureextraktion wurde mit einem kommerziellen RNA-Mini-Kit (z. B. QIAamp Viral RNA Mini Kit) verglichen, einer säulenbasierten Extraktionsmethode, die im Labor verwendet wird, indem 33 Fluss- und Grundwasserproben getestet wurden, die mit HAdV und MS2 durch Magermilchflockung. Die Vergleichsergebnisse zeigten, dass die VirWaTest-Methode in 23/33 Fällen für HAdV sowie für MS2 (Tabelle 4) höher war. Ein Wilcoxon-Test zeigte p-Werte von 0,0005569 für HAdV und 0,02791 für MS2. VirWaTest Nukleinsäure-Extraktion bietet deutlich höhere virale Erholungals als die kommerzielle.
Nachweis von HAdV in Umweltwasserproben, die nach der VirWaTest-Methode konzentriert sind
Um die entwickelte Methode zur Viruskonzentration im Feld zu testen, sammelte das Oxfam Water, Sanitation and Hygiene (WASH) Team mit Sitz in Banghi (RCA) im März 2017 Viren aus fünf Brunnenwasserproben und konzentrierte sie.
Auch im Gebiet von Pedernales (Ecuador), das 2016 und 2017 von Erdbeben heimgesucht wurde, wurden im Februar 2017 sechs Brunnenwasserproben von einem Oxfam WASH-Team entnommen und seine Viren durch die VirWaTest-Konzentrationsmethode konzentriert. Virale Konzentrate aus beiden Einstellungen wurden zur VirWaTest-Nukleinsäureextraktion und viralen Quantifizierung ins Labor in Barcelona geschickt.
In Ecuador wurden in sechs der sechs analysierten Proben natürlich vorkommende HAdV mit Konzentrationswerten von 3,27 x 101 bis 1,80 x 102 GC/L nachgewiesen, während eine der fünf in Banghi (RCA) getesteten Proben positiv für HAdV, bei einer Konzentration von 3,46 x 102 GC/L (Tabelle 5).
MS2, das allen getesteten Proben als interne Prozesskontrolle hinzugefügt wurde, wurde in allen getesteten Proben nachgewiesen, was zeigt, dass die Methode von der Konzentration bis zur Detektion korrekt durchgeführt wurde.
Abbildung 1 : VirWaTest-Methode. Überblick über die Schritte, aus den die VirWaTest-Methode besteht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Materialien | konzentration | Nukleinsäureextraktion | entdeckung |
| ausrüstung | Magnetischer Rührer (2 Einheiten) Batterie (2 Einheiten) Batterie-/Rührer-Steckverbinder (2 Einheiten) Netzteile (2 Einheiten) Bucket-Unterstützung (2 Einheiten) Seil (1 Einheit) Rührmagnet (3 Einheiten) Pinzette (1 Einheit) Siliziumschläuche (1 Einheit) Pipettenregler (1 Einheit) Marker (1 Einheit) |
Magnetische Pipette (1 Einheit) Solar Rotary Platform (1 Einheit) Multi-Size Tube Rack (1 Einheit) Timer (1 Einheit) |
Thermocycler (1 Einheit) Batterie (1 Einheit) computer Rohrträger (1 Einheit) 0,5 l - 10 l Mikropipette (1 Einheit) 2 l - 20 l Mikropipette (1 Einheit) |
| Verbrauchsmaterialien und Reagenzien (für je 2 Wasserproben/Replikationen) | Eimer (3 Einheiten) pH-Indikatorstreifen Tape-End 10 ml Pipette (2 Einheiten) Open-Tip 10 ml Pipette (2 Stück) Tape-End 50 ml Pipette (2 Einheiten) Tape-End 100 ml Pipette (2 Einheiten) Pasteur Pipette (4 Einheiten) Stand-Up Plastiktüte (4 Stück) Kunststoffbehälter mit 25 ml destilliertem Wasser (1 Einheit) Kunststoffbehälter mit 50 ml destilliertem Wasser (1 Einheit) 100 ml Leerbehälter (1 Einheit) Handschuhe (6 Paare) Prozesssteuerung (2 Röhren) Rohr mit 10 ml destilliertem Wasser (2 Einheiten) Zitronensäure (1 Tube) Natriumhydroxid (1 Tube) Magermilch (1 Tube) Zitronensäure Sachet (1 Einheit) Destilliertes Wasser (1 500 ml Flasche) Probenkonditionierung (2 Sachets) Konservierungslösung (2 Tuben) Neutralisationsmittel (4 Beutel) |
Magnetische Pipettenspitzen (2 Einheiten) Pasteur Pipette (2 Einheiten) Bindungspuffer (2 Röhren) Waschpuffer 1 (2 Tuben) Waschpuffer 2 (2 Tuben) Waschpuffer 3 (2 Tuben) Elutionspuffer (2 Röhren) Handschuhe (6 Paare) |
10 l Micropipette Tips (1 Box) 20 l Micropipette Tips (1 Box) DNA qPCR Mix (1 Tube) RNA qPCR Mix (1 Tube) Reverse Transcriptase Enzyme (1 Tube) Molekularbiologie Wasser (1 Tube) HAdV Rohrleiste mit Grundierung, Sonde und Standard (1 Einheit) MS2 Rohrleiste mit Grundierung, Sonde und Standard (1 Einheit) Nukleinsäureentferner Handschuhe (6 Paare) |
Tabelle 1: VirWaTest-Inhalt. Geräte, Verbrauchsmaterialien und Reagenzien, die für die Konzentration, Extraktion und detektion von Viren in zwei Wasserproben/Replikationen vorbereitet werden müssen.
