Summary
Aqui, nós apresentamos um método para a cultura ex vivo de ossos murino longos em estágios fetal e recém-nascido, apropriados para analisar o desenvolvimento do osso e da cartilagem e o homeostase em circunstâncias controladas ao recapitulando o processo in vivo.
Abstract
Os ossos longos são estruturas complexas e dinâmicas, que surgem da ossificação endocondral através de um intermediário de cartilagem. O acesso limitado aos ossos humanos saudáveis torna particularmente valioso o uso de modelos de mamíferos, como rato e rato, para olhar em diferentes aspectos do crescimento ósseo e homeostase. Além disso, o desenvolvimento de ferramentas genéticas sofisticadas em camundongos permite estudos mais complexos de crescimento ósseo longo e pede uma expansão das técnicas utilizadas para estudar o crescimento ósseo. Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para a cultura de osso murino ex vivo, que permite o estudo do osso e da cartilagem em uma maneira firmemente controlada ao recapitulando a maioria do processo in vivo. O método descrito permite a cultura de uma gama de ossos, incluindo tíbia, fêmur e ossos metatársicos, mas temos focado principalmente na cultura tibial aqui. Além disso, pode ser usado em combinação com outras técnicas, tais como a imagem latente viva do tempo-lapso ou o tratamento da droga.
Introduction
O crescimento de órgãos tem de ser firmemente afinado para evitar o aparecimento de distúrbios de crescimento, e envolve a regulação de vários tipos de células, vias moleculares e conversa cruzada entre diferentes partes do corpo. Técnicas de imagem são essenciais para abordar as mudanças que ocorrem ao longo do tempo em um embrião em crescimento, tanto em condições normais, bem como após uma perturbação é induzida no sistema. Embriões com desenvolvimento intrauterino, como os modelos de roedores amplamente utilizados, apresentam um desafio adicional para a imagem ao vivo e tratamento medicamentoso, que pode ser parcialmente superado pelo uso de técnicas de cultura ex vivo. Para recapitular com sucesso os processos in vivo e obter resultados significativos, torna-se crucial encontrar as condições de cultivo certas para cada órgão ou tecido.
A maioria dos ossos do esqueleto de mamíferos cresce através da ossificação endocondral, onde a cartilagem embrionária (composta de células denominadas condrócitos) impulsiona o crescimento longitudinal e é gradualmente substituída pelo osso. Esse processo ocorre nas placas de crescimento, localizadas no final dos ossos longos, onde três zonas podem ser distinguidas: repouso, proliferativa e hipertrófica1,2. Primeiramente, os condrócitos redondos do progenitoras na transição da zona descansando nos condrócitos colunar de ciclagem na zona proliferative. Durante a fase seguinte da diferenciação, estes condrócitos tornam-se hipertrófica e começam secretoras o tipo colagénio de X. Os condrócitos hipertróficos orquestram as etapas subsequentes da ossificação: secretam moléculas-chave de sinalização, como fator de crescimento do tecido conjuntivo, proteínas morfogenéticas ósseas e ouriço indiano, e dirigem a mineralização da matriz, recrutam os vasos sanguíneos para a parte central do osso, e, após a apoptose, permitem osteoblastos (células formadoras de osso) para invadir a matriz para formar o centro de ossificação primária3,4. A matriz mineralizada facilita a penetração dos vasos sanguíneos através dos quais os osteoblastos migram para substituir esta cartilagem degradada por uma matriz óssea5. A maioria dos osteoblastos invade a matriz cartilaginosa do pericôndrio, uma camada fibrosa que envolve a cartilagem6. Alternativamente, uma proporção de condrócitos hipertróficos é capaz de sobreviver e transdiferenciar a osteoblastos7,8,9. O comprimento final do osso é devido ao crescimento acumulado da cartilagem transitória, cuja taxa de crescimento por sua vez depende do número e tamanho dos condrócitos hipertróficos, e sua produção matricial10. Adicionalmente, foi demonstrado recentemente que a duração da última fase de hipertrofia correlaciona-se com o comprimento final do osso11. Conseqüentemente, a regulação apertada da proliferação e da diferenciação destas pilhas é exigida para assegurar o tamanho apropriado do osso.
