Summary
Qui presentiamo VirWaTest, che è un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e il rilevamento di virus da campioni d'acqua nel punto di utilizzo.
Abstract
I virus escreti da esseri umani e animali possono contaminare le fonti d'acqua e rappresentare un rischio per la salute umana quando quest'acqua viene utilizzata per bere, irrigazione alimentare, lavaggio, ecc. L'indicatore classico dei batteri fecali non sempre controlla la presenza di patogeni virali, quindi il rilevamento di patogeni virali e indicatori virali è rilevante per adottare misure di mitigazione del rischio, soprattutto in scenari umanitari e in aree dove i focolai virali trasmessi dall'acqua sono frequenti.
Attualmente, diversi test commerciali che consentono la quantificazione dei batteri dell'indicatore fecale (FIB) sono disponibili per i test presso il punto di utilizzo. Tuttavia, tali test commerciali non sono disponibili per il rilevamento di virus. La rilevazione di virus nei campioni di acqua ambientale richiede la concentrazione di diversi litri in volumi più piccoli. Inoltre, una volta concentrata, la rilevazione di virus si basa su metodi quali l'estrazione dell'acido nucleico e il rilevamento molecolare (ad esempio, la reazione a catena della polimerasi [PCR]) dei genomi virali.
Il metodo qui descritto consente la concentrazione di virus da campioni d'acqua da 10 L, nonché l'estrazione di acidi nucleici virali nel punto di utilizzo, con apparecchiature semplici e portatili. Ciò consente la sperimentazione di campioni d'acqua nel punto di utilizzo di diversi virus ed è utile in scenari umanitari, nonché in qualsiasi contesto in cui non è disponibile un laboratorio attrezzato. In alternativa, il metodo consente di concentrare i virus presenti nei campioni d'acqua e la spedizione del concentrato in un laboratorio a temperatura ambiente per ulteriori analisi.
Introduction
Durante le prime fasi di qualsiasi emergenza umanitaria, l'accesso alle forniture di acqua pulita, i servizi igienico-sanitari e l'igiene sono fondamentali per la sopravvivenza delle persone colpite. Pertanto, il monitoraggio della qualità dell'acqua è una priorità per prevenire i focolai di origine idrica. È risaputo che l'acqua contaminata è spesso l'origine di malattie, ma è spesso difficile determinare le fonti di focolai virali come il virus dell'epatite E (HEV), anche con la disponibilità di metodi di laboratorio convenzionali. Il controllo della qualità dell'acqua si basa sulla quantificazione di FIB1,2,3,4. Tuttavia, è stato ampiamente documentato che non vi è alcuna correlazione tra l'assenza di FIB e la presenza di patogeni virali trasmessi dall'acqua come rotavirus (RoV), norovirus (NoV), o HEV5,6. Pertanto, l'utilizzo dei criteri di qualità dell'acqua basati sulla FIB potrebbe comportare una sottovalutazione dei rischi associati alla presenza di patogeni virali trasportati dall'acqua. La sorveglianza dei virus indicatori, come gli adenovirus umani (HAdV), o di specifici patogeni sarebbe utile per definire l'esposizione a patogeni virali e identificare la potenziale fonte di infezione umana7,8, 9,10 e nella convalida dell'efficacia delle misure igienico-sanitarie11.
Fino ad ora, il rilevamento di virus in questi scenari si basava su personale qualificato e logistica complessa. VirWaTest (virwatest.org) è finalizzato allo sviluppo di un metodo semplice, conveniente e portatile per la concentrazione e la successiva rilevazione di virus da campioni d'acqua nel punto di utilizzo.
La concentrazione di virus si basa sul principio di flocculazione organica di campioni di acqua 10 L, con cui i virus vengono recuperati in piccoli volumi12,13. I floc vengono raccolti e aggiunti a un buffer che liccia i virus e impedisce la degradazione degli acidi nucleici quando sono conservati a temperatura ambiente per non più di 2 settimane.
Il metodo di estrazione dell'acido nucleico si basa sull'uso di particelle magnetiche a cui gli acidi nucleici vengono adsorbiti. Possono essere trasferiti da un buffer di lavaggio all'altro e infine nel buffer di eluizione utilizzando una pipetta magnetica a cui le particelle si attaccano. Le sospensioni virali dell'acido nucleico ottenute possono essere spedite in un laboratorio di riferimento in cui il rilevamento può essere eseguito utilizzando metodi molecolari basati sulla PCR. Per ogni estrazione dell'acido nucleico, vengono testate due diverse quantità per escludere l'inibizione ezimatica originata dal campione. In alternativa, con una disponibilità minima delle apparecchiature, i test PCR possono essere eseguiti nel punto di utilizzo. L'intero processo è progettato per essere eseguito indipendentemente da un alimentatore (Figura 1).
Un saggio pcR quantitativo per rilevare l'HAdV, espulso dall'uomo e trovato in campioni di acque reflue in alte concentrazioni, è stato adattato per essere eseguito nel punto di utilizzo. HAdV sono utilizzati come indicatori virali fecali umani. Una PCR per la quantificazione del batteriofago MS2 è stata adattata anche poiché MS2 viene utilizzato in VirWaTest come controllo del processo. Il metodo può essere personalizzato per il rilevamento di qualsiasi virus di interesse.
Dopo lo sviluppo, il metodo VirWaTest è stato applicato dagli utenti in due diverse impostazioni nella Repubblica di Africa Centrale (RCA) e in Ecuador, fornendo feedback sull'applicazione del protocollo in situazioni reali.
Per quanto ne sappiamo, questa è la prima procedura che consente la concentrazione e il rilevamento di virus nel punto di utilizzo, indipendentemente da qualsiasi alimentazione, grandi apparecchiature e condizioni di congelamento/raffreddamento. Si raccomanda di raccogliere due repliche di ogni campione d'acqua al fine di ottenere risultati robusti.
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Protocol
1. Preparazione e confezionamento
NOTA: i materiali/attrezzature da imballare sono elencati nella tabella 1. Utilizzare i guanti per gestire i reagenti necessari per il controllo del processo, i reagenti di concentrazione, i reagenti di estrazione dell'acido nucleico e i reagenti di rilevamento. Indossare occhiali protettivi per maneggiare i reagenti necessari per l'estrazione dell'acido nucleico.
