Summary
כאן, אנו מציגים שיטה עבור תרבות vivo ex של עצמות murine ארוך בשלבים העוברי והיילוד, מתאים לניתוח העצם ופיתוח הסחוס הומאוסטזיס בתנאים מבוקרים תוך לכידה בתהליך vivo.
Abstract
עצמות ארוכות הן מבנים מורכבים ודינמיים, אשר נובעים endochondral אוסיפיקציה דרך הסחוס ביניים. הגישה המוגבלת לעצמות אנושיות בריאות הופכת ערך במיוחד לשימוש בדגמי היונקים, כגון עכבר ועכברוש, כדי לבדוק היבטים שונים של צמיחת העצם והומאוסטזיס. בנוסף, הפיתוח של כלים גנטיים מתוחכמים בעכברים מאפשר מחקרים מורכבים יותר של צמיחה עצם ארוך מבקש הרחבה של טכניקות המשמשות לחקר צמיחת העצם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור התרבות לשעבר vivo murine העצם, אשר מאפשר את המחקר של העצם ואת הסחוס באופן הדוק מבוקרת תוך לכידה של רוב בתהליך vivo. השיטה המתוארת מאפשרת את התרבות של מגוון העצמות, כולל עצמות השוקה, עצם הירך והמסרק, אך אנו מתמקדים בעיקר בתרבות הבאליס. כמו-כן, ניתן להשתמש בה בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון הדמיה בזמן הדמייה חיה או טיפול תרופתי.
Introduction
צמיחת איברים צריך להיות מכוון הדוק כדי למנוע את המראה של הפרעות גדילה, וכרוך בוויסות של סוגי תאים מרובים, מסלולים מולקולריים ומוצלב בין חלקים שונים של הגוף. טכניקות הדמיה חיוניים כדי לטפל בשינויים המתרחשים במשך הזמן בעובר הולך וגדל, הן בתנאים נורמליים, כמו גם לאחר המושרה הנגרמת במערכת. עוברים עם התפתחות תוך רחמי, כגון מודלים מכרסם בשימוש נרחב, להציג אתגר נוסף עבור הדמיה חיה וטיפול בסמים, אשר ניתן להתגבר חלקית על ידי שימוש בטכניקות לשעבר התרבות הvivo. כדי ללכוד בהצלחה את התהליכים הvivo ולהשיג תוצאות משמעותיות, זה הופך להיות חיוני כדי למצוא את התנאים הנכונים culturing עבור כל איבר או רקמה.
רוב העצמות של השלד היונקים לגדול דרך endochondral האוסיפיקציה, שם הסחוס העובריים (מורכב של תאים המכונים כונדרוציטים) כוננים האורך והוא מוחלף בהדרגה על ידי עצם. תהליך זה קורה בלוחות צמיחה, הממוקם בסוף העצמות הארוכות, שבו שלושה אזורים ניתן להבחין: נח, מתרבים, ו יפרטרופית1,2. ראשית, כונדרוציטים עגולות באזור מנוחה המעבר לתוך כונדרוציטים האופניים טורי באזור ההתרבות. בשלב הבא של בידול, כונדרוציטים אלה להפוך יפרטרופית ולהתחיל הפרשה סוג X קולגן. כונדרוציטים יפרטרופית לארגן את הצעדים הבאים של האוסיפיקציה: הם מפרישות מולקולות איתות מפתח, כגון גורם הצמיחה רקמת חיבור, עצם מורפולפרוטאין חלבונים ו קיפוד הודי, ולהפנות את המינרליזציה של המטריצה, לגייס כלי הדם לחלק המרכזי של העצם, ו, על אפופטוזיס, לאפשר אוסטאופתית (העצם להרכיב תאים) כדי לפלוש למטריקס כדי ליצור את מרכז האוסיפיקציה העיקרי3,4. מטריקס מינרליזציה מקלה על חדירת כלי הדם שדרכו האוסטאופה מחליפים את הסחוס היורד בעזרת מטריצת עצם5. האוסטאופתי ביותר לפלוש מטריצה הסחוס מן perichondrium, שכבה סיבי העוטפת את הסחוס6. לחילופין, שיעור של כונדרוציטים יפרטרופית מסוגלים לשרוד ולשנות את היכולת לעבור מעבר לעצמות7,8,9. האורך הסופי של העצם נובע הצמיחה המצטברת של הסחוס חולף, שיעור הצמיחה שלו בתורו תלוי במספר ובגודל של יפרטרופית כונדרוציטים, ואת ייצור המטריצה שלהם10. בנוסף, הוכח לאחרונה כי משך השלב האחרון של היפרפרס התואם לאורך הסופי של העצם11. לכן, רגולציה הדוקה של התפשטות והבידול של תאים אלה נדרש כדי להבטיח גודל העצם הנכון.
