Summary
ここでは、胎児および新生児の両方の段階での長いネズミ骨の元インビボ培養のための方法を提示し、生体内プロセスを概説しながら制御された条件下で骨および軟骨の発達およびホメオスタシスを分析するのに適している。
Abstract
長骨は複雑で動的な構造であり、軟骨中間体を介して endochondral 骨化から生じる。健康な人間の骨への限られたアクセスは、マウスやラットなどの哺乳動物モデルの使用は、骨の成長と恒常性の異なる側面を調べるために特に貴重になります。さらに, マウスの洗練された遺伝的ツールの開発は、長い骨の成長のより複雑な研究を可能にし、骨の成長を研究するために使用される技術の拡大を求めます.ここでは、概説のほとんどの in vivo プロセスを使用しながら、厳密に制御された方法で骨と軟骨の研究を可能にする ex vivo ネズミ骨培養の詳細なプロトコルを紹介します。記載された方法は、脛骨、大腿骨、および中足骨を含む骨の範囲の培養を可能にするが、ここでは主に脛骨培養に焦点を当てている。また、タイムラプスライブイメージングや薬物治療などの他の技術と組み合わせて使用することができる。
Introduction
臓器の成長は、成長障害の出現を防ぐために厳密に調整されなければならない、と体の異なる部分間の複数の細胞型、分子経路およびクロストークの調節を伴う。イメージング技術は、成長している胚において経時的に起こる変化に対処するために不可欠であり、正常な状態においても、またシステムにおいて摂動が誘発された後も同様である。子宮内発育を伴う胚は、広く使用されているげっ歯類モデルのような、生きた画像化および薬物治療のための追加の課題を提示し、これは ex vivo 培養技術を使用して部分的に克服することができる。インビボプロセスを正常に不在し、有意義な結果を得るためには、各器官または組織に対して適切な培養条件を見つけることが重要となる。
哺乳類の骨格のほとんどの骨は endochondral 骨化を通じて成長し、そこでは胚性軟骨 (軟骨細胞と呼ばれるセルで構成される) が長手方向の成長を駆動し、徐々に骨に置換される。このプロセスは、長い骨の末端に位置する成長プレートで発生します, 3 つのゾーンを区別することができます: 安静, 増殖性, 肥大と1,2.第1に、安静域における丸い前駆軟骨は、増殖性ゾーンにおいて循環柱状軟骨細胞へと移行する。分化の次の段階では、これらの軟骨細胞は肥厚性になり、タイプ X コラーゲンを分泌し始めます。肥大性軟骨細胞は骨化の後続のステップを調整します: 結合組織成長因子、骨形態形成タンパク質、インドヘッジホッグなどの主要なシグナル伝達分子を分泌し、マトリックスの無機化を誘導し、血管は、骨の中央部分に、そして、アポトーシスの際に、骨芽細胞 (骨形成セル) が一次骨化中心3,4を形成するマトリックスに浸潤することを可能にする。無機化されたマトリックスは、骨芽細胞がこの劣化した軟骨を骨格5に置き換えて移行する血管の浸透を促進する。ほとんどの骨芽細胞は、軟骨膜から軟骨基質に浸潤し、軟骨6を包み込む繊維層である。あるいは、肥厚性軟骨細胞の割合は、骨芽細胞7、8、9に生存し、transdifferentiate することができます。骨の最終的な長さは、一時的な軟骨の蓄積された成長によるものであり、その成長速度は、肥大性軟骨細胞の数およびサイズ、およびそれらのマトリックス産生10に依存する。さらに、最後の肥大期の持続時間が骨11の最終的な長さと相関することが最近示された。したがって、これらの細胞の増殖および分化の厳密な調節は、正しい骨サイズを確保するために必要である。
組織や成長プレートの開発に長年にわたって得られたかなりの知識にもかかわらず、これらの結論のほとんどは、固定組織学的セクションの観察に基づいています。ティッシュの区分はこのプロセスに関する貴重な情報を提供するが、技術的なアーティファクトと乗ることができる従って異なった段階間の形態的なかサイズの変更を推定するのに常に確実に使用することができない。さらに、骨の成長は動的なプロセスであるため、静的二次元 (2D) 画像は成長板の細胞の動きに限られた洞察を与え、生きた組織に対するタイムラプス撮影は、その行動に関する貴重な情報を提供することができます。成長プレート内の軟骨細胞。
