Summary
Здесь мы представляем VirWaTest, который является простым, доступным и портативным методом для концентрации и обнаружения вирусов из образцов воды в точке использования.
Abstract
Вирусы, выделяемые людьми и животными, могут загрязнять источники воды и представлять опасность для здоровья человека, когда эта вода используется для питья, орошения пищевых продуктов, мытья и т.д. Классический индикатор фекальных бактерий не всегда проверяет наличие вирусных патогенов, поэтому обнаружение вирусных патогенов и вирусных показателей имеет отношение к принятию мер по снижению риска, особенно в гуманитарных сценариях и в районах где часто происходят вспышки вирусной инфекции, передаваемой через воду.
В настоящее время для тестирования в точке использования доступно несколько коммерческих тестов, позволяющих количественно определить бактерии фекальных индикаторов (FIB). Однако такие коммерческие тесты недоступны для обнаружения вирусов. Обнаружение вирусов в пробах воды в окружающей среде требует концентрации нескольких литров в меньших объемах. Кроме того, после сосредоточения, обнаружение вирусов опирается на такие методы, как добыча нуклеиновой кислоты и молекулярное обнаружение (например, полимераза цепной реакции (PCR основе анализов) вирусных геномов.
Описанный здесь метод позволяет концентрацию вирусов из 10 L проб воды, а также извлечение вирусных нуклеиновых кислот в точке использования, с простым и портативным оборудованием. Это позволяет проводить тестирование проб воды в точке применения нескольких вирусов и полезно в гуманитарных сценариях, а также в любом контексте, где не имеется оборудованной лаборатории. Кроме того, метод позволяет концентрировать вирусы, присутствующие в пробах воды, и отгружать концентрат в лабораторию при комнатной температуре для дальнейшего анализа.
Introduction
На первых этапах любой чрезвычайной гуманитарной помощи доступ к чистой воде, санитарии и гигиене имеет решающее значение для выживания пострадавших. Поэтому мониторинг качества воды является приоритетной задачей для предотвращения вспышек воды. Хорошо известно, что загрязненная вода часто является источником заболеваний, но часто бывает трудно определить источники вирусных вспышек, таких как вирус гепатита Е (HEV), даже при наличии обычных лабораторных методов. Контроль качества воды основан на количественной оценкеFIB 1, 2,3,4. Тем не менее, было широко документировано, что нет никакой корреляции между отсутствием FIB и наличие вирусных патогенов, передающихся через воду, таких как ротавирус (RoV), норовирус (NoV), или HEV5,6. Таким образом, использование критериев качества воды, основанных на FIB, может привести к недооценке рисков, связанных с наличием вирусных патогенов, передающихся через воду. Наблюдение за вирусами индикаторов, такими как аденовирусы человека (HAdV), или конкретные патогенные микроорганизмы будут полезны в определении воздействия вирусных патогенов и выявлении потенциального источника инфекции человека7,8, 9,10 и в проверке эффективности санитарных мер11.
До сих пор выявление вирусов в этих сценариях опиралось на квалифицированный персонал и сложную логистику. VirWaTest (virwatest.org) направлена на разработку простого, доступного и портативного метода концентрации и последующего обнаружения вирусов из проб воды в момент использования.
Концентрация вируса основана на принципе органической флоккуляции 10 Л проб воды, с помощью которых вирусы восстанавливаются в меньших объемах12,13. Флоксы собираются и добавляются в буфер, который лизирует вирусы и предотвращает деградацию нуклеиновых кислот при их комнатной температуре не более 2 недель.
Метод извлечения нуклеиновой кислоты основан на использовании магнитных частиц, к которым адсорбируются нуклеиновые кислоты. Они могут быть переданы из одного буфера стирки в другой и, наконец, в буфер elution с помощью магнитной пипетки, к которой прикрепляются частицы. Полученные вирусные нуклеиновые кислотные суспензии могут быть отправлены в референтную лабораторию, где обнаружение может быть выполнено с использованием молекулярных методов, основанных на ПЦР. Для каждой добычи нуклеиновой кислоты, два различных количества тестируются, чтобы исключить ферментативное ингибирование, возникшее в образе. Кроме того, при минимальной доступности оборудования, ПЦР-тесты могут быть запущены в точке использования. Весь процесс предназначен для выполнения независимо от источника питания(рисунок 1).
Количественный ПЦР-аналитика для обнаружения HAdV, выведенного человеком и обнаруженного в пробах сточных вод в высоких концентрациях, был адаптирован для запуска в точке применения. HAdV используются в качестве человека фекальные вирусные показатели. ПЦР для количественной оценки бактериофага MS2 также был адаптирован, так как MS2 используется в VirWaTest в качестве управления процессом. Метод может быть настроен для обнаружения любого вируса, интересуемого.
После разработки метод VirWaTest был применен пользователями в двух различных условиях в Центральноафриканской Республике (RCA) и Эквадоре, обеспечивая обратную связь о применении протокола в реальных ситуациях.
Насколько нам известно, это первая процедура, которая позволяет концентрации и обнаружения вирусов в точке использования, независимо от какого-либо источника питания, большого оборудования и условий замораживания/охлаждения. Рекомендуется собрать по две реплики каждого образца воды, чтобы получить надежные результаты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка и упаковка
ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы/оборудование, которые будут упакованы, перечислены в таблице 1. Используйте перчатки для обработки реагентов, необходимых для контроля процесса, реагентов концентрации, реагентов для извлечения нуклеиновой кислоты и реагентов обнаружения. Носите защитные очки для обработки реагентов, необходимых для извлечения нуклеиновой кислоты.
- Контроль процессов
- Подготовка MS2 бактериофаг фондовой культуры (Американская коллекция культуры типа (ATCC) 15597-B1), содержащий 1 х 1010 PFU/mL в лаборатории, следуя процедуре ISO 10705-1:199514.
