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Immunology and Infection

VirWaTest, पानी के नमूनों में वायरस की जांच के लिए एक बिंदु के उपयोग विधि

Published: May 11, 2019 doi: 10.3791/59463
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 3,4, 1, 1
1Laboratory of Viruses Contaminants of Water and Food (VIRCONT), Department of Genetics, Microbiology and Statistics, Section of Microbiology, Virology and Biotechnology, University of Barcelona, 2Grupo de Investigación Biodiversidad, Medio Ambiente y Salud (BIOMAS), Facultad de Ingenierías y Ciencias Agropecuarias (FICA), Ingeniería en Biotecnología, Universidad de las Américas, 3Municipal Laboratory - Waters of Mataró, 4GenIUL

Summary

यहाँ हम VirWaTest, जो एकाग्रता और उपयोग के बिंदु पर पानी के नमूनों से वायरस का पता लगाने के लिए एक सरल, सस्ती और पोर्टेबल विधि है प्रस्तुत करते हैं.

Abstract

मनुष्यों और जानवरों द्वारा उत्सर्जित वायरस जल स्रोतों को दूषित कर सकते हैं और जब इस पानी का उपयोग पीने, खाद्य सिंचाई, धोने आदि के लिए किया जाता है तो मानव स्वास्थ्य के लिए खतरा पैदा हो सकता है। शास्त्रीय मल बैक्टीरिया सूचक हमेशा वायरल रोगजनकों की उपस्थिति के लिए जांच नहीं करता है इसलिए वायरल रोगजनकों और वायरल संकेतकों का पता लगाने के लिए जोखिम शमन के उपायों को अपनाने के लिए प्रासंगिक है, विशेष रूप से मानवीय परिदृश्यों में और क्षेत्रों में जहां जल जनित वायरल का प्रकोप अक्सर होता है।

वर्तमान में, मल सूचक बैक्टीरिया (एफआईबी) के परिमाणीकरण की अनुमति देने वाले कई वाणिज्यिक परीक्षण उपयोग के बिंदु पर परीक्षण के लिए उपलब्ध हैं। तथापि, ऐसे वाणिज्यिक परीक्षण वायरसों का पता लगाने के लिए उपलब्ध नहीं हैं। पर्यावरण पानी के नमूनों में वायरस का पता लगाने के छोटे संस्करणों में कई लीटर ध्यान केंद्रित करने की आवश्यकता है. इसके अलावा, एक बार ध्यान केंद्रित, वायरस का पता लगाने ऐसे न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और आणविक पता लगाने के रूप में तरीकों पर निर्भर करता है (जैसे, polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया [पीसीआर] आधारित परख) वायरल जीनोम की.

विधि यहाँ वर्णित 10 एल पानी के नमूनों से वायरस की एकाग्रता की अनुमति देता है, साथ ही उपयोग के बिंदु पर वायरल न्यूक्लिक एसिड की निकासी, सरल और पोर्टेबल उपकरणों के साथ. यह कई वायरस के लिए उपयोग के बिंदु पर पानी के नमूनों के परीक्षण की अनुमति देता है और मानवीय परिदृश्यों में उपयोगी है, साथ ही किसी भी संदर्भ में जहां एक सुसज्जित प्रयोगशाला उपलब्ध नहीं है. वैकल्पिक रूप से, विधि पानी के नमूनों में मौजूद वायरस और आगे के विश्लेषण के लिए कमरे के तापमान पर एक प्रयोगशाला में ध्यान केंद्रित करने के शिपिंग ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है।

Introduction

किसी भी मानवीय आपात स्थिति के पहले चरण के दौरान, स्वच्छ पानी की आपूर्ति, स्वच्छता, और स्वच्छता के लिए उपयोग प्रभावित लोगों के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसलिए, जलजनित प्रकोपों को रोकने के लिए जल गुणवत्ता की निगरानी करना प्राथमिकता है। यह सर्वविदित है कि दूषित पानी अक्सर रोगों का मूल है, लेकिन पारंपरिक प्रयोगशाला विधियों की उपलब्धता के साथ भी हेपेटाइटिस ई वायरस (एचईवी) जैसे वायरल प्रकोपों के स्रोतों का निर्धारण करना अक्सर मुश्किल होता है। जल गुणवत्ता का नियंत्रण एफआईबी1,2,3,4के परिमाणीकरण पर आधारित है . तथापि, यह व्यापक रूप से प्रलेखित किया गया है कि एफआईबी की अनुपस्थिति और रोटावायरस (आरओवी), नोरोवायरस (एनवी), या एचईवी5,6जैसे वायरल जलजनित रोगजनकों की उपस्थिति के बीच कोई संबंध नहीं है। इस प्रकार, एफआईबी पर आधारित जल गुणवत्ता मानदंडों का उपयोग करने से जलजनित वायरल रोगजनकों की उपस्थिति से जुड़े जोखिमों का कम आकलन हो सकता है। सूचक वायरस की निगरानी, जैसे कि मानव एडेनोवायरस (एचएडीवी), या विशिष्ट रोगजनक वायरल रोगजनकों के संपर्क को परिभाषित करने और मानव संक्रमण के संभावित स्रोत की पहचान करने में सहायक होंगे7,8, 9,10 और स्वच्छता उपायों की प्रभावकारिता को मान्य करने में11.

अब तक, इन परिदृश्यों में वायरस का पता लगाने कुशल कर्मचारियों और जटिल रसद पर भरोसा किया. VirWaTest (virwatest.org) एकाग्रता और उपयोग के बिंदु पर पानी के नमूनों से वायरस के बाद का पता लगाने के लिए एक सरल, सस्ती, और पोर्टेबल विधि के विकास के उद्देश्य से है.

वायरस सांद्रता 10 एल पानी के नमूनों के कार्बनिक फ्लैक्यूलेशन के सिद्धांत पर आधारित है, जिसके द्वारा वायरस छोटे मात्रा12,13में बरामद किए जाते हैं। Flocs एकत्र कर रहे हैं और एक बफर है कि वायरस lyses और गिरावट से न्यूक्लिक एसिड रोकता है जब वे अधिक से अधिक 2 सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहीत करने के लिए जोड़ा जाता है.

न्यूक्लिक अम्ल निष्कर्षण विधि चुंबकीय कणों के उपयोग पर आधारित होती है जिससे न्यूक्लिक अम्ल अधिशोचित हो जाते हैं। वे एक धोने बफर से दूसरे करने के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है और अंत में एक चुंबकीय पिपेट का उपयोग करके elution बफर में जो कणों देते हैं. प्राप्त वायरल न्यूक्लिक एसिड निलंबन एक संदर्भ प्रयोगशाला जहां पता लगाने पीसीआर के आधार पर आणविक तरीकों का उपयोग किया जा सकता करने के लिए भेज दिया जा सकता है। प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए, दो अलग अलग मात्राएं नमूने द्वारा उत्पन्न एंजाइमी अवरोध बाहर शासन करने के लिए परीक्षण कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, न्यूनतम उपकरण उपलब्धता के साथ, पीसीआर परीक्षण उपयोग के बिंदु पर चलाया जा सकता है. पूरी प्रक्रिया को विद्युत आपूर्ति से स्वतंत्र रूप से निष्पादित करने के लिए अभिकल्पित किया गया है (चित्र 1)।

मानव द्वारा उत्सर्जित और उच्च सांद्रता में अपशिष्ट जल नमूनों में पाए जाने वाले HAdV का पता लगाने के लिए एक मात्रात्मक पीसीआर परख को उपयोग के बिंदु पर चलाने के लिए अनुकूलित किया गया है। HAdV मानव मल वायरल संकेतक के रूप में उपयोग किया जाता है. MS2 बैक्टीरियोफेज के परिमाणीकरण के लिए एक पीसीआर भी अनुकूलित किया गया है के बाद से MS2 प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में VirWaTest में प्रयोग किया जाता है. विधि ब्याज के किसी भी वायरस का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

विकास के बाद, VirWaTest विधि उपयोगकर्ताओं द्वारा मध्य अफ्रीका गणराज्य (RCA) और इक्वाडोर में दो अलग अलग सेटिंग्स में लागू किया गया है, वास्तविक स्थितियों में प्रोटोकॉल के आवेदन पर प्रतिक्रिया प्रदान.