למרות הידע הניכר שנרכש לאורך השנים על הארגון והפיתוח של לוחות הצמיחה, מרבית המסקנות הללו מבוססות על התבוננות בסעיפים היסטלוגיים קבועים. שימוש ברקמות מספק מידע רב ערך אודות תהליך זה, אך ניתן לרכבו עם חפצים טכניים, כך שהוא לא יכול לשמש תמיד באופן אמין להערכת שינויים מורפולוגיים או בגודל בין שלבים שונים. בנוסף, כמו צמיחת העצם הוא תהליך דינמי, התמונות דו מימדי סטטי (2D) מציעים תובנה מוגבלת לתוך התנועה של התאים בצלחת הצמיחה, בעוד הדמיה הזמן לשגות על רקמה חיה יכול להציע מידע חשוב על ההתנהגות של כונדרוציטים בצלחת הצמיחה.
כל המגבלות הללו ניתן לפתרון פוטנציאלי באמצעות תרביות עצם vivo לשעבר. בעוד שפרוטוקולי תרבות העצם פותחו לפני זמן מה, הם הוחלו על עצמות ארוכות של מורטין. רוב המחקרים משתמשים בעצמות האפרוח בשל היתרונות הטכניים המוצעים על-ידי דגם האפרוח12,13. תרבויות אורגאוטימית (ממשק אוויר/נוזלים) הוחלו על מורים עובריים, שהיו מתוחזקים בתרבות במשך 10 ימים14. הכלים הגנטיים המתוחכמים הזמינים בעכבר להפוך את המודל הזה מאוד מושך לשמש לשעבר בתרבות העצם vivo. המחקרים שהשתמשו בעכברים כדי להסתכל על גדילה העצם עבד בעיקר עם עצמות המסרק15, כנראה בשל גודלם הקטן ומספרים גדולים יותר המתקבלים לעובר16. למרות שנחשב באופן מסורתי עצמות ארוכות, מטאטסי להיכנס הזדקנות (מאופיין התפשטות מופחתת אינוולוציה של צלחת הצמיחה17) מוקדם יותר מאשר עצמות ארוכות אחרות vivo, ולכן הצמיחה המתמשכת שלהם לשעבר vivo אינו ממש את התהליך הvivo. לצורך מאמר זה, נשתמש במונח עצמות ארוכות לעצמות מאזורי הגפיים האבובי והביניים. מספר מחקרים קודמים השתמשו בעצמות murine ארוך, כגון שוקה, בתרבויות vivo לשעבר נצפתה צמיחה משמעותית של הסחוס אבל מעט ההתקשות18. השתמשנו גם בתרבויות הבאליס לאחרונה, בעיקר כדי ללמוד כchondrocyte dynamics19. מחקרים אחרים השתמשו בראשי הירך מעכברים צעירים20 או רק את החלק המרוחק של עצם הירך לתרבות21. כמה יצירות אחרונות יותר בהצלחה לשלב את התרבות הvivo ex של עצמות מלאות עם הדמיה זמן ההדמיה כדי לרכוש תלת מימדי (3d) סרטים של כונדרוציטים ברקמת העכבר חי22,23. המחברים הצליחו להתבונן בעבר אירועים מבלי שיבחינו בסידור מחדש של כונדרוציטים לאזור מתרבים23 בדוגמה טובה של היישום הפוטנציאלי של תרבות vivo ex העצם. החלופה, כלומר, ניתוח תמונות סטטיות, דורשת טכניקות עקיפות ומורכבות. זה היה לידי ביטוי על ידי מחקר שנערך לאחרונה הערכת החשיבות של שיבוטים transversally לצמיחת הסחוס, שם מעקב גנטי עם זנים רבים העכבר העיתונאי בשילוב עם מידול מתמטי שימשו24. לכן, התרבות הvivo לשעבר עשוי לעזור להשיג תובנה תהליכים דינמיים בצורה מהירה וישירה יותר.
