Summary
ここでは、使用時点での水サンプルからのウイルスの濃度と検出のためのシンプルで手頃な価格でポータブルな方法であるVirWaTestを紹介します。
Abstract
人間や動物によって排泄されるウイルスは、水源を汚染し、この水を飲み物、食品灌漑、洗濯などに使用すると、人間の健康に危険をもたらす可能性があります。古典的な大腿菌の指標は、常にウイルス病原体の存在をチェックしないので、ウイルス病原体とウイルス指標の検出は、特に人道的なシナリオや地域でリスク軽減の対策を採用するために関連しています水媒介ウイルスの発生が頻繁に発生する場所。
現在、フェカル指標細菌(FIB)の定量を可能にするいくつかの市販試験が、使用時点での試験に利用可能である。しかし、このような商用テストは、ウイルスの検出には利用できません。環境水サンプル中のウイルスの検出には、数リットルを少量に濃縮する必要があります。さらに、いったん濃縮されると、ウイルスの検出は、ウイルスゲノムの核酸抽出および分子検出(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]ベースのアッセイ)などの方法に依存する。
ここで説明する方法は、10L水サンプルからのウイルスの濃度、ならびに使用時点でのウイルス核酸の抽出を、シンプルで携帯可能な装置と可能にする。これにより、複数のウイルスの使用時点での水サンプルの検査が可能になり、人道的なシナリオや、設備の整った実験室が利用できない状況で役立ちます。あるいは、この方法は、水サンプルに存在するウイルスを濃縮し、さらに分析するために室温で実験室に濃縮物を輸送することを可能にする。
Introduction
人道的緊急事態の最初の段階では、被災者の生存のためには、清潔な水の供給、衛生、衛生へのアクセスが不可欠です。したがって、水質の監視は、水媒介性の発生を防ぐための優先事項です。汚染水が病気の原因になることはよく知られていますが、従来の実験法が利用できる場合でも、E型肝炎ウイルス(HEV)などのウイルス発生源を特定することは困難です。水質の制御は、FIB1、2、3、4の定量に基づいています。しかしながら、FIBの不在とロタウイルス(RoV)、ノロウイルス(NoV)、またはHEV5、6などのウイルス水媒介病原体の存在との間に相関関係がないことが広範囲に文書化されている。したがって、FIBに基づく水質基準を使用すると、水媒介性ウイルス病原体の存在に関連するリスクを過小評価する可能性があります。ヒトアデノウイルス(HAdV)、または特定の病原体などの指標ウイルスのサーベイランスは、ウイルス病原体への曝露を定義し、ヒト感染の潜在的な原因を特定するのに役立つだろう7,8, 9,10および衛生対策の有効性を検証する 11.
これまで、これらのシナリオでのウイルスの検出は、熟練したスタッフと複雑なロジスティクスに依存していました。VirWaTest(virwatest.org)は、使用時点で水サンプルからのウイルスの濃度およびその後の検出のためのシンプルで手頃な価格の、ポータブルな方法の開発を目的としています。
ウイルス濃度は、10L水サンプルの有機凝集の原理に基づいており、それによってウイルスは小さな体積12、13で回収される。フロッハを採取し、ウイルスを分解し、2週間以内に室温で保存すると核酸の劣化を防ぐバッファーに添加されます。
核酸抽出法は、核酸が吸着する磁性粒子の使用に基づいている。それらは、粒子が付着する磁気ピペットを使用して、ある洗浄バッファーから別の洗浄バッファーに移され、最後に溶出バッファーに移すことができます。得られたウイルス核酸懸濁液は、PCRに基づく分子法を用いて検出を行うことができる基準実験室に出荷することができる。各核酸抽出について、2つの異なる量が試料によって生じた酵素阻害を排除するために試験される。また、機器の可用性を最小限に抑えながら、使用時点で PCR テストを実行することもできます。プロセス全体は、電源装置とは無関係に実行するように設計されています (図1)。
ヒトによって排泄され、高濃度の排水サンプル中に見られるHAdVを検出する定量的なPCRアッセイは、使用時に実行されるように適合されている。HAdV は、ヒトの fecal ウイルスインジケーターとして使用されます。.MS2バクテリオファージの定量化のためのPCRは、MS2がプロセス制御としてVirWaTestで使用されているので、適応されています。この方法は、目的の任意のウイルスの検出のためにカスタマイズすることができます。
開発後、VirWaTestメソッドは、中央アフリカ共和国(RCA)とエクアドルの2つの異なる設定でユーザーによって適用され、実際の状況でプロトコルの適用に関するフィードバックを提供しています。
私たちの知るところによれば、これは、電源、大型機器、凍結/冷却条件に依存しない、使用時点でのウイルスの濃度と検出を可能にする最初の手順です。堅牢な結果を得るために、各水サンプルの2つの反復を収集することをお勧めします。
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Protocol