これらすべての制限は、ex vivo の骨培養を使用して潜在的に解決することができます。骨培養プロトコルは、いくつかの時間前に開発されているが、彼らは限定マウスの長い骨に適用されました。研究のほとんどは、ひよこモデル12,13によって提供される技術的な利点のためにひよこの骨を使用しています。Organotypic 培養物 (空気/液体界面) を、10日間14の培養で維持したひよこ胚大腿骨に適用した。マウスで利用可能な洗練された遺伝学的ツールは、このモデルは、ex vivo の骨の培養で使用されることが非常に魅力的にする。骨の成長を調べるためにマウスを使用した研究は、ほとんど中足骨15で働いていましたが、おそらくその小さなサイズと胚16あたりのより大きな数に起因します。伝統的に長い骨と考えられていたが、metatarsi は、インビボで他の長骨よりも早く (成長プレート17の増殖および退縮を減少させることを特徴とする) 老化を入力し、したがってそれらの連続的な増殖は実際に in vivo プロセスを不在ます。この記事の目的のために、近位および中間肢領域からの骨のための長い骨という用語を使用します。以前のいくつかの研究では、脛骨のような長いネズミ骨を、ex vivo 培養で使用し、軟骨の実質的な成長を観察したが、少し骨化18.我々はまた、最近、主に軟骨ダイナミクス19を研究するために脛骨培養物を使用しました。他の研究は、若年マウス20または培養物21のための大腿骨の遠位部分のみから大腿骨頭を使用した。いくつかのより最近の作品では、正常な骨の ex 培養とタイムラプス撮影を組み合わせることで、生きているマウス組織22,23における軟骨細胞の三次元 (3d) 映画を得ることができます。著者らは、骨 ex インビボ培養の潜在的適用の良い例において、増殖性ゾーン23への軟骨細胞の再配置において以前気付かれなかった事象を観察することを管理した。静的な画像を分析する代替手段として、間接的で複雑になる手法が必要です。これは、軟骨成長のための横断的指向クローンの重要性を評価する最近の研究によって例示された、数学的モデリングと結合した多色レポーターマウス系統を用いた遺伝的トレースは24を使用した。したがって、ex vivo カルチャは、動的なプロセスについてより迅速かつ簡単に洞察を得るのに役立つ可能性があります。
ここでは、マウス長骨培養のための方法を提示し、これを異なる分子処理および/またはタイムラプスライブイメージングと組み合わせることができる。このプロトコルは、以前のレポート15、18、25で使用される方法を適応するが、いくつかの追加の問題に対処し、中足の骨ではなく、脛骨などの長骨に焦点を当てています。最後に、異なる物質の存在下で左右の骨を別々に培養することによって、統計的に強力な対比較を使用する可能性を探ります。
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Protocol
すべての実験は、実験動物の倫理的取扱いに関する地方の政府および制度のガイドラインに従って行われるべきである。
1. 骨培養日前の準備
- Matings の日 14.5 (E 14.5) 以降から胎児と仔を得るために、時限マウスを設定します。
注:長い骨の文化は、正常に異なるマウス系統に適用することができます。本プロトコールにおいて、outbred スイスウェブスター野生型マウスが用いられる。 - 解離培地の調製 (ヒューストン et al.15): 希釈α-最小エッセンシャル培地 (α-MEM) またはダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 1/13 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) および 2Mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) およびフィルター滅菌0.22 μ m、33 mm 直径のスポイトフィルターを通して。アリコートを-20 ° c に保管してください。
- 胎児の抽出の前日に、0.2% BSA を含む DMEM、0.5 mM L-グルタミン、40 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、0.05 mg/mL アスコルビン酸、および1mm の betaglycerophosphate からなる無血清骨培養培地を準備する。フィルター滅菌は、0.22 μ m、33 mm 径のシリンジフィルターを通して、4° c で最大1ヶ月間保存します。
- 文化の日とマウスのカリングの前に、解剖培地で24ウェルプレートと 60 mm の料理を準備し、氷冷してください。37° c の水浴中で骨培養培地を外。胎児の取り扱いに使用する工具 (ピンセットと小さなはさみ) に 80% (v/v) エタノールを噴霧する。双眼スコープをクラス II バイオセーフティキャビネットに移します。