- Controllo del processo
- Preparare la cultura dello stock MS2 (American Type Culture Collection [ATCC] 15597-B1) contenente 1 x 1010 PFU/mL in laboratorio seguendo la procedura ISO 10705-1:199514.
- Quindi, 10 l'aliquota della sospensione per tubo contenente 1 x 108 PFU in tubi da 10 mL e lasciare che l'acqua evapora a 37 gradi centigradi. Utilizzare un tubo per ogni campione d'acqua.
- Inoltre, preparare un tubo contenente 10 mL di acqua distillata sterile per ogni campione raccolto.
- Reagenti di concentrazione
- Per la soluzione di latte scremato prefloccato (PSM), utilizzare i seguenti importi per concentrare cinque campioni di acqua da 10 L.
- Preparare un tubo di plastica contenente 5 g di latte scremato.
- Preparare un sacchetto di plastica con cerniera contenente 16,66 g di sali marini.
- Preparare una bottiglia di plastica contenente 500 mL di acqua distillata.
- Preparare i reagenti necessari per la regolazione del pH. Utilizzare i seguenti importi per regolare il pH del PSM e di cinque campioni di acqua da 10 L.
- Aggiungere 5 g di acido citrico 1-idrato in un tubo di plastica da 10 ml.
APRudenza: L'acido citrico causa gravi irritazioni quando entra in contatto con gli occhi. In questo caso, sciacquare l'occhio con cautela con acqua per alcuni minuti. Se l'irritazione persiste, consultare un medico. - Mettere 2 g di idrossido di sodio in un tubo di plastica da 10 ml.
AVVISO: l'idrossido di sodio può causare gravi ustioni cutanee e danni agli occhi. Se ingerito, sciacquare la bocca. Non indurre il vomito. Se viene a contatto con gli occhi, risciacquare con cautela con acqua per diversi minuti. Quindi, consultare un medico. - Mettere 25 mL di acqua distillata sterile in un contenitore di plastica.
- Mettere 50 mL di acqua distillata sterile in un contenitore di plastica.
- Aggiungere 5 g di acido citrico 1-idrato in un tubo di plastica da 10 ml.
- Preparare la sacca di condizionamento del campione utilizzata per la flocculazione, la soluzione di conservazione utilizzata per conservare gli acidi nucleici e la sacca neutralizzante per neutralizzare l'acqua e i materiali scartati. Utilizzare le seguenti quantità per ogni campione d'acqua da 10 L da testare.
- Mettere 15 g di sali di mare e 8 g di acido citrico 1-idratare in un sacchetto di plastica cerniera per la borsa di condizionamento.
- Aggiungere 2 mL di tampone di lisi (Tabella dei materiali) e 0,3 mL di acido nucleico conservando l'agente ( Tabella deimateriali) a un tubo da 5 mL.
AVVISO: il buffer di lisi contiene il fiideo di guanidina e il Triton X-100. Il contatto con l'acido libera gas tossici, ed è dannoso se ingerito, inalato, o entra in contatto con la pelle. Se ingerito, sciacquare la bocca. Non indurre il vomito. Se viene a contatto con la pelle, lavare con molta acqua. Quindi, consultare un medico. L'agente conservante dell'acido nucleico causa irritazione della pelle e degli occhi ed è dannoso se ingerito. Se viene a contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua per diversi minuti. In ogni caso, soprattutto se ingerito e sentirsi male, consultare un medico. - Mettere 40 g di polvere detergente in quattro sacchetti di plastica con cerniera.
AMMONIenza: Il detersivo in polvere causa irritazione agli occhi. Se viene a contatto con gli occhi, risciacquare con abbondante acqua per diversi minuti. Se l'irritazione persiste o se ingerita, consultare un medico.
- Per la soluzione di latte scremato prefloccato (PSM), utilizzare i seguenti importi per concentrare cinque campioni di acqua da 10 L.
- Reagenti di estrazione dell'acido nucleico
- Mettete 50 -L di particelle magnetiche (Tabella dei Materiali) e 1 mL di etanolo 96% in un tubo da 5 mL che costituiscono il buffer di legame.
AVVISO: Il buffer di particelle magnetiche contiene azide di sodio, che forma un gas tossico quando entra in contatto con acidi o ioni metallici pesanti ed è tossico se ingerito o quando viene a contatto con la pelle. Se ingerito o a contatto con la pelle, sciacquare la bocca o la pelle con abbondante acqua e consultare un medico. L'etanolo è un liquido e vapore altamente infiammabile e provoca gravi irritazioni agli occhi. Tenere lontano da calore, superfici calde, scintille, e qualsiasi altra fonte di accensione. Se viene a contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua. In caso di ingestione di grandi quantità di acqua e/o se inalato, uscire all'aria aperta. In ogni caso, consultare un medico. - Aggiungete rispettivamente 500 l, 600 l e 200 l di detersivi 1, 2 e 3 (Tabella dei materiali), a tre tubi da 2 mL.
AVVISO: i tamponi di lavaggio contengono il tiocianato di guanidinium e il cloruro di guanidio, che sono dannosi se inalati o ingeriti e irritano la pelle e gli occhi. Il contatto con gli acidi rilascia gas molto tossico. Se entrano in contatto con la pelle o gli occhi, risciacquare con abbondante acqua. Se ingerito, sciacquare la bocca con abbondante acqua. Non indurre il vomito. Consultare sempre un medico. - Aggiungere 120 l di tampone di eluizione (Tabella dei materiali) a un tubo da 0,5 mL.
- Mettete 50 -L di particelle magnetiche (Tabella dei Materiali) e 1 mL di etanolo 96% in un tubo da 5 mL che costituiscono il buffer di legame.
- Reagenti di rilevamento HAdV e MS2
NOTA: Due diverse reazioni di estrazione dell'acido nucleico possono essere analizzate simultaneamente in ogni test PCR se viene utilizzato un termociclo a 8 bengeti. Per tutti i saggi PCR, preparare l'acqua di biologia molecolare aliquota in tubi da 1,5 mL.-
Rilevamento HAdV
- Preparare una miscela contenente 10 -L di 22,5 M di primer in avanti AdF, 10 -L di 22,5 M AdRinversi e 5 -L di 11,25 M sonda AdP (tabella 2).
- Aggiungere 2,5 l'l del mix ai tubi da 1 a 8 di una striscia di tubi. Lasciare asciugare a temperatura ambiente, chiudere i tubi e tenerli protetti dalla luce.
