Summary
Her presenterer vi VirWaTest, som er en enkel, rimelig og bærbar metode for konsentrasjon og påvisning av virus fra vann prøver på bruks punktet.
Abstract
Virus som skilles ut av mennesker og dyr kan forurense vannkilder og utgjøre en risiko for menneskers helse når dette vannet brukes til drikking, mat vanning, vasking, etc. Den klassiske avføring bakterier indikatoren ikke alltid se etter tilstedeværelsen av virale patogener så påvisning av virale patogener og viral indikatorer er relevant for å vedta tiltak for risikoreduksjon, spesielt i humanitære scenarier og i områder virus utbrudd er hyppige.
I dag, flere kommersielle tester slik at kvantifisering av avføring indikator bakterier (LØGN) er tilgjengelig for testing på det punktet av bruk. Men slike kommersielle tester er ikke tilgjengelig for påvisning av virus. Påvisning av virus i miljøet vann prøver krever konsentrere flere liter i mindre volumer. Videre, når konsentrert, er påvisning av virus avhengig av metoder som nukleinsyre syre utvinning og molekylær deteksjon (f. eks, polymerase kjedere reaksjon [PCR]-baserte analyser) av viral genomer.
Metoden beskrevet her tillater konsentrasjonen av virus fra 10 L vann prøver, samt utvinning av viral nukleinsyre syrer på bruksstedet, med enkelt og bærbart utstyr. Dette gjør at testing av vann prøver på bruksstedet for flere virus og er nyttig i humanitære scenarier, samt i enhver sammenheng der et utstyrt laboratorium ikke er tilgjengelig. Alternativt kan metoden konsentrere virus som finnes i vann prøver og frakt av konsentrat til et laboratorium ved romtemperatur for videre analyse.
Introduction
I løpet av de første fasene av en humanitær nødssituasjon er tilgang til rent vannforsyninger, sanitær og hygiene avgjørende for overlevelse av de berørte. Derfor er overvåking av vannkvaliteten en prioritet for å hindre vannbaserte utbrudd. Det er velkjent at forurenset vann er ofte opprinnelsen til sykdommer, men det er ofte vanskelig å fastslå kildene til viral utbrudd som hepatitt E-virus (HEV), selv med tilgjengeligheten av konvensjonelle laboratorie metoder. Kontroll av vannkvaliteten er basert på kvantifisering av løgn1,2,3,4. Imidlertid har det vært omfattende dokumentert at det er ingen sammenheng mellom fraværet av liten løgn og tilstedeværelsen av viral vannbaserte patogener som rotavirus (RoV), Norovirus (NoV), eller Hev5,6. Således, ved hjelp av vannkvalitet kriterier basert på LØGN kan resultere i en undervurdering av risiko forbundet med tilstedeværelsen av vannbaserte virale patogener. Overvåking av indikator virus, slik som Human adenoviruses (HAdV), eller bestemte patogener vil være nyttig i å definere eksponering for virale patogener og identifisere den potensielle kilden til menneskelig infeksjon7,8, 9,10 og i å validere effekten av sanitær tiltak11.
Inntil nå, var påvisning av virus i disse scenariene avhengig av dyktige medarbeidere og komplekse logistikk. VirWaTest (virwatest.org) er rettet mot utvikling av en enkel, rimelig og bærbar metode for konsentrasjon og påfølgende deteksjon av virus fra vann prøver på bruksstedet.
Viruset konsentrasjonen er basert på prinsippet om organiske flokk ule Rings av 10 L vann prøver, der virus utvinnes i mindre volumer12,13. Flocs samles og legges til en buffer som analyser virusene og hindrer at nukleinsyre syrer forringes når de oppbevares ved romtemperatur i ikke mer enn 2 uker.
Den nukleinsyre syre utvinnings metoden er basert på bruk av magnetiske partikler som nukleinsyre syrer får adsorberes. De kan overføres fra en vaskebuffer til en annen og til slutt inn i eluering buffer ved hjelp av en magnetisk pipette som partiklene feste. Viral nukleinsyre syre suspensjoner innhentet kan sendes til et referanse laboratorium der påvisning kan utføres ved hjelp av molekylære metoder basert på PCR. For hver nukleinsyre syre ekstraksjon testes to forskjellige mengder for å utelukke enzymatisk hemming av prøven. Med minimum utstyrs tilgjengelighet kan også PCR-tester kjøres på bruksstedet. Hele prosessen er utformet for å utføres uavhengig av en strømforsyning (figur 1).
En kvantitativ PCR-analyse for å oppdage HAdV, utskilles av mennesker og funnet i avløpsvann prøver i høye konsentrasjoner, har blitt tilpasset for å kjøres på bruksstedet. HAdV brukes som menneskelige avføring viral indikatorer. En PCR for kvantifisering av MS2 bakteriofag er også tilpasset siden MS2 brukes i VirWaTest som prosesskontroll. Metoden kan tilpasses for påvisning av virus av interesse.
Etter utviklingen har VirWaTest-metoden blitt brukt av brukerne i to forskjellige innstillinger i Republikken Sentral-Afrika (RCA) og Ecuador, og gir tilbakemelding om anvendelsen av protokollen i virkelige situasjoner.