2. 胎児・新生児の培養脛骨と大腿骨
- 所望の妊娠の段階 (E 14.5 から E 18.5 までの範囲) での頚部脱臼を通して妊娠中のマウスをカリングする。新生児が使用されている場合は、1つずつ母からそれらを削除し、斬首によってカリングします。
- 彼女の背中にマウスを置き、その表面に 80% (v/v) エタノールを噴霧することにより、腹部領域を滅菌します。
- 皮膚と腹部の筋肉を小さなはさみで切り、子宮の角にアクセスします。
- ピンセットと小さなはさみの助けを借りて腹腔から子宮を抽出し、mesometrium を取り除き、角の基部を切断する。氷冷解剖培地で 60 mm ペトリ皿に子宮を置き、全体の手順の間に氷の上に培養皿を保つ。
- ペトリ皿を子宮と一緒にバイオセーフティキャビネットに移し、これから作業を行います。
- 嚢間を切断することにより、個々の胎児をはさみで分離する。
- 解剖培地を備えた清潔な 60 mm ディッシュの実体顕微鏡で個々の嚢を移し、ピンセットで開き、胎児を胎盤から分離し、膜から拭きます。
注:氷の上に残りを維持しながら、一度に1つの胚で動作します。 - 胎児を斬るし、1つの mL の切られた生殖不能のピペットが付いているきれいで新しい 60 mm の皿にボディを移す。
- ピンセットで胎児や仔の皮膚を取り除き、つま先まで剥がします。
- 脊椎に近いピンセットで切断して体から四足獣を分離し、氷冷解剖培地できれいな皿に移します。
- 遠位大腿骨および近位脛骨の表面の軟骨の間で慎重にそれらを導入することによってピンセットが付いている腿骨からの脛骨を分けなさい。
- 近位腿骨および踵骨からの股関節骨および脛骨からの腓骨を除去する。
- 慎重にニッピングし、それを引っ張ることによって大腿骨と脛骨から軟部組織を除去します。
注:2つの軟骨極を接続する組織を除去するのに特別な注意を取って、できるだけ多くの軟部組織を除去することが重要ですが、軟骨、軟骨膜、骨を損傷するのを避けてください。 - 4本の骨 (左右脛骨と大腿骨) を24ウェルプレートの最初の井戸に入れ、プラスチック製の1ml の滅菌ピペットで置きます。あるいは、左右の手足の異なる治療の効果を比較するために、対の四肢を異なる井戸に置く。
注:彼らは簡単にピペットに固執することができますように、骨がウェルに転送されたときに余分なケアを取る必要があります。 - 必要な数の胎児と同じように進行してください。
注:切開した骨をはっきりと見ることが重要なので、それが曇ってしまうとすぐに、解剖培地で皿を変えてください。 -
すべての所望の骨がウェルに転送されると、プラスチック1ml の滅菌ピペットで解剖培地を除去し、骨を吸引しないように余分な注意を取ります。
- 実験の目的に応じて、実験の timepoint ゼロとして、解剖培地を除去する前に骨の写真を撮ることができる。デジタルカメラに取り付けられた顕微鏡で写真を撮り、使用する露出とスケールに注釈を付けます。簡単で信頼性の高い測定を行うには、無機化された部分を区別するためにコントラストの良い写真を撮影します。
- 各ウェルに培養液 1 mL を加えます。任意の治療は、骨 (ドキシサイクリン、タモキシフェン、成長因子など) に意図されている場合、それは今追加する必要があります。
- 培養条件における増殖阻害の影響を観察するには、左脛骨をレチノイン酸 (RA, 500 nM) で治療し、同等量のビヒクルで右脛骨をインキュベートしながら (ジメチルスルホキシド [DMSO]、最終濃度 0.1%)コントロールとして。
- 標準的な細胞培養条件 (5% CO2 インキュベーターで37° c で) で細胞培養インキュベーター内で2日間以上成長するように骨を残します。
- 増殖を評価するには、固定の前に 5-ethynyl-2'-デオキシウリジン (EdU) または 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン (BrdU) を10μ m 1 − 2 h の最終濃度で培地に加える。
注:EdU のストック濃度は20mm です。
注意:EdU および BrdU は、チミジン類似体であり、毒性および変異原性であり得る。 - 解凍 4% パラホルムアルデヒド (PFA) と個々の2ml の管の PFA に浸漬することによって骨を固定します。