Apesar do conhecimento substancial adquirido ao longo dos anos sobre a organização e o desenvolvimento das placas de crescimento, a maioria destas conclusões baseiam-se na observação de secções histológicas fixas. O corte de tecidos fornece informações valiosas sobre esse processo, mas pode ser montado com artefatos técnicos, por isso não pode ser sempre confiável usado para estimar alterações morfológicas ou de tamanho entre diferentes estágios. Adicionalmente, porque o crescimento do osso é um processo dinâmico, as imagens bidimensionais (2D) estáticas oferecem uma introspecção limitada no movimento das pilhas na placa do crescimento, quando a imagem latente do tempo-lapso no tecido vivo poderia oferecer a informação valiosa no comportamento do condrócitos na placa de crescimento.
Todas essas limitações podem ser potencialmente resolvidas usando culturas ósseas ex vivo. Quando os protocolos da cultura do osso forem desenvolvidos alguma hora há, foram aplicados limitadamente aos ossos longos murino. A maioria dos estudos utiliza ossos de pintinhos devido às vantagens técnicas oferecidas pelo modelo de pintainho12,13. Culturas organotípicas (interface ar/líquido) foram aplicadas a fêmures embrionárias de pintinhos, mantidas em cultura por 10 dias14. As sofisticadas ferramentas genéticas disponíveis no mouse tornam este modelo muito atraente para ser usado na cultura óssea ex vivo. Os estudos que utilizaram camundongos para olhar para o crescimento ósseo trabalharam principalmente com os ossos do metatarso15, provavelmente devido ao seu tamanho pequeno e maiores números obtidos por embrião16. Embora tradicionalmente considerados ossos longos, metatarsos entram em senescência (caracterizada pela redução da proliferação e involução da placa de crescimento17) mais cedo do que outros ossos longos in vivo, e, portanto, o seu crescimento contínuo ex vivo não realmente recapitular o processo in vivo. Para os propósitos deste artigo, usaremos o termo ossos longos para ossos das regiões proximal e intermediária do membro. Vários estudos prévios utilizaram ossos murinos longos, como a tíbia, em culturas ex vivo e observaram um crescimento substancial da cartilagem, mas pouca ossificação18. Também utilizamos culturas tibiais recentemente, principalmente para estudar a dinâmica do condrócitos19. Outros estudos utilizaram cabeças femorais de camundongos jovens20 ou apenas a parte distal do fêmur para cultura21. Alguns trabalhos mais recentes combinam com sucesso a cultura ex vivo de ossos cheios com imagens de lapso temporal para adquirir filmes tridimensionais (3D) de condrócitos em tecido vivo de camundongo22,23. Os autores conseguiram observar eventos previamente despercebidos no rearranjo de condrócitos para a zona proliferativa23 em um bom exemplo da potencial aplicação da cultura óssea ex vivo. A alternativa, ou seja, analisando imagens estáticas, requer técnicas indiretas e complexas. Isto foi exemplificado por um estudo recente avaliando a importância de clones transgénicos orientados para o crescimento da cartilagem, onde o traçado genético com cepas multicolor do rato do repórter acoplados com modelagem matemática foi usado24. Portanto, a cultura ex vivo pode ajudar a obter insights sobre processos dinâmicos de forma mais rápida e direta.
Aqui, nós apresentamos um método para a cultura longa dos ossos murino, que pode ser combinada com os tratamentos moleculars diferentes e/ou com imagem latente viva do tempo-lapso. Este protocolo adapta os métodos utilizados nos relatórios anteriores15,18,25, mas aborda alguns problemas adicionais e se concentra em ossos longos, como a tíbia, ao invés de ossos metatarsais. Por fim, explora o potencial do uso de comparações pareadas estatisticamente poderosas, cultivando ossos esquerdos e direitos separadamente na presença de diferentes substâncias.
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Protocol
Todos os experimentos devem ser realizados seguindo as diretrizes governamentais e institucionais locais de manejo ético de animais de laboratório.