- Tagliare la striscia dividendola in due strisce: tubi 1-5 e tubi 6-8.
- Preparare una diluizione seriale delle sospensioni del DNA contenente la sequenza nucleotida della regione HAdV amplificata. L'aria secco 1 L- di sospensioni contenenti 1 x 105, 1 x 107e 1 x 109 GC/mL in tubi 6-8.
NOTA: Tenere i tubi contenenti i primer, la sonda e le sospensioni essiccate all'aria protette dalla luce.
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Rilevamento MS2
- Preparare una miscela contenente 10 -L di 25 s.l. per il pezzetto-2F, 10-L di 25 pecson-2R inversi e 2,5 litri di 25 M PecP-2 (tabella 2).
- Aggiungere 2,25 l del mix ai tubi da 1 a 8 di una striscia di tubi. Lasciare asciugare a temperatura ambiente, chiudere i tubi e tenerli protetti dalla luce.
- Tagliare la striscia dividendola in due strisce: tubi 1-5 e tubi 6-8.
- Procedere come nel passaggio 1.4.1.4, ma utilizzare una sospensione standard progettata per MS2.
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Rilevamento HAdV
2. Concentrazione virale
NOTA: utilizzare i guanti in qualsiasi momento durante le procedure di raccolta dei campioni, preparazione del reagente, flocculazione, raccolta di floc e smaltimento dei rifiuti. Indossare occhiali protettivi durante la procedura di preparazione del reagente.
- Raccolta di campioni
- Raccogliere un campione d'acqua da 10 L in un secchio piatto con coperchio. Raccogliere un minimo di due repliche per ogni campione.
NOTA: È importante utilizzare secchi chiari per visualizzare il pellet. Se il campione d'acqua contiene materiale sospeso (ad esempio, sabbia, alghe), lasciarlo sedimentare e, quindi, raccogliere il supernatante d'acqua in un nuovo secchio. - Registrare il volume raccolto, nonché la posizione e la data di ritiro, per ogni campione d'acqua.
- Mettere un agitatore magnetico collegato a una batteria sotto un supporto secchio e posizionare il secchio contenente il campione d'acqua sul suo supporto.
NOTA: Cercare una superficie piana in un luogo fresco e mantenere i secchi contenenti i campioni d'acqua dalla luce solare diretta.
- Raccogliere un campione d'acqua da 10 L in un secchio piatto con coperchio. Raccogliere un minimo di due repliche per ogni campione.
- Preparazione dei reagenti
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Reagenti di regolazione pH
- Versare la polvere acida citrica e i pellet di idrossido di sodio nelle pentole contenenti rispettivamente 25 e 50 mL di acqua distillata.
- Agitare delicatamente a mano fino a quando l'acido citrico e l'idrossido di sodio sono completamente disciolti.
AVVISO: Non versare l'acqua sui pellet di idrossido di sodio. Versare invece i pellet di idrossido di sodio sull'acqua.
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Latte scremato prefloccolto
- Mettere un sacchetto in piedi su un agitatore magnetico e versarci 500 mL di acqua distillata. Far cadere un magnete di agitazione all'interno del sacchetto e accendere l'agitatore magnetico.
- Versare il contenuto di una folatà di sale marino e di un tubo di latte scremato nel sacchetto di stand-up e mescolare per 5 min a media velocità per scioglierli.
- Aggiungere 3 mL di acido citrico alla soluzione PSM utilizzando una pipetta Pasteur per assicurarsi che il pH sia compreso tra 3,4 e 3,6. Misurare il pH della soluzione PSM utilizzando strisce di indicatore pH. Aggiungere piccole quantità di acido citrico e idrossido di sodio man mano che il pH si avvicina a 3,5.
- Spegnere l'agitatore magnetico e assicurarsi che i floc siano visibili. Utilizzare una torcia elettrica per aiutare a visualizzare i floc.
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Reagenti di regolazione pH
- Flocculazione
- Far cadere un magnete di agitazione in acqua, impostare l'agitatore magnetico alla massima velocità e accenderlo. Assicurarsi che il magnete agitando inizi a girare.
- Aggiungere 10 mL di acqua distillata a un tubo di controllo di processo. Invertire il tubo un paio di volte per reidratare il brodo virale e versare la soluzione in acqua.
- Versare il contenuto di una sacca di condizionamento campione in acqua e mescolare per 5 min.
- Misurare il pH del campione d'acqua utilizzando strisce indicatore pH. Aggiungere alcune gocce di acido citrico o idrossido di sodio al campione d'acqua per assicurarsi che il pH si trovi tra 3,4 e 3,6. Aggiungere piccole quantità di acido citrico e idrossido di sodio man mano che il pH si avvicina a 3,5.
- Aggiungere 100 mL della soluzione PSM utilizzando un contenitore da 100 mL.
- Sigillare il secchio con il coperchio, impostare l'agitatore magnetico alla velocità minima e lasciare che l'acqua si agiti per 8 h.
- Spegnere l'agitatore magnetico e lasciare che l'acqua sia ferma per almeno 5 h per consentire ai floc di depositarsi.
- Collezione Floc
- Costruire un sistema di sifone composto da un controller pipetta, due pipette e un tubo di plastica, per aspirare il sovrettinte ad acqua per scaricare l'acqua sui floc.
- Attaccare una pipetta a nastro da 10 mL al controller della pipetta. Quindi, attaccare la punta della pipetta al tubo di plastica.
- Rimuovere il filtro di una pipetta a punta aperta da 10 mL utilizzando una pinzetta e attaccare la pipetta al tubo di plastica.
- Posizionare un secchio vuoto sul pavimento.
- Immergere la punta della pipetta a punta aperta nell'acqua. Assicurarsi di tenerlo vicino alla superficie dell'acqua per evitare di disturbare i floc. Aspirare il supernatante d'acqua fino a raggiungere la pipetta a nastro.
- Avvicinare il tubo di plastica all'estremità attaccata alla pipetta adesiva e staccarlo dalla pipetta.
- Collocare il tubo in un secchio vuoto. Rilasciare la pressione sul tubo per far scorrere l'acqua nel secchio vuoto.
- Pizzicare il tubo di plastica per fermare il flusso d'acqua quando il livello dell'acqua sta per raggiungere il magnete di agitazione e spostare la pipetta lontano dal secchio.