注意:PFA は有毒であり、潜在的なヒト発癌物質として指定されています。パラホルムアルデヒド粉末および蒸気を呼吸することは避けてください。EdU および BrdU は、チミジン類似体であり、毒性および変異原性であり得る。 - 室温で PFA の短い10分の固定の後、最終的な timepoint で写真の取得のための PBS に骨を転送します。その後、4° c で一晩固定するための PFA に戻って骨を置きます。
- 固定骨は望ましい下流の適用のために処理することができる後。
3. 骨および無機化された領域の全長の測定と分析
- イメージ編集ソフトウェアを使用して、イメージのスケールを考慮して、ボーンの長さを測定します。骨の全長と無機化された領域の両方を測定します。一端の最初の暗いセルからもう一方の端にある最後のものまで測定を開始します。
注:無機化された領域は、より暗い色を特徴とし、軟骨と容易に区別される。 - 一日あたりの平均の長さの増加として定義された成長率を計算するには、骨の最終的な長さと最初のものの差を培養日数で割ります。
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Representative Results
骨培養は、異なる段階から開始して行うことができる。図 1a− Dにおいて、同一の段階での培養した脛骨と抽出したものとの比較が示されている。第1の観察は、達成された最大2日間の培養が、軟骨および無機骨の両方についてインビボ骨成長に匹敵することである (図 1a、B、D)。培養期間が長いと、培養骨と新たに抽出したものとの間に大きな差が生じる (図 1c)。さらに、このプロトコルで言及されているように、骨の両端をつなぐ軟部組織を除去することは、それ以外の場合、骨が曲がることが重要です。図 1eは軟部組織を伴わない脛骨に対して軟質組織の不完全な除去を伴って成長した脛骨の例を示す。
次に、脛骨を2日間培養し、その長さを測定した。図 2a、Bに見られるように、全長さおよび鉱化部分の測定は、画像解析ソフトウェアを用いて行うことができる。De ルカ et al.26によって示されるように、RA による治療は、すでに治療の2日後に脛骨の成長に強い影響を及ぼし、私たちの培養でも同様の結果が認められました (図 2b-D)。重要なことに、この実験は一対の骨を用いて、右骨をコントロールとし、左に RA で処置した (図 2a、B、E) ことにより、異なる標本間の骨サイズの自然変動を克服するのに役立つ。したがって、記載される培養方法は、骨成長に対する異なる化合物の効果を評価するのに適している。
次に、培養後の骨の成長率を評価した。骨を抽出し、測定し、E 15.5、16.5 または P1 で培養し、2日後に再び固定して測定した。合計の長さの増加と鉱化部品の長さの両方が測定されました (図 3c)。培養前の E 15.5 脛骨および大腿骨の例 (図 3a) および実験の終了点 (図 3b) が示されている。グラフおよび表から観察することができるように (図 3c、D)、脛骨の全長の一貫した増加があり、初期の長さから9− 29% のおおよその増加に対応する。これは、インビボで観察されたものよりも少ない増加である。主な違いは、近位軟骨のレベルに起因する可能性があり、遠位より大きく、栄養素にアクセスしにくい。実際に、EdU 標識は、培養後のこの領域における陽性細胞の数が、抽出された同じ段階の骨と比較して減少した (図 4a、C)。遠位脛骨における EdU の取込みは、培養されたそして新たに抽出した骨において類似していた (図 4b、D) 遠位軟骨は、この段階27でインビボでの総増殖に約1/3 を寄与し、培養で観察される成長速度に匹敵するので、我々は、分析が骨のこの部分に焦点を当てるべきであると提案する。さらに、培養骨の無機化性を評価し、この領域の長さがほとんど増加しないことを観察した。この違いは、ex vivo 培養における血管および骨芽細胞浸潤の欠如に起因する可能性がある。これは、軟骨成長の研究は数日間延長することができるが、関心領域が骨の ossified 部分である場合、培養の期間はより短くなければならないことを示唆している。この観察は、培養中の脛骨をより長い期間 (6 日まで) 保持することによって確認された。図 5に見られるように、骨格要素の全長は実質的に増加するが、無機化された領域ではほとんど増加が見られることはない (図 5c)。
全体として、これらの結果は、長い骨の培養が、骨全体の成長に対するさまざまな因子の影響を分析し、特に軟骨の動態を評価するために使用できることを示唆している。確立された中足の文化はこれらの目的でも使用できますが、metatarsals と他の長い骨との間の固有の違いを考えると、両方のタイプの培養が互いに補完することを提出します。