हमारे ज्ञान के लिए, यह पहली प्रक्रिया है कि एकाग्रता और उपयोग के बिंदु पर वायरस का पता लगाने की अनुमति देता है, किसी भी बिजली की आपूर्ति से स्वतंत्र, बड़े उपकरण, और ठंड / मजबूत परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रत्येक जल नमूने की दो प्रतिकृतियां एकत्र करने की सिफारिश की जाती है।

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Protocol

1. तैयारी और पैकेजिंग

नोट: पैक की जाने वाली सामग्री/उपकरण तालिका 1में सूचीबद्ध हैं। प्रक्रिया नियंत्रण के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को संभालने के लिए दस्ताने का उपयोग करें, एकाग्रता अभिकर्मकों, न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण अभिकर्मकों और पता लगाने अभिकर्मकों. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को संभालने के लिए सुरक्षात्मक चश्मा पहनें।

  1. प्रक्रिया नियंत्रण
    1. MS2 बैक्टीरियोफैग स्टॉक संस्कृति तैयार करें (अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन [ATCC] 15597-B1) जिसमें 1 x 10 PFU/mL को ISO प्रक्रिया 10705-1:199514का पालन करके प्रयोगशाला में शामिल किया गया है।
    2. इसके बाद, 10 एमएल ट्यूबों में 1 x 108 PFU युक्त निलंबन के 10 डिग्री सेल्सियल और जल को 37 डिग्री सेल्सियस पर वाष्पित होने दें। पानी के नमूने के प्रति एक ट्यूब का प्रयोग करें.
    3. इसके अतिरिक्त, एकत्र नमूने प्रति बाँझ आसुत पानी के 10 एमएल युक्त एक ट्यूब तैयार करें।
  2. एकाग्रता अभिकर्मकों
    1. preflocculated स्किम्ड दूध समाधान (पीएसएम) के लिए, पांच 10 एल पानी के नमूने ध्यान केंद्रित करने के लिए निम्नलिखित मात्रा का उपयोग करें।
      1. 5 ग्राम स्किम्ड दूध युक्त एक प्लास्टिक ट्यूब तैयार कीजिए।
      2. 16.66 ग्राम समुद्री लवण युक्त एक ज़िप प्लास्टिक बैग तैयार करें।
      3. 500 एमएल आसुत जल युक्त प्लास्टिक की बोतल तैयार कीजिए।
    2. पीएच समायोजन के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को तैयार करें। पीएसएम के पीएच और पांच 10 एल पानी के नमूनों को समायोजित करने के लिए निम्न मात्रा का उपयोग करें।
      1. एक 10 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 5 ग्राम साइट्रिक एसिड 1-हाइड्रेट जोड़ें।
        चेतावनी: साइट्रिक एसिड गंभीर जलन का कारण बनता है जब यह आंखों के साथ संपर्क में आता है। यदि ऐसा होता है, तो आंखों को कई मिनट के लिए पानी से सावधानी से कुल्ला करें। यदि जलन बनी रहती है, तो चिकित्सा सलाह लें।
      2. 10 एमएल प्लास्टिक ट्यूब में 2 ग्राम सोडियम हाइड्रॉक्साइड डालें।
        चेतावनी: सोडियम हाइड्रॉक्साइड गंभीर त्वचा जलने और आंखों की क्षति का कारण बन सकता है। यदि निगल लिया, मुंह कुल्ला. उल्टी पैदा न करें। यदि यह आंखों के संपर्क में आता है, तो कई मिनट के लिए सावधानी से पानी से कुल्ला करें। फिर, चिकित्सा सलाह लें।
      3. एक प्लास्टिक के कंटेनर में बाँझ आसुत पानी के 25 एमएल रखो.
      4. एक प्लास्टिक के कंटेनर में बाँझ आसुत पानी के 50 एमएल रखो.
    3. नमूना कंडीशनिंग पाउच flocculation के लिए इस्तेमाल किया तैयार, परिरक्षक समाधान न्यूक्लिक एसिड की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया, और त्याग े पानी और सामग्री को बेअसर करने के लिए पाउच बेअसर. परीक्षण किया जा करने के लिए प्रत्येक 10 एल पानी के नमूने के लिए निम्न मात्रा का उपयोग करें।
      1. कंडीशनिंग पाउच के लिए एक ज़िप प्लास्टिक बैग में 15 ग्राम समुद्री लवण और 8 ग्राम साइट्रिक एसिड 1-हाइड्रेट रखो।
      2. 2 एमएल लाइसिस बफर (माल की सारणी) और 0ण्3 एमएल न्यूक्लिक अम्ल संरक्षण एजेंट ( सामग्री कीसारणी) को 5 एमएल ट्यूब में जोड़ें।
        चेतावनी: Lysis बफर guanidine thiocyanate और Triton X-100 शामिल हैं. एसिड के साथ संपर्क विषाक्त गैस मुक्त, और यह हानिकारक है अगर निगल लिया, साँस, या त्वचा के साथ संपर्क में आता है. यदि निगल लिया, मुंह कुल्ला. उल्टी पैदा न करें। यदि यह त्वचा के संपर्क में आता है, पानी के बहुत से धो लें. फिर, चिकित्सा सलाह लें। न्यूक्लिक एसिड संरक्षण एजेंट त्वचा और आंख जलन का कारण बनता है और हानिकारक है अगर निगल लिया. यदि यह त्वचा या आंखों के संपर्क में आता है, तो कई मिनट के लिए प्रचुर मात्रा में पानी से कुल्ला करें। किसी भी मामले में, खासकर अगर निगल लिया और अस्वस्थ महसूस कर रहा है, तो चिकित्सा सलाह लें।
      3. चार ज़िप प्लास्टिक की थैलियों में 40 ग्राम डिटर्जेंट पाउडर रखो.
        चेतावनी: पाउडर डिटर्जेंट आंखों में जलन का कारण बनता है। यदि यह आंखों के संपर्क में आता है, तो कई मिनट के लिए प्रचुर मात्रा में पानी से कुल्ला करें। यदि जलन बनी रहती है या निगल लिया, तो चिकित्सा सलाह लें।
  3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण अभिकर्मक
    1. चुंबकीय कणों का 50 डिग्री लल (सामग्री की सारणी) और 1 एमएल एथेनॉल 96% को 5 एमएल ट्यूब में डालिए जो बाइंडिंग बफर का निर्माण करता है।
      चेतावनी: चुंबकीय कणों बफर सोडियम azide, जो एक विषाक्त गैस रूपों जब यह एसिड या भारी धातु आयनों के साथ संपर्क में आता है और विषाक्त है अगर ingested या जब यह त्वचा के साथ संपर्क में आता है शामिल हैं. यदि ingested या त्वचा के साथ संपर्क में, मुंह या प्रचुर मात्रा में पानी के साथ त्वचा कुल्ला और चिकित्सा सलाह लेनी. इथेनॉल एक अत्यधिक ज्वलनशील तरल और वाष्प है और गंभीर आंख जलन का कारण बनता है। गर्मी, गर्म सतहों, स्पार्क्स, और किसी भी अन्य प्रज्वलन स्रोत से दूर रखें। यदि यह त्वचा या आंखों के संपर्क में आता है, तो प्रचुर मात्रा में पानी से कुल्ला करें। बड़ी मात्रा में पानी और/या यदि साँस लेने के मामले में, ताजा हवा में बाहर जाएं। किसी भी मामले में, चिकित्सा सलाह लें।
    2. तीन 2 एमएल ट्यूबों में क्रमशः 500 एलएल, 600 जेडएल और 200 डिग्री सेल्सियस कपड़े धोने वाले बफ़र्स 1, 2, और 3, जोड़ें।
      चेतावनी: धोने के बफर में ग्वानिडिनियम थायोसाइनेट और ग्वानिडिनियम क्लोराइड होते हैं, जो हानिकारक होते हैं यदि साँस लिया जाता है या निगल लिया जाता है और त्वचा और आंखों को परेशान करता है। एसिड के साथ संपर्क बहुत विषाक्त गैस विज्ञप्ति. यदि वे त्वचा या आंखों के संपर्क में आते हैं, तो प्रचुर मात्रा में पानी से कुल्ला करें। यदि निगल लिया, प्रचुर मात्रा में पानी के साथ मुंह कुल्ला. उल्टी पैदा न करें। हमेशा चिकित्सा सलाह लेनी चाहिए।
    3. 0ण्5 एमएल ट्यूब में 120 डिग्री सेल्सियस एल्यूशन बफर (सामग्री कीसारणी) जोड़ें।
  4. HAdV और MS2 का पता लगाने अभिकर्मकों
    नोट: एक 8 अच्छी तरह से thermocycler प्रयोग किया जाता है, तो प्रत्येक पीसीआर परख में दो अलग न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रतिक्रियाओं एक साथ विश्लेषण किया जा सकता है। सभी पीसीआर परख के लिए, आणविक जीव विज्ञान पानी 1.5 एमएल ट्यूबों में aliउद्ध तैयार करते हैं.
    1. HAdV का पता लगाने
      1. 22.5 डिग्री एम एडीएफ फॉरवर्ड प्राइमर के 10 डिग्री एल, 22.5 डिग्री एम एडीआर रिवर्स प्राइमर के 10 डिग्री एल, और 11.25 डिग्री एडीपी जांच के 5 डिग्री एल (तालिका 2) युक्त मिश्रण तैयार करें।
      2. एक ट्यूब पट्टी के 1 से 8 ट्यूबों के लिए मिश्रण के 2.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. इसे कमरे के तापमान पर सूखने दें, ट्यूबों को बंद करें, और उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रखें।
      3. यह दो स्ट्रिप्स में विभाजित पट्टी कट: ट्यूब 1-5 और ट्यूब 6-8.
      4. प्रवर्धित HAdV क्षेत्र के न्यूक्लिओटाइड अनुक्रम युक्त डीएनए निलंबन के एक सीरियल तनुकरण तैयार करें। 1 x 105, 1 x 107, और 1 x 109 GC/mL ट्यूबों में 6-8 युक्त निलंबन के एयर-ड्राई 1 $L।
        नोट: प्राइमर युक्त ट्यूब रखें, जांच, और हवा सूखा निलंबन प्रकाश से सुरक्षित.
    2. MS2 का पता लगाने
      1. 25 डिग्री सेल्सियस पेक्सन-2 एफ फॉरवर्ड प्राइमर के 10 डिग्री एल, 25 डिग्री सेल्सियस पिकसन-2 आर रिवर्स प्राइमर के 10 डिग्री एल, और 25 डिग्री पीसीपी-2 जांच के 2.5 डिग्री एल युक्त मिश्रण तैयार करें (तालिका 2)।
      2. एक ट्यूब पट्टी के 1 से 8 ट्यूबों के लिए मिश्रण के 2ण्25 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। इसे कमरे के तापमान पर सूखने दें, ट्यूबों को बंद करें, और उन्हें प्रकाश से सुरक्षित रखें।
      3. यह दो स्ट्रिप्स में विभाजित पट्टी कट: ट्यूब 1-5 और ट्यूब 6-8.
      4. चरण 1.4.1.4 में के रूप में आगे बढ़ें, लेकिन इसके बजाय MS2 के लिए डिज़ाइन किया गया मानक निलंबन का उपयोग करें.