- Agitare il secchio per risospendere i floc e versarli in un sacchetto di plastica stand-up da 500 mL. Lasciare che i floc si accontentino di 1 h di più.
- Aspirare con attenzione il supernatante ad acqua usando una pipetta da 50 mL e un controller manuale pipetta, evitando di disturbare i floc.
- Aspirare i floc usando una pipetta da 100 mL e trasferirli in un tubo di centrifuga turalario da 50 mL. Annotare il volume finale del concentrato del campione e trasferirne 1 mL in un tubo da 5 mL contenente la soluzione conservante, utilizzando una pipetta Pasteur.
NOTA: È importante che il tubo di centrifuga sia graduato in modo che il volume finale del campione concentrato possa essere misurato nel modo più accurato possibile e registrato. - Eseguire l'estrazione dell'acido nucleico sul campo. In alternativa, conservare la soluzione conservante contenente i virus a 20-30 gradi centigradi per un massimo di 15 giorni o spedirli in un laboratorio di riferimento per ulteriori analisi.
- Costruire un sistema di sifone composto da un controller pipetta, due pipette e un tubo di plastica, per aspirare il sovrettinte ad acqua per scaricare l'acqua sui floc.
- Smaltimento dei rifiuti e riutilizzo dei materiali
- Aggiungere il contenuto di una sacca agente neutralizzante al secchio contenente l'acqua scartata. Mescolare l'acqua, e poi, lasciare fermo per 30 min.
- Smaltire l'acqua trattata come rifiuti generali.
- Posizionare le pipette e il tubo di plastica all'interno del secchio. Riempire il secchio con acqua e versare il contenuto di una sacca agente neutralizzante.
- Lavarli per almeno 30 minuti per sterilizzarli e sciacquarli con abbondante acqua pulita per rimuovere qualsiasi agente neutralizzante rimanente.
3. Estrazione di acido nucleico
NOTA: Utilizzare guanti e indossare sempre occhiali protettivi durante la procedura di estrazione dell'acido nucleico.
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Funzionamento della pipetta magnetica
- Acquisire familiarità con il funzionamento della pipetta magnetica prima di eseguire l'estrazione.
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Estrazione di acido nucleico
- Disporre i tubi contenenti i reagenti necessari per l'estrazione in un rack, da sinistra a destra: tampone di rilegatura, buffer di lavaggio e buffer di elusione. Impostare il numero appropriato di tubi in base al numero di campioni o repliche in corso di analisi.
- Trasferire 1 mL di concentrato di campione al tubo contenente il tampone di rilegatura, utilizzando una pipetta Pasteur usa e getta. Invertire il tubo da 8x a 10x per omogeneizzare la soluzione.
- Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min mescolando continuamente, utilizzando un orbitale a energia solare o manualmente.
- Raccogliere le particelle magnetiche utilizzando la pipetta magnetica e una punta pulita, che può essere riutilizzata per i tre buffer di lavaggio.
- Rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente 500 L di lavaggio buffer 1. Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.
- Trasferire le particelle magnetiche al tubo contenente 600 - L di lavaggio buffer 2. Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.
- Trasferire le particelle magnetiche al tubo contenente 200 . Lavarli agitando delicatamente la soluzione con la punta per 30 s e raccoglierli.
- Rilasciare le particelle magnetiche nel tubo contenente il tampone di eluizione e scartare la punta.
- Incubare la soluzione a temperatura ambiente per 5 min mescolando continuamente, utilizzando l'orbitale a energia solare.
NOTA: La miscelazione delle particelle magnetiche nel tampone di eluizione è un passo cruciale. In caso di mancanza di un orbitale, mescolare continuamente a mano durante il tempo di incubazione. - Sostituire la punta sulla pipetta magnetica con una nuova e raccogliere le particelle magnetiche dal buffer di eluizione. Assicurarsi di rimuovere completamente le particelle magnetiche dal buffer di eluizione poiché possono interferire con i metodi di rilevamento molecolare.
- Scartare la punta con le particelle ad essa attaccate. Procedere con l'analisi PCR, spedire il tampone di eluizione in un laboratorio di riferimento o conservare il tampone di eluizione a 4 gradi centigradi per un'ulteriore analisi.
4. Rilevamento virale con termociclo in tempo reale a otto tubi a batteria
NOTA: Utilizzare guanti e indossare sempre occhiali protettivi durante la procedura di rilevamento dell'acido nucleico. Sostituire i guanti per quelli nuovi quando si esegue un nuovo esperimento PCR per evitare la contaminazione incrociata.
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HAdV quantitativo PCR
- Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenono ai tubi 2, 4 e 5.
- Aggiungere 4 -L di miscela PCR ai tubi 1-5.
- Aggiungere 14 - L di estrazione dell'acido nucleico dal campione A al tubo 1 e 14 l dal campione B al tubo 3.
- Aggiungere 2 -L di acidi nucleici estratti dal campione A al tubo 2 e 2 -L dal campione B al tubo 4. Chiudere la striscia di cinque tubi.
- Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenonità ai tubi 6, 7 e 8.
- Aggiungete 4 gradi di questo mix ai tubi 6, 7 e 8 e chiudeteli.
- Inserire entrambe le strisce nel termociclore e selezionare la conduttura appropriata (Tabella 3).
- Scartare il tubo dell'acqua e mantenere l'acido nucleico estratto nel congelatore, se possibile, o, in caso contrario, in un luogo fresco protetto dalla luce nel caso in cui sia necessario eseguire una seconda prova.
- Pulire correttamente le micropipette, il rack, il materiale di lavoro e tutto il materiale con un detergente acido nucleico e scartare il sacchetto di plastica contenente la punta, i guanti e i tubi usati.
AVVISO: L'assovia dell'acido nucleico è un liquido e vapore molto infiammabili. Non respirare la nebbia spray ed evitare qualsiasi contatto del liquido con gli occhi o la pelle. In caso contrario, risciacquare immediatamente con abbondante acqua e consultare un medico. - Raccogliere i risultati e analizzare i dati ottenuti.
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BCR quantitativo MS2
- Aggiungete 14 l di acqua priva di nuclenono ai tubi 2, 4 e 5.
- Aggiungete 4 -L di miscela PCR e 0,5 l di enzima di trascrizione inversa ai tubi 1-5.
- Aggiungere 14 - L di estrazione dell'acido nucleico dal campione A al tubo 1 e 14 l dal campione B al tubo 3.