כאן, אנו מציגים שיטה לתרבות ארוכה של עצמות ממורין, אשר ניתן לשלב עם טיפולים מולקולריים שונים ו/או עם הדמיה בזמן ההדמיה החיה. פרוטוקול זה מתאים את השיטות המשמשות בדוחות קודמים15,18,25, אך מטפל בנושאים נוספים ומתמקד בעצמות ארוכות כגון השוקה, במקום בעצמות המסרק. לבסוף, הוא חוקר את הפוטנציאל של שימוש מבחינה סטטיסטית השוואות לזווג חזק על ידי culturing עצמות שמאל וימין בנפרד בנוכחות של חומרים שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים צריכים להתבצע בעקבות ההנחיות המקומיות והמוסדיים של טיפול מוסרי בבעלי חיים מעבדתיים.
1. ההכנות לקראת יום התרבות העצם
- להגדיר מתזמן העכבר מתוזמן כדי להשיג עוברים וגורים מהיום העובריים 14.5 (E 14.5) והלאה.
הערה: התרבות של עצמות ארוכות ניתן להחיל בהצלחה על זנים שונים של העכבר; בפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בעכברים מסוג שוויצרי וובסטר פראי. - להכין ניתוח בינוני (מותאם יוסטון et al.15): לדלל α-בינוני חיוני מינימלי (α-הגברת) או בינונית שונה של הנשר של מדיום (dmem) 1/13 ב פוספט-באגירה מלוחים (PBS) ו 2 מ"ג/mL סרום הפרה אלבומין (bsa) ומסנן לעקר דרך a 0.22 μm, 33 מזרק בקוטר מילימטר מסנן. החנות מובחנות ב-20 ° c.
- יום לפני החילוץ של העוברים, להכין את סרום ללא מדיום תרבות העצם מורכב DMEM המכיל 0.2% BSA, 0.5 mM L-גלוטמין, 40 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 0.05 mg/mL חומצה אסקורבית, ו 1 מ"מ betaglycerophosphate. מסנן לעקר דרך 0.22 μm, 33 מ"מ מזרק בקוטר מסנן ולאחסן ב 4 ° צ' עבור עד 1 חודש.
- ביום של התרבות ולפני ליקוט העכבר, להכין צלחות 24-לוחות ו 60 mm מנות עם מדיום לחיתוך ולשמור על קרח קר. חמם מראש את מדיום תרבות העצם באמבט מים ב37 ° c. רסס 80% (v/v) אתנול על הכלים (מלקחיים ומספריים קטנים) שישמשו לטיפול בעובר. העבר טווח המשקפת לארון בטיחות של Class II.
2. תרבות העובר ושוקה היילוד ועצם הירך
- Cull את העכבר ההרה דרך פריקה צוואר הרחם בשלב ההריון הרצוי (החל E 23.4 ל-E 29.8). אם משתמשים בגורי היילוד, הוציאו אותם מהאמא אחד אחד ומעליו בעריפת ראש.
- מניחים את העכבר על גבה ולעקר את אזור הבטן על ידי ריסוס 80% (v/v) אתנול על פני השטח שלה.
- חותכים את העור ואת שריר הבטן עם מספריים קטנים כדי לגשת קרני הרחם.
- לחלץ את הרחם מחלל הבטן בעזרת מלקחיים ומספריים קטנים, הסרת meמהtrium וחיתוך בסיס הקרניים. מניחים את הרחם בצלחת פטרי 60 מ"מ עם מדיום לניתוח קר, ושומרים את קערת התרבות על הקרח במהלך ההליך כולו.
- העבר את צלחת פטרי עם הרחם אל הקבינט בטיחות ולעבוד שם מעתה והלאה.
- הפרד בין העוברים הבודדים במספריים באמצעות חיתוך בין השקי.