1. 準備と包装
注: 梱包する材料/備品は表 1に示されています。プロセス制御に必要な試薬、濃度試薬、核酸抽出試薬および検出試薬を処理するために手袋を使用してください。核酸抽出に必要な試薬を取り扱うには、保護メガネを着用してください。
- プロセス制御
- ISO手順10705-1:199514に従って実験室で1 x 1010 PFU/mLを含むMS2バクテリオファージストック培養(アメリカ型カルチャーコレクション[ATCC]15597-B1)を調製する。
- 次に、1x 108 PFUを10mLチューブに含有するチューブ当たりの懸濁液10μLをアリコート10μLとし、水を37°Cで蒸発させる。水サンプルごとに 1 つのチューブを使用します。
- さらに、採取した試料あたり10mLの無菌蒸留水を含むチューブを1本調用する。
- 濃縮試薬
- 予凝集脱脂乳溶液(PSM)の場合は、以下の量を使用して、5つの10L水サンプルを濃縮します。
- 5gのスキムミルクを含むプラスチックチューブを準備します。
- 16.66 gの海塩を含むジッパービニール袋を準備します。
- 蒸留水の500 mLを含むペットボトルを準備します。
- pH調整に必要な試薬を準備します。PSMと5つの10L水サンプルのpHを調整するには、以下の量を使用します。
- 10 mLのプラスチックチューブにクエン酸1水和物を5g加えます。
注意:クエン酸は、目に接触すると深刻な刺激を引き起こす。この場合は、数分間水で目をすすいでください。刺激が続く場合は、医師の診断を受けてください。 - 水酸化ナトリウム2gを10mLのプラスチックチューブに入れます。
注意:水酸化ナトリウムは、重度の皮膚火傷や眼の損傷を引き起こす可能性があります。飲み込んだ場合は、口をすすいで下さい。嘔吐を誘発しないでください。目に触れたら、数分間水で十分にすすいでください。その後、医師の診断を受けてください。 - プラスチック容器に無菌蒸留水の25 mLを入れます。
- プラスチック容器に50mLの滅菌蒸留水を入れます。
- 10 mLのプラスチックチューブにクエン酸1水和物を5g加えます。
- 凝集に使用されるサンプルコンディショニング袋、核酸を保存するために使用される防腐液、および廃棄された水と材料を中和する中和袋を調調します。試験する10L水サンプルごとに以下の量を使用します。
- 15gの海塩と8gのクエン酸1水和物を、コンディショニング袋用のジッパービニール袋に入れます。
- 5mLチューブに2mLのリシスバッファー(材料表)と核酸保存剤(材料表)を0.3mL加えます。
注意:リシスバッファーには、グアニジンチオシアネートおよびトリトンX-100が含まれています。酸との接触は有毒ガスを解放し、飲み込んだり吸入したり、皮膚に接触したりすると有害である。飲み込んだ場合は、口をすすいで下さい。嘔吐を誘発しないでください。皮膚に触れたら、水をたっぷりと洗う。その後、医師の診断を受けてください。核酸保存剤は皮膚や目の炎症を引き起こし、飲み込むと有害です。皮膚や目に触れたら、数分間豊富な水ですすいでください。いずれにせよ、特に飲み込んで気分が悪い場合は、医師の診察を受けてください。 - 4つのジッパービニール袋に40gの洗剤粉末を入れます。
注意:粉末洗剤は目の炎症を引き起こします。目に触れたら、数分間豊富な水ですすいでください。刺激が持続する場合、または飲み込んだ場合は、医師の診察を受けてください。
- 予凝集脱脂乳溶液(PSM)の場合は、以下の量を使用して、5つの10L水サンプルを濃縮します。
- 核酸抽出試薬
- 50 μLの磁性粒子(材料の表)と1 mLのエタノール96%を結合バッファーを構成する5 mLチューブに入れます。
注意:磁性粒子バッファーにはアジドナトリウムが含まれており、酸や重金属イオンに接触すると有毒なガスを形成し、摂取した場合や皮膚に接触すると有毒です。摂取または皮膚に接触した場合は、豊富な水で口や皮膚をすすいで、医師の診察を受けてください。エタノールは非常に可燃性の液体と蒸気であり、深刻な目の刺激を引き起こす。熱、高温の表面、火花、その他の点火源から遠ざけてください。皮膚や目に触れたら、豊富な水ですすいでください。大量の水を摂取したり吸入したりする場合は、新鮮な空気の中に入ります。いずれにせよ、医師の診断を受けてください。 - 500 μL、600 μL、および 200 μL の洗浄バッファー 1、2、および 3 (材料の表)を 3 つの 2 mL チューブにそれぞれ追加します。
注意:洗浄バッファーには、チオシアネートとグアニジニウム塩化物が含まれており、吸入または飲み込んだり、皮膚や目を刺激したりすると有害です。酸との接触は非常に有毒なガスを放出する。皮膚や目に触れる場合は、豊富な水ですすいでください。飲み込んだ場合は、豊富な水で口をすすいでください。嘔吐を誘発しないでください。常に医師の診断を受けてください。 - 溶出バッファー(材料表)を0.5mLチューブに120μLを追加します。
- 50 μLの磁性粒子(材料の表)と1 mLのエタノール96%を結合バッファーを構成する5 mLチューブに入れます。
