Summary
Qui, presentiamo un metodo per la coltura ex vivo di ossa lunghe murine sia a stadi fetali che neonati, adatto per l'analisi dello sviluppo osseo e della cartilagine e dell'omeostasi in condizioni controllate, ricapitolando il processo in vivo.
Abstract
Le ossa lunghe sono strutture complesse e dinamiche, che derivano dall'ossificazione endocondrale attraverso una cartilagine intermedia. L'accesso limitato a ossa umane sane rende particolarmente prezioso l'uso di modelli di mammiferi, come topo e ratto, per esaminare diversi aspetti della crescita ossea e dell'omeostasi. Inoltre, lo sviluppo di sofisticati strumenti genetici nei topi consente studi più complessi di crescita ossea lunga e richiede un'espansione delle tecniche utilizzate per studiare la crescita ossea. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la coltura ossea ex vivo murina, che consente lo studio dell'osso e della cartilagine in modo strettamente controllato, ricapitolando la maggior parte del processo in vivo. Il metodo descritto permette la coltura di una gamma di ossa, tra cui tibia, femore, e ossa metatarsali, ma ci siamo concentrati principalmente sulla cultura tibiale qui. Inoltre, può essere utilizzato in combinazione con altre tecniche, come l'imaging Live time-lapse o il trattamento farmacologico.
Introduction
La crescita degli organi deve essere strettamente sintonizzata per prevenire la comparsa di disturbi della crescita, e coinvolge la regolazione di diversi tipi di cellule, vie molecolari e crosstalk tra diverse parti del corpo. Le tecniche di imaging sono essenziali per affrontare i cambiamenti che si verificano nel corso del tempo in un embrione in crescita, sia in condizioni normali, così come dopo una perturbazione è indotta nel sistema. Gli embrioni con sviluppo intrauterino, come i modelli di roditori ampiamente utilizzati, presentano una sfida aggiuntiva per l'imaging dal vivo e il trattamento farmacologico, che può essere parzialmente superato utilizzando tecniche di coltura ex vivo. Per ricapitolare con successo i processi in vivo e ottenere risultati significativi, diventa cruciale trovare le giuste condizioni di coltura per ogni organo o tessuto.
La maggior parte delle ossa dello scheletro dei mammiferi crescono attraverso l'ossificazione endocondrale, dove la cartilagine embrionale (composta da cellule chiamate condrociti) spinge la crescita longitudinale e viene gradualmente sostituita dall'osso. Questo processo avviene alle piastre di crescita, situate alla fine delle ossa lunghe, dove si distinguono tre zone: riposo, proliferativo e ipertrofico1,2. In primo luogo, i condrociti progenitrici rotondi nella zona di riposo transitano nei condrociti colonnari ciclistici nella zona proliferativa. Durante la successiva fase di differenziazione, questi condrociti diventano ipertrofici e iniziano a secchire il collagene di tipo X. I condrociti ipertrofici orchestrano le fasi successive di ossificazione: secernono molecole di segnalazione chiave, come il fattore di crescita del tessuto connettivo, le proteine morfogenetiche ossee e il riccio indiano, e dirigono la mineralizzazione della matrice, reclutano vasi sanguigni alla parte centrale dell'osso, e, su apoptosi, consentire osteoblasti (cellule che formano ossa) per invadere la matrice per formare il centro di ossificazione primaria3,4. La matrice mineralizzata facilita la penetrazione dei vasi sanguigni attraverso i quali gli osteoblasti migrano per sostituire questa cartilagine degradata con una matrice ossea5. La maggior parte degli osteoblasti invade la matrice cartilaginea dal perichdri, uno strato fibusto che avvolge la cartilagine6. In alternativa, una proporzione di condrociti ipertrofici è in grado di sopravvivere e di trasdifferenziarsi agli osteoblasti7,8,9. La lunghezza finale dell'osso è dovuta alla crescita accumulata della cartilagine transitoria, il cui tasso di crescita a sua volta dipende dal numero e dalle dimensioni dei condrociti ipertrofici e dalla loro produzione di matrici10. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che la durata dell'ultima fase dell'ipertrofia è correlata alla lunghezza finale dell'osso11. Pertanto, è necessaria una stretta regolazione della proliferazione e differenziazione di queste cellule per garantire la corretta dimensione ossea.
Nonostante le conoscenze sostanziali acquisite nel corso degli anni sull'organizzazione e lo sviluppo delle piastre di crescita, la maggior parte di queste conclusioni si basano sull'osservazione delle sezioni istologiche fisse. Il sezionamento dei tessuti fornisce informazioni preziose su questo processo, ma può essere guidato con artefatti tecnici, quindi non può essere sempre utilizzato in modo affidabile per stimare i cambiamenti morfologici o dimensionali tra le diverse fasi. Inoltre, poiché la crescita ossea è un processo dinamico, le immagini statiche bidimensionali (2D) offrono una visione limitata del movimento delle cellule nella piastra di crescita, mentre l'imaging time-lapse sul tessuto vivo potrebbe offrire informazioni preziose sul comportamento del condrociti nella piastra di crescita.