- העברת שק בודד תחת stereomicroscope לנתיחה בצלחת 60 mm נקי עם בינוני לחיתוך ולפתוח אותם עם מלקחיים כדי להפריד את העוברים מן הפלנטאס ולנקות אותם מן הקרומים.
הערה: לעבוד עם עובר אחד בכל פעם, תוך שמירה על השאר על הקרח. - לערוף את ראשו של העוברים ולהעביר את הגוף לצלחת חדשה ונקייה 60 mm עם 1 mL לחתוך פיפטה סטרילי.
- הסירו את עורם של העוברים או הגורים בעזרת מלקחיים שמתחילים מאחור ומתקלקים אותו עד לאצבעות הרגליים.
- הפרידו את הגפיים מהגוף על-ידי חיתוך עם הפינצטה הקרובה לעמוד השדרה והעברתם לתבשיל נקי עם מדיום לחיתוך קר-קרח.
- מציגים אותם בזהירות בין הסחוס. של עצם הירך לבין שוקה האבובי
- הסירו את עצמות הירך מעצם הירך. ועצם העצמות והפיבולה משוקה
- הסירו בזהירות את הרקמה הרכה מעצם הירך והשוקה על ידי הקפדה ומשיכת העור.
הערה: חשוב להסיר רקמות רכות הרבה ככל האפשר, נטילת טיפול מיוחד בהסרת הרקמה המחברת בין שני קטבים הסחוס, אבל הימנעות נזק הסחוס, perichondrium, ואת העצמות. - מניחים את ארבעת העצמות (הטיה ושמאל הימנית והפדורים) בבאר הראשונה של הצלחת 24-הטוב עם מפלסטיק 1 mL סטרילי הצינורות. לחילופין, כדי להשוות את ההשפעה של טיפולים שונים על גפיים שמאל וימין, המקום גפיים שונים בבארות שונות.
הערה: יש לנקוט טיפול נוסף כאשר העצמות מועברות לבארות, שכן הן יכולות להיצמד בקלות לפיפטה. - המשיכו באותה דרך עם. כמה שיותר עוברים שצריך
הערה: שינוי המנה עם מדיום החיתוך ברגע שהוא נעשה מעורפל מדי, כפי שחשוב לראות בבירור את העצמות שבגזור. -
כאשר כל העצמות הרצויות מועברים לבארות, להסיר את בינוני הניתוח עם פלסטיק 1 mL סטרילי צנרת ולקחת טיפול נוסף לא לבשל את העצמות.
- בהתאם למטרת הניסוי, ניתן לקחת את התמונות של העצמות לפני הסרת מדיום החיתוך, כאשר נקודת הזמן אפס של הניסוי. צלם תמונות עם מיקרוסקופ המחובר למצלמה דיגיטלית והביאור את החשיפה ואת קנה המידה המשמש. כדי להבטיח מדידות קלות ואמינות, צלם תמונות בניגוד טוב כדי להבדיל בין החלק המינרלי.
- הוסיפו 1 מ ל של התרבות הבינונית לכל באר. אם כל טיפול מיועד על העצמות (דוקסיציקלין, טממוקסיפן, גורמי גדילה, וכו '), יש להוסיף אותו עכשיו.
- כדי לצפות את ההשפעה של עיכוב הצמיחה בתנאי התרבות, לטפל tibias שמאל עם חומצה retinoic (RA, 500 nM), תוך הדגירה tibias הזכות עם נפח המקבילה של הרכב (diמתיל סולפוקסיד [DMSO], ריכוז סופי 0.1%) כפקד.
- השאירו את העצמות לצמוח למשך יומיים או יותר בחממה לתרבות התא תחת תנאי תרבות תא סטנדרטיים (ב 37 ° c בחממה 5% CO2 ).
- להערכת התפשטות, להוסיף 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) או 5-bromo-2'-deoxyuridine (Bromo) למדיום בריכוז הסופי של 10 μM 1 על 2 לפני קיבוע.
הערה: ריכוז המניה של אדו הוא 20 מ"מ.
זהירות: EdU ו brdu הם מקבילים תימידין והוא יכול להיות רעיל מוטאנמית. - הפשרת 4% פאראפורמלדהיד (בכיוון השדרה) ותקן את העצמות על ידי שקיעה בתוך הכדורגלן ביחידה 2 מ ל.
