Summary
Aquí, presentamos un método para la cultura ex vivo de huesos largos de murino en las etapas del feto y del recién nacido, adecuado para analizar el desarrollo de hueso y cartílago y la la homeostasis en condiciones controladas, mientras que recapitular el proceso in vivo.
Abstract
Los huesos largos son estructuras complejas y dinámicas, que surgen de la osificación endocondral a través de un cartílago intermedio. El acceso limitado a huesos humanos sanos hace particularmente valioso el uso de modelos de mamíferos, como ratones y ratas, para buscar en diferentes aspectos del crecimiento óseo y la homeostasis. Además, el desarrollo de herramientas genéticas sofisticadas en ratones permite estudios más complejos de crecimiento óseo largo y pide una expansión de las técnicas utilizadas para estudiar el crecimiento óseo. Aquí, presentamos un protocolo detallado para el cultivo de hueso murino ex vivo, que permite el estudio del hueso y el cartílago de una manera estrechamente controlada, mientras que la recapitulación de la mayor parte del proceso in vivo. El método descrito permite la cultura de una gama de huesos, incluyendo la tibia, el fémur y los huesos metatarsales, pero nos hemos centrado principalmente en la cultura tibial aquí. Además, se puede utilizar en combinación con otras técnicas, como el Time-lapse Live Imaging o tratamiento farmacológico.
Introduction
El crecimiento de órganos tiene que estar estrechamente afinado para prevenir la aparición de trastornos del crecimiento, e implica la regulación de múltiples tipos celulares, vías moleculares y diafonía entre diferentes partes del cuerpo. Las técnicas de imagen son esenciales para abordar los cambios que ocurren a lo largo del tiempo en un embrión en crecimiento, tanto en condiciones normales, como después de que se induce una perturbación en el sistema. Los embriones con desarrollo intrauterino, como los modelos de roedores ampliamente utilizados, presentan un desafío adicional para la imagen en vivo y el tratamiento farmacológico, que puede superarse parcialmente mediante el uso de técnicas de cultivo ex vivo. Para recapitular con éxito los procesos in vivo y obtener resultados significativos, resulta crucial encontrar las condiciones de cultivo correctas para cada órgano o tejido.
La mayoría de los huesos del esqueleto de mamíferos crecen a través de la osificación endocondral, donde el cartílago embrionario (compuesto de células denominadas condrocitos) impulsa el crecimiento longitudinal y se sustituye gradualmente por el hueso. Este proceso ocurre en las placas de crecimiento, situadas al final de los huesos largos, donde se pueden distinguir tres zonas: descansando, proliferativa e hipertrófica1,2. Primero, los condrocitos de los progenitoras redondos en la transición de la zona de reposo en los condrocitos ciclistas columnar en la zona proliferativa. Durante la siguiente etapa de diferenciación, estos condrocitos se vuelven hipertróficos y empiezan a secretar colágeno tipo X. Los condrocitos hipertróficos orquestan los siguientes pasos de osificación: segretan moléculas clave de señalización, como el factor de crecimiento del tejido conjuntivo, proteínas morfolgenéticas óseas y erizo indio, y dirigen la mineralización de la matriz, reclutan los vasos sanguíneos a la parte central del hueso, y, sobre la apoptosis, permiten osteoblastos (células que forman hueso) para invadir la matriz para formar el centro de osificación primaria3,4. La matriz mineralizada facilita la penetración de los vasos sanguíneos a través de los cuales los osteoblastos migran para reemplazar este cartílago degradado por una matriz ósea5. La mayoría de los osteoblastos invaden la matriz del cartílago del pericondrio, una capa fibrosa que envuelve el cartílago6. Alternativamente, una proporción de condrocitos hipertróficos son capaces de sobrevivir y transdiferenciar a osteoblastos7,8,9. La longitud final del hueso se debe al crecimiento acumulado del cartílago transitorio, cuya tasa de crecimiento a su vez depende del número y tamaño de los condrocitos hipertróficos, y su producción matricial10. Además, se demostró recientemente que la duración de la última fase de la hipertrofia se correlaciona con la longitud final del hueso11. Por lo tanto, se requiere una regulación estricta de la proliferación y diferenciación de estas células para asegurar el tamaño adecuado de los huesos.