Til vår kunnskap, er dette den første fremgangsmåten som gjør at konsentrasjonen og påvisning av virus på bruksstedet, uavhengig av strømforsyning, stort utstyr, og frysing/kjøling forhold. Det anbefales å samle to replikerer av hver vannprøve for å oppnå robuste resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse og pakking
Merk: materialene/utstyret som skal pakkes er listet opp i tabell 1. Bruk hansker til å håndtere reagensene som kreves for prosesskontrollen, konsentrasjons reagensene, nukleinsyre og reagens reagensene. Bruk vernebriller for å håndtere reagensene som kreves for nukleinsyre yre ekstraksjon.
- Behandle kontroll
- Forbered MS2 bakteriofag aksje kultur (American type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) som inneholder 1 x 1010 PFU/ml i laboratoriet ved å følge ISO-prosedyren 10705-1:199514.
- Deretter alikvot 10 μL av suspensjonen per rør som inneholder 1 x 108 PFU i 10 ml rør og la vannet fordampe ved 37 ° c. Bruk ett rør per vannprøve.
- I tillegg forbereder du ett rør som inneholder 10 mL sterilt destillert vann per innsamlet prøve.
- Reagenser for konsentrasjon
- For preflocculated skummet melk løsning (PSM), bruk følgende beløp for å konsentrere 5 10 vann prøver.
- Forbered et plastrør med 5 g skummet melk.
- Forbered en glidelås plastpose som inneholder 16,66 g havsalt.
- Forbered en plastflaske inneholdende 500 mL destillert vann.
- Klargjør reagensene som kreves for justering av pH. Bruk følgende beløp for å justere pH-verdien i PSM og av vann prøver fra 5 10 L.
- Tilsett 5 g sitronsyre 1-hydrat til en 10 mL plastrør.
FORSIKTIG: sitronsyre forårsaker alvorlig irritasjon når den kommer i kontakt med øynene. Hvis dette skjer, skyll øyet forsiktig med vann i flere minutter. Hvis irritasjonen vedvarer, kontakt lege. - Sett 2 g natriumhydroksid i en 10 mL plastrør.
FORSIKTIG: natriumhydroksid kan forårsake alvorlige hudforbrenninger og øyeskader. Skyll munnen ved svelging. Ikke indusere oppkast. Hvis den kommer i kontakt med øynene, skyll forsiktig med vann i flere minutter. Deretter oppsøke lege. - Sett 25 mL sterilt destillert vann i en plastbeholder.
- Sett 50 mL sterilt destillert vann inn i en plastbeholder.
- Tilsett 5 g sitronsyre 1-hydrat til en 10 mL plastrør.
- Forbered prøven condition pose som brukes for flokk ule Rings, konserveringsmiddel løsningen som brukes til å bevare nukleinsyre syrer, og nøytralisere posen for å nøytralisere den kasserte vann og materialer. Bruk følgende beløp for hver 10 L vannprøve som skal testes.
- Sett 15 g havsalt og 8 g sitronsyre 1-hydrat i en glidelås plastpose for condition posen.
- Tilsett 2 mL lyseringsbuffer (tabell av materialer) og 0,3 ml nukleinsyre syre konserveringsmiddel (tabell av materialer) til et 5 ml rør.
FORSIKTIG: lyseringsbuffer inneholder guaniniumtiocyanat ammoniumthiocyanat og Triton X-100. Kontakt med syre utvikles giftig gass, og det er skadelig ved svelging, inhalert, eller kommer i kontakt med huden. Skyll munnen ved svelging. Ikke indusere oppkast. Hvis den kommer i kontakt med huden, vask med mye vann. Deretter oppsøke lege. Nukleinsyre yre konserveringsmiddel forårsaker hud-og øyeirritasjon og er skadelig ved svelging. Hvis den kommer i kontakt med huden eller øynene, skyll med rikelig vann i flere minutter. I alle fall, spesielt hvis du svelger og føler deg uvel, søk legehjelp. - Sett 40 g vaskemiddel pulver i fire plastposer med glidelås.
FORSIKTIG: pulver vaskemiddel forårsaker øyeirritasjon. Hvis den kommer i kontakt med øynene, skyll med rikelig vann i flere minutter. Hvis irritasjonen vedvarer eller svelges, kontakt lege.
- For preflocculated skummet melk løsning (PSM), bruk følgende beløp for å konsentrere 5 10 vann prøver.
- Reagenser for nukleinsyre yre ekstraksjon
- Sett 50 μL av magnetiske partikler (tabell av materialer) og 1 mL etanol 96% til et 5 ml rør som utgjør innbindings bufferen.
FORSIKTIG: den magnetiske partikler buffer inneholder natrium Natriumazid, som danner en giftig gass når den kommer i kontakt med syrer eller heavy metal ioner og er giftig hvis svelget eller når det kommer i kontakt med huden. Ved svelging eller hudkontakt, skyll munnen eller huden med rikelige mengder vann og oppsøk lege. Etanol er en svært brannfarlig væske og damp og forårsaker alvorlig øyeirritasjon. Holdes vekk fra varme, varme overflater, gnister og andre antennelseskilder. Hvis den kommer i kontakt med huden eller øynene, skyll med rikelig vann. Ved inntak av store mengder vann og/eller ved innånding, gå ut i frisk luft. I alle fall oppsøke lege. - Tilsett 500 μL, 600 μL og 200 μL av vaske buffere 1, 2 og 3, henholdsvis (tabell av materialer), til tre 2 ml rør.