2. वायरल एकाग्रता

नोट: नमूना संग्रह, अभिकर्मक तैयारी, flocculation, flocs संग्रह, और अपशिष्ट निपटान प्रक्रियाओं के दौरान हर समय दस्ताने का प्रयोग करें। अभिकर्मक तैयारी प्रक्रिया के दौरान सुरक्षात्मक चश्मा पहनें।

  1. नमूना संग्रह
    1. एक ढक्कन के साथ एक फ्लैट नीचे बाल्टी में एक 10 एल पानी का नमूना ले लीजिए. प्रत्येक नमूने के लिए दो प्रतिकृतिकी की एक न्यूनतम ले लीजिए।
      नोट: यह स्पष्ट बाल्टी का उपयोग करने के लिए गोली कल्पना महत्वपूर्ण है. यदि पानी के नमूने में निलंबित सामग्री (जैसे, रेत, शैवाल) होता है, तो इसे तलछट दें और फिर, एक नई बाल्टी में पानी के सुपरनेंट को इकट्ठा करें।
    2. एकत्र मात्रा रजिस्टर, साथ ही स्थान और संग्रह की तारीख, प्रत्येक पानी के नमूने के लिए.
    3. एक बाल्टी समर्थन के तहत एक बैटरी से जुड़ा एक चुंबकीय उत्तेजक रखो और उसके समर्थन पर पानी के नमूने युक्त बाल्टी जगह है.
      नोट: एक ताजा जगह में एक फ्लैट सतह के लिए देखो और सीधे सूर्य के प्रकाश से पानी के नमूने युक्त बाल्टी रखने के लिए।
  2. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. पीएच समायोजन अभिकर्मक
      1. साइट्रिक एसिड पाउडर और सोडियम हाइड्रॉक्साइड छर्रों को क्रमशः 25 और 50 एमएल आसुत पानी वाले बर्तन में डालें।
      2. धीरे से हाथ से हिला जब तक साइट्रिक एसिड और सोडियम हाइड्रॉक्साइड पूरी तरह से भंग कर रहे हैं.
        चेतावनी: सोडियम हाइड्रॉक्साइड छर्रों पर पानी न डालें। इसके बजाय, पानी के ऊपर सोडियम हाइड्रॉक्साइड छर्रों डालना.
    2. प्रीफ्लोक् से सकित स्किम्ड दूध
      1. एक चुंबकीय उत्तेजक पर एक स्टैंड-अप बैग रखें और उसमें आसुत पानी के 500 एमएल डालदें। बैग के अंदर एक उत्तेजक चुंबक गिरा और चुंबकीय उत्तेजक पर बारी.
      2. एक समुद्री नमक पाउच की सामग्री और स्टैंड अप बैग में एक स्किम्ड दूध ट्यूब की सामग्री डालो और मध्यम गति से 5 मिनट के लिए हलचल उन्हें भंग करने के लिए.
      3. पीएसएम पिपेट का उपयोग करके 3 एमएल साइट्रिक एसिड जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पीएच 3.4 और 3.6 के बीच स्थित है। पीएच सूचक स्ट्रिप्स का उपयोग कर पीएसएम समाधान के पीएच को मापने। पीएच 3.5 के करीब हो जाता है के रूप में साइट्रिक एसिड और सोडियम हाइड्रॉक्साइड की छोटी मात्रा जोड़ें।
      4. चुंबकीय उत्तेजक बंद करें और सुनिश्चित करें कि flocs दिखाई दे रहे हैं. Flocs कल्पना करने में मदद करने के लिए एक टॉर्च का प्रयोग करें।
  3. फ्लोकुलेशन
    1. पानी में एक सरगर्मी चुंबक ड्रॉप, अधिकतम गति पर चुंबकीय उत्तेजक सेट, और इसे चालू करें. सुनिश्चित करें कि सरगर्मी चुंबक कताई शुरू होता है.
    2. एक प्रक्रिया नियंत्रण ट्यूब के लिए आसुत पानी के 10 एमएल जोड़ें. वायरल स्टॉक को फिर से हाइड्रेट करने और समाधान को पानी में डालने के लिए ट्यूब को कई बार उलटा करें।
    3. पानी में एक नमूना कंडीशनिंग पाउच की सामग्री डालो और 5 मिनट के लिए हलचल.
    4. पीएच सूचक स्ट्रिप्स का उपयोग कर पानी के नमूने के पीएच उपाय. पानी के नमूने में साइट्रिक एसिड या सोडियम हाइड्रॉक्साइड की कुछ बूँदें जोड़ें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पीएच 3-4 और 3.6 के बीच है। पीएच 3.5 के करीब हो जाता है के रूप में साइट्रिक एसिड और सोडियम हाइड्रॉक्साइड की छोटी मात्रा जोड़ें।
    5. 100 एमएल कंटेनर का उपयोग करके PSM समाधान का 100 एमएल जोड़ें.
    6. ढक्कन के साथ बाल्टी सील, कम से कम गति पर चुंबकीय उत्तेजक सेट, और 8 ज के लिए सरगर्मी पानी छोड़ दें.
    7. चुंबकीय उत्तेजक बंद करें और पानी अभी भी कम से कम 5 एच के लिए flocs व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए करते हैं।
  4. फ्लोक संग्रह
    1. एक पिपेट नियंत्रक, दो pipettes, और एक प्लास्टिक ट्यूब से बना एक साइफनिंग प्रणाली का निर्माण, flocs पर पानी के निर्वहन के लिए पानी supernatant aspirate करने के लिए।
      1. पिपेट नियंत्रक के लिए एक 10 एमएल टेप अंत pipette संलग्न करें। फिर, पिपेट की नोक को प्लास्टिक ट्यूब से जोड़ते हैं।
      2. एक 10 एमएल खुला टिप पिपेट के फिल्टर को हटा दें छातना का उपयोग कर और प्लास्टिक ट्यूब के लिए पिपेट देते हैं।
    2. फर्श पर एक खाली बाल्टी रखें।
    3. पानी में खुले टिप पिपेट की नोक विसर्जित कर दें। Flocs परेशान से बचने के लिए यह पानी की सतह के करीब रखने के लिए सुनिश्चित करें। पानी supernatant aspirate जब तक यह टेप अंत pipette तक पहुँचता है.
    4. टेप अंत पिपेट से जुड़े अंत से प्लास्टिक ट्यूब चुटकी और यह पिपेट से अलग.
    5. ट्यूब को खाली बाल्टी में रखें। खाली बाल्टी में पानी के प्रवाह जाने के लिए ट्यूब पर दबाव छोड़ दें।