1. preparações antes do dia da cultura óssea
- Configurar temporizações cronometradas do rato para obter fetos e filhotes de 14,5 do dia embrionário (E 14.5) e avante.
Nota: A cultura de ossos longos pode ser aplicada com sucesso a diferentes cepas de camundongo; no presente protocolo, são usados ratos suíços de tipo selvagem da raça Webster. - Prepare o meio de dissecção (adaptado de Houston et al.15): diluir α-meio essencial mínimo (α-mem) ou o meio de águia modificado de Dulbecco (dmem) 1/13 em soro fisiológico com tampão fosfato (PBS) e 2 mg/ml de albumina sérica bovina (BSA) e esterilizar filtro através de um 0,22 μm, filtro de seringa de 33 mm de diâmetro. Armazene alíquotas a-20 ° c.
- O dia antes da extração dos fetos, prepare o meio de cultura óssea livre de soro composto por DMEM contendo 0,2% de BSA, 0,5 mM L-glutamina, 40 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0, 5 mg/mL de ácido ascórbico e 1 mM de betaglicerofosfato. Filtre esterilize através de um 0,22 μm, filtro da seringa do diâmetro de 33 milímetros e armazene em 4 ° c por até 1 mês.
- No dia da cultura e antes do abate do rato, prepare placas de 24 poços e pratos de 60 mm com meio de dissecção e mantenha-os gelados. Pré-aqueça o meio de cultura óssea em um banho de água de 37 ° c. Spray de 80% (v/v) etanol nas ferramentas (pinças e pequenas tesouras) para ser usado para a manipulação do feto. Transfira um espaço binocular a um armário da Biossegurança da classe II.
2. cultura do feto e tíbia e fêmur recém-nascidos
- Cull o rato grávido através da deslocação cervical na fase gestacional desejada (variando de E 14.5 a E 18.5). Se os filhotes recém-nascidos são usados, removê-los da mãe um por um e cull por decapitação.
- Coloque o mouse sobre as costas e esterilizar a região abdominal por pulverização 80% (v/v) etanol em sua superfície.
- Corte a pele e o músculo abdominal com pequenas tesouras para acessar os chifres uterinos.
- Extraia o útero da cavidade abdominal com a ajuda de pinças e pequenas tesouras, removendo o mesométrio e cortando a base dos chifres. Coloque o útero em uma placa de Petri de 60 mm com meio de dissecção gelada e mantenha o prato de cultura no gelo durante todo o procedimento.
- Transfira a placa de Petri com o útero para o gabinete de biossegurança e trabalhe lá a partir de agora.
- Separe os fetos individuais com tesouras cortando entre as SACs.
- Transfira o saco individual um estereomicroscópio da dissecção em um prato limpo de 60 milímetros com meio da dissecção e abra-os acima com pinças para separar os feto das placentas e para limpá-los das membranas.
Nota: Trabalhe com um embrião de cada vez, mantendo o resto no gelo. - Decapitar os fetos e transferir o corpo para um novo prato limpo de 60 mm com uma pipeta estéril cortada em 1 mL.
- Retire a pele dos fetos ou filhotes com pinças a partir da parte de trás e descascando-o para fora até os dedos do pé.
- Separe os membros posteriores do corpo cortando com as pinças próximas da coluna vertebral e transfira-as para um prato limpo com meio de dissecção gelada.
- Separe a tíbia do fêmur com pinças, introduzindo-as cuidadosamente entre a cartilagem superficial do fêmur distal e a tíbia proximal.
- Retire os ossos da anca do fêmur proximal e do osso calcâneo e a fíbula da tíbia.
- Retire cuidadosamente o tecido mole do fêmur e da tíbia por beliscando e puxando-o.
Nota: É importante remover o máximo de tecido mole possível, tomando cuidado especial na remoção do tecido que conecta os dois pólos de cartilagem, mas evitando danificar a cartilagem, o pericôndrio, e os ossos. - Coloque os quatro ossos (tíbias esquerda e direita e fêmures) no primeiro poço da placa de 24 poços com uma pipeta estéril de plástico de 1 ml. Alternativamente, para comparar o efeito de diferentes tratamentos em Membros esquerdos e direitos, coloque Membros contralaterais em diferentes poços.