- HAdVおよびMS2検出試薬
注:8ウェルサーモサイクラーを使用する場合、2つの異なる核酸抽出反応は、各PCRアッセイで同時に分析されてもよい。すべてのPCRアッセイについて、1.5 mLチューブに引用された分子生物学水を調調します。-
HAdV 検出
- 22.5 μM AdF フォワードプライマーの 10 μL、22.5 μM AdR の 10 μL、および 11.25 μM AdP プローブの 5 μL を含むミックスを調出します (表2)。
- チューブストリップのチューブ1~8に2.5 μLのミックスを追加します。室温で乾燥させ、チューブを閉じ、光から保護してください。
- チューブ1-5とチューブ6-8:2つのストリップに分割ストリップをカットします。
- 増幅されたHAdV領域のヌクレオチド配列を含むDNA懸濁液の連続希釈を調剤する。1 x 10 5、1 x 107、および 1 x 109 GC/mL をチューブ 6-8 に含む懸濁液の空気乾燥 1 μL。
注: プライマー、プローブ、および空気乾燥サスペンションを含むチューブは、光から保護してください。
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MS2 検出
- 25 μM pecson-2F フォワードプライマーの10 μL、25 μM pecson-2Rリバースプライマーの10 μL、および25 μM pecP-2プローブの2.5 μLを含む混合物を調製する(表2)。
- チューブストリップのチューブ1~8にミックスの2.25 μLを追加します。室温で乾燥させ、チューブを閉じ、光から保護してください。
- チューブ1-5とチューブ6-8:2つのストリップに分割ストリップをカットします。
- 手順 1.4.1.4 のように進みますが、代わりに MS2 用に設計された標準のサスペンションを使用します。
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HAdV 検出
2. ウイルス濃度
注:サンプル収集、試薬の調製、凝集、フロッチェルの回収、廃棄物処理の手順の間は、常に手袋を使用してください。試薬の調製手順中は保護眼鏡を着用してください。
- サンプルコレクション
- 蓋付きの平らな底のバケツに10Lの水サンプルを集めます。サンプルごとに少なくとも 2 つの反復を収集します。
注: クリア バケットを使用してペレットを視覚化することが重要です。水サンプルに懸濁材料(例えば、砂、藻類)が含まれている場合は、堆積物を入れ、次に、新しいバケツに水上清を収集します。 - 各水サンプルの収集量と場所と収集日を登録します。
- バケツサポートの下にバッテリーに接続された磁気攪拌機を置き、水サンプルを含むバケツをサポートに置きます。
注:新鮮な場所で平らな表面を探し、直射日光の当たる水のサンプルを含むバケツを保管してください。
- 蓋付きの平らな底のバケツに10Lの水サンプルを集めます。サンプルごとに少なくとも 2 つの反復を収集します。
- 試薬製剤
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pH調整試薬
- クエン酸粉末と水酸化ナトリウムペレットをそれぞれ蒸留水の25と50 mLを含むポットに注ぎます。
- クエン酸と水酸化ナトリウムが完全に溶解するまで手でゆっくりと振ります。
注意:水酸化ナトリウムペレットの上に水を注がさってください。代わりに、水酸化ナトリウムペレットを水の上に注ぎます。
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プレフロクレートスキムミルク
- 磁気攪拌機にスタンドアップバッグを置き、その中に蒸留水の500 mLを注ぎます。かき混ぜた磁石を袋の中に落とし、磁気攪拌機をオンにします。
- 海塩袋とスキムミルクチューブの内容物をスタンドアップバッグに注ぎ、中速で5分間かき混ぜて溶かします。
- パスツールピペットを使用してPSM溶液に3 mLのクエン酸を加え、pHが3.4~3.6の間にあることを確認します。pHインジケータストリップを使用してPSM溶液のpHを測定します。pHが3.5に近づくにつれて、クエン酸と水酸化ナトリウムの少量を追加します。
- 磁気攪拌機をオフにし、フロッコンが見えるようにします。懐中電灯を使用して、フロッカを視覚化するのに役立ちます。
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pH調整試薬
- 凝集
- 攪拌磁石を水に落とし、磁気攪拌機を最高速度でセットし、電源を入れます。攪拌磁石が回転し始まることを確認します。
- プロセス制御チューブに蒸留水の10 mLを追加します。チューブを数回反転してウイルスストックを水分補給し、溶液を水に注ぎます。
- 1つのサンプルコンディショニング袋の内容物を水に注ぎ、5分間かき混ぜます。
- pHインジケータストリップを使用して水サンプルのpHを測定します。水サンプルに数滴のクエン酸または水酸化ナトリウムを加え、pHが3.4~3.6の間にあることを確認します。pHが3.5に近づくにつれて、クエン酸と水酸化ナトリウムの少量を追加します。