A pesar de los sustanciales conocimientos adquiridos a lo largo de los años en la organización y desarrollo de las placas de crecimiento, la mayoría de estas conclusiones se basan en la observación de secciones histológicas fijas. La sección de tejido proporciona información valiosa sobre este proceso, pero se puede montar con artefactos técnicos, por lo que no se puede utilizar siempre de forma fiable para estimar los cambios morfológicos o de tamaño entre diferentes etapas. Además, a medida que el crecimiento óseo es un proceso dinámico, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) ofrecen una visión limitada del movimiento de las células en la placa de crecimiento, mientras que la toma de imágenes de lapso de tiempo en el tejido vivo podría ofrecer información valiosa sobre el comportamiento de la condrocitos en la placa de crecimiento.
Todas estas limitaciones se pueden resolver potencialmente utilizando cultivos óseos ex vivo. Mientras que los protocolos de cultivo óseo se han desarrollado hace algún tiempo, se aplicaron limitadamente a los huesos largos murinos. La mayoría de los estudios utilizan huesos de polluelo debido a las ventajas técnicas ofrecidas por el Chick Model12,13. Los cultivos organotíticos (interfaz aire/líquido) se aplicaron a las fémures embrionarias de polluelo, que se mantuvieron en cultivo durante 10 días14. Las sofisticadas herramientas genéticas disponibles en ratón hacen que este modelo sea muy atractivo para ser utilizado en cultivos de hueso ex vivo. Los estudios que utilizaron ratones para mirar el crecimiento óseo trabajaron principalmente con huesos metatarsos15, probablemente debido a su pequeño tamaño y mayor número obtenido por embrión16. Aunque tradicionalmente se consideran huesos largos, el metatarsi entra en la senescencia (caracterizado por una reducción de la proliferación y la involución de la placa de crecimiento17) antes que otros huesos largos in vivo, y por lo tanto su continuo crecimiento ex vivo no realmente recapitular el proceso in vivo. Para los fines de este artículo, utilizaremos el término huesos largos para los huesos de las regiones proximal e intermedia de las extremidades. Varios estudios previos utilizaron huesos murinos largos, como la tibia, en cultivos ex vivo y observaron un crecimiento sustancial del cartílago, pero poca osificación18. También usamos culturas tibial recientemente, principalmente para estudiar la dinámica de condrocitos19. Otros estudios utilizaron cabezas femorales de ratones jóvenes20 o sólo la parte distal del fémur para la cultura21. Algunas obras más recientes combinan con éxito la cultura ex vivo de huesos llenos con imágenes de lapso de tiempo para adquirir películas tridimensionales (3D) de condrocitos en el tejido del ratón viviente22,23. Los autores lograron observar eventos previamente inadvertidas en la reordenación de los condrocitos a la zona proliferativa23 en un buen ejemplo de la posible aplicación de la cultura ósea ex vivo. La alternativa, es decir, el análisis de imágenes estáticas, requiere técnicas indirectas y complejas. Esto fue ejemplificado por un estudio reciente que valoró la importancia de los clones orientados transversalmente para el crecimiento del cartílago, donde se utilizaron el rastreo genético con cepas de ratones de reportero multicolor junto con el modelado matemático24. Por lo tanto, la cultura ex vivo podría ayudar a profundizar en los procesos dinámicos de una manera más rápida y directa.
Aquí, presentamos un método para la cultura de los huesos largos murinos, que se puede combinar con diferentes tratamientos moleculares y/o con imágenes en vivo de lapso de tiempo. Este protocolo adapta los métodos utilizados en los informes anteriores15,18,25, pero aborda algunos problemas adicionales y se centra en los huesos largos, como la tibia, en lugar de los huesos metatarsales. Por último, explora el potencial de usar comparaciones emparejadas estadísticamente poderosas mediante el cultivo de huesos izquierdos y derecho por separado en presencia de diferentes sustancias.
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Protocol
Todos los experimentos deben llevarse a cabo siguiendo las pautas gubernamentales e institucionales locales de manejo ético de los animales de laboratorio.