- Aggiungere 1 l l di acidi nucleici estratti dal campione A al tubo 2 e 1 l dal campione B al tubo 4. Chiudere la striscia di cinque tubi.
- Aggiungete 15,5 l di acqua priva di nuclenonazione ai tubi 5, 6, 7 e 8 e chiudeteli.
- Aggiungete 4 o L di miscela PCR e 0,5 l di enzima di trascrizione inversa ai tubi 6, 7 e 8.
- Inserire entrambe le strisce nel termociclore e selezionare la conduttura appropriata (Tabella 3).
- Procedere come descritto nei passaggi da 4.1.8 a 4.1.10.
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Representative Results
Sviluppo del metodo
Questa procedura è stata sviluppata nel Laboratorio dei virus Contaminanti dell'Acqua e degli Alimenti con la collaborazione di GenIUL e Oxfam Intermàn. Si compone di tre fasi diverse. Il primo, la concentrazione di particelle virali, è un adattamento di un metodo di flocculazione del latte scremato descritto in precedenza12,17,18. Il metodo originale è stato modificato per essere indipendente da un alimentatore, più semplice e senza fasi di centrifugazione.
Il recupero del metodo di concentrazione VirWaTest è stato testato in campioni di acque sotterranee con picchi di batterifagi MS2. Il recupero virale del metodo di concentrazione ed estrazione Di VirWaTest è stato stimato dal 3,01% al 18,02% per MS2 e dal 17,52% al 44,22% per HAdV. Questi recuperi sono stati calcolati in base ai valori ottenuti dalla PCR quantitativa durante lo sviluppo del metodo rispetto alle concentrazioni iniziali di HAdV e MS2 nei campioni d'acqua dopo averli spiati con concentrazioni note di questi stock virali.
L'estrazione dell'acido nucleico magnetico VirWaTest è stato confrontato con un mini kit commerciale di RNA (ad esempio, QIAamp Viral RNA Mini Kit), un metodo di estrazione a colonna utilizzato in laboratorio, testando 33 campioni di acqua e acqua sotterranea con HAdV e MS2 e da flocculazione di latte scremato. I risultati del confronto hanno mostrato che il recupero del metodo VirWaTest è stato più elevato nei casi 23/33 per HAdV, così come per MS2 (Tabella 4). Un test Wilcoxon ha mostrato valori pdi 0,0005569 per HAdV e 0,02791 per MS2. L'estrazione dell'acido nucleico VirWaTest fornisce recuperi virali significativamente più elevati rispetto a quello commerciale.
Rilevamento di HAdV in campioni di acqua ambientale concentrati dal metodo VirWaTest
Per testare il metodo sviluppato per la concentrazione virale sul campo, il team di Oxfam Water, Sanitation and Hygiene (WASH), situato a Banghi (RCA) nel marzo 2017, ha raccolto e concentrato virus da cinque campioni di acqua di pozzo.
Inoltre, nell'area di Pedernales (Ecuador), che è stata colpita dai terremoti nel 2016 e 2017, sei campioni di acqua di pozzo sono stati raccolti da un team di Oxfam WASH nel febbraio 2017, e i suoi virus sono stati concentrati dal metodo di concentrazione VirWaTest. Concentrati virali provenienti da entrambe le impostazioni sono stati inviati al laboratorio di Barcellona per l'estrazione dell'acido nucleico VirWaTest e la quantificazione virale.
In Ecuador, HAdV naturale sono stati rilevati in sei dei sei campioni analizzati, con valori di concentrazione che vanno da 3,27 x 101 a 1,80 x 102 GC/L, mentre uno dei cinque campioni raccolti e concentrati in Banghi (RCA) è stato testato positivo per HAdV, con una concentrazione di 3,46 x 102 GC/L (tabella5).
MS2, aggiunto a tutti i campioni testati come controllo del processo interno, è stato rilevato in tutti i campioni testati, dimostrando che il metodo è stato eseguito correttamente dalla concentrazione al rilevamento.
Figura 1 : metodo VirWaTest. Panoramica dei passaggi di cui è composto il metodo VirWaTest. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Materiali | concentrazione | Estrazione dell'acido nucleico | scoperta |
| attrezzatura | Stirrer magnetico (2 unità) Batteria (2 unità) Connettori batteria/Stirrer (2 unità) Adattatori di alimentazione (2 unità) Supporto del secchio (2 unità) Corda (1 unità) Magnete Stirring (3 unità) Pinzette (1 unità) Tubo di silicio (1 unità) Controller Pipette (1 unità) Pennarello (1 unità) |
Pipetta magnetica (1 unità) Piattaforma Solar Rotary (1 Unità) Rack tubo multi-dimensione (1 unità) Timer (1 unità) |
Termociclista (1 unità) Batteria (1 unità) computer Tubo Rack (1 Unità) 0,5 l - 10 - Micropipette luna (1 unità) 2 - 20 L Micropipette (1 Unità) |
| Materiali di consumo e reagenti (per ogni 2 campioni/replica d'acqua) | Secchio (3 unità) PH Indicatore Strisce Pipetta a nastro finale 10 mL (2 unità) Open-Tip 10 mL Pipette (2 Unità) Pipetta a nastro da 50 mL (2 unità) Pipette a nastro da 100 mL (2 unità) Pasteur Pipette (4 unità) Borsa in plastica Stand-Up (4 unità) Contenitore di plastica con 25 mL di acqua distillata (1 unità) Contenitore di plastica con 50 mL di acqua distillata (1 unità) 100 mL Contenitore vuoto (1 Unità) Guanti (6 Paia) Controllo di processo (2 tubi) Tubo con 10 mL di acqua distillata (2 unità) Acido citrico (1 tubo) Idrossido di sodio (1 tubo) Latte scremato (1 tubo) Sacca per acido citrico (1 unità) Acqua distillata (1 bottiglia da 500 mL) Condizionamento campione (2 sachets) Soluzione di conservazione (2 tubi) Agente neutralizzante (4 sachets) |
Punte Magnetic Pipette (2 unità) Pasteur Pipette (2 Unità) Buffer di rilegatura (2 tubi) Lavaggio Buffer 1 (2 Tubi) Lavaggio Buffer 2 (2 Tubi) Lavaggio Buffer 3 (2 Tubi) Buffer di eluzione (2 tubi) Guanti (6 Paia) |
10 punte Micropipette (1 scatola) 20 consigli Micropipette (1 scatola) Miscela di DNA qPCR (1 tubo) RNA qPCR Mix (1 tubo) Trascrizione inversa Enzima (1 tubo) Biologia molecolare Acqua (1 tubo) HAdV Tube Strip con primer, sonda e standard (1 unità) Striscia tubo MS2 con primer, sonda e standard (1 unità) Rimozione dell'acido nucleico Guanti (6 Paia) |
Tabella 1: contenuti di VirWaTest. Attrezzature, materiali di consumo e reagenti che devono essere preparati per la concentrazione, l'estrazione e il rilevamento di virus in due campioni/replica d'acqua.