- Затем, aliquot 10 qL подвески на трубку, содержащую 1 х 108 PFU в 10 мл труб и пусть вода испаряется при 37 градусов по Цельсию. Используйте одну трубку на образец воды.
- Кроме того, приготовьте одну трубку, содержащую 10 мл стерильной дистиллированной воды на собранный образец.
- Концентрационные реагенты
- Для префлокированного обезжиренного молочного раствора (PSM) используйте следующие количества, чтобы сконцентрировать пять проб воды 10 л.
- Приготовьте пластиковую трубку, содержащую 5 г обезжиренного молока.
- Приготовьте полиэтиленовый пакет на молнии, содержащий 16,66 г морских солей.
- Приготовьте пластиковую бутылку, содержащую 500 мл дистиллированной воды.
- Подготовьте реагенты, необходимые для регулировки рН. Используйте следующие суммы для регулировки рН PSM и пяти 10 l проб воды.
- Добавьте 5 г лимонной кислоты 1-гидрат ампрогидат в пластиковую трубку 10 мл.
ВНИМАНИЕ: Лимонная кислота вызывает серьезное раздражение, когда он вступает в контакт с глазами. Если это происходит, ополчить глаз осторожно с водой в течение нескольких минут. Если раздражение сохраняется, обратитесь к врачу. - Положите 2 г гидроксида натрия в пластиковую трубку 10 мл.
ВНИМАНИЕ: Гидроксид натрия может вызвать сильные ожоги кожи и повреждения глаз. Если проглотить, промыть рот. Не вызывайте рвоту. Если он соприкасается с глазами, осторожно смыть водой в течение нескольких минут. Затем обратитесь к врачу. - Положите 25 мл стерильной дистиллированной воды в пластиковый контейнер.
- Положите 50 мл стерильной дистиллированной воды в пластиковый контейнер.
- Добавьте 5 г лимонной кислоты 1-гидрат ампрогидат в пластиковую трубку 10 мл.
- Подготовьте пакетик кондиционирования образца, используемый для флоккуляции, консервантный раствор, используемый для сохранения нуклеиновых кислот, и нейтрализующий пакетик для нейтрализации отбрасываемой воды и материалов. Используйте следующие суммы для каждого образца воды 10 Л для тестирования.
- Положите 15 г морских солей и 8 г лимонной кислоты 1-гидрат в застежку-молнию полиэтиленовый пакет для кондиционирования пакетик.
- Добавьте 2 мл буфера лизиса(Таблицаматериалов) и 0,3 мл агента сохранения нуклеиновой кислоты (Таблицаматериалов)в трубку 5 мл.
ВНИМАНИЕ: Лисис буфер содержит гуанидин тиоцианат и Тритон X-100. Контакт с кислотой высвобляет токсичный газ, и это вредно, если проглотить, вдыхать, или вступает в контакт с кожей. Если проглотить, промыть рот. Не вызывайте рвоту. Если он соприкасается с кожей, мыть с большим количеством воды. Затем обратитесь к врачу. Нуклеиновая кислота, сохраняющая агент вызывает раздражение кожи и глаз и вредно при проглатывании. Если он соприкасается с кожей или глазами, промыть обильной водой в течение нескольких минут. В любом случае, особенно если проглотил и чувствует себя плохо, обратитесь к врачу. - Положите 40 г порошка моющего средства в четыре пластиковых пакета молнии.
ВНИМАНИЕ: Порошковое моющее средство вызывает раздражение глаз. Если он соприкасается с глазами, промыть обильной водой в течение нескольких минут. Если раздражение сохраняется или если проглотил, обратитесь к врачу.
- Для префлокированного обезжиренного молочного раствора (PSM) используйте следующие количества, чтобы сконцентрировать пять проб воды 10 л.
- Реагенты по извлечению нуклеиновой кислоты
- Положите 50 л магнитных частиц(Таблицаматериалов) и 1 мл этанола 96% в трубку 5 мл, которые составляют связывающий буфер.
ВНИМАНИЕ: Магнитные частицы буфера содержит азид натрия, который образует токсичный газ, когда он вступает в контакт с кислотами или ионами тяжелых металлов и является токсичным, если попадает или когда он вступает в контакт с кожей. При погловал или в контакте с кожей, промыть рот или кожу с обильной водой и обратиться к врачу. Этанол является легковоспламеняющейся жидкостью и паром и вызывает серьезное раздражение глаз. Держитесь подальше от тепла, горячих поверхностей, искр и любого другого источника зажигания. Если он соприкасается с кожей или глазами, промыть обильной водой. В случае проглатывания большого количества воды и/или при вдыхании выйдите на свежий воздух на свежий воздух. В любом случае, обратитесь к врачу. - Добавьте 500 кЛ, 600 л и 200 л стиральных буферов 1, 2 и 3, соответственно(Таблицаматериалов), к трем трубам 2 мл.
ВНИМАНИЕ: Стиральные буферы содержат гиоцинат тиоцианат и хлорид гуанидиний, которые вредны при вдыхании или проглатывании и раздражают кожу и глаза. Контакт с кислотами высвобождает очень токсичный газ. Если они вступают в контакт с кожей или глазами, промыть обильной водой. Если проглотить, промыть рот с обильной водой. Не вызывайте рвоту. Всегда обращитесь за медицинской консультацией. - Добавьте 120 л буфера elution(Таблицаматериалов) к трубке 0.5 mL.
- Положите 50 л магнитных частиц(Таблицаматериалов) и 1 мл этанола 96% в трубку 5 мл, которые составляют связывающий буфер.