1. preparaciones previas al día de la cultura ósea
- Configurar los apareamientos del ratón cronometrados para obtener fetos y cachorros de día embrionario 14,5 (e 14.5) y en adelante.
Nota: La cultura de los huesos largos se puede aplicar con éxito a diferentes cepas de ratón; en el presente Protocolo, se utilizan ratones salvajes de tipo salvaje de Swiss Webster. - Preparar el medio de disección (adaptado de Houston et al.15): diluir α-medio esencial mínimo (α-MEM) o el medio de águila modificada de Dulbecco (dmem) 1/13 en solución salina con tampón de fosfato (PBS) y 2 mg/ml de albúmina bovina (BSA) y filtro esterilizados a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm, 33 mm de diámetro. Almacene alícuts a-20 ° c.
- El día antes de la extracción de los fetos, preparar el medio de cultivo óseo libre de suero compuesto de DMEM que contiene 0,2% de BSA, 0,5 mM L-glutamina, 40 U/mL de penicilina/estreptomicina, 0,05 mg/mL de ácido ascórbico, y 1 mM betaglycerofosfato. Filtro esterilizar a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm, 33 mm de diámetro y almacenar a 4 ° c durante un máximo de 1 mes.
- En el día de la cultura y antes del sacrificio del ratón, Prepare placas de 24-Well y platos de 60 mm con medio de disección y manténguelos fríos. Precalentar el medio de cultivo óseo en un baño de agua de 37 ° c. Pulverizar 80% (v/v) de etanol sobre las herramientas (pinzas y tijeras pequeñas) que se utilizarán para la manipulación del feto. Transfiera un endoscopio binocular a un gabinete de bioseguridad de clase II.
2. la cultura del feto y la tibia recién nacida y el fémur
- Cull el ratón embarazada a través de la luxación cervical en la etapa gestacional deseada (que van de la E 14.5 a la E 18.5). Si se utilizan crías recién nacidos, quítelos de la madre uno por uno y cúrelos por decapitación.
- Coloque el ratón sobre su espalda y esterilice la región abdominal rociando el 80% (v/v) de etanol en su superficie.
- Corta la piel y el músculo abdominal con pequeñas tijeras para acceder a los cuernos uterinos.
- Extraer el útero de la cavidad abdominal con la ayuda de pinzas y pequeñas tijeras, quitando el mesometrium y cortando la base de los cuernos. Colocar el útero en una placa de Petri de 60 mm con medio de disección helada y mantener el plato de cultivo en hielo durante todo el procedimiento.
- Transfiera la placa de Petri con el útero al gabinete de bioseguridad y trabaje allí a partir de ahora.
- Separe los fetos individuales con tijeras cortando entre los sacos.
- Transfiera el saco individual bajo un estereomicroscopio de disección en un plato limpio de 60 mm con medio de disección y ábralos con pinzas para separar los fetos de las en y limpiarlos de las membranas.
Nota: Trabaje con un embrión a la vez, manteniendo el resto en hielo. - Decapar los fetos y transferir el cuerpo a un nuevo plato limpio de 60 mm con una Piera estéril de corte de 1 mL.
- Retire la piel de los fetos o cachorros con pinzas a partir de la parte posterior y pelar hacia fuera hasta los dedos de los pies.
- Separe las extremidades posteriores del cuerpo cortando con las pinzas cercanas a la espina dorsal y transfiéralas a un plato limpio con medio de disección helada.
- Separe la tibia del fémur con pinzas al introducirlas cuidadosamente entre el cartílago superficial del fémur distal y la tibia proximal.
- Retire los huesos de la cadera del fémur proximal y el hueso del calcáneo y el peroné de la tibia.
- Retire con cuidado el tejido blando del fémur y la tibia por cercenó y tirando de él.
Nota: Es importante eliminar tanto tejido blando como sea posible, teniendo especial cuidado en la eliminación del tejido que conecta los dos polos del cartílago, pero evitando dañar el cartílago, el pericondrio, y los huesos. - Colocar los cuatro huesos (tibias y femurs izquierdo y derecho) en el primer pozo de la placa de 24-Well con una pipas estéril de 1 mL de plástico. Alternativamente, para comparar el efecto de diferentes tratamientos en extremidades izquierdas y derecha, coloque extremidades contralateral en diferentes pozos.