図 1: 異なる期間の培養した脛骨の例。(A-D)取り出したばかりの脛骨 (上) と E 14.5 (下) で抽出した脛骨を比較し、2日間培養し (A)、e 15.5 で抽出し、2日間 (B) 培養し、e 16.5 で抽出し、4日間培養して (C)、新たに抽出した。生後2日目 (P2) と生後1日目 (P1) で抽出し、1日 (D) 培養した。なお、軟骨成長は異なる培養期間の後も極めて生理的なままであるが、ossified 部分は培養時間後の生育遅延を、対応する段階での新たに抽出された骨と比較して2日より長いことを示す。スケールバー = 1 mm。 (e) e 15.5 から2日間培養した脛骨;骨の2つの端の間の軟部組織の不完全な除去は、骨の曲がりにつながることに注意してください。スケールバー = 600 μ m。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: レチノイン酸 (RA) 処理時の骨の長さの測定。(A-B)脛骨を E 15.5 で抽出し、0.1% DMSO (A) および RA (B) で2日間増殖させた。全長と鉱化された部分の両方の違いに注意してください。スケールバー = 1 mm (c) の総長さの変化 (c) またはコントロールの状況で6日の期間にわたって脛骨の無機化された部分 (D) と RA の存在.結果は平均±標準偏差 (SD) として示されます。比較は、変数 (p値がグラフに示されている) としての治療の種類との双方向分散分析 (ANOVA) によって行われます。(E) DMSO (右脛骨) または RA (左脛骨) のいずれかで2日間培養した一対の骨の長さの比較;各ドットは、条件ごとに3つの生物学的反復のいずれかを表します。ペアの両側スチューデントt検定を使用しました。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: ex インビボ培養の48時間後の脛骨の総増殖および石灰化の比較。(A) e 15.5 脛骨および大腿骨は、培養前の四肢の左 (上) および右 (下) から開始します。(B) 2 日培養後に同じ脛骨と大腿骨が続いた。スケールバー = 600 μ m。 (C) 異なる発達段階で培養した脛骨の成長速度を表すグラフ。総成長と鉱化部品の成長の両方が評価されました。(D) 培養中に e 15.5 および2日後に培養する前の骨全体および鉱化部分の初期および最終の長さを示す表。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:大きな成長板は、培養物に多くの増殖を示さない。(A-B)この近位 (A) および遠位 (B) の脛骨成長プレートについての EdU 染色は、e 15.5 から2日間培養した。(C-D)EdU 染色は、E 17.5 で抽出された近位 (C) および遠位 (D) 脛骨成長プレートについて。近位脛骨における EdU (+) 細胞の数の違いに注意してください。データには、6つの培養された手足のペアと3つの新たな抽出が含まれる。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 脛骨培養のより長い期間は、実質的な軟骨成長を示すが、無機化は少ない。新規に抽出した脛骨を E 15.5 (t = 0) (A) および培養6日後 (B) に行う。軟骨の成長と無機化された部分の成長の違いに注意してください。スケールバー = 1 mm (C) 6 日間の期間にわたる全長と無機化された領域の変化を示すグラフ。n = 5 培養脛骨;各時点の SD は次のようになります: t = 0、全長 = 0.0777、無機化 = 0.0213;t = 3 d、全長 = 0.1495、無機化 = 0.056;t = 6 d、全長 = 0.1193、無機化 = 0.0521。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
骨 ex インビボ培養法は、骨成長28の生物学を評価するためにしばらくの間使用されてきたが、マウス長骨にはめったに適用されていない。画像化技術の発達により、ex vivo の骨培養は、インビボ条件に近い設定でリアルタイムで骨成長を研究する魅力的な方法を提供する。このシナリオでは、長い骨の成長がインビボでの成長に匹敵する条件を定義することが重要である。