FORSIKTIG: vaske buffere inneholder guanidiniumklorid ammoniumthiocyanat og guanidiniumklorid klorid, som er skadelige ved innånding eller svelging og irriterer huden og øynene. Kontakt med syrer utgivelser svært giftig gass. Hvis de kommer i kontakt med hud eller øyne, skyll med rikelig vann. Ved svelging, skyll munnen med rikelige mengder vann. Ikke indusere oppkast. Søk alltid legehjelp. - Tilsett 120 μL av eluering buffer (materialfortegnelsen) til et 0,5 ml rør.
- Sett 50 μL av magnetiske partikler (tabell av materialer) og 1 mL etanol 96% til et 5 ml rør som utgjør innbindings bufferen.
- Reagenser for HAdV-og MS2-deteksjon
Merk: to forskjellige nukleinsyre yre utvinnings reaksjoner kan analyseres samtidig i hver PCR-analyse hvis en 8-brønn thermocycler brukes. For alle PCR-analyser, Forbered molekylærbiologi vann aliquoted i 1,5 mL rør.-
HAdV-gjenkjenning
- Forbered en miks som inneholder 10 μL av 22,5 μM AdF forover, 10 μL av 22,5 μM AdR omvendt primer, og 5 μL av 11,25 μM AdP probe (tabell 2).
- Tilsett 2,5 μL av blandingen i rør 1 til 8 av en slange strimmel. La den tørke ved romtemperatur, lukke rørene, og holde dem beskyttet mot lyset.
- Skjær stripen dele den i to strimler: rør 1-5 og rør 6-8.
- Forbered en seriell fortynning av DNA suspensjoner som inneholder nukleotid sekvensen av forsterket HAdV regionen. Air-Dry 1 μL av suspensjoner som inneholder 1 x 105, 1 x 107, og 1 x 109 GC/ml i rør 6-8.
Merk: Hold rørene som inneholder primere, sonde, og luft-tørket suspensjoner beskyttet mot lys.
-
MS2 deteksjon
- Forbered en blanding som inneholder 10 μL av 25 μM pecson-2F forover primer, 10 μL av 25 μM pecson-2R omvendt primer, og 2,5 μL av 25 μM PecP-2 sonde (tabell 2).
- Tilsett 2,25 μL av blandingen i rør 1 til 8 av en slange strimmel. La den tørke ved romtemperatur, lukke rørene, og holde dem beskyttet mot lyset.
- Skjær stripen dele den i to strimler: rør 1-5 og rør 6-8.
- Fortsette idet inne steg 1.4.1.4 bortsett fra bruk en målestokk suspensjon beregnet på MS2 i stedet.
-
HAdV-gjenkjenning
2. viral konsentrasjon
Merk: Bruk hansker til alle tider under prøvetaking, reagens forberedelser, flokk ule Rings, flocs Oppsamling og avfalls håndteringsprosedyrer. Bruk vernebriller under prosedyren for reagens forberedelse.
- Eksempel på samling
- Samle en 10 L vannprøve i en flat bunn bøtte med et lokk. Samle minst to replikerer for hver prøve.
Merk: det er viktig å bruke klare bøtter for å visualisere pellet. Hvis vann prøven inneholder suspendert materiale (f. eks, sand, alger), la det sediment og, deretter, samle vann supernatanten i en ny bøtte. - Registrere samlet volum, samt plassering og innsamlings dato, for hvert vannprøve.
- Sett en magnetisk rører koblet til et batteri under en bøtte støtte og plassere bøtte som inneholder vann prøven på sin støtte.
Merk: se etter en flat overflate i et friskt sted og holde bøtter som inneholder vannprøvene fra direkte sollys.
- Samle en 10 L vannprøve i en flat bunn bøtte med et lokk. Samle minst to replikerer for hver prøve.
- Tilberedning av reagenser
-
reagenser for pH-justering
- Hell den sitronsyre pulver og natriumhydroksid i potter som inneholder 25 og 50 mL destillert vann, henholdsvis.
- Rist forsiktig for hånd til sitronsyre og natriumhydroksid er helt oppløst.
FORSIKTIG: ikke Hell vannet over natriumhydroksid. I stedet helle natriumhydroksid pellets over vannet.
-
Preflocculated skummet melk
- Plasser en stand-up bag på en magnetisk rører og hell 500 mL destillert vann i den. Slipp en røring magnet inne i posen og slå på magnetiske rører.
- Hell innholdet i en havsalt pose og en skummet melk tube inn i stand-up bag og rør i 5 min på middels hastighet for å oppløse dem.
- Tilsett 3 mL sitronsyre til PSM løsningen ved hjelp av en Pasteur pipette for å sikre at pH ligger mellom 3,4 og 3,6. Mål pH i PSM løsningen ved hjelp av pH-indikator strimler. Legg mindre mengder sitronsyre og natriumhydroksid som pH kommer nærmere 3,5.
- Slå av magnetisk stirrer og sørg for at flocs er synlige. Bruk en lommelykt for å bidra til å visualisere flocs.