    6. पानी के प्रवाह को रोकने के लिए प्लास्टिक ट्यूब चुटकी जब पानी के स्तर के बारे में सरगर्मी चुंबक तक पहुँचने के लिए और पाइपेट बाल्टी से दूर ले जाने के लिए है।
    7. Flocs resuspend और उन्हें एक 500 एमएल स्टैंड अप प्लास्टिक बैग में डालना करने के लिए बाल्टी हिलाओ. Flocs 1 h अधिक के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
    8. ध्यान से एक 50 एमएल पिपेट और एक मैनुअल पिपेट नियंत्रक का उपयोग कर पानी supernatant aspirate, flocs परेशान से बचने.
    9. एक 100 एमएल पिपेट का उपयोग कर flocs aspirate और उन्हें एक 50 एमएल स्नातक centrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण. नमूना ध्यान केंद्रित की अंतिम मात्रा नीचे नोट और एक 5 एमएल परिरक्षक समाधान युक्त ट्यूब के लिए यह की 1 एमएल हस्तांतरण, एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर.
      नोट: यह महत्वपूर्ण है कि अपकेंद्रित्र ट्यूब स्नातक की उपाधि प्राप्त है तो केंद्रित नमूना के अंतिम मात्रा के रूप में सही रूप में संभव है और पंजीकृत मापा जा सकता है.
    10. क्षेत्र में न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रदर्शन. वैकल्पिक रूप से, 15 दिनों के लिए 20-30 डिग्री सेल्सियस पर वायरस युक्त परिरक्षक समाधान की दुकान या उन्हें आगे के विश्लेषण के लिए एक संदर्भ प्रयोगशाला में जहाज.
  5. अपशिष्ट निपटान और सामग्री पुन: उपयोग
    1. फेंके गए पानी युक्त बाल्टी के लिए एक तटस्थ एजेंट पाउच की सामग्री जोड़ें। पानी मिक्स, और फिर, यह अभी भी 30 मिनट के लिए छोड़ दें.
    2. उपचारित जल को सामान्य अपशिष्ट के रूप में निपटान करें।
    3. बाल्टी के अंदर पिपेट और प्लास्टिक ट्यूब रखें। पानी के साथ बाल्टी भरें और एक तटस्थ एजेंट पाउच की सामग्री में डालना।
    4. उन्हें कम से कम 30 मिनट के लिए धो उन्हें बाँझ और उन्हें प्रचुर मात्रा में साफ पानी के साथ कुल्ला किसी भी शेष तटस्थ एजेंट को दूर करने के लिए.

3. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण

नोट: दस्ताने का प्रयोग करें और हमेशा न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान सुरक्षात्मक चश्मा पहनते हैं।

  1. चुंबकीय पिपेट संक्रिया
    1. निष्कर्षण करने से पहले चुंबकीय पिपेट के संचालन से परिचित हो जाओ।
  2. न्यूक्लिक अम्ल निष्कर्षण
    1. एक रैक में निष्कर्षण के लिए आवश्यक अभिकर्मकों युक्त ट्यूबों की व्यवस्था, बाएँ से दाएँ: बाध्यकारी बफर, धोने बफ़र्स, और elution बफर. नमूनों की संख्या के अनुसार ट्यूबों की उचित संख्या निर्धारित करें या विश्लेषण किया जा रहा प्रतिकृति.
    2. स्थानांतरण 1 एमएल नमूना बाइंडिंग बफर युक्त ट्यूब पर ध्यान केंद्रित, एक डिस्पोजेबल पाश्चर पिपेट का उपयोग कर. समाधान homogenize करने के लिए ट्यूब 8x से 10x उलटा।
    3. लगातार मिश्रण करते समय 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान इनक्यूबेट करें, या तो एक सौर संचालित कक्षीय या मैन्युअल रूप से उपयोग कर।
    4. चुंबकीय पिपेट और एक साफ टिप है, जो तीन धोने बफ़र्स के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता का उपयोग चुंबकीय कणों ले लीजिए।
    5. बफर 1 धोने के 500 डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूब में चुंबकीय कणों को छोड़ें। धीरे 30 s के लिए टिप के साथ समाधान मिलाते हुए उन्हें धो लें और उन्हें इकट्ठा.
    6. बफर 2 धोने के 600 डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूब के लिए चुंबकीय कणों स्थानांतरण। धीरे 30 s के लिए टिप के साथ समाधान मिलाते हुए उन्हें धो लें और उन्हें इकट्ठा.
    7. बफर 3 धोने के 200 डिग्री सेल्सियस युक्त ट्यूब के लिए चुंबकीय कणों स्थानांतरण। धीरे 30 s के लिए टिप के साथ समाधान मिलाते हुए उन्हें धो लें और उन्हें इकट्ठा.
    8. Elution बफर युक्त ट्यूब में चुंबकीय कणों रिलीज और टिप छोड़ दें।
    9. सौर-संचालित कक्षीय का उपयोग करते हुए लगातार मिश्रण करते हुए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
      नोट: elution बफर में चुंबकीय कणों मिश्रण एक महत्वपूर्ण कदम है. कक्षक की कमी के मामले में, ऊष्मायन समय के दौरान हाथ से लगातार मिश्रण।
    10. एक नया एक द्वारा चुंबकीय पिपेट पर टिप बदलें और elution बफर से चुंबकीय कणों को इकट्ठा। वे आणविक पता लगाने के तरीकों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के बाद से पूरी तरह से elution बफर से चुंबकीय कणों को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें.
    11. इससे जुड़े कणों के साथ टिप को छोड़ दें। पीसीआर विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें, एक संदर्भ प्रयोगशाला के लिए elution बफर जहाज, या आगे के विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में elution बफर की दुकान.