Tutte queste limitazioni possono essere potenzialmente risolte utilizzando colture ossee ex vivo. Mentre i protocolli di coltura ossea sono stati sviluppati qualche tempo fa, sono stati limitatamente applicati alle ossa lunghe murine. La maggior parte degli studi usa le ossa delle pollastrelle a causa dei vantaggi tecnici offerti dal pulcino modello12,13. Le colture organotipiche (interfaccia aria/liquido) sono state applicate ai femori embrionali di pulcino, che sono stati mantenuti in coltura per 10 giorni14. I sofisticati strumenti genetici disponibili nel topo rendono questo modello molto attraente per essere utilizzato nella coltura ossea ex vivo. Gli studi che hanno usato i topi per esaminare la crescita ossea hanno funzionato principalmente con le ossa metatarsali15, probabilmente a causa delle loro piccole dimensioni e dei numeri maggiori ottenuti per embrione16. Sebbene tradizionalmente considerate ossa lunghe, metatarsi entrano in senescenza (caratterizzata da ridotta proliferazione e involuzione della piastra di crescita17) prima di altre ossa lunghe in vivo, e quindi la loro continua crescita ex vivo non davvero ricapitolare il processo in vivo. Ai fini di questo articolo, useremo il termine ossa lunghe per le ossa delle regioni degli arti prossimali e intermedie. Diversi studi precedenti hanno usato ossa lunghe murine, come la tibia, in colture ex vivo e osservato una crescita sostanziale della cartilagine, ma poca ossificazione18. Abbiamo anche usato le colture tibiali recentemente, principalmente per studiare la dinamica dei condrociti19. Altri studi hanno usato teste femorali da giovani topi20 o solo la parte distale del femore per la cultura21. Alcune opere più recenti combinano con successo la cultura ex vivo di ossa piene con imaging time-lapse per acquisire film tridimensionali (3D) di condrociti nel tessuto vivente del topo22,23. Gli autori sono riusciti ad osservare eventi precedentemente inosservati nel riarrangiamento dei condrociti alla zona proliferativa23 in un buon esempio della potenziale applicazione della coltura ossea ex vivo. L'alternativa, cioè l'analisi delle immagini statiche, richiede tecniche indirette e complesse. Questo è stato esemplificato da un recente studio che ha valutato l'importanza di cloni orientati alla trasversalmente per la crescita della cartilagine, dove il tracciamento genetico con ceppi di topo reporter multicolore accoppiato con la modellazione matematica sono stati utilizzati24. Pertanto, la cultura ex vivo potrebbe contribuire a ottenere informazioni sui processi dinamici in modo più rapido e diretto.
Qui, presentiamo un metodo per la cultura ossea lunga murina, che può essere combinata con diversi trattamenti molecolari e/o con Time-lapse Live Imaging. Questo protocollo adatta i metodi utilizzati nelle precedenti relazioni15,18,25, ma affronta alcuni problemi aggiuntivi e si concentra su ossa lunghe come la tibia, piuttosto che le ossa metatarsali. Infine, Esplora il potenziale dell'utilizzo di confronti associati statisticamente potenti Culturando le ossa sinistra e destra separatamente in presenza di diverse sostanze.
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Protocol
Tutti gli esperimenti devono essere svolti seguendo le linee guida governative e istituzionali locali di manipolazione etica degli animali da laboratorio.
1. preparativi prima del giorno della coltura ossea
- Impostare le accoppiamenti temporizzate del mouse per ottenere feti e cuccioli dal giorno embrionale 14,5 (e 14.5) e successivi.
Nota: La cultura delle ossa lunghe può essere applicata con successo a diversi ceppi di topo; nel presente protocollo vengono utilizzati topi wild-type svizzeri di tipo Webster. - Preparare il mezzo di dissezione (adattato da Houston et al.15): diluire α-minimo il mezzo essenziale (α-MEM) o il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (dmem) 1/13 in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 2 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA) e sterilizzare il filtro attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm, 33 mm di diametro. Conservare le aliquote a-20 ° c.
- Il giorno prima dell'estrazione dei feti, preparare il mezzo di coltura ossea privo di siero composto da DMEM contenente 0,2% BSA, 0,5 mM L-Glutammina, 40 U/mL penicillina/streptomicina, 0,05 mg/mL di acido ascorbico e 1 mM di betaglicofosfato. Filtrare sterilizzare attraverso un filtro per siringa da 0,22 μm, 33 mm di diametro e conservare a 4 ° c per un massimo di 1 mese.
- Il giorno della cultura e prima dell'abbattimento del topo, preparate piatti da 24 pozzetti e 60 mm con mezzo di dissezione e mantenete il ghiaccio freddo. Preriscaldare il terreno di coltura ossea in un bagnomaria a 37 ° c. Spray 80% (v/v) etanolo sugli attrezzi (pinzette e piccole forbici) da utilizzare per la manipolazione del feto. Trasferire un mirino binoculare ad un armadietto di biosicurezza di classe II.