- Реагенты обнаружения HAdV и MS2
ПРИМЕЧАНИЕ: Две различные реакции извлечения нуклеиновой кислоты могут быть проанализированы одновременно в каждом анализе ПЦР, если 8-колодец термоциклер используется. Для всех анализов ПЦР, подготовить молекулярной биологии воды aliquoted в 1,5 мл труб.-
Обнаружение HAdV
- Подготовьте смесь, содержащую 10 кЛ из 22,5 мкм AdF вперед грунтовки, 10 зЛ 22,5 мкм AdR обратной грунтовки, и 5 зл 11,25 мкм AdP зонд (Таблица 2).
- Добавьте 2,5 л смеси в трубки от 1 до 8 прокладки трубки. Дайте ему высохнуть при комнатной температуре, закройте трубки и защитите их от света.
- Разрежьте полосу, разделяющую ее на две полосы: трубки 1-5 и трубки 6-8.
- Подготовьте серийное разбавление суспензий ДНК, содержащих нуклеотидную последовательность усиленной области HAdV. Воздушно-сухие 1 л суспензий, содержащих 1 х 105, 1 х 107,и 1 х 109 GC/mL в трубки 6-8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите трубки, содержащие грунтовки, зонд, и высушенные воздухом суспензии защищены от света.
-
Обнаружение MS2
- Подготовьте смесь, содержащую 10 зл 25 мкм pecson-2F передний грунт, 10 зл из 25 мкм pecson-2R обратной грунтовки, и 2,5 зл и 25 мКМ PecP-2 зонда (Таблица 2).
- Добавьте 2,25 л смеси в трубки от 1 до 8 прокладки трубки. Дайте ему высохнуть при комнатной температуре, закройте трубки и защитите их от света.
- Разрежьте полосу, разделяющую ее на две полосы: трубки 1-5 и трубки 6-8.
- Продолжить как в шаге 1.4.1.4, но использовать стандартную подвеску, предназначенную для MS2 вместо.
-
Обнаружение HAdV
2. Вирусная концентрация
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки в любое время во время сбора проб, подготовки реагентов, флоккуляции, сбора флоксов и процедур удаления отходов. Носите защитные очки во время процедуры подготовки реагента.
- Коллекция образцов
- Соберите 10 л образца воды в плоском нижнем ведре с крышкой. Соберите минимум две реплики для каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать прозрачные ведра для визуализации гранул. Если образец воды содержит взвешенный материал (например, песок, водоросли), пусть это осадок, а затем, собирать воды супернатант в новом ведре. - Зарегистрируйте собранный объем, а также дату расположения и сбора для каждого образца воды.
- Положите магнитный мешалку, подключенную к батарее под поддержкой ведра и поместите ведро, содержащее образец воды, на его поддержку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ищите плоскую поверхность в свежем месте и держите ведра, содержащие образцы воды от прямых солнечных лучей.
- Соберите 10 л образца воды в плоском нижнем ведре с крышкой. Соберите минимум две реплики для каждого образца.
- Подготовка реагентов
-
реагенты реагенты реагенты регулировки pH
- Налейте порошок лимонной кислоты и гранулы гидроксида натрия в кастрюли, содержащие 25 и 50 мл дистиллированной воды, соответственно.
- Аккуратно встряхните вручную до полного растворения лимонной кислоты и гидроксида натрия.
ВНИМАНИЕ: Не наливайте воду на гранулы гидроксида натрия. Вместо этого, залить натрия гидроксида гранулы над водой.
-
Префлоккуляция обезжиренного молока
- Поместите стоячий мешок на магнитный мешалку и залить 500 мл дистиллированной воды в нем. Бросьте помешивающий магнит внутри мешка и включите магнитный мешалку.
- Налейте содержимое пакетика морской соли и обезжиренной молочной трубки в стоячий мешок и перемешать в течение 5 минут на средней скорости, чтобы растворить их.
- Добавьте 3 мл лимонной кислоты в раствор PSM с помощью пипетки Pasteur, чтобы убедиться, что рН находится между 3,4 и 3,6. Измерьте рН раствора PSM с помощью полос индикатора pH. Добавить меньшее количество лимонной кислоты и гидроксида натрия, как рН становится ближе к 3,5.
- Выключите магнитный мешалку и убедитесь, что флоксы видны. Используйте фонарик, чтобы помочь визуализировать флоксы.
-
реагенты реагенты реагенты регулировки pH
- Флокуляции
- Бросьте помешивающий магнит в воду, установите магнитную мешалку на максимальной скорости и включите его. Убедитесь, что помешивая магнит начинает вращаться.
- Добавьте 10 мл дистиллированной воды в трубку управления процессом. Перевернуть трубку несколько раз, чтобы регидратировать вирусный запас и залить раствор в воду.
- Налейте содержимое одного образца кондиционирования пакетик в воду и перемешать в течение 5 минут.
- Измерьте рН образца воды с помощью полос индикатора рН. Добавьте несколько капель лимонной кислоты или гидроксида натрия в образец воды, чтобы убедиться, что рН находится между 3,4 и 3,6. Добавить меньшее количество лимонной кислоты и гидроксида натрия, как рН становится ближе к 3,5.
- Добавьте 100 мл раствора PSM с помощью контейнера объемом 100 мл.
- Запечатать ведро крышкой, установить магнитный мешалку на минимальной скорости, и оставить воду помешивая на 8 ч.
- Выключите магнитный мешалку и пусть вода еще, по крайней мере 5 ч, чтобы флоксы осесть.
- Коллекция Floc
- Построить систему сифонирования, состоящую из контроллера пипетки, двух пипетки, и пластиковой трубки, чтобы аспирировать супернатант воды для разрядки воды на флоксах.
- Прикрепите 10 мл ленты конец пипетки на контроллер пипетки. Затем прикрепите кончик пипетки к пластиковой трубке.