| virus | Primer | Genbank Accession No. | posizione | Sequenza (5'-u20123') | lunghezza | referenza | ||
| Adenovirus umano (HAdV) | Adf | J01917.1 | 18869-u201218887 | CWTACATGCACATCSGGGG | 19 del 12 | Hernroth et al., 200215 | ||
| Adr | 18919-u201218937 (informazioni in base alla | CRCGGGCRACraAYTGCACCAG | 19 del 12 | |||||
| AdP1 (informazioni in stato di | 18890-u201218916 | 6-FAM-CCGGGCTCAGGTMACCGGCCCTCCT-Q535 | 27 mi lapiùdel | |||||
| Batteriofa MS2 (MS2) | pecson-2F | NC_001417.2 | 344,u2012363 | AAGGTGCCTACAGCGAAGT | 20 anni | Pecson et al., 200916 | ||
| pecsone-2R | 659-u2012678 | TTCGTTTAGGGCAAGGTAGC | 20 anni | |||||
| PecP-2 | 369-u2012388 | 6-FAM-ATCGTGGGGCGCGCGCGCGTACG-BHQ-1 | 20 anni | |||||
Tabella 2: Oligonucleotidi per esperimenti quantitativi PCR. Primer e sonda progettati per legarsi alle sequenze di acido nucleico di HAdV e MS2.
| temperatura | ora | Cicli | temperatura | ora | Cicli |
| 95 gradi centigradi | 12 min | 1 : il nome del | 55 gradi centigradi | 15 min | 1 : il nome del |
| 95 gradi centigradi | 10 min | 1 : il nome del | |||
| 95 gradi centigradi | 15 s | 40 anni ( | 95 gradi centigradi | 15 s | 40 anni ( |
| 60 gradi centigradi | 1 min | 60 gradi centigradi | 1 min |
Tabella 3: Condizioni termiche per esperimenti quantitativi di PCR. Temperatura, tempo e cicli utilizzati per l'amplificazione HAdV e MS2.
| QIAgen | VirWaTest (Test di VirWa) | QIAgen | VirWaTest (Test di VirWa) | ||
| medio | 2,53 x 103 | 2,43 x 103 | 4,74 x 104 | 5,13 x 104 | |
| Significare | 1,74 x 104 | 3,12 x 104 | 4,24 x 104 | 5,97 x 104 | |
| Sd | 5,66 x 105 | 2,23 x 106 | 4,49 x 104 | 1,63 x 105 | |
| valore di p (Wilcoxon) per HAdV: 0.0005569 | |||||
| valore di p (Wilcoxon) per MS2: 0,02791 | |||||
| Virus testato | Campioni testati | QIAgen | Test VirWa | ||
| HAdv | 33 Mi lasa | 10 del sistema | 23 del 23 o | ||
| Ms2 (in modo non il più | 33 Mi lasa | 10 del sistema | 23 del 23 o | ||
Tabella 4: Sviluppo dell'estrazione dell'acido nucleico VirWaTest. Valori mediani, medi e SD ottenuti quando si confrontano i metodi di estrazione Qiagen e VirWaTest in 33 campioni di acque sotterranee per HAdV e MS2.
| paese | sito internet | campione | HAdV GC/L |
| Rca | Eau de la SODECA | 1 : il nome del | Nd |
| Ile Bongossoua, Villaggio 1 | 2 Il nome del sistema | Nd | |
| Ile Bongossoua, Villaggio 3 | 3 (COM del nome | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier | 4 DEL psu' | Nd | |
| Bangui, Puits Quartier Yambassa | 5 Del numero 3( | 3,64 x 102 | |
| Ecuador | Foro A | 6 È possibile: | 7,96 x 101 |
| Foro B | 7 (in questo stato | 1,80 x 102 | |
| Borehole C | 8 (IN vio | 8,88 x 101 | |
| Acqua di pozzo A | 9 (in vie | 6,06 x 101 | |
| Acqua di pozzo B | 10 del sistema | 1,12 x 102 | |
| Acqua di pozzo C | 11 Del sistema di | 3,27 x 101 |
Tabella 5: Quantificazione di HAdV utilizzando il metodo VirWaTest. Risultati quantitativi di PCR, espressi in GC/litro, per HAdV quantificati in campioni d'acqua raccolti e concentrati dalla RCA e dall'Ecuador.
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Discussion
Il metodo VirWaTest consente la concentrazione di virus e l'estrazione di acido nucleico da campioni d'acqua nel punto di utilizzo da parte di utenti non esperti. Si tratta di un protocollo conveniente, rapido e semplice. La concentrazione si basa sul principio della flocculazione organica con latte scremato, con il quale il pH basso e le condizioni di alta conduttività rendono le proteine del latte scremato aggregate in floc gli adsorbienti dei virus. Quando il sedimento di floc, è facile raccoglierli, rendendo possibile concentrare 10 L di acqua, mentre l'ultracentrifuga tradizionale non può gestire grandi volumi d'acqua.
Il metodo è stato modificato per essere praticabile nel punto di campionamento senza utilizzare alcuna apparecchiatura elettrica ad eccezione di un agitatore magnetico a batteria. Alcuni altri approcci basati sulla filtrazione dell'acqua sono stati adattati alla concentrazione di virus e possono essere eseguiti anche nel punto di utilizzo. Tuttavia, il materiale sospeso presente nei campioni d'acqua spesso intasa i filtri; pertanto, il piccolo volume che può essere concentrato con questi sistemi è una grave limitazione.
Questa è la prima descrizione di un metodo per concentrare i virus da campioni d'acqua nel punto di utilizzo, indipendentemente dalla torbidità del campione. Il metodo di concentrazione VirWaTest consente di elaborare contemporaneamente più campioni se è disponibile il materiale appropriato. Inoltre, la flocculazione del latte scremato ha dimostrato di essere utile per la concentrazione di batteri e parassiti19.