-
reagenser for pH-justering
- Flokk ule Rings
- Slipp en gripende magnet i vannet, sett den magnetiske stirrer ved maksimal hastighet, og slå den på. Pass på at røring magneten begynner å spinne.
- Tilsett 10 mL destillert vann til et prosesskontroll rør. Inverter røret et par ganger for å rehydrate viral lager og hell løsningen i vannet.
- Hell innholdet i en prøve condition pose i vannet og rør i 5 min.
- Mål pH i vann prøven ved hjelp av pH-indikator strimler. Legg noen dråper sitronsyre eller natriumhydroksid til vann prøven for å sikre at pH ligger mellom 3,4 og 3,6. Legg mindre mengder sitronsyre og natriumhydroksid som pH kommer nærmere 3,5.
- Tilsett 100 mL av PSM-løsningen ved hjelp av en 100 mL beholder.
- Forsegle bøtte med lokket, sett magnetiske stirrer på minimum hastighet, og la vannet stirring i 8 h.
- Slå av magnetiske stirrer og la vannet fortsatt i minst 5 t for å la flocs til å bosette seg.
- Floc-kolleksjonen
- Bygg et siphoning system bestående av en pipette kontroller, to Pipetter, og et plastrør, for å aspirer vann supernatanten for å tømme vannet på flocs.
- Fest en 10 mL tape-end pipette til pipette kontrolleren. Deretter festes tuppen av pipette til plastrør.
- Fjern filteret på en 10 mL åpen propp ved hjelp av pinsett og fest pipette til plastrør.
- Plasser en tom bøtte på gulvet.
- Dypp tuppen av pipette med åpen spiss i vannet. Sørg for å holde den nær vannflaten for å unngå å forstyrre flocs. Aspirer vann supernatanten til den når pipette med tape-enden.
- Knip plastrør ved enden festet til tape-end pipette og løsne den fra pipette.
- Plasser røret i en tom bøtte. Slipp trykket på røret for å la vannet strømme inn i den tomme bøtta.
- Knip plastrør for å stoppe vannstrømmen når vannstanden er i ferd med å nå omrøring magnet og flytte pipette bort fra bøtte.
- Rist bøtte for å resuspend flocs og hell dem i en 500 mL stand-up plastpose. La flocs til å bosette seg for 1 t mer.
- Aspirer forsiktig vann supernatanten med en 50 mL pipette og en manuell pipette, slik at du unngår å forstyrre flocs.
- Aspirer flocs ved hjelp av en 100 mL pipette og Overfør dem til en 50 mL gradert sentrifuge slange. Skrive ned det endelige volumet av prøven konsentrat og overføre 1 mL av den til en 5 mL rør som inneholder konserveringsmiddel løsning, ved hjelp av en Pasteur pipette.
Merk: det er viktig at sentrifuge slangen er gradert slik at det endelige volumet av den konsentrerte prøven kan måles så nøyaktig som mulig og registrert. - Utfør nukleinsyre yre ekstraksjon i felten. Alternativt kan du lagre konserveringsmiddel løsningen som inneholder virusene ved 20-30 ° c i opptil 15 dager, eller sende dem til et referanse laboratorium for videre analyse.
- Bygg et siphoning system bestående av en pipette kontroller, to Pipetter, og et plastrør, for å aspirer vann supernatanten for å tømme vannet på flocs.
- Avfallshåndtering og material gjenbruk
- Legg innholdet av en nøytralisere agent pose til bøtte som inneholder kasserte vannet. Bland vannet, og deretter, la den fortsatt i 30 min.
- Kast det behandlede vannet som generelt avfall.
- Plasser Pipetter og plastrøret inne i skuffen. Fyll bøtte med vann og hell i innholdet i en nøytralisere agent pose.
- Vask dem i minst 30 min for å sterilisere dem og skyll dem med rikelig rent vann for å fjerne eventuelle gjenværende nøytralisere agent.
3. nukleinsyre syre avsug
Merk: Bruk hansker og alltid bruke vernebriller under nukleinsyre syre utvinning prosedyre.
-
Magnetisk pipette-operasjon
- Få kjent med bruk av magnet pipette før du utfører ekstraksjon.
-
Nukleinsyre syre utvinning
- Ordne rørene som inneholder reagensene som kreves for ekstraksjon i et rack, fra venstre til høyre: bindings buffer, vaske buffere og eluering buffer. Angi riktig antall rør i henhold til antall prøver eller replikerer som analyseres.
- Overfør 1 mL prøve konsentrat til røret som inneholder bindings bufferen, ved hjelp av en gangs pipette med Pasteur. Vend røret 8x til 10x for å homogenisere løsningen.
- Ruge løsningen ved romtemperatur i 10 minutter mens den kontinuerlig blandes, enten ved hjelp av en soldrevne orbital eller manuelt.
- Samle de magnetiske partiklene ved hjelp av magnetisk pipette og et rent tips, som kan gjenbrukes for de tre vaske buffere.
- Løsne magnet partiklene i røret som inneholder 500 μL av vaskebuffer 1. Vask dem ved å riste forsiktig løsningen med spissen for 30 s og samle dem.
- Overfør magnet partiklene til røret som inneholder 600 μL av vaskebuffer 2. Vask dem ved å riste forsiktig løsningen med spissen for 30 s og samle dem.