Nota: Se debe tener cuidado adicional cuando los huesos se transfieren a los pozos, ya que pueden adherirse fácilmente a la pipas. - Proceda de la misma manera con tantos fetos como sea necesario.
Nota: Cambiar el plato con el medio de disección tan pronto como se oscurezca, ya que es importante ver claramente los huesos diseccionados. -
Cuando todos los huesos deseados se transfieran a los pozos, retire el medio de disección con una estéril de 1 mL de plástico y tenga cuidado adicional de no aspirar los huesos.
- Dependiendo del propósito del experimento, se pueden tomar imágenes de los huesos antes de quitar el medio de disección, como el punto de tiempo cero del experimento. Tome fotografías con un microscopio conectado a una cámara digital y anote la exposición y la escala utilizada. Para garantizar mediciones fáciles y fiables, tome fotografías con buen contraste para distinguir la parte mineralizada.
- Añadir 1 mL de medio de cultivo a cada pozo. Si algún tratamiento está destinado a los huesos (doxiciclina, tamoxifeno, factores de crecimiento, etc.), se debe añadir ahora.
- Para observar el efecto de la inhibición del crecimiento en las condiciones de cultivo, tratar la tibias izquierda con ácido retinoico (RA, 500 nM), mientras que incubando la tibias derecha con un volumen equivalente de vehículo (dimetilsulfóxido [DMSO], concentración final 0,1%) como un control.
- Deje que los huesos crezcan durante dos días o más en una incubadora de cultivos celulares bajo condiciones de cultivo celular estándar (a 37 ° c en una incubadora de 5% de CO2 ).
- Para evaluar la proliferación, añadir 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) o 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) al medio en una concentración final de 10 μM 1 − 2 h antes de la fijación.
Nota: La concentración de stock de EdU es de 20 mM.
PRECAUCIÓN: EdU y BrdU son análogos de timidina y pueden ser tóxicos y mutagénicos. - Descongelar el 4% de paraformaldehído (PFA) y fijar los huesos por inmersión en PFA en tubos individuales de 2 mL.
PRECAUCIÓN: La PFA es tóxica y se designa como un probable carcinógeno humano. Evite respirar el polvo y los vapores de paraformaldehído. EdU y BrdU son análogos de timidina y pueden ser tóxicos y mutagénicos. - Después de una breve fijación de 10 min en PFA a temperatura ambiente, transfiera los huesos a PBS para la adquisición de imágenes en el punto de tiempo final. A continuación, coloque los huesos de nuevo en PFA para la fijación durante la noche a 4 ° c.
- Después de que los huesos de fijación se pueden procesar para aplicaciones descendentes deseadas.
3. medición y análisis de la longitud completa del hueso y de la región mineralizada
- Utilice un software de edición de imágenes para medir la longitud de los huesos, teniendo en cuenta la escala de la imagen. Mida tanto la longitud total del hueso como la región mineralizada. Comience las mediciones desde las primeras células oscuras en un extremo hasta las últimas en el otro extremo.
Nota: La región mineralizada se caracteriza por el color más oscuro y se distingue fácilmente del cartílago. - Para calcular la tasa de crecimiento, definida como el aumento promedio de la longitud por día, divida la diferencia entre la longitud final del hueso y la inicial por el número de días en la cultura.
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Representative Results
El cultivo óseo se puede realizar a partir de diferentes etapas. En la figura 1A-D, se muestra una comparación entre la tibia cultivada y los recién extraídos en etapas equivalentes. La primera observación es que hasta dos días de cultivo el tamaño logrado es comparable al crecimiento óseo in vivo tanto para el cartílago como para el hueso mineralizado (figura 1A, B, D). Periodos de cultivo más largos conducen a mayores diferencias entre los huesos cultivados y los recién extraídos (figura 1C). Además, como se menciona en el protocolo, es crucial para eliminar el tejido blando que conecta ambos extremos de los huesos, ya que de lo contrario los huesos se doblan. La Figura 1E muestra un ejemplo de una tibia cultivada con eliminación incompleta de tejido blando versus una tibia sin tejido blando.