La preparazione del materiale appropriato è fondamentale per eseguire correttamente la procedura. Considerare il numero di campioni d'acqua da analizzare e preparare i reagenti e il materiale prima di passare al luogo in cui è necessario il test per la preparazione dei reagenti e del materiale. Diversi campioni possono essere elaborati contemporaneamente se è disponibile la quantità appropriata di materiale.
Prima di iniziare la concentrazione di un campione d'acqua, una concentrazione nota di uno stock virale sarà utilizzata per picco il campione come controllo di processo. Questo metodo utilizza un brodo virale essiccato che viene reidratato con acqua distillata prima di essere aggiunto al campione d'acqua nel punto di utilizzo. Ciò è utile per escludere risultati falsi negativi alla fine della procedura e fornisce un'indicazione delle prestazioni del metodo.
I concentrati virali ottenuti con il VirWaTest possono essere ulteriormente testati sul campo applicando i metodi di estrazione e rilevazione dell'acido nucleico VirWaTest o, in alternativa, i concentrati possono essere inviati a un laboratorio di riferimento a temperatura ambiente. La soluzione conservante aggiunta al concentrato consente ai virus di rimanere stabili fino a 2 settimane (risultati inediti).
L'estrazione dell'acido nucleico VirWaTest è un metodo basato sulle particelle magnetiche. È facile e veloce e permette di elaborare diversi campioni allo stesso tempo e mostra un'efficienza di recupero equivalente e persino migliore rispetto ai metodi attualmente utilizzati per le estrazioni di acidi nucleici virali. Gli acidi nucleici possono essere inviati ai laboratori di riferimento a temperatura ambiente o, se gli utenti sono fiduciosi nell'esecuzione del rilevamento molecolare, un test quantitativo PCR può essere eseguito nel punto di utilizzo del campione d'acqua originale.
Inoltre, se è disponibile un piccolo impianto di laboratorio, il protocollo di concentrazione VirWaTest può essere accoppiato a kit di estrazione acido nucleico standard che dipendono da una centrifuga e da metodi standard basati su PCR che richiedono un congelatore per mantenere i reagenti ma che utilizzano termocicli standard, che sono meno costosi di quelli a batteria.
Tuttavia, poiché un alimentatore a volte non è disponibile, abbiamo ottimizzato i saggi di rilevamento per i batteriofagi MS2 come controllo del processo e HAdV come indicatore fecale virale, e la metodologia può essere personalizzata per qualsiasi altro virus di interesse, come l'epatite virus, RoV, NoV, o altri, da eseguire sul campo senza bisogno di un congelatore per la manutenzione dei reagenti, né termocicli convenzionali, ma solo uno a batteria. Sono disponibili in commercio diversi termocicli a batteria. In alternativa, se è disponibile un alimentatore, è possibile utilizzare altre apparecchiature qPCR convenzionali. Se viene utilizzato un termociclore a otto tubi, è possibile testare fino a due estrazioni di acidi nucleici (due campioni diversi o due repliche dello stesso campione) nello stesso test PCR. Per ogni estrazione dell'acido nucleico, saranno testate due diverse quantità per escludere l'inibizione ezimatica originata dal campione. L'adattamento si basa sulla precedente preparazione di tubi PCR da primer, sonde e sospensioni standard per l'essiccazione dell'aria. Esistono diverse soluzioni commerciali liofilizzate qPCR che potrebbero essere utilizzate applicando la stessa procedura descritta di seguito. Abbiamo descritto una possibilità che abbiamo considerato facile da eseguire.
I test di confronto eseguiti durante lo sviluppo del metodo hanno mostrato che i metodi di concentrazione, estrazione e rilevamento di VirWaTest sono efficienti per la quantificazione dei virus nei campioni d'acqua.
Il limite di rilevamento (LOD) della procedura descritta è variabile poiché il volume raccolto dopo la concentrazione è variabile. Inoltre, il LOD può essere leggermente diverso per diversi virus. Se viene raccolto un volume di circa 10 L, il LOD per HAdV sarebbe di circa 1 x 102 virale GC/L. Quindi, concentrazioni relativamente piccole di HAdV possono essere rilevate dal metodo VirWaTest. In Pedernales (Ecuador), sei dei sei dei sei campioni testati hanno presentato HAdV, in concentrazioni vicine al LOD, che vanno da 3,27 x 101 a 1,80 x 102 GC/L. In Banghi (RCA), HAdV è stato rilevato in uno dei cinque campioni analizzati, ad una concentrazione di 3,46 x 102 GC/L. La presenza di HAdV, così come la presenza di MS2 come processo di controllo nei campioni testati, mostra che il metodo è utile per il recupero di particelle virali da campioni d'acqua, anche se eseguito da utenti non esperti.
Il feedback ottenuto fino ad ora indica che la concentrazione virale è una procedura facile da eseguire, senza problemi gravi se applicata al punto di utilizzo dei campioni, anche se sono necessari passaggi da 8 e 5 h. È importante notare che questi passaggi si verificano senza alcuna assistenza umana. Inoltre, si sta sviluppando un metodo più veloce basato sulla filtrazione come alternativa per le acque non torbide. Tuttavia, la flocculazione sembra essere, fino ad ora, il metodo unico che permette la concentrazione di campioni che presentano un'elevata torbidità. I concentrati virali possono poi essere inviati a qualsiasi laboratorio in tutto il mondo a temperatura ambiente, il che rende anche più facile testare i virus poiché le aree di campionamento non sempre dispongono di buoni servizi di trasporto che forniscono condizioni di raffreddamento. In alternativa, i protocolli di estrazione e rilevamento qui presentati consentono di testare il rilevamento virale nel punto di utilizzo dei campioni.