- 100 mL容器を使用してPSM溶液を100 mL追加します。
- 蓋でバケツを密封し、磁気攪拌機を最低速度でセットし、水を8時間撹拌したままにします。
- 磁気攪拌機をオフにし、水を少なくとも5時間静止させて、フロッカスが落ち着くようにします。
- フロックコレクション
- ピペットコントローラ、2つのピペット、プラスチックチューブで構成されたサイフォンシステムを構築し、フロッホに水を排出するための水の上清を吸引します。
- 10 mLテープエンドピペットをピペットコントローラに取り付けます。次に、ピペットの先端をプラスチックチューブに取り付けます。
- ピンセットを使用して10mLのオープンチップピペットのフィルターを取り外し、ピペットをプラスチックチューブに取り付けます。
- 空のバケツを床に置きます。
- オープンチップピペットの先端を水に浸します。フロッカの邪魔にならないように、水面の近くに保管してください。テープエンドピペットに達するまで水の上清を吸引します。
- テープエンドピペットに取り付けられた端でプラスチックチューブをつまみ、ピペットから取り外します。
- チューブを空のバケツに入れます。チューブの圧力を離して、水が空のバケツに流れ込みます。
- 水位が攪拌磁石に到達しようとしているときに水の流れを停止し、バケツからピペットを離れて移動するためにプラスチックチューブをピンチ。
- バケツを振ってフロッケを再吊り下げ、500 mLの立ち上がりビニール袋に注ぎます。フロッホがさらに1時間落ち着くようにします。
- 50 mLピペットと手動ピペットコントローラを使用して水上清を慎重に吸引し、フロッキングを邪魔しないようにします。
- 100 mLピペットを使用してフロッチャを吸引し、50 mLの卒業遠心管に移します。サンプル濃縮物の最終容積を注意し、パストゥールピペットを使用して、防腐液を含む5 mLチューブに1 mLを移します。
注:濃縮されたサンプルの最終体積を可能な限り正確に測定し、登録できるように、遠心管を卒業することが重要です。 - 現場で核酸抽出を行う。あるいは、ウイルスを含む防腐剤を20~30°Cで最大15日間保存するか、さらに分析のためにリファレンスラボに出荷してください。
- ピペットコントローラ、2つのピペット、プラスチックチューブで構成されたサイフォンシステムを構築し、フロッホに水を排出するための水の上清を吸引します。
- 廃棄物処理および材料再利用
- 廃棄された水を含むバケツに中和剤袋の内容物を追加します。水を混ぜてから30分間放置します。
- 処理水を一般廃棄物として処分する。
- ピペットとプラスチックチューブをバケツの中に入れます。バケツに水を入れ、中和剤袋の中身を注ぎます。
- 少なくとも30分間洗って殺菌し、豊富なきれいな水で洗い流し、残りの中和剤を取り除きます。
3. 核酸抽出
注:手袋を使用し、核酸抽出手順中に常に保護眼鏡を着用してください。
-
磁気ピペット操作
- 抽出を実行する前に、磁気ピペットの動作に慣れます。
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核酸抽出
- ラック内の抽出に必要な試薬を含むチューブを左から右に配置します:バインディングバッファー、洗浄バッファー、溶出バッファー。分析されるサンプルまたは反復の数に応じて、適切な数のチューブを設定します。
- 使い捨てパスツールピペットを使用して、結合バッファーを含むチューブにサンプル濃縮物の1 mLを転送します。チューブを8xから10xに反転して溶液を均質化します。
- 太陽電池の軌道または手動で連続的に混合しながら、10分間室温で溶液をインキュベートします。
- 磁気ピペットとクリーンチップを使用して磁性粒子を収集し、3つの洗浄バッファーに再利用できます。
- 洗浄バッファー1の500μLを含むチューブに磁性粒子を放出する。30sの先端で溶液を静かに振ってそれらを洗い、それらを収集します。
- 磁性粒子を洗浄バッファー2の600μLを含むチューブに移す。30sの先端で溶液を静かに振ってそれらを洗い、それらを収集します。
- 磁性粒子を洗浄バッファー3の200μLを含むチューブに移す。30sの先端で溶液を静かに振ってそれらを洗い、それらを収集します。
- 溶出バッファーを含むチューブに磁性粒子を放出し、先端を廃棄します。
- 太陽電池の軌道を使用して、連続的に混合しながら、5分間室温で溶液をインキュベートします。
注:溶出バッファー内の磁性粒子を混合することは重要なステップです。軌道を欠いている場合は、インキュベーション時間中に手で連続的に混合する。 - 磁気ピペットの先端を新しいピペットに交換し、溶出バッファーから磁性粒子を収集します。溶出バッファーから磁性粒子を完全に除去してください。
- パーティクルをアタッチしたチップを破棄します。PCR解析を進め、溶出バッファーをリファレンスラボに出荷するか、溶出バッファーを4°Cに保存してさらなる分析を行います。