A continuación, las tibias se cultivaron durante 2 días y se midió su longitud. Como se puede ver en la figura 2A, B, la medición de la longitud total y de la parte mineralizada se puede realizar con un software de análisis de imagen. Como se muestra en de Luca et al.26, el tratamiento con RA tiene un fuerte efecto en el crecimiento de las tibias ya después de 2 días de tratamiento y se observó un resultado similar en nuestras culturas (figura 2B-D). Es importante destacar que el experimento se realizó utilizando huesos emparejados, con el hueso derecho como control y el izquierdo tratado con RA (figura 2A, B, E), que ayuda a superar la variabilidad natural en el tamaño de los huesos entre diferentes especímenes. Por lo tanto, el método de cultivo descrito es adecuado para evaluar el efecto de diferentes compuestos en el crecimiento óseo.
A continuación, se evaluó la tasa de crecimiento de los huesos después de la cultura. Los huesos fueron extraídos, medidos y cultivados en E 15.5, 16,5 o P1, y fijados y medidos de nuevo dos días después. Se midieron tanto el aumento total de la longitud como la longitud de la parte mineralizada (Figura 3C). Un ejemplo de E 15.5 tibia y fémur antes de la cultura (figura 3a) y en el punto final del experimento (figura 3B) se muestran. Como se puede observar desde el gráfico y la tabla (Figura 3C, D), hay un aumento constante en la longitud total de la tibia, correspondiente a un aumento aproximado de 9 − 29% a partir de la longitud inicial. Esto es menos aumento que el observado in vivo; la principal diferencia es probablemente debido al nivel del cartílago proximal, más grande que el distal y menos accesible a los nutrientes. De hecho, el etiquetado EdU mostró menos células positivas en esta región después de la cultura en comparación con los huesos recién extraídos de la etapa equivalente (figura 4a, C). La incorporación EdU en la tibia distal fue similar en los huesos cultivados y recién extraídos (Figura 4B, D) el cartílago distal contribuye aproximadamente un tercio al crecimiento total de la tibia in vivo en esta etapa27, comparable a la tasa de crecimiento observada en la cultura, por lo que proponemos que el análisis debe centrarse en esta parte del hueso. Adicionalmente, evaluamos la mineralización de los huesos cultivados, y no observamos casi ningún aumento en la longitud de esta región. La diferencia podría deberse a la ausencia de invasión de los vasos y osteoblastos en la cultura ex vivo. Esto sugiere que los estudios de crecimiento del cartílago pueden extenderse durante varios días, mientras que si la región de interés es la parte osificada del hueso, el período de cultivo debe ser más corto. Esta observación se confirmó manteniendo la tibia en la cultura por un período más largo (hasta 6 días). Como se puede ver en la figura 5, la longitud total del elemento esquelético aumenta sustancialmente, mientras que casi no se observa ningún aumento en la región mineralizada (figura 5C).
En general, estos resultados sugieren que la cultura de los huesos largos se puede utilizar para analizar el efecto de diferentes factores sobre el crecimiento óseo general y particularmente para evaluar la dinámica del cartílago. Mientras que las culturas metatarsales bien establecidas también se pueden utilizar con estos fines, se presenta que ambos tipos de culturas se complementan entre sí, dadas las diferencias intrínsecas entre los metatarsos y el resto de los huesos largos.