- Overfør magnet partiklene til røret som inneholder 200 μL av vaskebuffer 3. Vask dem ved å riste forsiktig løsningen med spissen for 30 s og samle dem.
- Løsne magnet partiklene i røret som inneholder eluering buffer og kast spissen.
- Ruge løsningen ved romtemperatur i 5 minutter, mens den kontinuerlig blandes ved bruk av soldrevne orbital.
Merk: å blande de magnetiske partiklene i eluering buffer er et avgjørende skritt. I tilfelle av manglende en orbital, kontinuerlig blanding for hånd under inkubasjonstid. - Bytt tuppen på den magnetiske pipette med en ny og samle de magnetiske partikler fra eluering buffer. Sørg for å fjerne de magnetiske partiklene helt fra eluering buffer siden de kan forstyrre molekylære gjenkjenningsmetoder.
- Kast tuppen med partiklene festet til den. Fortsett med PCR-analysen, Send eluering buffer til et referanse laboratorium eller Oppbevar eluering buffer ved 4 ° c for videre analyse.
4. viral deteksjon med et batteridrevet åtte-tube sanntids thermocycler
Merk: Bruk hansker og alltid bruke vernebriller under nukleinsyre syre deteksjon prosedyre. Erstatt hanskene for nye når du utfører et nytt PCR-eksperiment for å unngå krysskontaminering.
-
HAdV kvantitativ PCR
- Tilsett 14 μL av nuklease vann til rør 2, 4 og 5.
- Tilsett 4 μL av PCR-mix i rør 1-5.
- Tilsett 14 μL av nukleinsyre syre avsug fra prøve A til rør 1 og 14 μL fra prøve B til rør 3.
- Tilsett 2 μL av utpakkede nukleinsyre syrer fra prøve A til rør 2 og 2 μL fra prøve B til rør 4. Steng fem-tube stripe.
- Tilsett 14 μL av nuklease vann til rør 6, 7 og 8.
- Tilsett 4 μL av denne blandingen i rør 6, 7 og 8, og Lukk dem.
- Sett begge stripene inn i thermocycler og velg riktig løp (tabell 3).
- Kast vannrøret og hold den utpakkede nukleinsyre syre i fryseren, hvis mulig, eller, hvis ikke, i et friskt sted beskyttet mot lys i tilfelle en ny test må utføres.
- Rengjør Mikropipetter, stativet, arbeids materialet og alt materiale riktig med en nukleinsyre syre rengjøringsmiddel, og kast plastposen som inneholder det brukte tipset, hanskene og rørene.
FORSIKTIG: nukleinsyre acid Remover er en veldig brannfarlig væske og damp. Ikke pust inn sprøytetåke og unngå kontakt med væsken med øynene eller huden. Hvis ikke, skyll straks med rikelige mengder vann og oppsøk lege. - Samle resultatene og analysere innhentet data.
-
MS2 kvantitativ PCR
- Tilsett 14 μL av nuklease vann til rør 2, 4 og 5.
- Tilsett 4 μL av PCR-mix og 0,5 μL av revers transkriptase enzym til rør 1-5.
- Tilsett 14 μL av nukleinsyre syre avsug fra prøve A til rør 1 og 14 μL fra prøve B til rør 3.
- Tilsett 1 μL av utpakkede nukleinsyre syrer fra prøve A til rør 2 og 1 μL fra prøve B til rør 4. Steng fem-tube stripe.
- Tilsett 15,5 μL av nuklease vann til rør 5, 6, 7 og 8, og Lukk dem.
- Tilsett 4 μL av PCR-mix og 0,5 μL av revers transkriptase enzym i rør 6, 7 og 8.
- Sett begge stripene inn i thermocycler og velg riktig løp (tabell 3).
- Fortsett som beskrevet i trinn 4.1.8 til 4.1.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodeutvikling
Denne prosedyren er utviklet i laboratoriet av virus forurensninger av vann og mat med samarbeid av GenIUL og Oxfam Intermón. Det består av tre ulike trinn. Den første, viral partikkel konsentrasjon, er en tilpasning av en skummet melk flokk ule Rings metode som tidligere er beskrevet12,17,18. Den opprinnelige metoden ble endret for å være uavhengig av en strømforsyning, enklere, og uten sentrifugering trinn.
Utvinningen av VirWaTest konsentrasjon metoden ble testet i HAdV og MS2 bakteriofag-piggete grunn vanns prøver. Det viral det å bli frisk av det VirWaTest konsentrasjonen og trekking metoden var anslått å bli 3,01% å 18,02% for MS2 og 17,52% å 44,22% for HAdV. Disse inn data ble beregnet fra verdiene innhentet av kvantitative PCR under utviklingen av metoden i forhold til den opprinnelige konsentrasjonen av HAdV og MS2 i vann prøver etter skyter dem med kjente konsentrasjoner av disse virale bestandene.
Den VirWaTest magnetisk nukleinsyre syre ekstraksjon ble sammenlignet med en kommersiell RNA mini Kit (f. eks, QIAamp viral RNA mini Kit), en kolonne-basert utvinningsmetode som brukes i laboratoriet, ved å teste 33 elv og grunnvann prøver piggete med HAdV og MS2 og konsentrert av skummet melk flokk ule Rings. Sammenligningen resultater viste det det VirWaTest metoden det å bli frisk var høyere inne 23/33 sakene for HAdV, likeledes idet for MS2 (bord 4). En Wilcoxon-test viste p-verdier på 0,0005569 for HAdV og 0,02791 for MS2. VirWaTest nukleinsyre acid utvinning gir betydelig høyere viral inngang enn den kommersielle en.