- Снимите фильтр 10 мл пипетки с открытым наконечником с помощью пинцета и прикрепите пипетку к пластиковой трубке.
- Поместите пустое ведро на пол.
- Погрузите кончик пипетки с открытым наконечником в воду. Убедитесь в том, чтобы держать его близко к поверхности воды, чтобы избежать тревожных флоксов. Призадыхать о водном супернатанте, пока не достигнет котлеты на пленке.
- Pinch пластиковой трубки к концу прилагается к ленте конце пипетки и отсоедините его от пипетки.
- Поместите трубку в пустое ведро. Отпустите давление на трубку, чтобы вода текла в пустое ведро.
- Pinch пластиковой трубки, чтобы остановить поток воды, когда уровень воды вот-вот достигнет перемешивания магнита и переместить пипетку от ведра.
- Встряхните ведро, чтобы повторно приостановить flocs и залить их в 500 мл стоячий полиэтиленовый пакет. Разрешить флоксы, чтобы согласиться на 1 ч больше.
- Тщательно аспирируйте водный супернатант с помощью 50 мл пипетки и ручного контроллера пипетки, избегая нарушения флоксов.
- Приготовьте флоксы с помощью 100 мл пипетки и перенесите их в 50 мл центрифуги трубки. Запишите окончательный объем концентрата образца и перенесите 1 мл его в трубку 5 мл, содержащую консервантный раствор, используя пипетку Pasteur.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы центрифуга трубки градуирована, чтобы окончательный объем концентрированного образца можно было измерить как можно точнее и зарегистрировать. - Выполните добычу нуклеиновой кислоты в поле. Кроме того, храните консервантный раствор, содержащий вирусы, на уровне 20-30 градусов по Цельсию в течение 15 дней или отправляем их в справочную лабораторию для дальнейшего анализа.
- Построить систему сифонирования, состоящую из контроллера пипетки, двух пипетки, и пластиковой трубки, чтобы аспирировать супернатант воды для разрядки воды на флоксах.
- Утилизация отходов и повторное использование материалов
- Добавьте содержимое нейтрализуемого саше в ведро, содержащее отбрасываемую воду. Смешайте воду, а затем, оставить его еще на 30 минут.
- Утилизация очищенной воды в качестве общего отхода.
- Поместите пипетки и пластиковую трубку в ведро. Заполните ведро водой и влить содержимое одного нейтрализуя агента пакетик.
- Вымойте их, по крайней мере 30 минут, чтобы стерилизовать их и промыть их с обильной чистой водой, чтобы удалить все оставшиеся нейтрализующего агента.
3. Добыча нуклеиновой кислоты
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и всегда носите защитные очки во время процедуры извлечения нуклеиновой кислоты.
-
Операция магнитных пипетков
- Ознакомьтесь с работой магнитного пипетки перед выполнением экстракции.
-
Добыча нуклеиновой кислоты
- Упорядочить трубки, содержащие реагенты, необходимые для извлечения в стойке, слева направо: связывание буфера, стиральные буферы, и elution буфера. Установите соответствующее количество трубок в зависимости от количества анализируемых образцов или репликатов.
- Передача 1 мл образца концентрата в трубку, содержащую связывающий буфер, с помощью одноразовой пипетки Pasteur. Перевернуть трубку 8x до 10x, чтобы гомогензизировать раствор.
- Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 10 минут при непрерывном смешивании, либо с помощью орбитальной энергии на солнечных батареях, либо вручную.
- Соберите магнитные частицы с помощью магнитного пипетки и чистого наконечника, который может быть повторно использован для трех стиральных буферов.
- Отпустите магнитные частицы в трубку, содержащую 500 злиц моющих буфера 1. Вымойте их, осторожно встряхивая раствор кончиком в течение 30 с и собирать их.
- Перенесите магнитные частицы в трубку, содержащую 600 злителю стирального буфера 2. Вымойте их, осторожно встряхивая раствор кончиком в течение 30 с и собирать их.
- Перенесите магнитные частицы в трубку, содержащую 200 зл и буфер для мытья 3. Вымойте их, осторожно встряхивая раствор кончиком в течение 30 с и собирать их.
- Отпустите магнитные частицы в трубку, содержащую буфер elution, и отбросьте кончик.
- Инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 5 минут при непрерывном смешивании, используя орбитальную энергию на солнечных батареях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание магнитных частиц в буфере elution является важным шагом. При отсутствии орбитальной, непрерывно смешивать вручную во время инкубации времени. - Замените наконечник на магнитной пипетке на новый и соберите магнитные частицы из буфера elution. Убедитесь в том, чтобы полностью удалить магнитные частицы из буфера elution, поскольку они могут вмешиваться в молекулярные методы обнаружения.
- Отбросьте кончик с прикрепленными к нему частицами. Продолжить анализ ПЦР, отправить буфер elution в референтную лабораторию, или хранить буфер elution в при 4 кВ для дальнейшего анализа.
4. Вирусное обнаружение с аккумуляторной 8-трубкой в режиме реального времени термоциклер
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки и всегда носите защитные очки во время процедуры обнаружения нуклеиновой кислоты. Замените перчатки на новые при выполнении нового эксперимента ПЦР, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
-
HAdV количественный ПЦР
- Добавьте 14 qL безнужной воды в трубки 2, 4 и 5.
- Добавьте 4 qL смеси ПЦР в трубки 1-5.
- Добавьте 14 qL извлечения нуклеиновой кислоты из образца А в трубку 1 и 14 Л из образца В в трубку 3.
- Добавьте 2 злицы извлеченных нуклеиевых кислот из образца А в трубку 2 и 2 Зл из образца В в трубку 4. Закройте пятитрубную полосу.