4. एक बैटरी संचालित आठ ट्यूब वास्तविक समय thermocycler के साथ वायरल का पता लगाने

नोट: दस्ताने का प्रयोग करें और हमेशा न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया के दौरान सुरक्षात्मक चश्मा पहनते हैं। पार संदूषण से बचने के लिए एक नया पीसीआर प्रयोग प्रदर्शन करते समय नए लोगों के लिए दस्ताने बदलें।

  1. HAdV मात्रात्मक पीसीआर
    1. ट्यूब 2, 4, और 5 के लिए nuclease मुक्त पानी के 14 डिग्री एल जोड़ें.
    2. ट्यूब 1-5 के लिए पीसीआर मिश्रण के 4 डिग्री एल जोड़ें।
    3. नमूने A से ट्यूब 1 और 14 डिग्री एल के लिए नमूना बी से ट्यूब 3 के लिए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के 14 डिग्री एल जोड़ें।
    4. नमूना A से ट्यूब 2 और 2 डिग्री सेल्सियस से ट्यूब 4 के लिए निकाले गए न्यूक्लिक एसिड के 2 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। पांच-ट्यूब पट्टी बंद करें.
    5. ट्यूब 6, 7, और 8 में न्यूक्लिएस-मुक्त जल का 14 डिग्री सेल्सियस जोड़ें।
    6. ट्यूब 6, 7, और 8 के लिए इस मिश्रण के 4 डिग्री एल जोड़ें, और उन्हें बंद करो.
    7. दोनों स्ट्रिप्स को थर्मोसाइकिलर में रखिए और उपयुक्त रन (सारणी3) का चयन करें।
    8. पानी की नली को छोड़ दें और निकाले गए न्यूक्लिक एसिड को फ्रीजर में रखें, यदि संभव हो तो, या यदि नहीं, तो एक दूसरे परीक्षण के मामले में प्रकाश से सुरक्षित ताजा जगह में।
    9. micropipettes साफ, रैक, काम कर रहे सामग्री, और सभी सामग्री ठीक से एक न्यूक्लिक एसिड क्लीनर के साथ, और इस्तेमाल किया टिप युक्त प्लास्टिक बैग, दस्ताने, और ट्यूबों को त्यागें.
      चेतावनी: न्यूक्लिक एसिड पदच्युत एक बहुत ज्वलनशील तरल और भाप है. स्प्रे धुंध में सांस न लें और आंखों या त्वचा के साथ तरल के किसी भी संपर्क से बचें। अन्यथा, तुरंत प्रचुर मात्रा में पानी से कुल्ला और चिकित्सा सलाह लेनी.
    10. परिणाम ले लीजिए और प्राप्त डेटा का विश्लेषण.
  2. MS2 मात्रात्मक पीसीआर
    1. ट्यूब 2, 4, और 5 के लिए nuclease मुक्त पानी के 14 डिग्री एल जोड़ें.
    2. पीसीआर मिश्रण के 4 डिग्री सेल्सियस और ट्यूब 1-5 के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्सेज एंजाइम के 0.5 डिग्री एल जोड़ें।
    3. नमूने A से ट्यूब 1 और 14 डिग्री एल के लिए नमूना बी से ट्यूब 3 के लिए न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के 14 डिग्री एल जोड़ें।
    4. नमूना A से ट्यूब 2 और 1 डिग्री एल से ट्यूब 4 के लिए निकाले गए न्यूक्लिक एसिड के 1 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। पांच-ट्यूब पट्टी बंद करें.
    5. ट्यूब 5, 6, 7, और 8 के लिए nuclease मुक्त पानी के 15.5 $L जोड़ें, और उन्हें बंद करो.
    6. पीसीआर मिश्रण के 4 डिग्री सेल्सियस और रिवर्स ट्रांसक्रिप्सेज एंजाइम के 0.5 डिग्री एल को ट्यूब 6, 7 और 8 में जोड़ें।
    7. दोनों स्ट्रिप्स को थर्मोसाइकिलर में रखिए और उपयुक्त रन (सारणी3) का चयन करें।
    8. चरण 4.1.8 से 4.1.10 में वर्णित के रूप में आगे बढ़ें।

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Representative Results

विधि विकास

इस प्रक्रिया को जेनआईयूएल और ऑक्सफैम इन्टरमन के सहयोग से जल और खाद्य के वायरस संदूषकों की प्रयोगशाला में विकसित किया गया है। यह तीन अलग अलग चरणों के शामिल हैं. पहले एक, वायरल कण एकाग्रता, एक स्किम्ड दूध flocculation विधि का एक अनुकूलन है पहले12,17,18वर्णित . मूल विधि एक बिजली की आपूर्ति से स्वतंत्र होने के रूप में संशोधित किया गया था, सरल, और centrifugation कदम के बिना.

VirWaTest एकाग्रता विधि की वसूली HAdV और MS2 बैक्टीरियोफेज-spiked भूजल नमूनों में परीक्षण किया गया था. VirWaTest एकाग्रता और निष्कर्षण विधि के वायरल वसूली के लिए 3.01% MS2 के लिए 18.02% और 17.52% करने के लिए 44.22% HAdV के लिए होने का अनुमान था. इन वसूली इन वायरल स्टॉक के ज्ञात सांद्रता के साथ उन्हें spiking के बाद पानी के नमूनों में HAdV और MS2 के प्रारंभिक सांद्रता की तुलना में विधि के विकास के दौरान मात्रात्मक पीसीआर द्वारा प्राप्त मूल्यों से गणना की गई.

VirWaTest चुंबकीय न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण एक वाणिज्यिक आरएनए मिनी किट (उदाहरण के लिए, QIAamp वायरल आरएनए मिनी किट), एक स्तंभ आधारित निष्कर्षण विधि प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया, 33 नदी और भूजल नमूने HAdV और MS2 और केंद्रित के साथ spiked परीक्षण द्वारा की तुलना में किया गया था स्किम्ड मिल्क फ्लैक्कुलेशन द्वारा। तुलना परिणामों से पता चला है कि VirWaTest विधि वसूली HAdV के लिए 23/33 मामलों में अधिक था, साथ ही MS2 के लिए (तालिका 4). एक Wilcoxon परीक्षण HAdV के लिए 0.0005569 के p-values और MS2 के लिए 0.02791 दिखाया. VirWaTest न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण वाणिज्यिक एक की तुलना में काफी अधिक वायरल वसूली प्रदान करता है।

VirWaTest विधि द्वारा केंद्रित पर्यावरण पानी के नमूनों में HAdV की जांच

क्षेत्र में वायरल एकाग्रता के लिए विकसित विधि का परीक्षण करने के लिए, Oxfam पानी, स्वच्छता और स्वच्छता (वाश) टीम, मार्च 2017 में बंगी (आरसीए) में स्थित, एकत्र और पांच अच्छी तरह से पानी के नमूने से वायरस केंद्रित.

इसके अलावा, Pedernales (Ecuador) के क्षेत्र में, जो 2016 और 2017 में भूकंप से प्रभावित था, छह अच्छी तरह से पानी के नमूने फरवरी 2017 में एक Oxfam वाश टीम द्वारा एकत्र किए गए थे, और इसके वायरस VirWaTest एकाग्रता विधि द्वारा केंद्रित थे. वायरल दोनों सेटिंग्स से ध्यान केंद्रित VirWaTest न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और वायरल परिमाणीकरण के लिए बार्सिलोना में प्रयोगशाला के लिए भेजा गया था।

इक्वाडोर में, स्वाभाविक रूप से होने वाली HAdV विश्लेषण छह नमूनों में से छह में पाया गया, एकाग्रता मान के साथ 3.27 x 101 से 1.80 x 102 GC/L को लेकर, जबकि पांच नमूनों में से एक एकत्र और Banghi में केंद्रित (आरसीए) परीक्षण किया HAdV के लिए सकारात्मक, 3.46 x 102 GC/L की सांद्रता पर (तालिका 5)।

MS2, आंतरिक प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में सभी परीक्षण नमूनों में जोड़ा, सभी नमूनों का परीक्षण में पाया गया, दिखा रहा है कि विधि सही ढंग से एकाग्रता से पता लगाने के लिए किया गया था.