Nota: O cuidado extra deve ser tomado quando os ossos são transferidos aos poços, porque podem facilmente furar à pipeta. - Proceda da mesma forma com o número de fetos que for necessário.
Nota: Mude o prato com o meio da dissecção assim que começ demasiado clouded, porque é importante ver claramente os ossos dissecados. -
Quando todos os ossos desejados forem transferidos para os poços, retire o meio de dissecção com uma pipeta estéril de 1 mL de plástico e tome cuidado extra para não aspirar os ossos.
- Dependendo da finalidade do experimento, fotos podem ser tiradas dos ossos antes de remover o meio de dissecção, como ponto de tempo zero do experimento. Tire fotografias com um microscópio ligado a uma câmara digital e anote a exposição e a escala utilizadas. Para garantir medições fáceis e confiáveis, tire fotos com bom contraste para distinguir a parte mineralizada.
- Adicione 1 mL de meio de cultura a cada poço. Se qualquer tratamento é destinado aos ossos (doxiciclina, tamoxifeno, fatores de crescimento, etc.), ele deve ser adicionado agora.
- Para observar o efeito da inibição do crescimento nas condições de cultura, tratar a tíbias esquerda com ácido retinóico (ra, 500 nm), enquanto incubando a tíbias direita com um volume equivalente de veículo (dimetil sulfóxido [DMSO], concentração final 0,1%) como um controle.
- Deixe os ossos crescer por dois dias ou mais em uma incubadora da cultura de pilha condições padrão da cultura de pilha (em 37 ° c em uma incubadora de 5% CO2 ).
- Para avaliar a proliferação, adicione 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) ou 5-bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) ao meio em uma concentração final de 10 μM 1 − 2 h antes da fixação.
Nota: A concentração conservada em estoque de EdU é 20 milímetros.
Cuidado: EdU e BrdU são análogos da timidina e podem ser tóxicos e mutagênicos. - Descongelar 4% paraformaldeído (PFA) e fixar os ossos por imersão em PFA em tubos individuais de 2 mL.
Cuidado: A PFA é tóxica e designada como um provável carcinógeno humano. Evite respirar paraformaldeído em pó e vapores. EdU e BrdU são análogos da timidina e podem ser tóxicos e mutagênicos. - Após uma breve fixação de 10 min em PFA à temperatura ambiente, transfira os ossos para PBS para aquisição de imagens no ponto temporal final. Em seguida, coloque os ossos de volta na PFA para fixar durante a noite a 4 ° c.
- Depois que os ossos da fixação podem ser processados para aplicações a jusante desejadas.
3. mensuração e análise do comprimento total do osso e da região mineralizada
- Use um software de edição de imagem para medir o comprimento dos ossos, levando em conta a escala da imagem. Meça tanto o comprimento total do osso quanto a região mineralizada. Comece as medições das primeiras células escuras em uma extremidade até os últimos na outra extremidade.
Nota: A região mineralizada é caracterizada pela cor mais escura e é facilmente distinguida da cartilagem. - Para calcular a taxa de crescimento, definida como o aumento médio de comprimento por dia, divida a diferença entre o comprimento final do osso e o inicial pelo número de dias na cultura.
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Representative Results
A cultura óssea pode ser realizada a partir de diferentes estágios. Na Figura 1a-D, é mostrada uma comparação entre a tíbia cultivada e as recém-extraídas em estágios equivalentes. A primeira observação é que até dois dias de cultura o tamanho alcançado é comparável ao crescimento ósseo in vivo para cartilagem e osso mineralizado (Figura 1a, B, D). Períodos de cultura mais longos levam a maiores diferenças entre os ossos cultivados e os recém-extraídos (Figura 1C). Adicionalmente, como mencionado no protocolo, é crucial remover o tecido macio que conecta ambas as extremidades dos ossos, como de outra maneira os ossos dobrarão. A Figura 1e mostra um exemplo de uma tíbia cultivada com remoção incompleta de tecido mole versus tíbia sem tecido mole.