- Добавьте 14 qL безнужной воды в трубки 6, 7 и 8.
- Добавьте 4 qL этой смеси в трубки 6, 7 и 8, и закройте их.
- Положите обе полосы в термоциклер и выберите соответствующий пробег(Таблица 3).
- Откажитесь от водяной трубки и держите извлеченную нуклеиновую кислоту в морозильной камере, если это возможно, или, если нет, то в свежем месте, защищенном от света в случае, если необходимо провести второй тест.
- Очистите микропипетты, стойку, рабочий материал и весь материал должным образом с нуклеиновой кислотой чистых, и отказаться от полиэтиленового пакета, содержащего использованный кончик, перчатки и трубки.
ВНИМАНИЕ: Удаление нуклеиновой кислоты является очень легковоспламеняющейся жидкостью и паром. Не дышите в тумане спрей и избежать любого контакта жидкости с глазами или кожей. В противном случае, сразу промыть обильной водой и обратиться к врачу. - Соберите результаты и проанализируйте полученные данные.
-
MS2 количественный ПЦР
- Добавьте 14 qL безнужной воды в трубки 2, 4 и 5.
- Добавьте 4 зЛ смеси ПЦР и 0,5 л фермента обратной транскриптазы в трубки 1-5.
- Добавьте 14 qL извлечения нуклеиновой кислоты из образца А в трубку 1 и 14 Л из образца В в трубку 3.
- Добавьте 1 зл и l извлеченных нуклеиевых кислот из образца А в трубку 2 и 1 Зл из образца В в трубку 4. Закройте пятитрубную полосу.
- Добавьте 15,5 кл.л воды без нуклеаза в трубки 5, 6, 7 и 8, и закройте их.
- Добавьте 4 зЛ смеси ПЦР и 0,5 л фермента обратной транскриптазы в трубки 6, 7 и 8.
- Положите обе полосы в термоциклер и выберите соответствующий пробег(Таблица 3).
- Продолжить, как описано в шагах 4.1.8 до 4.1.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Разработка метода
Эта процедура была разработана в Лаборатории вирусов загрязняющих веществ воды и продуктов питания в сотрудничестве с GenIUL и Oxfam Интерман. Она состоит из трех различных шагов. Первый, концентрация вирусных частиц, является адаптацией метода обезжиренного молока флоккуляции ранее описанных12,17,18. Первоначальный метод был изменен, чтобы быть независимым от источника питания, проще, и без шагов центрифугирования.
Восстановление метода концентрации VirWaTest было протестировано в пробах грунтовых вод HAdV и MS2. Вирусный восстановления VirWaTest концентрации и извлечения метод, по оценкам, 3,01% до 18,02% для MS2 и 17,52% до 44,22% для HAdV. Эти излечения были рассчитаны на основе значений, полученных с помощью количественного ПЦР в ходе разработки метода по сравнению с первоначальными концентрациями HAdV и MS2 в пробах воды после пикирования их с известными концентрациями этих вирусных запасов.
Извлечение магнитной нуклеиновой кислоты VirWaTest было сравнено с коммерческим мини-комплектом РНК (например, мини-комплектом вирусной РНК) и концентрированным концентрированным методом извлечения на основе столбцов, который использовался в лаборатории, путем тестирования 33 образцов рек и грунтовых вод с помощью HAdV и MS2 и концентрированных обезжиренным молоком флоккуляцией. Результаты сравнения показали, что восстановление метода VirWaTest было выше в 23/33 случаях для HAdV, а также для MS2 (Таблица 4). Тест Уилкоксона показал p-значения 0.0005569 для HAdV и 0.02791 для MS2. Извлечение нуклеиновой кислоты VirWaTest обеспечивает значительно более высокое вирусное восстановление, чем коммерческое.
Обнаружение HAdV в пробах воды в окружающей среде, сосредоточенных методом VirWaTest
Для проверки разработанного метода вирусной концентрации в полевых условиях команда Oxfam Water, Sanitation and Hygiene (WASH), расположенная в Банги (RCA), в марте 2017 года собрала и концентрировала вирусы из пяти проб воды скважины.
Кроме того, в районе Педерналеса (Эквадор), пострадавшего от землетрясений в 2016 и 2017 годах, шесть проб воды были собраны командой Oxfam WASH в феврале 2017 года, и ее вирусы были сконцентрированы методом концентрации VirWaTest. Вирусные концентраты из обоих параметров были отправлены в лабораторию в Барселоне для извлечения нуклеиновой кислоты VirWaTest и вирусной количественной оценки.
В Эквадоре, естественно ежеподобный HAdV были обнаружены в шести из шести проанализированных образцов, с значениями концентрации от 3,27 х 10до 1,80 х 102 GC/L, в то время как один из пяти образцов, собранных и сосредоточенных в Банги (RCA) испытания положительный для HAdV, в концентрации 3,46 х 102 GC / L (Таблица5).
MS2, добавленный ко всем проверенным образцам в качестве внутреннего контроля процесса, был обнаружен во всех проверенных образцах, показывая, что метод был правильно выполнен от концентрации до обнаружения.