Påvisning av HAdV i miljø vann prøver konsentrert av VirWaTest-metoden
For å teste utviklet metode for viral konsentrasjon i feltet, den Oxfam vann, sanitær og hygiene (WASH) team, som ligger i Banghi (RCA) i mars 2017, samlet og konsentrert virus fra fem brønnvann prøver.
Også i området Pedernales (Ecuador), som ble rammet av jordskjelv i 2016 og 2017, seks brønnvann prøvene ble samlet inn av en Oxfam WASH team i februar 2017, og dens virus ble konsentrert av VirWaTest konsentrasjon metoden. Viral konsentrater fra begge innstillingene ble sendt til laboratoriet i Barcelona for VirWaTest nukleinsyre syre utvinning og viral kvantifisering.
I Ecuador, naturlig forekommende HAdV ble oppdaget i seks av de seks prøvene analysert, med konsentrasjon verdier fra 3,27 x 101 til 1,80 x 102 GC/L, mens en av de fem prøvene samlet og KONSENTRERT i Banghi (RCA) testet positiv for HAdV, ved en konsentrasjon på 3,46 x 102 GC/L (tabell 5).
MS2, lagt til alle testede prøvene som intern prosesskontroll, ble påvist i alle prøver testet, viser at metoden ble riktig utført fra konsentrasjon til deteksjon.
Figur 1 : VirWaTest-metoden. Oversikt over trinnene VirWaTest-metoden består av. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Materialer | Konsentrasjon | Nukleinsyre syre utvinning | Oppdagelsen |
| Utstyr | Magnetiske stirrer (2 enheter) Batteri (2 enheter) Kontakter for batteri/rører (2 enheter) Strømadaptere (2 enheter) Bøtte støtte (2 enheter) Tau (1 enhet) Røring magnet (3 enheter) Pinsett (1 enhet) Silisium slange (1 enhet) Pipette Controller (1 enhet) Markør (1 enhet) |
Magnetisk pipette (1 enhet) Solar Rotary Platform (1 enhet) Multi-size tube rack (1 enhet) Tidtaker (1 enhet) |
Thermocycler (1 enhet) Batteri (1 enhet) Datamaskinen Tube rack (1 enhet) 0,5 μL-10 μL Micropipette (1 enhet) 2 μL-20 μL Micropipette (1 enhet) |
| Forbruksvarer og reagenser (for hver 2 vann prøver/replikeres) | Bøtte (3 enheter) pH-indikator strimler Bånd-end 10 mL pipette (2 enheter) Pipette med åpen tupp 10 mL (2 enheter) Tape-end 50 mL pipette (2 enheter) Tape-end 100 mL pipette (2 enheter) Pasteur Pipetter (4 enheter) Stand-up plastpose (4 enheter) Plastbeholder med 25 mL destillert vann (1 enhet) Plastbeholder med 50 mL destillert vann (1 enhet) 100 mL tom beholder (1 enhet) Hansker (6 par) Prosesskontroll (2 rør) Rør med 10 mL destillert vann (2 enheter) Sitronsyre (1 tube) Natriumhydroksid (1 tube) Skummet Milk (1 tube) Sitronsyre pose (1 enhet) Destillert vann (1 500 mL flaske) Prøve condition (2 poser) Konserveringsmiddel løsning (2 rør) Nøytralisere agent (4 poser) |
Tips om magnetisk pipette (2 enheter) Pasteur Pipetter (2 enheter) Bindings buffer (2 rør) Vaske buffer 1 (2 rør) Vaske buffer 2 (2 rør) Vaske buffer 3 (2 rør) Eluering buffer (2 rør) Hansker (6 par) |
10 μL Micropipette tips (1 boks) 20 μL Micropipette tips (1 boks) DNA qPCR mix (1 tube) RNA qPCR mix (1 rør) Omvendt transkriptase enzym (1 tube) Molekylærbiologi vann (1 tube) HAdV tube Strip med primere, sonde og standard (1 enhet) MS2 tube Strip med primere, sonde og standard (1 enhet) Nukleinsyre acid Remover Hansker (6 par) |
Tabell 1: VirWaTest innhold. Utstyr, forbruksvarer og reagenser som må forberedes for konsentrasjon, ekstraksjon og påvisning av virus i to vann prøver/-replikerer.
| Virus | Primere | Genbank tiltredelse nr. | Posisjon | Sekvens (5 ' \u20123 ') | Lengde | Referanse | ||
| Human Adenovirus (HAdV) | Automatiske dokumentmateren | J 01917.1 | 18869\u201218887 | CWTACATGCACATCKCSGG | 19 | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919\u201218937 | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 | |||||
| AdP1 | 18890\u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTCCT-BMN-Q535 | 27 | |||||
| MS2 Bakteriofag (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344 \ u2012363 | AAGGTGCCTACAAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| pecson-2R | 659 \ u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 | |||||
| PecP-2 | 369 \ u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCCCGTACG-BHQ-1 | 20 | |||||
Tabell 2: oligonukleotider for KVANTITATIVE PCR-eksperimenter. Primere og sonde designet for å binde til nukleinsyre syre sekvenser av HAdV og MS2.