4.電池式8チューブリアルタイムサーモサイクラーによるウイルス検出
注:手袋を使用し、核酸検出手順中は常に保護眼鏡を着用してください。クロスコンタミネーションを避けるために、新しいPCR実験を行う際は、新しい手袋を交換してください。
-
HAdV 定量 PCR
- チューブ2、4、および5に14 μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。
- チューブ1-5に4 μLのPCRミックスを追加します。
- サンプルAからチューブ1に14 μLの核酸抽出を加え、サンプルBからチューブ3に14μLを加えます。
- サンプルAから抽出された核酸の2 μLをサンプルBからチューブ4にチューブ2と2μLを加えます。5本のチューブストリップを閉じます。
- チューブ6、7、および8に14 μLのヌクレアーゼフリー水を追加します。
- チューブ6、7、8にこのミックスの4 μLを追加し、それらを閉じます。
- 両方のストリップをサーモサイクラーに入れ、適切な実行を選択します(表3)。
- 水管を廃棄し、抽出した核酸を冷凍庫に保管し、可能であれば、2回目の検査を行う必要がある場合に備えて、光から保護された新鮮な場所に保管してください。
- マイクロピペット、ラック、作業材料、およびすべての材料を核酸クリーナーで適切に清掃し、使用済みの先端、手袋、チューブを含むビニール袋を廃棄します。
注意:核酸除去剤は非常に可燃性の液体と蒸気です。スプレーミストで呼吸し、目や皮膚との液体の接触を避けてください。それ以外の場合は、すぐに豊富な水ですすいで、医師の診察を受けてください。 - 結果を収集し、取得したデータを分析します。
-
MS2 定量 PCR
- チューブ2、4、および5に14 μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。
- 4 μLのPCRミックスと0.5 μLの逆転写酵素をチューブ1-5に加えます。
- サンプルAからチューブ1に14 μLの核酸抽出を加え、サンプルBからチューブ3に14μLを加えます。
- サンプルAからチューブ2に抽出された核酸を1 μL、サンプルBからチューブ4に1 μLを加えます。5本のチューブストリップを閉じます。
- チューブ5、6、7、8に15.5 μLのヌクレルフリー水を加え、閉じます。
- 4 μLのPCRミックスと0.5 μLの逆転写酵素をチューブ6、7、8に加えます。
- 両方のストリップをサーモサイクラーに入れ、適切な実行を選択します(表3)。
- 手順 4.1.8 から 4.1.10 に進みます。
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Representative Results
メソッド開発
この手順は、GenIULとオックスファム・インターモンの協力を得て、水と食品のウイルス汚染物質の研究室で開発されました。それは3つの異なったステップから成っている。第1の、ウイルス粒子濃度は、前述の12、17、18の脱脂乳凝集法の適応である。元の方法は、電源から独立し、より簡単で、遠心分離ステップなしで変更されました。
VirWaTest濃度法の回収をHAdVおよびMS2バクテリオファージスパイク地下水サンプルで試験した。VirWaTest濃度および抽出方法のウイルス回収は、MS2で3.01%~18.02%、HAdVでは17.52%~44.22%と推定された。これらの回収は、これらのウイルスストックの既知の濃度でそれらをスパイクした後、水試料中のHAdVおよびMS2の初期濃度と比較した方法の開発中に定量的PCRによって得られた値から計算された。
VirWaTest磁気核酸抽出は、HAdVおよびMS2でスパイクされた33の河川および地下水サンプルを試験することによって、実験室で使用されるカラムベースの抽出方法である市販のRNAミニキット(例えば、QIAampウイルスRNAミニキット)と比較した。脱脂ミルク凝集によって。比較結果は、VirWaTestメソッドの回復がHAdVの23/33症例およびMS2(表4)で高いことを示した。ウィルコクソン試験では、HAdVの場合は0.0005569、MS2では0.02791のp値が示されました。VirWaTest核酸抽出は、市販のものよりも有意に高いウイルス回収を提供する。
VirWaTest法により濃縮された環境水試料中のHAdVの検出
2017年3月、バンギ(RCA)にあるオックスファム水衛生衛生(WASH)チームは、この分野におけるウイルス濃度の開発方法を試験し、5つの井戸水サンプルからウイルスを採取して濃縮した。
また、2016年と2017年に地震の影響を受けたペデルナレス(エクアドル)地域では、2017年2月にオックスファムWASHチームが6つの井戸水サンプルを採取し、VirWaTest濃度法によりウイルスを濃縮しました。両方の設定からウイルス濃縮物は、VirWaTest核酸抽出およびウイルス定量のためにバルセロナの実験室に送られた。