Figure 1
चित्र 1 : VirWaTest विधि. VirWaTest विधि से बना है चरणों का ओवरव्यू। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सामग्री एकाग्रता न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण डिटेक्शन
उपकरण चुंबकीय स्टरर (2 यूनिट)
बैटरी (2 यूनिट)
बैटरी/स्टर कनेक्टर्स (2 यूनिट)
पावर एडाप्टर (2 यूनिट)
बाल्टी समर्थन (2 इकाइयों)
रस्सी (1 यूनिट)
स्टर्लिंग चुंबक (3 इकाइयों)
टवियों (1 यूनिट)
सिलिकॉन ट्यूबिंग (1 यूनिट)
पिपेट नियंत्रक (1 यूनिट)
मार्कर (1 यूनिट)		 चुंबकीय पिपेट (1 यूनिट)
सौर रोटरी प्लेटफार्म (1 यूनिट)
मल्टी आकार ट्यूब रैक (1 यूनिट)
टाइमर (1 यूनिट)		 थर्मोसाइकिलर (1 यूनिट)
बैटरी (1 यूनिट)
कंप्यूटर
ट्यूब रैक (1 यूनिट)
0.5 जेडएल - 10 डिग्री एल माइक्रोपिपेट (1 यूनिट)
2 $L - 20 डिग्री एल माइक्रोपिपेट (1 यूनिट)
उपभोग्य और अभिकर्मकों (हर 2 पानी के नमूने के लिए / बाल्टी (3 यूनिट)
पीएच संकेतक स्ट्रिप्स
टेप-एंड 10 एमएल पिपेट (2 यूनिट)
ओपन-टिप 10 एमएल पिपेट (2 यूनिट)
टेप-एंड 50 एमएल पिपेट (2 यूनिट)
टेप-एंड 100 एमएल पिपेट (2 यूनिट)
पास्चर पिपेट (4 यूनिट)
स्टैंड-अप प्लास्टिक बैग (4 इकाइयों)
25 एमएल आसुत जल के साथ प्लास्टिक कंटेनर (1 यूनिट)
50 एमएल आसुत जल के साथ प्लास्टिक कंटेनर (1 यूनिट)
100 एमएल खाली कंटेनर (1 यूनिट)
दस्ताने (6 जोड़े)
प्रक्रिया नियंत्रण (2 ट्यूब)
आसुत पानी के 10 एमएल के साथ ट्यूब (2 इकाइयों)
साइट्रिक एसिड (1 ट्यूब)
सोडियम हाइड्रोक्साइड (1 ट्यूब)
स्किम्ड दूध (1 ट्यूब)
साइट्रिक एसिड साकेत (1 यूनिट)
आसुत जल (1 500 एमएल बोतल)
नमूना कंडीशनिंग (2 पाउच)
संरक्षक समाधान (2 ट्यूब)
एजेंट को निष्क्रिय करना (4 पाउच)		 चुंबकीय पिपेट युक्तियाँ (2 इकाइयों)
पास्चर पिपेट (2 यूनिट)
बंधन बफर (2 ट्यूब)
कपड़े धोने बफर 1 (2 ट्यूब)
कपड़े धोने बफर 2 (2 ट्यूब)
कपड़े धोने बफर 3 (2 ट्यूब)
Elution बफर (2 ट्यूब)
दस्ताने (6 जोड़े)		 10 $L माइक्रोपिपेट टिप्स (1 बॉक्स)
20 डिग्री एल माइक्रोपिपेट टिप्स (1 बॉक्स)
डीएनए क्षपीसीआर मिक्स (1 ट्यूब)
आरएनए क्यूपीसीआर मिक्स (1 ट्यूब)
रिवर्स ट्रांसस्क्रिप्टेस एंजाइम (1 ट्यूब)
आण्विक जीव विज्ञान पानी (1 ट्यूब)
प्राइमर, जांच और मानक (1 यूनिट) के साथ HAdV ट्यूब पट्टी
प्राइमर, जांच और मानक (1 यूनिट) के साथ MS2 ट्यूब पट्टी
न्यूक्लिक एसिड हटानेवाला
दस्ताने (6 जोड़े)

तालिका 1: VirWaTest सामग्री। उपकरण, उपभोग्य सामग्रियों, और अभिकर्मकों कि एकाग्रता, निष्कर्षण, और दो पानी के नमूनों में वायरस का पता लगाने के लिए तैयार किया जाना है /

वायरस प्राइमरों Genbank प्रवेश नहीं स्थिति अनुक्रम (5'u20123') लंबाई संदर्भ
मानव एडेनोवायरस (एचएडीवी) Adf J01917.1 18869$u201218887 CWTACATGCACATCKCSGG 19 हेर्नरोथ एट अल., 200215
एडीआर 18919$u201218937 सी.आर.सी.जी.जी.सी.आर.ए.आर.ए.टी.जी.सी.ए.सी.ए. 19
AdP1 18890$u201218916 6-FAM-CCGGGCTCAGACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 27
MS2 बैक्टीरियोफेज (MS2) पेक्सन-2 एफ एनसीजेड 001417.2 344$u2012363 AAGGTGCCTACAGCGAAGT 20 Pecson एट अल,200916
पेक्सन-2 आर 659$u2012678 TTCGTTTAGGGCATAGC 20
पीसीपी-2 369$u2012388 6-FAM-ATCGTGGGTCGCGTACG-BHQ-1 20

तालिका 2: मात्रात्मक पीसीआर प्रयोगों के लिए Oligonucleotides. प्राइमर और जांच HAdV और MS2 के न्यूक्लिक एसिड दृश्यों के लिए बाध्य करने के लिए डिज़ाइन किया गया।

तापमान समय चक्र तापमान समय चक्र
95 डिग्री सेल्सियस 12 मिनट 1 55 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट 1
95 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट 1
95 डिग्री सेल्सियस 15 एस 40 95 डिग्री सेल्सियस 15 एस 40
60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट 60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट

तालिका 3: मात्रात्मक पीसीआर प्रयोगों के लिए थर्मल की स्थिति. तापमान, समय, और चक्र HAdV और MS2 प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया.

QIAgen वीरवाटेस्ट QIAgen वीरवाटेस्ट
औसत 2.53 x 103 2.43 x 103 4.74 x 104 5.13 x 104
मतलब 1.74 x 104 3.12 x 104 4.24 x 104 5.97 x 104
एसडी 5.66 x 105 2.23 x 106 4.49 x 104 1.63 x 105
p-मान (विलकॉक्सन) HAdV के लिए: 0.0005569
पी-मान (विलकॉक्सन) MS2 के लिए: 0.02791
वायरस का परीक्षण किया नमूनों की जांच की QIAgen वीरवा टेस्ट
HAdv 33 10 23
एमएस 2 33 10 23

तालिका 4: VirWaTest न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण विकास. Median, मतलब है, और एसडी मूल्यों प्राप्त जब HAdV और MS2 के लिए 33 भूजल नमूनों में Qiagen और VirWaTest निष्कर्षण तरीकों की तुलना.

देश साइट नमूना एचएडीवी जीसी/
आरसीए एउ डे ला सोडेका 1 एन डी
Ile Bongossoua, गांव 1 २ एन डी
Ile Bongossoua, गांव 3 3 एन डी
बंगुई, प्यूट्स क्वार्टियर फोन्दो 4 एन डी
बंगुई, प्यूट्स क्वार्टियर याम्बासा 5 3.64 x 102
इक्वेडोर बोरहोल ए 6 7.96 x 101
बोरहोल बी 7 1.80 x 102
बोरहोल सी 8 8.88 x 101
अच्छी तरह से पानी एक 9 6.06 x 101
अच्छी तरह से पानी बी 10 1.12 x 102
अच्छी तरह से पानी सी 11 3.27 x 101

तालिका 5: VirWaTest विधि का उपयोग कर HAdV की मात्रा. मात्रात्मक पीसीआर परिणाम, जीसी/लीटर में व्यक्त, HAdV के लिए एकत्र पानी के नमूनों में मात्रा निर्धारित और आरसीए और इक्वाडोर से ध्यान केंद्रित.