本研究では、長い骨培養のためのシンプルで手頃な価格のプロトコルについて説明し、限界と可能な用途に対処する。この方法の最も重要なステップは、骨の単離であり、そのままで、かつ、可能な限りボーンの端部との間の軟部組織として少なくする必要がある。軟部組織を骨の末端の間に残すことは、図 1eに例示されているように骨の正常な成長を防ぎ、屈曲を誘発する。骨の末端にある軟組織は、最終的には消滅するので、残すことができる。特別な注意を必要とする別のステップは、プラスチックピペットに容易に固執することができるように、培養プレートへの骨の移動です。可能な解決策の1つは、血液および組織片を含む解剖培地を上下にピペットで入れ、それがピペットに固着することから骨を排除するのに役立つコーティングを作成することである。
一旦抽出されると、骨は、48までの間培養したときに該当する in vivo ステージに匹敵する大きさに達する。骨の長さを測定することから離れて、成長速度 (一日あたりの平均長さの増加) はこれらの条件で容易に推定することができる。しかし、この成長率計算のためのこのアプローチは、カルセインラベル29のような他の方法が使用されるべきである長い培養期間にわたって有効ではありません。早期軟骨分化を促進するレチノイン酸による治療は、骨の成長の実質的な減少をもたらし、この培養の時間は、異なる物質が骨に与える可能性のある効果を観察するのに十分であることを示唆している成長。重要なことに、比較は同じ標本からの一対の骨についても行われたので、左脛骨は RA 治療を受け、右はコントロールであった。これは、統計的により強力な対になった比較を行うことができるため、骨培養モデルの利点です。
長い間培養すると軟骨部分の著しい成長を示すが、無機化されたものの成長の遅れ、および技術の適用を選択する際にこの結果を考慮することが重要である。同様の結果は、6日間18日培養したマウス脛骨におけると同様に拡大した多発性領域および減少した骨幹骨襟14を示す最大10日間にわたって培養したひよこ大腿骨において観察された。さらに、軟骨領域では成長も均質ではないことを言及することが重要である: 大腿骨のかさばる遠位領域と脛骨の近位領域は、単純な拡散によって栄養素を効率的に受けず、適切に成長することができません。この文脈では、研究は、培養の観察された成長と同様に、全成長27の3分の1に寄与すると推定された反対の成長プレートに焦点を当てるべきである。培養骨の成長の遅延を、中足の培養15についても説明した。
このタイプの培養の重要な考慮事項は、骨の ossified 部分の成長の欠如である。骨芽細胞が血管3,4と共に骨膜から軟骨のマトリックスに侵入することはよく確立されており、このプロセスは、明らかに骨折したときに破壊されます。これは、培養条件下で骨化が存在しないことを説明するかもしれません。肥大性軟骨分化形質転換は、骨芽細胞7、8、9の重要な供給源としても示されたが、このプロセスが一部でも血管の存在を必要とするかどうかは、骨折治癒30、または ex インビボ培養物に存在しないいくつかの他の組織は、さらなる調査を必要とする。さらに、長い骨と中足の骨に異なる影響を与える骨成長31,32を形成する際の機械的負荷の重要性についてもよく説明されていますが、ex インビボ培養セットアップには存在しません。それにもかかわらず、記載された培養方法は、軟骨ダイナミクスおよび長手方向成長の変化を測定するのに適しており、したがって、特定の用途に使用することができる。
全体として、記述されたプロトコルは、異なる段階から始まる長い骨を培養するための簡単で安価な方法を提供し、これは、生きたタイムラプス撮影などの主要な細胞および分子メカニズムに対処するための追加の技術と結合することができる,23または薬物治療。
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Disclosures
作者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
私たちは、このプロトコルが確立されているときに彼女のサポートのためにアレクサンドラ・ジョイナーに感謝したいと思います, レチノイン酸を共有するためのエドウィナ McGlinn と Yi-チェン.オーストラリア再生医療研究所は、ビクトリア州政府とオーストラリア政府からの助成金によって支えられています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
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