Рисунок 1 : Метод VirWaTest. Обзор шагов, из шагах составлен метод VirWaTest. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Материалы | Концентрации | Добыча нуклеиновой кислоты | Обнаружения |
| Оборудование | Магнитный Стирлер (2 единицы) Аккумулятор (2 единицы) Аккумулятор/ Стиршер-коннекторов (2 единицы) Адаптеры питания (2 единицы) Поддержка ковша (2 единицы) Веревка (1 единица) Перемешивая магнит (3 единицы) Пинцет (1 единица) Силиконовый Тюбинг (1 единица) Пипетка Контроллер (1 единица) Маркер (1 единица) |
Магнитная пипетка (1 единица) Солнечная Ротари Платформа (1 единица) Многоразмерная трубная стойка (1 единица) Таймер (1 единица) |
Термоциклер (1 единица) Аккумулятор (1 единица) Компьютере Трубка Стойка (1 единица) 0,5 л - 10 мл микропайпет (1 единица) 2 зл- - 20 мл микропайпет (1 единица) |
| Расходные материалы и реагенты (на каждые 2 пробы воды/репликации) | Ковш (3 единицы) полоски индикаторов pH Лента-Конец 10 мл Пипетта (2 единицы) Открытый Совет 10 мл Пипетта (2 единицы) Лента-Конец 50 мл Пипетта (2 единицы) Лента-Конец 100 мл Пипетта (2 единицы) Пастер Пайпетт (4 единицы) Стоячий пластиковый пакет (4 единицы) Пластиковый контейнер с 25 мл дистиллированной воды (1 единица) Пластиковый контейнер с 50 мл дистиллированной воды (1 единица) 100 мл Пустой контейнер (1 единица) Перчатки (6 пар) Управление процессом (2 трубки) Трубка с 10 мл дистиллированной воды (2 единицы) Кислота (1 труба) Гидроксид натрия (1 труба) Обезжиренное молоко (1 труба) Лимонная кислота Саше (1 единица) Дистиллированная вода (1 500 мл бутылки) Кондиционирование образцов (2 саше) Консервантное решение (2 трубки) Нейтрализующий агент (4 саше) |
Магнитные Пипетки Советы (2 единицы) Пастер Пайпетт (2 единицы) Связывание буфера (2 трубки) Стиральный буфер 1 (2 трубки) Стиральный буфер 2 (2 трубки) Стиральный буфер 3 (2 трубки) Обезлививание буфера (2 трубы) Перчатки (6 пар) |
10 советы микропайпета (1 коробка) 20 советов микропайпета (1 коробка) Днк qPCR Mix (1 труба) RNA qPCR Mix (1 труба) Обратный фермент транскриптазы (1 труба) Молекулярная биология воды (1 Труба) HAdV Трубная полоса с грунтовки, зонд и стандартные (1 единица) MS2 Трубная полоса с грунтовками, зондом и стандартом (1 единица) Удаление нуклеиновой кислоты Перчатки (6 пар) |
Таблица 1: Содержимое VirWaTest. Оборудование, расходные материалы и реагенты, которые должны быть подготовлены для концентрации, извлечения и обнаружения вирусов в двух пробах воды/репликациях.
| Вирус | Грунтовки | Номер присоединения Генбанка | Позиции | Последовательность (5'u20123') | Длина | Ссылки | ||
| Аденовирус человека (HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869-у20121887 | CWTACATКакАТККСКСГГ | 19 лет | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919-18937 годы | CRCGGGCRAAYTGCACCAG | 19 лет | |||||
| AdP1 | 18890-х годов 201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTACTCCGAGGCGTGTT-BMN-No535 | 27 | |||||
| МС2 Бактериофаг (MS2) | pecson-2F | NC-001417.2 | 344-й ук2012363 | AAGGTGCCTACAGCGAAGT | 20 | Pecson et al., 200916 | ||
| pecson-2R | 659-u2012678 | ТТКГТАГгГАГГГАГГТАГТАГТАГТГК | 20 | |||||
| PecP-2 | 369-й u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGTCGCGGTACG-BH-1 | 20 | |||||
Таблица 2: Олигонуклеотиды для количественных экспериментов ПЦР. Праймеры и зонд, предназначенные для связывания с последовательностями нуклеиновой кислоты HAdV и MS2.
| Температура | Время | Циклов | Температура | Время | Циклов |
| 95 кв. c | 12 мин. | 1 | 55 кк с | 15 мин. | 1 |
| 95 кв. c | 10 мин. | 1 | |||
| 95 кв. c | 15 с | 40 г. | 95 кв. c | 15 с | 40 г. |
| 60 кк | 1 мин. | 60 кк | 1 мин. |
Таблица 3: Тепловые условия для количественных экспериментов ПЦР. Температура, время и циклы, используемые для усиления HAdV и MS2.
| ЗИАген | VirWaTest | ЗИАген | VirWaTest | ||
| Средний | 2.53 x 103 | 2.43 x 103 | 4.74 x 104 | 5.13 x 104 | |
| Означает | 1.74 x 104 | 3.12 x 104 | 4.24 x 104 | 5.97 x 104 | |
| Sd | 5.66 x 105 | 2.23 x 106 | 4.49 x 104 | 1.63 x 105 | |
| p-значение (Уилкоксон) для HAdV: 0.0005569 | |||||
| p-значение (Уилкоксон) для MS2: 0.02791 | |||||
| Вирус протестирован | Образцы Протестированы | ЗИАген | Тест VirWa | ||
| HAdv | 33 | 10 Лет | 23 | ||
| MS2 | 33 | 10 Лет | 23 | ||
Таблица 4: Развитие добычи нуклеиновой кислоты VirWaTest. Медианные значения, средние и SD, полученные при сравнении методов извлечения Циагена и VirWaTest в 33 пробах грунтовых вод для HAdV и MS2.