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Discussion

VirWaTest विधि गैर अनुभवी उपयोगकर्ताओं द्वारा उपयोग के बिंदु पर पानी के नमूनों से वायरस और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की एकाग्रता सक्षम बनाता है। यह एक सस्ती, तेजी से, और सरल प्रोटोकॉल है. एकाग्रता स्किम्ड दूध का उपयोग करके कार्बनिक फ्लोकेशन के सिद्धांत पर आधारित है, जिसके द्वारा कम पीएच और उच्च चालकता की स्थिति स्किम्ड दूध प्रोटीन को फ्लैक्स में वायरस एसोर्ब में समुच्चय बनाती है। जब flocs तलछट, यह उन्हें इकट्ठा करने के लिए आसान है, यह संभव 10 एल पानी के ध्यान केंद्रित करने के लिए, जबकि पारंपरिक ultracentrifugation बड़े पानी की मात्रा के साथ सौदा नहीं कर सकते.

विधि एक बैटरी संचालित चुंबकीय stirer के अलावा किसी भी बिजली के उपकरणों का उपयोग किए बिना नमूने के बिंदु पर व्यावहारिक होने के लिए संशोधित किया गया है. पानी निस्पंदन पर आधारित कुछ अन्य दृष्टिकोण वायरस की एकाग्रता के लिए अनुकूलित किया गया है और यह भी उपयोग के बिंदु पर किया जा सकता है. हालांकि, पानी के नमूनों में मौजूद निलंबित सामग्री अक्सर फिल्टर को रोकदेती है; इस प्रकार, छोटे मात्रा है कि इन प्रणालियों के साथ ध्यान केंद्रित किया जा सकता है एक गंभीर सीमा है.

यह उपयोग के बिंदु पर पानी के नमूनों से वायरस ध्यान केंद्रित करने के लिए एक विधि का पहला वर्णन है, नमूना की turbidity की परवाह किए बिना. VirWaTest एकाग्रता विधि कई नमूने एक साथ संसाधित किया जा करने के लिए यदि उपयुक्त सामग्री उपलब्ध है की अनुमति देता है. इसके अलावा स्किम्ड मिल्क फ्लोकेलेशन बैक्टीरिया और परजीवी सांद्रता19के लिए उपयोगी दिखाया गया है।

प्रक्रिया को ठीक से करने के लिए उपयुक्त सामग्री की तैयारी महत्वपूर्ण है। पानी के नमूनों की संख्या का विश्लेषण किया जा करने के लिए और जगह है जहाँ परीक्षण अभिकर्मकों और सामग्री की तैयारी के लिए आवश्यक है पर जाने से पहले अभिकर्मकों और सामग्री तैयार करने पर विचार करें। सामग्री की उचित मात्रा में उपलब्ध है, तो एक ही समय में कई नमूने संसाधित किया जा सकता है।

एक पानी के नमूने की एकाग्रता शुरू करने से पहले, एक वायरल स्टॉक के एक ज्ञात एकाग्रता प्रक्रिया नियंत्रण के रूप में नमूना स्पाइक करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। इस विधि का उपयोग करता है एक सूखे वायरल स्टॉक जो उपयोग के बिंदु पर पानी के नमूने में जोड़ा जा रहा से पहले आसुत पानी के साथ rehydrated है. यह प्रक्रिया के अंत में गलत-नकारात्मक परिणामों को खारिज करने के लिए उपयोगी है और विधि के प्रदर्शन का संकेत देता है।

वायरल VirWaTest के साथ प्राप्त ध्यान केंद्रित आगे VirWaTest न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और पता लगाने के तरीकों को लागू करने के क्षेत्र में परीक्षण किया जा सकता है या, वैकल्पिक रूप से, ध्यान केंद्रित कमरे के तापमान पर एक संदर्भ प्रयोगशाला के लिए भेजा जा सकता है. ध्यान केंद्रित करने के लिए जोड़ा परिरक्षक समाधान वायरस अप करने के लिए स्थिर रहने के लिए सक्षम बनाता है 2 सप्ताह (अप्रकाशित परिणाम).

VirWaTest न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण एक चुंबकीय कण आधारित विधि है. यह आसान और तेजी से है और कई नमूने एक ही समय में संसाधित किया जा करने के लिए अनुमति देता है और वर्तमान में वायरल न्यूक्लिक एसिड extractions के लिए इस्तेमाल किया तरीकों की तुलना में बराबर और भी बेहतर वसूली दक्षता से पता चलता है. न्यूक्लिक एसिड कमरे के तापमान पर संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए भेजा जा सकता है या, यदि उपयोगकर्ताओं को आणविक पता लगाने के प्रदर्शन में विश्वास कर रहे हैं, एक मात्रात्मक पीसीआर परख मूल पानी के नमूने के उपयोग के बिंदु पर किया जा सकता है.

इसके अलावा, अगर एक छोटी सी प्रयोगशाला की सुविधा उपलब्ध है, VirWaTest एकाग्रता प्रोटोकॉल मानक न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण किट है कि एक centrifuge और मानक पीसीआर आधारित तरीकों है कि एक फ्रीजर की आवश्यकता पर निर्भर अभिकर्मकों को बनाए रखने के लिए लेकिन है कि उपयोग करने के लिए युग्मित किया जा सकता है मानक थर्मोसाइकिलर्स, जो बैटरी संचालित लोगों की तुलना में कम महंगे हैं।

हालांकि, के बाद से एक बिजली की आपूर्ति कभी कभी उपलब्ध नहीं है, हम प्रक्रिया नियंत्रण और एक वायरल मल सूचक के रूप में HAdV के रूप में MS2 बैक्टीरियोफेज के लिए पता लगाने assays अनुकूलित है, और पद्धति ब्याज के किसी भी अन्य वायरस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे हेपेटाइटिस वायरस, RoV, NoV, या दूसरों, अभिकर्मकों के रखरखाव के लिए एक फ्रीजर की जरूरत के बिना क्षेत्र में चलाने के लिए, और न ही पारंपरिक thermocyclers लेकिन केवल एक बैटरी संचालित एक. कई बैटरी चालित थर्मोसाइकिलर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। वैकल्पिक रूप से, यदि एक बिजली की आपूर्ति उपलब्ध है, अन्य पारंपरिक QPCR उपकरण इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि एक आठ ट्यूब thermocycler प्रयोग किया जाता है, अप करने के लिए दो न्यूक्लिक एसिड extractions (दो अलग नमूने या दो एक ही नमूने से प्रतिकृति) एक ही पीसीआर परख में परीक्षण किया जा सकता है. प्रत्येक न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के लिए, दो अलग अलग मात्रा में नमूने द्वारा उत्पन्न एंजाइमी निषेध बाहर शासन करने के लिए परीक्षण किया जाएगा. अनुकूलन हवा सुखाने प्राइमर, जांच, और मानक निलंबन द्वारा पीसीआर ट्यूबों की पिछली तैयारी पर आधारित है। कई lyophilized वाणिज्यिक QPCR समाधान मौजूद है कि यहाँ वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया को लागू करने से इस्तेमाल किया जा सकता है. हम एक संभावना है कि हम करने के लिए आसान प्रदर्शन करने के लिए माना जाता है का वर्णन किया है.

तुलना कार्य विधि के विकास के दौरान प्रदर्शन से पता चला कि एकाग्रता के VirWaTest तरीकों, निष्कर्षण, और पता लगाने के पानी के नमूनों में वायरस के परिमाणीकरण के लिए कुशल हैं.