| Temperatur | Tid | Sykluser | Temperatur | Tid | Sykluser |
| 95 ° c | 12 min | 1 | 55 ° c | 15 min | 1 |
| 95 ° c | 10 min | 1 | |||
| 95 ° c | 15 s | 40 | 95 ° c | 15 s | 40 |
| 60 ° c | 1 min | 60 ° c | 1 min |
Tabell 3: termiske forhold for KVANTITATIVE PCR-eksperimenter. Temperatur, tid og sykluser som brukes for HAdV og MS2 forsterkning.
| QIAgen | VirWaTest | QIAgen | VirWaTest | ||
| Median | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| Mener | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| p-verdi (Wilcoxon) for HAdV: 0,0005569 | |||||
| p-verdi (Wilcoxon) for MS2:0,02791 | |||||
| Virus testet | Prøver testet | QIAgen | VirWa-test | ||
| HAdv | 33 | 10 | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 | 23 | ||
Tabell 4: VirWaTest nukleinsyre yre utvinnings utvikling. Median, middelverdi og SD-verdier oppnådd ved sammenligning av Qiagen og VirWaTest utvinningsmetoder i 33 grunn vanns prøver for HAdV og MS2.
| Land | Nettstedet | Eksempel | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 | Nd |
| Ile Bongossoua, landsby 1 | 2 | Nd | |
| Ile Bongossoua, Village 3 | 3 | Nd | |
| Bangui (Puits Quartier Fondo | 4 | Nd | |
| Bangui (Puits Quartier Yambassa | 5 | 3,64 x 102 | |
| Ecuador | Bore hull | 6 | 7,96 x 101 |
| Bore hull B | 7 | 1,80 x 102 | |
| Bore hull C | 8 | 8,88 x 101 | |
| Brønnvann A | 9 | 6,06 x 101 | |
| Brønnvann B | 10 | 1,12 x 102 | |
| Brønnvann C | 11 | 3,27 x 101 |
Tabell 5: kvantifisering av HAdV ved hjelp av VirWaTest-metoden. Kvantitative PCR-resultater, uttrykt i GC/liter, for HAdV kvantifisert i vann prøver innsamlet og konsentrert fra RCA og Ecuador.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den VirWaTest metoden gjør konsentrasjonen av virus og nukleinsyre syre utvinning fra vann prøver på det punktet av bruk av ikke-erfarne brukere. Det er en rimelig, rask og enkel protokoll. Konsentrasjonen er basert på prinsippet om organiske flokk ule Rings med skummet melk, der den lave pH og høy ledningsevne forhold gjør skummet melkeproteiner samlet inn flocs virusene adsorbere til. Når flocs sediment, er det lett å samle dem, noe som gjør det mulig å konsentrere 10 L vann, mens tradisjonelle ultracentrifugation ikke kan håndtere store vannvolumer.
Metoden har blitt modifisert for å være praktisk på det punktet av prøvetaking uten å bruke elektrisk utstyr bortsett fra en batteridrevet magnetiske rører. Noen andre tilnærminger basert på vann filtrering har blitt tilpasset konsentrasjonen av virus og kan også utføres på bruks punktet. Men suspendert materiale til stede i vann prøver ofte tresko filtrene; Dermed er det lite volum som kan være konsentrert med disse systemene, en alvorlig begrensning.
Dette er den første beskrivelsen av en metode for å konsentrere virus fra vann prøver på bruksstedet, uavhengig av turbiditet av prøven. Den VirWaTest konsentrasjon metoden gjør at flere prøver som skal behandles samtidig hvis det aktuelle materialet er tilgjengelig. Dessuten har skummet melk flokk ule Rings vist å være nyttig for bakterier og parasitt konsentrasjon19.
Utarbeidelse av riktig materiale er avgjørende for å utføre prosedyren riktig. Vurder antall vann prøver som skal analyseres, og klargjør reagensene og materialet før du flytter til stedet der testen er nødvendig for fremstilling av reagensene og materialet. Flere prøver kan behandles samtidig Hvis riktig mengde materiale er tilgjengelig.
Før du starter konsentrasjonen av en vannprøve, en kjent konsentrasjon av en viral lager vil bli brukt til å Spike prøven som prosesskontroll. Denne metoden bruker en tørket viral lager som er rehydrert med destillert vann før den legges til vann prøven på bruksstedet. Dette er nyttig for å utelukke falske negative resultater på slutten av prosedyren og gir en indikasjon på utførelsen av metoden.
Viral konsentrater oppnådd med VirWaTest kan bli ytterligere testet i feltet bruke VirWaTest nukleinsyre syre utvinning og deteksjon metoder eller, alternativt, konsentrater kan bli sendt til et referanse laboratorium ved romtemperatur. Konserveringsmiddelet løsningen legges til konsentrat gjør at virus å holde seg stabil i opptil 2 uker (upubliserte resultater).