| Страны | Сайта | Образец | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 | Nd |
| Иль Бонгоссуа, Деревня 1 | 2 | Nd | |
| Иль Бонгоссуа, Деревня 3 | 3 | Nd | |
| Банги, Puits квартал Фондо | 4 | Nd | |
| Банги, Пуитс Квартал Ямбасса | 5 | 3.64 x 102 | |
| Эквадор | Скважина А | 6 | 7.96 x 101 |
| Скважина B | 7 (г. | 1.80 x 102 | |
| Скважина C | 8 | 8.88 x 101 | |
| Ну вода А | 9 До 9 | 6.06 x 101 | |
| Ну вода B | 10 Лет | 1.12 x 102 | |
| Ну вода C | 11 Год | 3.27 x 101 |
Таблица 5: Количественная оценка HAdV с использованием метода VirWaTest. Количественные результаты ПЦР, выраженные в GC/liter, для HAdV, количественные в пробах воды, собранных и сконцентрированных из РКА и Эквадора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод VirWaTest позволяет концентрацию вирусов и извлечения нуклеиновой кислоты из проб воды в точке использования неопытными пользователями. Это доступный, быстрый и простой протокол. Концентрация основана на принципе органической флоккуляции с использованием обезжиренного молока, с помощью которого низкий рН и высокие условия проводимости делают обезжиренные молочные белки, агрегатированные в флоксы, к которым адсорбирует сяд. Когда осадки флокса, легко собрать их, что позволяет сконцентрировать 10 л воды, в то время как традиционные ультрацентрифугирования не могут иметь дело с большими объемами воды.
Метод был изменен для того, чтобы быть практически осуществимым в точке отбора проб без использования какого-либо электрического оборудования, за исключением аккумулятора магнитного мешалки. Некоторые другие подходы, основанные на фильтрации воды, были адаптированы к концентрации вирусов, а также могут быть выполнены в точке использования. Однако взвешенный материал, присутствующий в пробах воды, часто закупорывает фильтры; таким образом, небольшой объем, который может быть сконцентрирован с этими системами, является серьезным ограничением.
Это первое описание метода концентрации вирусов из проб воды в точке использования, независимо от мутности образца. Метод концентрации VirWaTest позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно, если имеется соответствующий материал. Кроме того, обезжиренное молоко флоккуляция была показана, чтобы быть полезным для бактерий и паразитов концентрации19.
Подготовка соответствующего материала имеет решающее значение для правильного выполнения процедуры. Рассмотрим количество проб воды, которые будут проанализированы, и подготовьте реагенты и материалы перед переездом в место, где тест необходим для подготовки реагентов и материала. Несколько образцов могут быть обработаны одновременно, если имеется соответствующее количество материала.
Перед началом концентрации образца воды, известная концентрация вирусного запаса будет использоваться для шипа образца в качестве контроля процесса. Этот метод использует сушеный вирусный запас, который регидратируется с дистиллированной водой, прежде чем добавить в образец воды в точке использования. Это полезно, чтобы исключить ложно-отрицательные результаты в конце процедуры и дает указание на производительность метода.
Вирусные концентраты, полученные с помощью VirWaTest, могут быть дополнительно протестированы в поле, применяя методы извлечения и обнаружения нуклеиновой кислоты VirWaTest или, в качестве альтернативы, концентраты могут быть отправлены в референтную лабораторию при комнатной температуре. Консервант, добавленный в концентрат, позволяет вирусам оставаться стабильными в течение 2 недель (неопубликованные результаты).
Извлечение нуклеиновой кислоты VirWaTest является методом, основанным на магнитных частицах. Это легко и быстро и позволяет несколько образцов, которые будут обработаны в то же время и показывает эквивалент и даже лучшую эффективность восстановления, чем методы, используемые в настоящее время для вирусных извлечений нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты могут быть отправлены в справочные лаборатории при комнатной температуре или, если пользователи уверены в выполнении молекулярного обнаружения, количественный анализ ПЦР может быть выполнен в точке использования исходного образца воды.
Кроме того, если имеется небольшой лабораторный объект, протокол концентрации VirWaTest может быть соединен со стандартными комплектами для извлечения нуклеиновой кислоты, которые зависят от центрифуги и стандартных методов на основе ПЦР, которые требуют морозильника для поддержания реагентов, но используют стандартные термоциклы, которые дешевле, чем батарейки них.
Однако, поскольку блок питания иногда не доступен, мы оптимизировали анализы обнаружения для ms2 бактериофагов как контроль процесса и HAdV как вирусный фекальный индикатор, и методология может быть настроена для любого другого вируса, интересующегося, таких как гепатит вирусы, RoV, NoV, или другие, которые будут работать в поле без необходимости морозильник для обслуживания реагентов, ни обычных термоциклов, но только батареи один. Несколько термоциклов, работающих от аккумулятора, доступны на коммерческой основе. Кроме того, при наличии источника питания может быть использовано другое обычное оборудование qPCR. Если используется термоцикл, то в одном и том же анализе ПЦР можно протестировать до двух извлечений нуклеиновой кислоты (два различных образца или два реплика циферла из одного и того же образца). Для каждой добычи нуклеиновой кислоты, два различных количества будут проверены, чтобы исключить ферментативное ингибирование, возникшее в образце. Адаптация основана на предыдущей подготовке пЦР-труб воздухосующими грунтовками, зондами и стандартными подвесками. Существует несколько лиофилизированных коммерческих решений qPCR, которые можно было бы использовать, применяя ту же процедуру, что описано здесь. Мы описали одну возможность, которую мы считали легкой в исполнении.
Сравнительные анализы, проведенные при разработке метода, показали, что методы концентрации, извлечения и обнаружения VirWaTest эффективны для количественной оценки вирусов в пробах воды.
Предел обнаружения (LOD) описанной процедуры является переменным, так как объем, собранный после концентрации, является переменным. Кроме того, LOD может быть немного отличается для различных вирусов. Если объем около 10 l собран, LOD для HAdV будет около 1 х 102 вирусных GC / L. Таким образом, относительно небольшие концентрации HAdV могут быть обнаружены методом VirWaTest. В Педерналес (Эквадор), шесть из шести образцов испытания представлены HAdV, в концентрациях, близких к LOD, начиная от 3,27 х 101 до 1,80 х 102 GC / L. В Банги (RCA) HAdV был обнаружен в одном из пяти проанализированных образцов, в концентрации 3,46 х 102 GC/L. Наличие HAdV, а также наличие MS2 в качестве контрольного процесса в проверенных образцах, показывает, что метод полезен для извлечения вирусных частиц из образцов воды, даже если они выполняются неопытными пользователями.