Em seguida, as tíbias foram cultivadas por 2 dias e seu comprimento foi medido. Como pode ser observado na Figura 2a, B, a mensuração do comprimento total e da parte mineralizada pode ser realizada com um software de análise de imagem. Como demonstrado por de Luca et al.26, o tratamento com ar tem um forte efeito sobre o crescimento da tíbias já após 2 dias de tratamento e um resultado semelhante foi observado em nossas culturas (Figura 2b-D). É importante ressaltar que o experimento foi realizado com ossos pareados, com o osso direito como controle e o esquerdo tratado com ar (Figura 2a, B, e), o que ajuda a superar a variabilidade natural do tamanho ósseo entre diferentes espécimes. Assim, o método de cultivo descrito é adequado para avaliar o efeito de diferentes compostos sobre o crescimento ósseo.
Em seguida, foi avaliada a taxa de crescimento dos ossos após a cultura. Os ossos foram extraídos, medidos e cultivados em e 15,5, 16,5 ou P1, e fixados e medidos novamente dois dias depois. Tanto o aumento total de comprimento quanto o comprimento da parte mineralizada foram medidos (Figura 3C). Um exemplo de E 15.5 tíbia e fêmur antes da cultura (Figura 3a) e no ponto final do experimento (Figura 3B) são mostrados. Como pode ser observado a partir do gráfico e da tabela (Figura 3C, D), há um aumento consistente no comprimento total da tíbia, correspondendo a um aumento aproximado de 9 − 29% do comprimento inicial. Isto é menos aumento do que aquele observado in vivo; a principal diferença é provavelmente devido ao nível da cartilagem proximal, maior do que o distal e menos acessível aos nutrientes. De fato, a rotulagem da EdU apresentou menos células positivas nessa região após a cultura em relação aos ossos recém-extraídos de estágio equivalente (figura 4a, C). A incorporação da EdU na tíbia distal foi semelhante nos ossos cultivados e recém-extraídos (Figura 4B, D) a cartilagem distal contribui aproximadamente um terço para o crescimento total da tíbia in vivo nesta etapa27, comparável à taxa de crescimento observada na cultura, por isso propomos que a análise deve ser focada nesta parte do osso. Adicionalmente, avaliamos a mineralização dos ossos cultivados e observamos quase nenhum aumento no comprimento desta região. A diferença pode ser devido à ausência de invasão de vasos e osteoblastos na cultura ex vivo. Isto sugere que os estudos do crescimento da cartilagem podem estender por diversos dias, quando se a região do interesse for a parte ossificada do osso, o período da cultura deve ser mais curto. Esta observação foi confirmada mantendo a tíbia na cultura por um período mais longo (até 6 dias). Como pode ser observado na Figura 5, o comprimento total do elemento esquelético aumenta substancialmente, enquanto quase nenhum aumento na região mineralizada é observado (Figura 5C).
Globalmente, esses resultados sugerem que a cultura dos ossos longos pode ser usada para analisar o efeito de diferentes fatores no crescimento ósseo global e, em particular, para avaliar a dinâmica da cartilagem. Enquanto as culturas metatársicas bem estabelecidas também podem ser usadas com esses propósitos, nós submetemos que ambos os tipos de culturas se complementam, dadas as diferenças intrínsecas entre os metatarsos e o resto dos ossos longos.