| virus | Zündkapseln | Genbank-Beitritts-Nr. | stellung | Sequenz (5'-u20123') | länge | verweis | ||
| Humanes Adenovirus (HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869-u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 | Hernroth et al., 200215 | ||
| AdR | 18919-u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 | |||||
| AdP1 | 18890-u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2 Bakteriophagen (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344-u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| pecson-2R | 659-u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| PecP-2 | 369-u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tabelle 2: Oligonukleotide für quantitative PCR-Experimente. Primer und Sonde entwickelt, um an Nukleinsäuresequenzen von HAdV und MS2 zu binden.
| temperatur | zeit | Zyklen | temperatur | zeit | Zyklen |
| 95 °C | 12 Min. | 1 | 55 °C | 15 Min. | 1 |
| 95 °C | 10 Min. | 1 | |||
| 95 °C | 15 s | 40 | 95 °C | 15 s | 40 |
| 60 °C | 1 Min. | 60 °C | 1 Min. |
Tabelle 3: Thermische Bedingungen für quantitative PCR-Experimente. Temperatur, Zeit und Zyklen, die für die HAdV- und MS2-Verstärkung verwendet werden.
| Qiagen | VirWaTest | Qiagen | VirWaTest | ||
| mittlere | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| knauserig | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| p-Wert (Wilcoxon) für HAdV: 0.0005569 | |||||
| p-Wert (Wilcoxon) für MS2: 0,02791 | |||||
| Virus getestet | Getestete Proben | Qiagen | VirWa-Test | ||
| HAdv | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tabelle 4: VirWaTest Nukleinsäureextraktionsentwicklung. Median-, Mittel- und SD-Werte, die beim Vergleich der Qiagen- und VirWaTest-Extraktionsmethoden in 33 Grundwasserproben für HAdV und MS2 ermittelt wurden.
| land | platz | probe | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, Dorf 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, Dorf 3 | 3 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Fondo | 4 | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Ecuador | Bohrung A | 6 | 7,96 x 101 |
| Bohrloch B | 7 | 1,80 x 102 | |
| Bohrung C | 8 | 8,88 x 101 | |
| Brunnen Wasser A | 9 | 6,06 x 101 | |
| Brunnen Wasser B | 10 | 1,12 x 102 | |
| Brunnen Wasser C | 11 | 3,27 x 101 |
Tabelle 5: Quantifizierung von HAdV mit der VirWaTest-Methode. Quantitative PCR-Ergebnisse, ausgedrückt in GC/Liter, für HAdV quantifiziert in Wasserproben, die von RCA und Ecuador gesammelt und konzentriert wurden.
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Discussion
Die VirWaTest-Methode ermöglicht die Konzentration von Viren und Nukleinsäureextraktion aus Wasserproben am Einsatzort von unerfahrenen Anwendern. Es ist ein erschwingliches, schnelles und einfaches Protokoll. Die Konzentration basiert auf dem Prinzip der organischen Flockung mit Magermilch, wodurch sich Magermilchproteine aufgrund des niedrigen pH- und hohen Leitfähigkeitswertes zu Flocken aggregieren lassen, die die Viren adsorbieren. Wenn die Flocken Sediment, ist es einfach, sie zu sammeln, so dass es möglich ist, 10 L Wasser zu konzentrieren, während traditionelle Ultrazentrifugation nicht mit großen Wassermengen umgehen kann.