पता लगाना (LOD) वर्णित प्रक्रिया की सीमा चर है क्योंकि मात्रा एकाग्रता चर है के बाद एकत्र की गई है। इसके अलावा, लोड अलग वायरस के लिए थोड़ा अलग हो सकता है. लगभग 10 एल की एक मात्रा एकत्र की है, तो HAdV के लिए LOD लगभग 1 x 102 वायरल GC/ तो, HAdV के अपेक्षाकृत छोटे सांद्रता VirWaTest विधि द्वारा पता लगाया जा सकता है. Pedernales (Ecuador) में, छह नमूनों में से छह प्रस्तुत HAdV, LOD के करीब सांद्रता में, 3.27 x 101 से 1.80 x 102 GC/ बंगी (आरसीए) में, एचएडीवी का विश्लेषण किए गए पांच नमूनों में से एक में 3.46 x 102 जीसी/एल की सांद्रता में पाया गया। HAdV की उपस्थिति, साथ ही परीक्षण के नमूनों में नियंत्रण प्रक्रिया के रूप में MS2 की उपस्थिति, विधि से पता चलता है पानी के नमूने से वायरल कणों की वसूली के लिए उपयोगी है, यहां तक कि जब nonexperienced उपयोगकर्ताओं द्वारा प्रदर्शन किया.

अब तक प्राप्त प्रतिक्रिया इंगित करता है कि वायरल एकाग्रता प्रदर्शन करने के लिए एक आसान प्रक्रिया है, कोई बड़ी समस्याओं के साथ जब नमूने के उपयोग के बिंदु पर लागू किया जाता है, हालांकि 8 एच और 5 एच कदम की आवश्यकता होती है। यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि ये चरण किसी भी मानवीय सहायता के बिना होते हैं। इसके अलावा, निस्पंदन पर आधारित एक तेजी से विधि nonturbid पानी के लिए एक विकल्प के रूप में विकसित किया जा रहा है. हालांकि, flocculation लगता है, अब तक, अद्वितीय विधि है कि उच्च turbidity पेश नमूनों की एकाग्रता की अनुमति देता है. वायरल ध्यान केंद्रित तो कमरे के तापमान पर दुनिया भर में किसी भी प्रयोगशाला के लिए भेजा जा सकता है, जो भी यह आसान वायरस का परीक्षण करने के लिए बनाता है के बाद से नमूना क्षेत्रों हमेशा अच्छा परिवहन सेवाओं ठंडा शर्तों प्रदान नहीं है. वैकल्पिक रूप से, निष्कर्षण और पता लगाने प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत नमूने के उपयोग के बिंदु पर वायरल का पता लगाने के लिए परीक्षण की अनुमति देते हैं.

जहाँ तक हम जानते हैं, यह पहली विधि के लिए एकाग्रता और क्षेत्र में पानी के नमूनों में वायरस की उपस्थिति के लिए परीक्षण के लिए उपयोगी होने की सूचना दी है. इसके अलावा कई अन्य मानवीय संकट परिदृश्यों में रुचि के मानव वायरल रोगजनकों की उपस्थिति के मूल्यांकन के लिए प्रक्रिया को लागू करने के लिए प्रयास किए जाने चाहिए। इसके अलावा, उपयोगकर्ता की प्रतिक्रिया प्रक्रिया friendlier बनाने के लिए संभावित कार्यान्वयन में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

VirWaTest ELHRA (मानवीय सहायता के लिए सीखने और अनुसंधान बढ़ाने) के HIF (मानवतावादी अभिनव कोष) कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित एक अनुसंधान परियोजना थी। लेखक इस अध्ययन में सहयोग करने वाली वाश टीमों को स्वीकार करते हैं। इक्वाडोर में नमूनों के विश्लेषण Oxfam इक्वाडोर और Direccien डे Investigaciones डे ला Universidad डे लास अमेरिका (एएमबी) द्वारा वित्त पोषित किया गया. BRT.17.01. एस Bofill-मास बार्सिलोना विश्वविद्यालय में एक Serra-Hunter साथी है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) Solis BioDyne 08-14-00001 Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions
8-Microtube Strips with Caps dD Biolab 840637 Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR
Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer GenIUL 900011674 Includes 12V car power adapter
Bucket Support GenIUL 900011648 Aluminium support
Bucket, 10 L Cater4You 10LTR Polypropilene, Tamperproof, Clear color
Centrifuge Tube, 50 mL LabBox CTSP-E50-050 Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt
Citric Acid 1-Hydrate, 500 g PanReac AppliChem 1410181211 Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram
Clear PET Bottle LabBox FPET-500-088 Clear Color, PET, Cap Not Included
Difco Skim Milk, 500 g Becton Dickinson 232100 Dehydrated
DNA/RNA Shield, 250 mL Zymo Research R1100-250 DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL
Easy9 Pipette Controller LabBox EAS9-001-001 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder
Eppendorf Tube, 0.5 mL Eppendorf 0030121023 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 2 mL Eppendorf 0030120094 Polypropilene, Safe-Lock
Eppendorf Tube, 5 mL dD Biolab 999542 Polypropylene, Sterile, Graduated
Ethanol 96% V/V, 1 L Panreac AppliChem 361085-1611 For UV, IR  and HPLC
Laboratory Tweezers LabBox FORS-007-002 Thin, Curved End, L= 120 mm
Magnetic Stirrer GenIUL 900017000 Battery-powered
Marker dD Biolab 929203 Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware
Micro Rota-Rack for Microtubes dD Biolab 37782 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm
Mini8 Real-Time PCR Cycler Coyote Biosciences, China Mini-8 Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes
NucliSens Lysis Buffer Biomerieux 200292 Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature
Open Tip Serological Pipette, 10 mL Deltalab 900136N Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
PE Screw Cap PP28 LabBox TP28-004-020 For PET Bottles
pH Indicator Strip LabBox WSPH-001-001 Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack
Plastic Test Tube Quimikals 300913 Includes Cap
Polyethylene Pasteur Pipette LabBox PIPP-003-500 Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL Deltalab 409726 Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL
Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL Deltalab 409526G Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL
Powder Powder Detergent - - Regular Powder Soap for washing clothes
Power Cables for Magnetic Stirrer GenIUL 900011692 Connection between batteries and magnetic stirrers
QuickPick Magnetic Tool BioNobile 24001 Hand-held tool for magnetic particles
QuickPick Tips in Box BioNobile 24296 RNase-Free, Autoclaved, 96 Units
QuickPick XL gDNA Magnetic Particles BioNobile SN51100 3.2 mL
Sea Salts Sigma-Aldrich S9883-500G An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water
Silicone Tubing LabBox SILT-006-005 Roll of 5 Meters, Inner  ø x Outer  ø= 6 x 10 mm
Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% VWR Chemicals 28244295 Pellets, 1 Kg
Solar Rotary Platform SOL-EXPERT Group 70020 Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams
SOLIScript 1-step Probe Kit Solis BioDyne 08-57-00250 Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions
SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit BioTools 21.141-4197 Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer).
SpinBar Octhaedral Stirring Magnet dD Biolab 045926 Pivot Ring, L x  ø = 38 x 8 mm, Blue
Tape-End Serological Pipette, 10 mL Deltalab PN10E1 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Tape-End Serological Pipette, 50 mL Deltalab 900043 Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic)
Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover BioTools 22001-4291 Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL
Water Molecular Biology Reagent, 1L Sigma-Aldrich W4502-1L Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered
Whirl-Pak Bag, 540 mL Deltalab 200361 Stable bottom
Zip Lock Plain Bag LabBox BZIP-080-100 Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm

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References

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VirWaTest, पानी के नमूनों में वायरस की जांच के लिए एक बिंदु के उपयोग विधि
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Aguado, D., Fores, E., Guerrero-Latorre, L., Rusiñol, M., Martínez-Puchol, S., Codony, F., Girones, R., Bofill-Mas, S. VirWaTest, A Point-of-Use Method for the Detection of Viruses in Water Samples. J. Vis. Exp. (147), e59463, doi:10.3791/59463 (2019).

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