Обратная связь, полученная до сих пор, указывает на то, что вирусная концентрация является легкой процедурой для выполнения, без каких-либо серьезных проблем при применении в точке использования образцов, хотя 8 ч и 5 ч шаги не требуется. Важно отметить, что эти шаги происходят без какой-либо помощи человека. Кроме того, в качестве альтернативы неторгуемым водам разрабатывается более быстрый метод, основанный на фильтрации. Тем не менее, флоккуляция, как представляется, до сих пор, уникальный метод, который позволяет концентрацию образцов, представляющих высокую мутность. Вирусные концентраты могут быть затем отправлены в любую лабораторию по всему миру при комнатной температуре, что также облегчает тестирование вирусов, поскольку в районах отбора проб не всегда имеются хорошие транспортные услуги, обеспечивающие условия охлаждения. Кроме того, представленные здесь протоколы добычи и обнаружения позволяют проводить тестирование на вирусное обнаружение в момент использования образцов.
Насколько нам известно, это первый метод, который, как сообщается, полезен для концентрации и тестирования на наличие вирусов в пробах воды в полевых условиях. Следует предпринять дальнейшие усилия по применению этой процедуры для оценки наличия вирусных патогенов человека, представляющих интерес в ряде других сценариев гуманитарного кризиса. Кроме того, отзывы пользователей будут необходимы для получения информации о потенциальной реализации, чтобы сделать процедуру более дружелюбной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
VirWaTest — исследовательский проект, финансируемый программой HIF (Гуманитарные инновационные фонды) КОМПАНИИ ELHRA (Повышение уровня обучения и исследований в области гуманитарной помощи). Авторы признают, WASH команды, которые любезно сотрудничали в этом исследовании. Анализ образцов в Эквадоре финансировался Оксфам Эквадор и Direccion де Investigaciones де ла Universidad де-лас-Америка (AMB. BRT.17.01). С. Бофилл-Мас является стипендиатом Серра-Хантер в Университете Барселоны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
- The Sphere Project. The Sphere Project: Humanitarian Charter and Minimum Standards in Humanitarian Response. , Practical Action Publishing. Rugby, UK. https://www.spherestandards.org/wp-content/uploads/2018/06/Sphere_Handbook_2011_English.pdf (2011).
- Bartram, J., et al. Water Safety Plan Manual:Step-by-step risk management for drinking-water suppliers. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/handle/10665/75141 (2009).
- World Health Organization. Guidelines for Drinking-water Quality. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://whqlibdoc.who.int/publications/2011/9789241548151_eng.pdf?ua=1 (2011).
- World Health Organization. 25 Years Progress on Sanitation and Drinking Water. , WHO Press. Geneva, Switzerland. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/177752/1/9789241509145_eng.pdf?ua=1 (2015).
- Girones, R., et al. Molecular detection of pathogens in water - The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 44 (15), 4325-4339 (2010).
- Rodriguez-Manzano, J., et al. Standard and new fecal indicators and pathogens in sewage treatment plants, microbiological parameters for improving the control of reclaimed water. Water Science and Technology. 66 (12), 2517-2523 (2012).
- Puig, M., et al. Detection of adenoviruses and enteroviruses in polluted waters by nested PCR amplification. Applied and Environmental Microbiology. 60 (8), 2963-2970 (1994).
- Carter, M. J. Enterically infecting viruses: Pathogenicity, transmission and significance for food and waterborne infection. Journal of Applied Microbiology. 98 (6), 1354-1380 (2005).
- Bofill-Mas, S., Pina, S., Girones, R. Documenting the epidemiologic patterns of polyomaviruses in human populations by studying their presence in urban sewage. Applied and Environmental Microbiology. 66 (1), 238-245 (2000).
- Bofill-Mas, S., et al. Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices. Applied and Environmental Microbiology. 72 (12), 7894-7896 (2006).
- Rames, E., Roiko, A., Stratton, H., Macdonald, J. Technical aspects of using human adenovirus as a viral water quality indicator. Water Research. 96, 308-326 (2016).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153 (2), 79-83 (2008).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. 58, 5-9 (2011).
- International Organization for Standardization. ISO 10705-1:1995: Water quality - Detection and enumeration of bacteriophages - Part 1: Enumeration of F-specific RNA bacteriophages. , https://www.iso.org/standard/18794.html (1995).
- Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report. Applied and Environmental Microbiology. 68 (9), 4523-4533 (2002).
- Pecson, B. M., Martin, L. V., Kohn, T. Quantitative PCR for determining the infectivity of bacteriophage MS2 upon inactivation by heat, UV-B radiation, and singlet oxygen: Advantages and limitations of an enzymatic treatment to reduce false-positive results. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5544-5554 (2009).
- Calgua, B., Barardi, C. R. M., Bofill-Mas, S., Rodriguez-Manzano, J., Girones, R. Detection and quantitation of infectious human adenoviruses and JC polyomaviruses in water by immunofluorescence assay. Journal of Virological Methods. 171 (1), 1-7 (2011).
- Bofill-Mas, S., et al. Cost-effective method for microbial source tracking using specific human and animal viruses. Journal of Visualized Experiments. (58), e2820 (2011).
- Gonzales-Gustavson, E., et al. Characterization of the efficiency and uncertainty of skimmed milk flocculation for the simultaneous concentration and quantification of water-borne viruses, bacteria and protozoa. Journal of Microbiological Methods. 134, 46-53 (2017).