Das Verfahren wurde so modifiziert, dass es am Entnahmeort praktikabel ist, ohne elektrische Geräte mit Ausnahme eines batteriebetriebenen Magnetrührers zu verwenden. Einige andere Ansätze, die auf der Wasserfiltration basieren, wurden an die Viruskonzentration angepasst und können auch am Einsatzort durchgeführt werden. Jedoch, schwebbares Material in Wasserproben vorhanden oft verstopft die Filter; Das geringe Volumen, das mit diesen Systemen konzentriert werden kann, stellt daher eine ernsthafte Einschränkung dar.
Dies ist die erste Beschreibung einer Methode zur Konzentration von Viren aus Wasserproben am Einsatzort, unabhängig von der Trübung der Probe. Das VirWaTest-Konzentrationsverfahren ermöglicht die gleichzeitige Bearbeitung mehrerer Proben, wenn das entsprechende Material zur Verfügung steht. Darüber hinaus hat sich die Magermilchflockung als nützlich für Bakterien und Parasitenkonzentration19erwiesen.
Die Herstellung des geeigneten Materials ist entscheidend für die ordnungsgemäße Durchführung des Verfahrens. Berücksichtigen Sie die Anzahl der zu analysierenden Wasserproben und bereiten Sie die Reagenzien und das Material vor, bevor Sie an den Ort übergehen, an dem die Prüfung für die Herstellung der Reagenzien und des Materials erforderlich ist. Mehrere Proben können gleichzeitig verarbeitet werden, wenn die entsprechende Materialmenge zur Verfügung steht.
Vor Beginn der Konzentration einer Wasserprobe wird eine bekannte Konzentration eines Virusbestands verwendet, um die Probe als Prozesskontrolle zu spitzen. Bei dieser Methode wird ein getrockneter Virusbestand verwendet, der mit destilliertem Wasser rehydriert wird, bevor er der Wasserprobe am Einsatzort zugesetzt wird. Dies ist nützlich, um falsch-negative Ergebnisse am Ende des Verfahrens auszuschließen und gibt einen Hinweis auf die Leistung der Methode.
Virale Konzentrate, die mit dem VirWaTest gewonnen werden, können im Bereich der VirWaTest-Nukleinsäureextraktions- und -detektionsmethoden weiter getestet oder konzentrate bei Raumtemperatur an ein Referenzlabor geschickt werden. Die dem Konzentrat zugesetzte Konservierungslösung ermöglicht es Viren, bis zu 2 Wochen stabil zu bleiben (unveröffentlichte Ergebnisse).
VirWaTest Nukleinsäureextraktion ist eine magnetische partikelbasierte Methode. Es ist einfach und schnell und ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proben und zeigt eine gleichwertige und noch bessere Wiederherstellungseffizienz als Methoden, die derzeit für virale Nukleinsäureextraktionen verwendet werden. Die Nukleinsäuren können bei Raumtemperatur an Referenzlabore gesendet werden, oder, wenn benutzerisch sicher sind, molekulare Detektion durchzuführen, kann ein quantitativer PCR-Assay am Verwendungspunkt der ursprünglichen Wasserprobe durchgeführt werden.
Wenn eine kleine Laboreinrichtung verfügbar ist, kann das VirWaTest-Konzentrationsprotokoll mit Standard-Nukleinsäureextraktionskits gekoppelt werden, die von einer Zentrifuge und Standard-PCR-basierten Methoden abhängen, die einen Gefrierschrank benötigen, um die Reagenzien zu erhalten, aber Standard-Thermocycler, die günstiger sind als batteriebetriebene.