זהירות: החצי ההוא רעיל ומיועד. לסבירות מסרטן אנושי הימנע לנשום אבקת פאראפורמלדהיד ואדים. EdU ו brdu הם מקבילים תימידין והוא יכול להיות רעיל מוטאנמית. - לאחר קיבעון קצר של 10 דקות בתוך השדרה בטמפרטורת החדר, העברת עצמות ל-PBS עבור רכישת תמונה בזמן הסופי. לאחר מכן הציבו את העצמות בחזרה לתוך הכיוון ההפוך של הלילה ב -4 ° c.
- לאחר עצמות קיבוע ניתן לעבד עבור יישומים הרצוי במורד הזרם.
3. מדידה וניתוח של אורך מלא של העצם ושל האזור המינרלי
- השתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי למדוד את אורך העצמות, תוך התחשבות בקנה המידה של התמונה. למדוד את האורך הכולל של העצם ואת האזור מינרליזציה. הפעל את המידות מהתאים הכהים הראשונים בקצה אחד עד שאלה האחרונים שבקצה השני.
הערה: האזור מינרליזציה מאופיין בצבע כהה והוא נבדל בקלות מן הסחוס. - כדי לחשב את קצב הצמיחה, המוגדר כגידול ממוצע באורך ליום, חלק את ההפרש בין האורך הסופי של העצם לבין הראשון במספר הימים בתרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרבות העצם ניתן לבצע החל משלבים שונים. באיור 1A-D, השוואה בין השוקה התרבותית והמחולצים הטריים בשלבים שווי-ערך מוצג. ההתבוננות הראשונה היא כי עד יומיים של תרבות הגודל הושג הוא המקבילה לצמיחה בעצם vivo עבור סחוס ועצם מינרליזציה (איור 1A, B, D). תקופות תרבות ארוכות יותר מובילות להבדלים גדולים יותר בין העצמות המתורבתות לבין המחולצים הטריים (איור 1C). בנוסף, כפי שהוזכר בפרוטוקול, זה חיוני כדי להסיר את הרקמה הרך המחבר בין הקצוות של העצמות, כמו אחרת העצמות יהיה לכופף. איור 1E מציג דוגמה של שוקה גדל עם הסרה לא מלאה של רקמה רכה לעומת שוקה ללא רקמה רכה.
לאחר מכן, טיטיה היו מתורבתים במשך יומיים ואורכם נמדד. כפי שניתן לראות באיור 2A, B, ניתן לבצע את המדידה של האורך הכולל ושל החלק העשוי מינרליזציה עם תוכנת ניתוח תמונה. כפי שמוצג על ידי דה לוקה et al.26, הטיפול עם RA יש השפעה חזקה על צמיחת הטיטיה כבר לאחר יומיים של טיפול ותוצאה דומה נצפתה בתרבויות שלנו (איור 2B-D). חשוב מכך, הניסוי בוצע באמצעות עצמות לזווג, עם העצם הימנית כמו שליטה שמאל טיפל עם RA (איור 2A, B, E), אשר מסייע להתגבר על השונות הטבעית בגודל העצם בין דגימות שונות. לפיכך, שיטת culturing תיאר מתאים להערכת ההשפעה של תרכובות שונות על צמיחת העצם.