エクアドルでは、分析された6つのサンプルのうち6つのサンプルで自然発生するHAdVが検出され、濃度値は3.27 x 101から1.80 x 102 GC/Lに及び、バンギ(RCA)で収集され、濃縮された5つのサンプルのうちの1つが試験された。HAdVに対して正、3.46 x 102 GC/L (表5)の濃度で。
MS2は、内部プロセス制御としてすべての試験されたサンプルに添加され、試験されたすべてのサンプルで検出され、濃度から検出まで正しく行われたことを示した。
図 1: VirWaTestメソッド。VirWaTest メソッドが構成する手順の概要。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 材料 | 濃度 | 核酸抽出 | 検出 |
| 機器 | 磁気撹拌機(2ユニット) バッテリー(2ユニット) バッテリー/スターラーコネクタ(2ユニット) 電源アダプタ(2台) バケットサポート(2ユニット) ロープ(1台) 撹拌マグネット(3ユニット) ピンセット(1ユニット) シリコンチューブ(1ユニット) ピペットコントローラ(1ユニット) マーカー (1 ユニット) |
磁気ピペット(1ユニット) ソーラーロータリープラットフォーム(1ユニット) マルチサイズチューブラック(1ユニット) タイマー(1ユニット) |
サーモサイクラー(1台) バッテリー(1ユニット) コンピューター チューブラック(1台) 0.5 μL - 10 μL マイクロピペット (1 単位) 2 μL - 20 μL マイクロピペット (1 単位) |
| 消耗品および試薬(2つの水サンプル/反復ごとに) | バケット (3 ユニット) pH インジケータストリップ テープエンド 10 mL ピペット (2 ユニット) オープンチップ 10 mL ピペット (2 ユニット) テープエンド 50 mL ピペット (2 ユニット) テープエンド 100 mL ピペット (2 ユニット) パストゥールピペット(4ユニット) スタンドアップビニール袋(4ユニット) 蒸留水25mLのプラスチック容器(1ユニット) 蒸留水50mLのプラスチック容器(1ユニット) 100 mL 空コンテナ(1ユニット) 手袋(6組) プロセス制御(2チューブ) 蒸留水10mLのチューブ(2ユニット) クエン酸(1チューブ) 水酸化ナトリウム (1 チューブ) スキムミルク(1チューブ) クエン酸小袋(1ユニット) 蒸留水(1 500 mLボトル) サンプルコンディショニング(2袋) 防腐液(2チューブ) 中和剤(4袋) |
磁気ピペットの先端(2単位) パストゥールピペット(2ユニット) バインディングバッファ(2チューブ) 洗浄バッファー1(2チューブ) 洗浄バッファー2(2チューブ) 洗浄バッファー3(2チューブ) 溶出バッファー(2チューブ) 手袋(6組) |
10 μLマイクロピペットの先端(1箱) 20 μLマイクロピペットの先端(1箱) DNA qPCR ミックス (1 チューブ) RNA qPCR ミックス (1 チューブ) 逆転写酵素(1チューブ) 分子生物学水 (1チューブ) プライマー、プローブおよび標準(1単位)が付いているHAdVの管ストリップ プライマー、プローブおよび標準(1単位)が付いているMS2管のストリップ 核酸除去剤 手袋(6組) |
表 1: VirWaTest の内容。2つの水サンプル/反復におけるウイルスの濃度、抽出、検出のために準備する必要がある機器、消耗品、および試薬。
| ウイルス | プライマー | ゲンバンク加盟 | 位置 | シーケンス (5'\u20123') | 長さ | 参照 | ||
| ヒトアデノウイルス(HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869\u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19歳 | ヘルンロスら, 200215 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | クラッググクレイトガッカグ | 19歳 | |||||
| アドップ1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTCCCCGCGCGCGCGCGCCCT-BMN-Q535 | 27歳 | |||||
| MS2 バクテリオファージ (MS2) | ペクソン-2F | NC_001417.2 | 344\u2012363 | アグットグクタカアグガグト | 20歳 | ペクソンら, 200916 | ||
| ペクソン-2R | 659\u2012678 | TTCGTTTタグガッグタグ | 20歳 | |||||
| ペクプ-2 | 369\u2012388 | 6-ファム-ATCGTGGTCGCGCGCGCGCGCGCGCG-BHQ-1 | 20歳 | |||||
表2:定量的PCR実験用オリゴヌクレオチド。HAdVおよびMS2の核酸配列に結合するように設計されたプライマーおよびプローブ。
| 温度 | 時間 | サイクル | 温度 | 時間 | サイクル |