Per quanto ne sappiamo, questo è il primo metodo segnalato per essere utile per la concentrazione e test per la presenza di virus nei campioni d'acqua nel campo. Ulteriori sforzi dovrebbero essere condotti per applicare la procedura alla valutazione della presenza di patogeni virali umani di interesse in diversi altri scenari di crisi umanitaria. Inoltre, il feedback dell'utente sarà necessario per fornire informazioni dettagliate sulla potenziale implementazione per rendere la procedura più semplice.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
VirWaTest è stato un progetto di ricerca finanziato dal programma HIF (Humanitarian Innovation Funds) di ELHRA (Enhancing Learning & Research for Humanitarian Assistance). Gli autori riconoscono i team WASH che hanno collaborato gentilmente a questo studio. L'analisi dei campioni in Ecuador è stata finanziata da Oxfam Ecuador e Direcciàn de Investigaciones de la Universidad de las Americas (AMB. BRT.17.01). S. Bofill-Mas è un borsista Serra-Hunter presso l'Università di Barcellona.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (ROX) | Solis BioDyne | 08-14-00001 | Includes Solis Biodyne's 5x HOT FIREPol Probe qPCR Mix Plus (qPCR Mix), 50 Reactions |
| 8-Microtube Strips with Caps | dD Biolab | 840637 | Low Profile, Thin Walls, Adapted for Quantitative and Qualitative PCR |
| Batteries and Power Adapters for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011674 | Includes 12V car power adapter |
| Bucket Support | GenIUL | 900011648 | Aluminium support |
| Bucket, 10 L | Cater4You | 10LTR | Polypropilene, Tamperproof, Clear color |
| Centrifuge Tube, 50 mL | LabBox | CTSP-E50-050 | Polypropylene, Sterile, Graduated, With Skirt |
| Citric Acid 1-Hydrate, 500 g | PanReac AppliChem | 1410181211 | Pure, Pharma Grade, 1 Kilogram |
| Clear PET Bottle | LabBox | FPET-500-088 | Clear Color, PET, Cap Not Included |
| Difco Skim Milk, 500 g | Becton Dickinson | 232100 | Dehydrated |
| DNA/RNA Shield, 250 mL | Zymo Research | R1100-250 | DNA/RNA Preservation Medium, 250 mL |
| Easy9 Pipette Controller | LabBox | EAS9-001-001 | 0.3 μm filter, Pipettes from 0.1 to 100 mL, Autoclavable silicone pipette holder |
| Eppendorf Tube, 0.5 mL | Eppendorf | 0030121023 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | Polypropilene, Safe-Lock |
| Eppendorf Tube, 5 mL | dD Biolab | 999542 | Polypropylene, Sterile, Graduated |
| Ethanol 96% V/V, 1 L | Panreac AppliChem | 361085-1611 | For UV, IR and HPLC |
| Laboratory Tweezers | LabBox | FORS-007-002 | Thin, Curved End, L= 120 mm |
| Magnetic Stirrer | GenIUL | 900017000 | Battery-powered |
| Marker | dD Biolab | 929203 | Black, Extra fine Tip, Water Resistant, Fast Drying, For Plastic and Glassware |
| Micro Rota-Rack for Microtubes | dD Biolab | 37782 | 4 Modules, L x W x H= 208 x 100 x 100 mm |
| Mini8 Real-Time PCR Cycler | Coyote Biosciences, China | Mini-8 | Portable, Works with 12V Power Supplies or External Batteries, Two channels, Capacity for 8 Tubes |
| NucliSens Lysis Buffer | Biomerieux | 200292 | Reagents for up to 48 Isolations, Store at Ambient Temperature |
| Open Tip Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | 900136N | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| PE Screw Cap PP28 | LabBox | TP28-004-020 | For PET Bottles |
| pH Indicator Strip | LabBox | WSPH-001-001 | Range pH 2.8 to pH 4.4, 50 Strips per Pack |
| Plastic Test Tube | Quimikals | 300913 | Includes Cap |
| Polyethylene Pasteur Pipette | LabBox | PIPP-003-500 | Graduated, 7 mL Overall Volume, Non-Sterile |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 150 mL | Deltalab | 409726 | Screw cap, Sterile, graduated up to 100 mL |
| Polypropylene Screw Flask With Screw Cap, 60 mL | Deltalab | 409526G | Screw cap, Sterile, Graduated up to 50 mL |
| Powder Powder Detergent | - | - | Regular Powder Soap for washing clothes |
| Power Cables for Magnetic Stirrer | GenIUL | 900011692 | Connection between batteries and magnetic stirrers |
| QuickPick Magnetic Tool | BioNobile | 24001 | Hand-held tool for magnetic particles |
| QuickPick Tips in Box | BioNobile | 24296 | RNase-Free, Autoclaved, 96 Units |
| QuickPick XL gDNA Magnetic Particles | BioNobile | SN51100 | 3.2 mL |
| Sea Salts | Sigma-Aldrich | S9883-500G | An artificial salt mixture closely resembling the composition of the dissolved salts of ocean water |
| Silicone Tubing | LabBox | SILT-006-005 | Roll of 5 Meters, Inner ø x Outer ø= 6 x 10 mm |
| Sodium Hydroxide Pellets, 98.5 - 100.5% | VWR Chemicals | 28244295 | Pellets, 1 Kg |
| Solar Rotary Platform | SOL-EXPERT Group | 70020 | Acrylic Plate, 10 RPM, Supports up to 300 Grams |
| SOLIScript 1-step Probe Kit | Solis BioDyne | 08-57-00250 | Includes Solis Biodyne's 5x One-Step Probe Mix (qPCR Mix) and 40x One-Step SOLIScript Mix (Reverse Transcriptase Enzyme), 250 Reactions |
| SPEEDTOOLS RNA Virus Extraction Kit | BioTools | 21.141-4197 | Includes BioTools's BAW Buffer (Washing Buffer 1), BAV3 Buffer (Washing Buffer 2 and 3) and BRE Buffer (Elution Buffer). |
| SpinBar Octhaedral Stirring Magnet | dD Biolab | 045926 | Pivot Ring, L x ø = 38 x 8 mm, Blue |
| Tape-End Serological Pipette, 10 mL | Deltalab | PN10E1 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Tape-End Serological Pipette, 50 mL | Deltalab | 900043 | Sterile, Individually Wrapped (Paper/Plastic) |
| Termi-DNA-Tor - Nucleic Acid Remover | BioTools | 22001-4291 | Remover of nucleic acids, bacteria, fungi and mycoplasma from material and surfaces, 450 mL |
| Water Molecular Biology Reagent, 1L | Sigma-Aldrich | W4502-1L | Nuclease and Protease Free, 0.1 μm Filtered |
| Whirl-Pak Bag, 540 mL | Deltalab | 200361 | Stable bottom |
| Zip Lock Plain Bag | LabBox | BZIP-080-100 | Polyethylene, L x W= 120 x 80 mm |
References
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