לאחר מכן, שיעור הצמיחה של העצמות לאחר התרבות הוערך. העצמות חולצו, נמדדו והתרבית ב-E 15.5, 16.5 או P1, ותוקנו ונמדדו שוב יומיים לאחר מכן. הן העלייה הכוללת באורך והן אורך החלק של מינרליזציה נמדדו (איור 3C). דוגמה של E 15.5 שוקה ועצם הירך לפני התרבות (איור 3A) ובנקודת הסיום של הניסוי (איור 3a) מוצגים. כפי שניתן לצפות מהגרף ומהשולחן (איור 3C, D), קיימת עלייה עקבית באורך הכולל של השוקה, המקבילה לעלייה משוערת של 9-29% מהאורך ההתחלתי. זה פחות מתגבר מהפעם שנצפתה בvivo; ההבדל העיקרי הוא כנראה בשל רמת הסחוס הקרוב ביותר, גדול יותר מהמרוחק ופחות נגיש לחומרים מזינים. אכן, התיוג EdU הראה תאים חיוביים פחות באזור זה לאחר התרבות לעומת העצמות המחולצים הטריים של השלב המקביל (איור 4A, C). התאגדות EdU בשוקה המרוחק הייתה דומה בעצמות המתורבתות והמחולצות (איור 4B, D) הסחוס המרוחק תורם כשליש אחד לצמיחה הכוללת של השוקה בשלב זה27, בדומה לקצב הצמיחה הנצפה בתרבות, לכן אנו מציעים כי הניתוח צריך להיות ממוקד על החלק הזה של העצם. בנוסף, העריכו את מינרליזציה של העצמות המתורבתות, והתבוננו כמעט ללא עלייה באורך האזור. ההבדל יכול להיות בגלל העדר של הספינה ואת הפלישה האוסטאופנה בתרבות vivo ex. זה מרמז כי מחקרים של גידול הסחוס יכול להאריך במשך כמה ימים, בעוד אם אזור העניין הוא החלק ההתקשות של העצם, תקופת התרבות צריך להיות קצר יותר. התבוננות זו אושרה על ידי שמירת השוקה בתרבות לתקופה ארוכה (עד 6 ימים). כפי שניתן לראות באיור 5, אורכו הכולל של אלמנט השלד גדל באופן משמעותי, ואילו כמעט ואין עלייה באזור מינרליזציה נצפתה (איור 5c).
בסך הכל, תוצאות אלה מרמזות כי התרבות של עצמות ארוכות ניתן להשתמש כדי לנתח את ההשפעה של גורמים שונים על צמיחת העצם הכוללת במיוחד כדי להעריך את הדינמיקה הסחוס. בעוד שתרבויות מתכת מבוססת היטב יכול לשמש גם עם מטרות אלה, אנו להגיש כי שני סוגי התרבויות משלימים זה את זה, בהתחשב ההבדלים הפנימיים בין בדיקות מתכת לשאר העצמות הארוכות.
איור 1: דוגמה של שוקה תרבותי עבור תקופות זמן שונות. (A-D) השוואה בין השוקה שחולצו טרי (למעלה) והשוקה שחולצו ב-E 23.4 (למטה) ומתורבת עבור 2 ימים (א), שחולצו ב-e 15.5 ו תרבותי עבור 2 ימים (ב), שחולצו ב-26.5 16.5 ו תרבותי עבור 4 ימים (ג) ו מופק טרי ב יום לידה 2 (P2) ו מופק ביום לידה 1 (P1) ומתורבת ליום אחד (ד). שים לב, בעוד צמיחת הסחוס נשאר פיזיולוגי לאחר תקופות culturing שונים, החלק ההתקשות מראה עיכוב הצמיחה לאחר זמן התרבות יותר מ 2 ימים לעומת העצם שחולצו טרי בשלב המקביל. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (E) שוקה בתרבית במשך יומיים החל ב-E 15.5; שימו לב כי ההסרה הבלתי מלאה של הרקמה הרכה בין שתי הקצוות של העצמות מובילה לכיפוף העצם. סרגל קנה מידה = 600 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מדידה של אורך העצמות על הטיפול חומצה retinoic (RA). (א-ב) טיטיה הופק ב-E 15.5 וגדל במשך יומיים עם 0.1% DMSO (א) ו-RA (ב). שים לב להבדל הן באורך כולל והן של החלק הכולל מינרליזציה. סרגל בקנה מידה = 1 מ"מ. (c-D) שינויים באורך כולל (c) או החלק הכולל מינרליזציה (D) של השוקה על פני תקופה של 6 ימים במצב שליטה ובנוכחות