Figura 1: ejemplo de tibia cultivada para diferentes periodos de tiempo. (A-D) Comparación entre la tibia recién extraída (arriba) y la tibia extraída en E 14.5 (fondo) y cultivada durante 2 días (A), extraídoAla e 15.5 y cultivado durante 2 días (B), extraído en e 16.5 y cultivado durante 4 días (C) y recién extraído en día de postnatal 2 (P2) y extraído en el día 1 de postnatal (P1) y cultivado durante 1 día (D). Tenga en cuenta que, mientras que el crecimiento del cartílago sigue siendo bastante fisiológico después de diferentes períodos de cultivo, la parte osificada muestra un retraso de crecimiento después de la cultura tiempo más de 2 días en comparación con el hueso recién extraído en la etapa correspondiente. Barra de escala = 1 mm. (e) tibia cultivada durante 2 días a partir de la e 15.5; Tenga en cuenta que la eliminación incompleta del tejido blando entre los dos extremos de los huesos conduce a la flexión del hueso. Barra de escala = 600 μm. por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: medición de la longitud de los huesos sobre el tratamiento con ácido retinoico (RA). (A-B) Tibias extraídas A la E 15.5 y cultivadas durante 2 días con 0,1% DMSO (A) y RA (B). Observe la diferencia tanto en la longitud total como en la parte mineralizada. Barra de escala = 1 mm. (c-D) cambios en la longitud total (c) o la parte mineralizada (d) de la tibia durante un período de 6 días en la situación de control y en presencia de RA. Los resultados se muestran como media ± desviación estándar (SD); comparación se realiza mediante el análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con el tipo de tratamiento como variable (los valoresp se muestran en el gráfico). (E) comparación de la longitud de los huesos emparejados cultivados durante 2 días con DMSO (tibia derecha) o RA (tibia izquierda); cada punto representa una de las 3 réplicas biológicas por condición. Se usó la prueba tdel estudiante de dos colas emparejadas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: comparación del crecimiento total y mineralización de la tibia después de 48 horas de cultivo ex vivo. (A) e 15.5 tibias y fémures de las extremidades izquierda (arriba) y derecha (inferior) antes del cultivo. (B) las mismas tibias y fémures siguieron después de la cultura de 2 días. Barra de escala = 600 μm. (C) gráfico que representa la tasa de crecimiento de las tibias cultivadas en diferentes etapas de desarrollo. Se evaluaron tanto el crecimiento total como el crecimiento de la parte mineralizada. (D) tabla que muestra la longitud inicial y final de todo el hueso y la parte mineralizada antes de cultivar a la e 15.5 y después de 2 días en cultivo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Las placas de crecimiento voluminosas no muestran mucha proliferación en la cultura. (A-B) Tinción EdU para placas de crecimiento proximal (a) y distal (B) tibial cultivadas de e 15.5 durante 2 días. (C-D) Tinción EdU para las placas de crecimiento tibial proximal (C) y distal (D) recién extraídas en la e 17.5. Observe la diferencia en el número de celdas EdU (+) en la tibia proximal. Los datos incluyen 6 pares cultivados de extremidades y 3 recién extraídos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: períodos más largos de cultivo de la tibia muestran un crecimiento sustancial del cartílago, pero poca mineralización. Tibia recién extraída A la E 15.5 (t = 0) (A) y después de 6 días en cultivo (B). Observe las diferencias entre el crecimiento del cartílago y el crecimiento de la parte mineralizada. Barra de escala = 1 mm (C) gráfico que muestra los cambios en la longitud total y la región mineralizada durante un período de 6 días. n = 5 tibias cultivadas; SD en cada punto de tiempo es el siguiente: t = 0, longitud completa = 0,0777, mineralizada = 0,0213; t = 3 d, longitud completa = 0,1495, mineralizada = 0,056; t = 6 d, longitud completa = 0,1193, mineralizada = 0,0521. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos de cultivo de hueso ex vivo se han utilizado durante algún tiempo para evaluar la biología del crecimiento óseo28, pero rara vez se han aplicado a los huesos largos murinos. Con el desarrollo de técnicas de imagen, el cultivo óseo ex vivo ofrece una forma atractiva de estudiar el crecimiento óseo en tiempo real en un entorno muy parecido a las condiciones in vivo. En este escenario, es importante definir las condiciones en las que el crecimiento de los huesos largos es comparable a su crecimiento in vivo.
En el presente estudio, describimos un protocolo simple y asequible para la cultura ósea larga, abordando las limitaciones y posibles aplicaciones. El paso más crítico de este método es el aislamiento de los huesos, que tienen que permanecer intactos y con menos tejido blando entre los extremos del hueso como sea posible. Dejar el tejido blando entre los extremos de los huesos evitará el crecimiento normal del hueso e inducirá la flexión, como se ejemplifica en la Figura 1E. El tejido blando en los extremos de los huesos puede dejarse, ya que eventualmente desaparecerá. Otro paso que requiere cuidado adicional es la transferencia de los huesos a la placa de cultivo, ya que pueden adherirse fácilmente a la pipas de plástico. Una posible solución es pipetear hacia arriba y hacia abajo el medio de disección que contiene sangre y trozos de tejido, ya que crea un recubrimiento que ayuda a impedir que los huesos se adhieran a la pipas.