VirWaTest nukleinsyre syre ekstraksjon er en magnetisk partikkel BAS ert metode. Det er lett og rask og innrømmer adskillige eksemplar å bli bearbeidet samtidig og viser ekvivalent og aften bedre det å bli frisk effektiv enn metoder aktuelle anvendt for viral nukleinsyre acid utdrag. Nukleinsyre syrer kan sendes til referanselaboratorier ved romtemperatur eller, hvis brukerne er sikre på å utføre molekylær deteksjon, en kvantitativ PCR-analysen kan utføres på det punktet av bruk av den opprinnelige vann prøven.
Også, hvis et lite laboratorium anlegget er tilgjengelig, den VirWaTest konsentrasjon protokollen kan være koplet til standard nukleinsyre acid utvinning kits som er avhengige av en sentrifuge og standard PCR-baserte metoder som krever en fryser for å opprettholde reagensene, men som bruker standard thermocyclers, som er rimeligere enn batteri drevne.
Men siden en strømforsyning er noen ganger ikke tilgjengelig, har vi optimalisert deteksjon analyser for MS2 bacteriophages som prosesskontroll og HAdV som en viral avføring indikator, og metodikken kan tilpasses for andre virus av interesse, for eksempel hepatitt virus, RoV, NoV, eller andre, skal kjøres i feltet uten å trenge en fryser for vedlikehold av reagensene, eller konvensjonelle thermocyclers men bare en batteridrevet ett. Flere batteridrevne thermocyclers er kommersielt tilgjengelige. Alternativt, hvis en strømforsyning er tilgjengelig, kan annet konvensjonelt qPCR-utstyr brukes. Hvis det brukes åtte rør thermocycler, kan opptil to nukleinsyre yre utdrag (to forskjellige prøver eller to replikerer fra samme prøve) testes i den samme PCR-analysen. For hver nukleinsyre yre ekstraksjon, vil to forskjellige mengder testes for å utelukke enzymatisk hemming som stammer fra prøven. Tilpasningen er basert på tidligere utarbeidelse av PCR-rør av lufttørking primere, sonder, og standard suspensjoner. Det finnes flere lyofilisert kommersielle qPCR-løsninger som kan brukes ved å bruke samme fremgangsmåte som beskrevet her. Vi har beskrevet en mulighet som vi anså som enkle å utføre.
Sammenligning analyser utført under utviklingen av metoden viste at VirWaTest metoder for konsentrasjon, utvinning og deteksjon er effektive for kvantifisering av virus i vann prøver.
Grensen for påvisning (LOD) av den beskrevne prosedyren er variabel siden volumet som er samlet inn etter konsentrasjon er variabel. Dessuten kan LOD være litt forskjellig for ulike virus. Hvis et volum på ca 10 L er samlet, vil LOD for HAdV være rundt 1 x 102 viral GC/L. Så, relativt små konsentrasjoner av HAdV kan oppdages av VirWaTest metoden. I Pedernales (Ecuador), seks av de seks prøvene testet presentert HAdV, i konsentrasjoner nær LOD, alt fra 3,27 x 101 til 1,80 x 102 GC/L. I Banghi (RCA) ble HAdV påvist i en av de fem prøvene som ble analysert, med en konsentrasjon på 3,46 x 102 GC/L. Tilstedeværelsen av HAdV, samt tilstedeværelsen av MS2 som kontrollprosessen i de testede prøvene, viser metoden er nyttig for gjenvinning av virale partikler fra vann prøver, selv når de utføres av nonexperienced brukere.
Tilbakemelding innhentet til nå indikerer at viral konsentrasjon er en enkel prosedyre for å utføre, uten store problemer når den brukes på det punktet av bruk av prøvene, selv om 8 h og 5 h trinn er nødvendig. Det er viktig å merke seg at disse trinnene oppstår uten menneskelig assistanse. Videre er en raskere metode basert på filtrering utvikles som et alternativ for nonturbid farvann. Imidlertid synes flokk ule Rings å være, før nå, den unike metoden som gjør at konsentrasjonen av prøvene presenterer høy turbiditet. Viral konsentrater kan deretter sendes til et laboratorium rundt om i verden ved romtemperatur, noe som også gjør det enklere å teste virus siden prøvetaking områder ikke alltid har gode transporttjenester som gir kjøling forhold. Alternativt, det trekking og oppdagelsen protokoller forevist her over tillate tester for viral oppdagelsen for punktet av bruk av prøvene.
Så vidt vi vet, er dette den første metoden rapportert å være nyttig for konsentrasjon og testing for tilstedeværelsen av virus i vann prøver i feltet. Videre tiltak bør gjennomføres for å bruke prosedyren til evaluering av tilstedeværelsen av menneskelige viral patogener av interesse i flere andre humanitære krise scenarier. I tillegg vil brukerens tilbakemelding være nødvendig for å gi innsikt i den potensielle implementeringen for å gjøre prosedyren vennligere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
VirWaTest var et forskningsprosjekt finansiert av HIF (humanitære Innovasjons fond) program for ELHRA (styrking læring & forskning for humanitær bistand). Forfatterne erkjenner WASH lagene som vennlig samarbeidet i denne studien. Analysen av prøvene i Ecuador ble finansiert av Oxfam Ecuador og Dirección de Investigaciones de la Universidad de Las Americas (AMB. BRT. 17.01). S. Bofill-mas er en Serra-Hunter stipendiat ved Universitetet i Barcelona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