RA. התוצאות מוצגות כמשמעות של ± סטיית תקן (SD); השוואה נעשית על-ידי ניתוח דו-כדרכי של סטיה (ANOVA) עם סוג הטיפול כמשתנה (ערכיp מוצגים בגרף). (ה) השוואה בין אורך העצמות לזווג תרבותי עבור 2 ימים עם dmso (השוקה הימנית) או RA (שוקה שמאל); כל נקודה מייצגת את אחד משלושת המשכפלת הביולוגיים בכל תנאי. נעשה שימוש במבחן tדו-זנבי של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואת הצמיחה הכוללת ומינרליזציה של השוקה לאחר 48 שעות של תרבות vivo ex. (א) הגפיים (א) 15.5 הטיה והפמורי משמאל (למעלה) ומימין (למטה) לפני התפירה. (ב) אותה הסטייה והפטיורים שעקבו אחרי התרבות של שני ימים. סרגל בקנה מידה = 600 μm. (C) גרף המייצג את קצב הצמיחה של הטיטיה תרבותית בשלבים התפתחותיים שונים. הן הצמיחה הכוללת והתפתחותם של החלק המיינרליזציה העריכו. (ד) הטבלה המציגה את האורך הראשוני והסופי של העצם כולו ואת החלק המומלא לפני התפירה ב-e 15.5 ואחרי יומיים בתרבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: לוחות צמיחה מגושם אינם מראים הרבה התפשטות בתרבות. (א-ב) EdU מכתים עבור לוחיות הצמיחה הקרובים (A) ו-(ב) התיכון התרבותי מ-e 15.5 במשך יומיים. (C-D) EdU מכתים עבור לוחות הצמיחה האבובית (C) ו-"הטאין" הטריים שחולצו בשנת 17.5. שים לב להבדל במספר התאים של EdU (+) בשוקה הימנית ביותר. הנתונים כוללים 6 זוגות מתורבתים של גפיים ו -3 המחולצים טריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תקופות ארוכות יותר של תרבות השוקה להראות צמיחה הסחוס משמעותי אבל מינרליזציה קטנה. שוקה טרי ב-E 15.5 (t = 0) (א) ואחרי 6 ימים בתרבות (ב). שים לב ההבדלים בין צמיחת הסחוס וצמיחת החלק המיינרליזציה. סרגל סרגל = 1 מ"מ (C) גרף המציג את השינויים באורך הכולל ובאזור המינרליזציה במשך שישה ימים. n = 5 הטייה תרבותית; SD בכל נקודה היא כדלקמן: t = 0, באורך מלא = 0.0777, מינרליזציה = 0.0213; t = 3 ד, אורך מלא = 0.1495, מינרליזציה = 0.056; t = 6 ד, אורך מלא = 0.1193, מינרליזציה = 0.0521. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות התרבות vivo העצם שימשו זמן מה כדי להעריך את הביולוגיה של צמיחת העצם28, אבל כבר לעתים רחוקות להחיל את העצמות הארוכות murine. עם התפתחות של טכניקות דימות, תרבות העצם vivo ex מציעה דרך אטרקטיבית לחקור את צמיחת העצם בזמן אמת בהגדרה הדומה היטב בתנאים vivo. בתרחיש זה, חשוב להגדיר את התנאים בהם הצמיחה של עצמות ארוכות דומה לצמיחה שלהם vivo.
במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט ובמחיר סביר עבור תרבות עצם ארוכה, התייחסות מגבלות ויישומים אפשריים. הצעד הקריטי ביותר בשיטה זו הוא בידוד העצמות, שצריך להישאר ללא פגע וברקמה פחות רכה בין קצות העצם ככל האפשר. השארת רקמות רכות בין קצות העצמות תמנע צמיחה נורמלית של העצם ולגרום כיפוף, כפי שהוא לדוגמה באיור 1E. רקמות רכות בקצות העצמות ניתן להשאיר, כפי שבסופו של דבר יעלם. צעד נוסף הדורש טיפול נוסף הוא העברת העצמות לצלחת culturing, כפי שהם יכולים בקלות לדבוק בצנרת פלסטיק. פתרון אפשרי אחד הוא ליטוף למעלה ולמטה לחיתוך בינוני המכיל פיסות דם ורקמות, כפי שהוא יוצר ציפוי המסייע למנוע את העצמות מתוך הדבקה לפיפטה.