| 95 °C | 12分 | 1 | 55 °C | 15分 | 1 |
| 95 °C | 10分 | 1 | |||
| 95 °C | 15 s | 40歳 | 95 °C | 15 s | 40歳 |
| 60 °C | 1 分 | 60 °C | 1 分 |
表3:定量的PCR実験の熱条件HAdVおよびMS2増幅に使用される温度、時間、およびサイクル。
| キアゲン | ヴァーワテスト | キアゲン | ヴァーワテスト | ||
| 中央 | 2.53×103 | 2.43×103 | 4.74×104 | 5.13×104 | |
| 意味 | 1.74×104 | 3.12×104 | 4.24×104 | 5.97×104 | |
| Sd | 5.66×105 | 2.23×106 | 4.49×104 | 1.63×105 | |
| HAdV の p 値 (ウィルコクソン) 0.0005569 | |||||
| MS2 の p 値 (ウィルコクソン): 0.02791 | |||||
| ウイルステスト済み | テスト済みサンプル | キアゲン | ヴァーワテスト | ||
| ハドフ | 33歳 | 10歳 | 23歳 | ||
| MS2 | 33歳 | 10歳 | 23歳 | ||
表4:VirWaTest核酸抽出開発HAdVおよびMS2の33の地下水サンプルでQiagenおよびVirWaTest抽出方法を比較した際に得られた中央値、平均値、およびSD値。
| 国 | サイト | サンプル | HAdV GC/L |
| Rca | オー・デ・ラ・ソデカ | 1 | Nd |
| イル・ボンゴソウア、ビレッジ1 | 2 | Nd | |
| イル・ボンゴソウア、ビレッジ3 | 3 | Nd | |
| バンギ、プイツ・クォーティエ・フォンド | 4 | Nd | |
| バンギ、プイツクォーティエ・ヤッバッサ | 5 | 3.64×102 | |
| エクアドル | ボアホール A | 6 | 7.96×101 |
| ボアホール B | 7 | 1.80×102 | |
| ボアホール C | 8 | 8.88×101 | |
| 井戸水A | 9 | 6.06×101 | |
| ウェルウォーターB | 10歳 | 1.12×102 | |
| ウェルウォーターC | 11歳 | 3.27×101 |
表5:VirWaTest法を用いたHAdVの定量化GC/リットルで表される定量的PCR結果は、RCAおよびエクアドルから採取および濃縮された水試料中で定量されたHAdVについて。
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Discussion
VirWaTest法は、経験のないユーザーが使用する時点で水試料からのウイルスおよび核酸抽出の濃度を可能にする。これは、手頃な価格、迅速かつシンプルなプロトコルです。濃度は、スキムミルクを使用した有機凝集の原理に基づいており、低pHおよび高導電性条件により、脱脂乳タンパク質がウイルスに凝集してウイルスが吸着するフロッホに凝集する。フロッキング堆積物の場合、それらを収集することが容易であり、10Lの水を濃縮することが可能であるのに対し、従来の超遠心分離は大きな水量を扱うことができない。
この方法は、バッテリ駆動の磁気撹拌機を除き、電気機器を使用せずにサンプリングの時点で実行可能に変更されています。水ろ過に基づくいくつかの他のアプローチは、ウイルスの濃度に適応されており、また、使用の時点で行うことができます。しかし、水サンプルに存在する懸濁材料は、多くの場合、フィルタを詰まらせる。したがって、これらのシステムに集中してもよい小さなボリュームは、深刻な制限です。
これは、サンプルの濁度に関係なく、使用時点で水サンプルからウイルスを濃縮する方法の最初の説明です。VirWaTest濃度法は、適切な材料が利用可能な場合、複数のサンプルを同時に処理することができます。また、脱脂乳凝集は、細菌および寄生虫濃度19に有用であることが示されている。
適切な材料の準備は、適切な手順を実行するために重要です。分析する水サンプルの数を考慮し、試薬および材料の調製に試験が必要な場所に移動する前に試薬と材料を調製します。適切な量の材料が利用可能な場合は、複数のサンプルを同時に処理できます。
水サンプルの濃度を開始する前に、ウイルスストックの既知の濃度がプロセス制御としてサンプルをスパイクするために使用されます。この方法は、使用時に水試料に添加される前に蒸留水で水分補給される乾燥ウイルスストックを使用します。これは、プロシージャの最後に偽陰性の結果を除外し、メソッドのパフォーマンスを示すのに役立ちます。
VirWaTestで得られたウイルス濃縮物は、VirWaTest核酸抽出および検出方法を適用する分野でさらに試験されてもよいし、あるいは、代わりに、濃縮物を室温で参照実験室に送りてもよい。濃縮物に添加された防腐液により、ウイルスは最大2週間安定した状態を維持できます(未発表の結果)。