Figura 1: exemplo de tíbia cultivada para diferentes períodos de tempo. (A-D) Comparação entre a tíbia recém-extraída (superior) e a tíbia extraídas em E 14,5 (inferior) e cultivadas por 2 dias (A), extraídas a e 15,5 e cultivadas por 2 dias (B), extraídas a e 16,5 e cultivadas por 4 dias (C) e recém-extraídas em dia pós-Natal 2 (P2) e extraído no dia 1 (P1) e cultivado durante 1 dia (D). Note-se que, enquanto o crescimento da cartilagem permanece bastante fisiológico após diferentes períodos de cultivo, a parte ossificada mostra um atraso de crescimento após o tempo de cultura maior que 2 dias em comparação com o osso recém-extraído no estágio correspondente. Barra de escala = 1 mm. (e) tíbia cultivada por 2 dias a partir de e 15,5; Note que a remoção incompleta do tecido mole entre as duas extremidades dos ossos leva à flexão do osso. Barra de escala = 600 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: medida do comprimento dos ossos sobre o tratamento com ácido retinóico (ar). (A-B) Tibias extraído em E 15.5 e crescido por 2 dias com 0,1% DMSO (A) e ra (B). Observe a diferença no comprimento total e da parte mineralizada. Barra de escala = 1 mm. (c-d) alterações no comprimento total (c) ou na parte mineralizada (d) da tíbia ao longo de um período de 6 dias na situação de controle e na presença de ar. Os resultados são mostrados como média ± desvio padrão (DP); a comparação é feita por meio da análise de variância em dois sentidos (ANOVA) com o tipo de tratamento como variável (valores dep são mostrados no gráfico). (E) comparação do comprimento dos ossos pareados cultivados por 2 dias com DMSO (tíbia direita) ou ar (tíbia esquerda); cada ponto representa uma das 3 repetições biológicas por condição. Utilizou-se o teste tde Student pareado de duas caudas. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: comparação do crescimento total e da mineralização da tíbia após 48 horas de cultura ex vivo. (A) e 15,5 tíbias e fêmures dos membros esquerdo (superior) e direito (inferior) antes da cultura. (B) as mesmas tíbias e fêmures seguiram após a cultura de 2 dias. Barra de escala = 600 μm. (C) gráfico representando a taxa de crescimento de tíbias cultivadas em diferentes estágios de desenvolvimento. O crescimento total e o crescimento da parte mineralizada foram avaliados. (D) tabela mostrando o comprimento inicial e final de todo o osso e a parte mineralizada antes de cultivar e 15,5 e após 2 dias de cultivo. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Placas de crescimento volumosos não mostram muita proliferação na cultura. (A-B) Coloração EdU para placas de crescimento tibial proximal (A) e distal (B) cultivadas a partir de e 15,5 por 2 dias. (C-D) Coloração EdU para placas de crescimento tibial proximal (C) e distal (D) recém-extraídas em e 17,5. Observe a diferença no número de células EdU (+) na tíbia proximal. Os dados incluem 6 pares de culturas de membros e 3 recém-extraídos. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: períodos mais longos de cultura da tíbia mostram crescimento significativo da cartilagem, mas pouca mineralização. Tíbia recém-extraída a E 15,5 (t = 0) (A) e após 6 dias na cultura (B). Observe as diferenças entre o crescimento da cartilagem e o crescimento da parte mineralizada. Barra de escala = 1 mm (C) gráfico mostrando as alterações no comprimento total e na região mineralizada ao longo de um período de 6 dias. n = 5 Tibias cultivadas; SD em cada ponto de tempo é o seguinte: t = 0, comprimento total = 0, 777, mineralizada = 0, 213; t = 3 d, comprimento total = 0,1495, mineralizada = 0, 56; t = 6 d, comprimento total = 0,1193, mineralizada = 0, 521. Estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os métodos de cultura óssea ex vivo têm sido usados há algum tempo para avaliar a biologia do crescimento ósseo28, mas raramente foram aplicados aos ossos longos murinos. Com o desenvolvimento de técnicas de imagem, a cultura óssea ex vivo oferece uma maneira atrativa de estudar o crescimento ósseo em tempo real em um cenário que se assemelha às condições in vivo. Neste cenário, é importante definir as condições em que o crescimento dos ossos longos é comparável ao seu crescimento in vivo.