Da jedoch eine Stromversorgung manchmal nicht verfügbar ist, haben wir optimierte Detektionstests für MS2-Bakterien als Prozesskontrolle und HAdV als viralen Fäkalienindikator, und die Methodik kann für alle anderen Viren von Interesse, wie Hepatitis, angepasst werden. Viren, RoV, NoV oder andere, die im Feld betrieben werden, ohne dass ein Gefrierschrank für die Wartung der Reagenzien oder herkömmliche Thermocycler, sondern nur ein batteriebetriebener, benötigt wird. Mehrere batteriebetriebene Thermocycler sind im Handel erhältlich. Wenn ein Netzteil verfügbar ist, können auch andere herkömmliche qPCR-Geräte verwendet werden. Wenn ein Acht-Rohr-Thermocycler verwendet wird, können bis zu zwei Nukleinsäureextraktionen (zwei verschiedene Proben oder zwei Repliken aus derselben Probe) in demselben PCR-Test getestet werden. Für jede Nukleinsäureextraktion werden zwei verschiedene Mengen getestet, um eine enzymatische Hemmung, die von der Probe ausgeht, auszuschließen. Die Anpassung basiert auf der vorherigen Aufbereitung von PCR-Rohren durch lufttrocknende Grundierungen, Sonden und Standardsuspensionen. Es gibt mehrere lyophilisierte kommerzielle qPCR-Lösungen, die mit dem gleichen Verfahren wie hier beschrieben verwendet werden könnten. Wir haben eine Möglichkeit beschrieben, die wir für einfach hielten.
Vergleichstests, die während der Entwicklung der Methode durchgeführt wurden, zeigten, dass die VirWaTest-Methoden der Konzentration, Extraktion und Detektion für die Quantifizierung von Viren in Wasserproben effizient sind.
Die Nachweisgrenze (LOD) des beschriebenen Verfahrens ist variabel, da das nach der Konzentration gesammelte Volumen variabel ist. Außerdem kann die LOD für verschiedene Viren leicht unterschiedlich sein. Wenn ein Volumen von ca. 10 L gesammelt wird, würde die LOD für HAdV etwa 1 x 102 virale GC/L betragen. So können relativ geringe Konzentrationen von HAdV durch die VirWaTest-Methode nachgewiesen werden. In Pedernales (Ecuador) präsentierten sechs der sechs getesteten Proben HAdV in Konzentrationen in der Nähe der LOD, die von 3,27 x 101 bis 1,80 x 102 GC/L reichten. In Banghi (RCA) wurde HAdV in einer der fünf analysierten Proben in einer Konzentration von 3,46 x 102 GC/L nachgewiesen. Das Vorhandensein von HAdV, sowie das Vorhandensein von MS2 als Kontrollprozess in den getesteten Proben, zeigt, dass die Methode für die Rückgewinnung von Viruspartikeln aus Wasserproben nützlich ist, auch wenn sie von unerfahrenen Benutzern durchgeführt werden.
Die bisher erhaltenen Rückmeldungen deuten darauf hin, dass die Viruskonzentration ein einfaches Verfahren ist, ohne größere Probleme bei der Anwendung am Einsatzort der Proben, obwohl 8 h und 5 h Schritte erforderlich sind. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Schritte ohne menschliche Hilfe erfolgen. Darüber hinaus wird als Alternative für nichtturbide Gewässer eine schnellere Methode auf Basis der Filtration entwickelt. Die Flockung scheint jedoch bis jetzt die einzigartige Methode zu sein, die die Konzentration von Proben mit hoher Trübung ermöglicht. Virale Konzentrate können dann bei Raumtemperatur an jedes Labor auf der ganzen Welt geschickt werden, was auch das Testen von Viren erleichtert, da Probenahmebereiche nicht immer über gute Transportleistungen verfügen, die Kühlbedingungen bieten. Alternativ ermöglichen die hier vorgestellten Extraktions- und Detektionsprotokolle Tests zur Virusdetektion am Einsatzort der Proben.
Soweit wir wissen, ist dies die erste Methode, die für die Konzentration und Prüfung des Vorhandenseins von Viren in Wasserproben im Feld nützlich sein soll. Es sollten weitere Anstrengungen unternommen werden, um das Verfahren auf die Bewertung des Vorhandenseins von menschlichen Viruspathogenen anzuwenden, die in mehreren anderen humanitären Krisenszenarien von Interesse sind. Außerdem ist das Feedback des Benutzers erforderlich, um Einblicke in die mögliche Implementierung zu geben, um das Verfahren freundlicher zu gestalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
VirWaTest war ein Forschungsprojekt, das vom HIF (Humanitarian Innovation Funds) Programm der ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance) finanziert wurde. Die Autoren würdigen die WASH-Teams, die freundlicherweise an dieser Studie mitgearbeitet haben. Die Analyse von Proben in Ecuador wurde von Oxfam Ecuador und Direccién de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas ist Serra-Hunter Fellow an der Universität Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