VirWaTest核酸抽出は、磁性粒子ベースの方法である。それは容易で、速く、複数のサンプルを同時に処理することを可能にし、現在ウイルス核酸抽出に使用される方法と同等およびよりよい回復効率を示す。核酸は、室温で基準実験室に送られるか、または、ユーザが分子検出を行うことに自信を持っている場合、元の水試料の使用時に定量的なPCRアッセイを行うことができる。
また、小規模な実験室施設がある場合、VirWaTest濃度プロトコルは、遠心分離機に依存する標準的な核酸抽出キットと、試薬を維持するために冷凍庫を必要とする標準的なPCRベースの方法に結合することができますが、その使用電池式のものよりも安価である標準的なサーモサイクラー。
しかし、電源が利用できない場合もあるため、プロセス制御としてMS2バクテリオファージの検出アッセイを最適化し、HAdVをウイルス性大腿骨指標として最適化し、肝炎などの他のウイルスに合わせてカスタマイズすることができます。ウイルス、RoV、NoV、または他のウイルスは、試薬のメンテナンスのための冷凍庫を必要とせず、従来のサーモサイクラーを必要とせずに現場で実行されるが、唯一の電池式の1つ。いくつかの電池式サーモサイクラーは市販されている。あるいは、電源が利用可能な場合は、他の従来のqPCR装置が使用されてもよい。8チューブサーモサイクラーを使用する場合、最大2つの核酸抽出(同じサンプルから2つの異なるサンプルまたは2つの反復)を同じPCRアッセイで試験することができます。各核酸抽出について、2つの異なる量が試料によって生じた酵素阻害を排除するために試験される。適応は空気乾燥プライマー、調査および標準的な懸濁液によるPCR管の前の調製に基づいている。いくつかの凍結乾燥市販のqPCR溶液が存在し、ここで説明するのと同じ手順を適用して使用することができる。私たちは、実行しやすいと考えられる1つの可能性を説明しました。
この方法の開発中に行われた比較アッセイは、VirWaTestの濃度、抽出、検出の方法が水試料中のウイルスの定量に有効であることを示した。
記載された手順の検出(LOD)の限界は、濃度後に収集される体積が可変であるため変動する。また、LODはウイルスによって若干異なる場合があります。約10Lの体積が収集された場合、HAdVのLODは約1 x 102ウイルスGC/Lになります。したがって、HAdVの比較的小さな濃度は、VirWaTest法によって検出することができる。ペダーナレス(エクアドル)では、試験された6つのサンプルのうち6個が、3.27 x 101から1.80 x 102 GC/LまでのLODに近い濃度でHAdVを提示しました。バンギ(RCA)では、分析された5つのサンプルのうちの1つでHAdVが検出され、3.46 x 102 GC/Lの濃度で検出されました。HAdVの存在は、試験されたサンプルにおける制御プロセスとしてのMS2の存在と同様に、経験の浅いユーザによって行われた場合でも、水試料からのウイルス粒子の回収に有用である方法を示す。
これまでに得られたフィードバックは、ウイルス濃度が、8時間および5時間のステップが必要であるが、サンプルの使用時に適用された場合に大きな問題を伴い、実行する容易な手順であることを示している。これらの手順は、人間の支援なしに行われることに注意することが重要です。さらに、非濁水の代替としてろ過に基づくより高速な方法が開発されています。しかし、これまでの凝集は、高い濁度を示すサンプルの濃度を可能にするユニークな方法であるようです。ウイルス濃縮物は、室温で世界中の任意の実験室に送られる可能性があり、サンプリングエリアは常に冷却条件を提供する良好な輸送サービスを持っていないため、ウイルスのテストも容易になります。あるいは、ここで提示される抽出および検出プロトコルは、サンプルの使用時点でのウイルス検出のための試験を可能にする。
私たちが知る限り、これは、フィールド内の水サンプル中のウイルスの存在のための濃度とテストに有用であると報告された最初の方法です。他のいくつかの人道危機シナリオにおける関心のあるヒトウイルス病原体の存在の評価に手順を適用するために更なる努力が行われるべきである。また、手順をより親しみやすいように、潜在的な実装に関する洞察を提供するために、ユーザーのフィードバックが必要になります。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
VirWaTestは、ELHRA(人道支援のための学習と研究の強化)プログラム(人道支援のための学習と研究の強化)プログラムによって資金提供された研究プロジェクトです。著者らは、この研究に親切に協力したWASHチームを認めている。エクアドルのサンプルの分析は、オックスファム・エクアドルとディレクシオン・デ・インベチガシオネス・デ・ラ・ユニバーシダ・デ・ラス・アメリカス(AMB)によって資金提供されました。BRT.17.01) S.ボフィルマスは、バルセロナ大学のセラハンターの仲間です。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
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