No presente estudo, descrevemos um protocolo simples e acessível para a cultura óssea longa, abordando as limitações e possíveis aplicações. O passo mais crítico deste método é o isolamento dos ossos, que têm de permanecer intactos e com o menor tecido mole entre as extremidades do osso possível. Deixar o tecido mole entre as extremidades dos ossos impedirá o crescimento normal do osso e induz a flexão, como é exemplificado na Figura 1e. Tecidos moles nas extremidades dos ossos podem ser deixados, como ele acabará por desaparecer. Outro passo que requer cuidado extra é a transferência dos ossos para a placa de cultivo, como eles podem facilmente furar a pipeta de plástico. Uma solução possível é pipetagem acima e para baixo o meio da dissecção que contem partes do sangue e do tecido, porque cria um revestimento que ajude a impedir que os ossos furem à pipeta.
Uma vez extraídos, os ossos alcançam o tamanho comparável ao estágio in vivo correspondente quando cultivado para até 48 h. além de medir o comprimento do osso, a taxa de crescimento (aumento médio de comprimento por dia) pode ser facilmente estimada nessas condições. No entanto, essa abordagem para o cálculo da taxa de crescimento não é válida em períodos de cultivo mais longos, onde devem ser utilizados outros métodos, como a rotulagem de calceína29. O tratamento com ácido retinóico, que promove a diferenciação de condrócitos prematuros, leva a uma redução substancial no crescimento dos ossos, sugerindo que este tempo para a cultura é suficiente para observar o efeito que diferentes substâncias podem ter no osso Crescimento. Importante, a comparação também foi feita em ossos pareados do mesmo espécime, de modo que a tíbia esquerda recebeu o tratamento de ar e o direito foi o controle. Esta é uma vantagem do modelo de cultura óssea, pois permite a realização de comparações pareadas, que são estatisticamente mais poderosas.
A cultura por mais tempo mostra um crescimento significativo da parte da cartilagem, mas um atraso no crescimento do mineralizado, e é importante considerar esse resultado ao escolher a aplicação da técnica. Resultados semelhantes foram observados em fêmures de pintinhos cultivados por até 10 dias, que mostram uma região epifisária ampliada e um colar ósseo diafisário reduzido14, assim como na tíbia do camundongo cultivado por 6 dias18. Além disso, é importante mencionar que na região da cartilagem o crescimento também não é homogêneo: a região distal volumosa do fêmur e a região proximal da tíbia não recebem nutrientes eficientemente por difusão simples e não podem crescer adequadamente. Nesse contexto, os estudos devem incidir sobre as placas de crescimento oposto, que foram estimadas para contribuir para um terço do crescimento total27, semelhante ao crescimento observado na cultura. O retardo no crescimento dos ossos cultivados também foi descrito para as culturas metatarsais15.
Uma consideração importante deste tipo de cultura é a ausência de crescimento da parte ossificada do osso. É bem estabelecido que os osteoblastos invadem a matriz cartilaginosa do periósteo, juntamente com os vasos sanguíneos3,4e este processo é obviamente interrompido quando o osso é isolado. Isso pode explicar a ausência de ossificação em condições de cultura. A transdiferenciação hipertrófica de condrocite também foi mostrada como uma importante fonte de osteoblastos7,8,9, mas se este processo também requer em parte a presença de vasos sanguíneos, como parece fazer durante a cicatrização de fraturas30, ou alguns outros tecidos não presentes em culturas ex vivo, precisa de mais investigação. Além disso, é bem descrita a importância da carga mecânica na formação do crescimento ósseo31,32, que influencia os ossos longos e os ossos metatársicos de forma diferente, mas está ausente em uma configuração de cultivo ex vivo. No entanto, o método de cultivo descrito é adequado para medir a dinâmica do condrócito e mudanças no crescimento longitudinal e, assim, pode ser usado para determinadas aplicações.
No geral, o protocolo descrito fornece um método simples e barato para a cultura de ossos longos a partir de diferentes estágios, que podem ser acoplados com técnicas adicionais para abordar os principais mecanismos celulares e moleculares, tais como imagens de lapso de tempo ao vivo13 , 23 ou tratamento medicamentoso.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Alexandra Joyner pelo seu apoio quando este protocolo estava a ser estabelecido, Edwina McGlinn e Yi-Cheng Chang por partilharem o ácido retinóico. O Instituto australiano de medicina regenerativa é apoiado por subsídios do governo estadual de Victoria e do governo australiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
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