Una vez extraídos, los huesos alcanzan un tamaño comparable a la etapa in vivo correspondiente cuando se cultivan hasta 48 h. aparte de medir la longitud del hueso, la tasa de crecimiento (promedio de aumento de la longitud por día) se puede estimar fácilmente en estas condiciones. Sin embargo, este enfoque para el cálculo de la tasa de crecimiento no es válido en períodos de cultivo más largos, donde se deben utilizar otros métodos, como el etiquetado calceína29. El tratamiento con ácido retinoico, que promueve la diferenciación prematura de condrocitos, conduce a una reducción sustancial en el crecimiento de los huesos, sugiriendo que este tiempo para el cultivo es suficiente para observar el efecto que diferentes sustancias pueden tener sobre el hueso Crecimiento. Es importante destacar que la comparación también se realizó en los huesos emparejados del mismo espécimen, por lo que la tibia izquierda recibió el tratamiento de RA y la derecha fue el control. Esta es una ventaja del modelo de cultivo óseo, ya que permite realizar comparaciones emparejadas, que son estadísticamente más poderosas.
El cultivo por más tiempo muestra un crecimiento significativo de la parte del cartílago, pero un retraso en el crecimiento de la mineralizada, y es importante considerar este resultado al elegir la aplicación de la técnica. Se observaron resultados similares en fémures polluelo cultivados por hasta 10 días que muestran una región epifisaria ampliada y un cuello de hueso diáfiseal reducido14, así como en la tibia del ratón cultivada durante 6 días18. Además, es importante mencionar que en la región del cartílago el crecimiento también no es homogéneo: la región distal voluminosa del fémur y la región proximal de la tibia no reciben nutrientes eficientemente por difusión simple y no pueden crecer correctamente. En este contexto, los estudios deben centrarse en las placas de cultivo opuestas, que se estima que contribuyen a un tercio del crecimiento total27, similar al crecimiento observado en la cultura. El retraso en el crecimiento de los huesos cultivados también se describió para las culturas metatarsales15.
Una consideración importante de este tipo de cultura es la ausencia de crecimiento de la parte osificada del hueso. Está bien establecido que los osteoblastos invaden la matriz del cartílago del periostio junto con los vasos sanguíneos3,4 y este proceso obviamente se interrumpe cuando se aísla el hueso. Esto podría explicar la ausencia de osificación en condiciones de cultivo. La transdiferenciación de condrocitos hipertróficos también se demostró como una importante fuente de osteoblastos7,8,9, pero si este proceso también requiere en parte la presencia de vasos sanguíneos, como parece hacer durante curación de fracturas30, o algunos otros tejidos no presentes en culturas ex vivo, necesita más investigación. Además, se describe bien la importancia de la carga mecánica en la conformación del crecimiento óseo31,32, que influye en los huesos largos y los huesos metatarsianos de manera diferente, pero está ausente en una configuración de cultivo ex vivo. Sin embargo, el método de cultivo descrito es adecuado para medir la dinámica de condrocitos y cambios en el crecimiento longitudinal y, por lo tanto, se puede utilizar para ciertas aplicaciones.
En general, el protocolo descrito proporciona un método simple y barato para la cultura de los huesos largos a partir de diferentes etapas, que se pueden acoplar con técnicas adicionales para abordar los mecanismos celulares y moleculares clave, tales como la imagen en tiempo de lapso en vivo13 , 23 o tratamiento farmacológico.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Alexandra Joyner su apoyo cuando se estableció este protocolo, Edwina McGlinn y Yi-Cheng Chang para compartir el ácido retinoico. El Instituto Australiano de Medicina Regenerativa está respaldado por subvenciones del gobierno del estado de Victoria y el gobierno australiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
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