לאחר שחולצו, העצמות להגיע לגודל דומה המקביל בשלב vivo כאשר תרבותי עד 48 h. מלבד מדידת אורך העצם, שיעור הצמיחה (העלייה הממוצעת באורך ליום) ניתן להעריך בקלות בתנאים אלה. עם זאת, גישה זו עבור חישוב שיעור הצמיחה אינה חוקית לאורך תקופות culturing יותר, שבו שיטות אחרות, כגון calcein תיוג29, יש להשתמש. טיפול עם חומצה retinoic, אשר מקדמת כונדרוהבחנה מוקדמת, מוביל לירידה משמעותית בצמיחה של העצמות, מציע כי הפעם עבור culturing הוא מספיק כדי להתבונן את ההשפעה כי חומרים שונים עשויים להיות על העצם צמיחה. וחשוב מכך, ההשוואה נעשתה גם על לזווג עצמות מאותו הדגימה, כך ששוקה השמאלית קיבלה את הטיפול RA ואת הזכות היה השליטה. זהו יתרון של מודל תרבות העצם, כפי שהוא מאפשר ביצוע השוואות לזווג, אשר מבחינה סטטיסטית יותר חזק.
Culturing במשך זמן רב יותר מראה צמיחה משמעותית של חלק הסחוס, אבל עיכוב בצמיחה של אחד מינרליזציה, וחשוב לשקול תוצאה זו בעת בחירת היישום של הטכניקה. תוצאות דומות נצפו באפרוח עצמות תרבותי למשך עד 10 ימים אשר מראים אזור אפיופלי מוגדל החותם הצמצם מופחת העצם צווארון14, כמו גם בשוקה העכבר לתוך שוקה במשך 6 ימים18. בנוסף, חשוב לציין כי באזור הסחוס הצמיחה היא גם לא הומוגנית: האזור מגושם של עצם הירך ואת האזור האבובי של השוקה לא מקבלים חומרים מזינים ביעילות על ידי דיפוזיה פשוטה לא יכול לצמוח כראוי. בהקשר זה, המחקרים צריכים להתמקד בצלחות ההולכות וגדלות, אשר העריכו לתרום לשליש מכלל הצמיחה הכוללת27, בדומה לגידול הנצפה בתרבות. העיכוב בצמיחה של עצמות מתורבתות תואר גם עבור תרבויות המסרק15.
שיקול חשוב של סוג זה של התרבות הוא היעדר הצמיחה של החלק ההתקשות של העצם. הוא מבוסס היטב כי האוסטאופאוקיים לפלוש מטריצה הסחוס מן הקרום ביחד עם כלי הדם3,4 ותהליך זה הוא ללא ספק מופרת כאשר העצם מבודד. זה עשוי להסביר את היעדר ההתקשות תחת תנאי התרבות. יפרטרופית כונדרוציט הטרנסבידול הוצגה גם כמקור חשוב של האוסטאופה7,8,9, אבל אם תהליך זה גם דורש בחלק הנוכחות של כלי הדם, כפי שנראה לעשות במהלך שבר ריפוי30, או כמה רקמות אחרות לא נוכח בתרבויות vivo ex, צריך חקירה נוספת. בנוסף, זה מתואר היטב את החשיבות של עומס מכני בעיצוב עצם הצמיחה31,32, אשר משפיע על עצמות ארוכות העצמות המסרק באופן שונה, אבל נעדר בהתקנה vivo culturing ex. עם זאת, השיטה המתוארת מתאימה למדידת דינמיקה של כchondrocyte ושינויים בצמיחה האורך, ולכן ניתן להשתמש בה ליישומים מסוימים.
בסך הכל, הפרוטוקול המתואר מספק שיטה פשוטה וזולה כדי התרבות עצמות ארוכות החל בשלבים שונים, אשר יכול להיות בשילוב עם טכניקות נוספות לטיפול מנגנונים סלולריים ומולקולרית מפתח, כגון הדמיה זמן חיים13 , 23 או טיפול תרופתי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
היינו רוצים להודות אלכסנדרה ג'וינר על התמיכה שלה כאשר הפרוטוקול הזה היה להיות מבוסס, Edwina מקגלין ו-יי צ'נג צ'אנג עבור שיתוף חומצה retinoic. המכון האוסטרלי לרפואה רגנרטיבית נתמך על ידי מענקים מממשלת המדינה של ויקטוריה והממשלה האוסטרלית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M. Development of the endochondral skeleton. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (1), a008334 (2013).
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K. The control of chondrogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (1), 33-44 (2006).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