2. cultura del feto e neonato tibia e femore
- Cull il topo incinta attraverso la lussazione cervicale alla fase gestazionale desiderata (che vanno da E 14.5 a E 18.5). Se vengono utilizzati cuccioli neonati, rimuoverli dalla madre uno per uno e Cull da decapitazione.
- Posizionare il mouse sulla schiena e sterilizzare la regione addominale spruzzando 80% (v/v) di etanolo sulla sua superficie.
- Tagliare la pelle e il muscolo addominale con piccole forbici per accedere alle corna uterina.
- Estrarre l'utero dalla cavità addominale con l'aiuto di pinzette e piccole forbici, rimuovendo il Mesometrio e tagliando la base delle corna. Posizionare l'utero in una piastra di Petri da 60 mm con un mezzo di dissezione ghiacciato e mantenere il piatto di coltura sul ghiaccio durante l'intera procedura.
- Trasferire la capsula di Petri con l'utero nel mobile di biosicurezza e lavorare lì da ora in poi.
- Separare i singoli feti con le forbici tagliando tra le sacche.
- Trasferire il sacco individuale sotto uno stereomicroscopio di dissezione in un piatto pulito da 60 mm con mezzo di dissezione e aprirli con delle pinzette per separare i feti dai placenta e pulirlo dalle membrane.
Nota: Lavorare con un embrione alla volta, mantenendo il resto sul ghiaccio. - Decapitate i feti e trasferite il corpo a un nuovo piatto 60 mm pulito con una pipetta sterile tagliata da 1 mL.
- Rimuovere la pelle dei feti o cuccioli con pinzette a partire dalla parte posteriore e staccarlo fino alle dita dei piedi.
- Separare gli arti posteriori dal corpo tagliando con le pinzette vicino alla colonna vertebrale e trasferirli in un piatto pulito con mezzo di dissezione ghiaccio-freddo.
- Separare la tibia dal femore con le pinzette, introducendole con attenzione tra la cartilagine superficiale del femore distale e la tibia prossimale.
- Rimuovere le ossa dell'anca dal femore prossimale e l'osso del calcagno e la fibula dalla tibia.
- Rimuovere con cautela il tessuto molle dal femore e la tibia da nipping e tirando fuori.
Nota: È importante rimuovere quanto più tessuto molle possibile, facendo particolare attenzione a rimuovere il tessuto che collega i due pali della cartilagine, ma evitando di danneggiare la cartilagine, il perichdri, e le ossa. - Posizionare le quattro ossa (tibia e femori sinistra e destra) nel primo pozzo della piastra 24-Well con una pipetta sterile in plastica da 1 ml. In alternativa, per confrontare l'effetto di diversi trattamenti sugli arti sinistro e destro, posiziona gli arti controlaterali in pozzi diversi.
Nota: Prestare maggiore attenzione quando le ossa vengono trasferite ai pozzi, in quanto possono facilmente aderire alla pipetta. - Procedere allo stesso modo con il maggior numero di feti se necessario.
Nota: Cambiare il piatto con il mezzo di dissezione non appena diventa troppo offuscato, in quanto è importante vedere chiaramente le ossa dissezionate. -
Quando tutte le ossa desiderate vengono trasferite ai pozzi, rimuovere il mezzo di dissezione con una pipetta sterile in plastica da 1 mL e prestare attenzione a non aspirare le ossa.
- A seconda dello scopo dell'esperimento, le immagini possono essere scattate delle ossa prima di rimuovere il mezzo di dissezione, come punto zero dell'esperimento. Scattare foto con un microscopio collegato a una fotocamera digitale e annotare l'esposizione e la scala utilizzata. Per garantire misurazioni semplici e affidabili, scattare foto con un buon contrasto per distinguere la parte mineralizzata.
- Aggiungere 1 mL di terreno di coltura a ogni pozzo. Se qualsiasi trattamento è destinato alle ossa (doxiciclina, tamoxifene, fattori di crescita, ecc.), dovrebbe essere aggiunto ora.
- Per osservare l'effetto dell'inibizione della crescita nelle condizioni di coltura, trattare la tibia sinistra con acido retinoico (RA, 500 Nm), mentre incubando la tibia destra con un volume equivalente di veicolo (dimetilsolfossido [DMSO], concentrazione finale 0,1%) come un controllo.
- Lasciare che le ossa crescano per due giorni o più in un incubatore di colture cellulari in condizioni di coltura cellulare standard (a 37 ° c in un incubatore 5% CO2 ).
- Per valutare la proliferazione, aggiungere 5-ethynyl-2'-deossiuridina (EdU) o 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) al fluido ad una concentrazione finale di 10 μM 1 − 2h prima della fissazione.
Nota: La concentrazione di stock di EdU è di 20 mM.
Attenzione: EdU e BrdU sono analoghi della timidina e possono essere tossici e mutageni. - Scongelare 4% paraformaldeide (PFA) e fissare le ossa per immersione in PFA in singoli tubi da 2 mL.
Attenzione: PFA è tossico e designato come un probabile cancerogeno umano. Evitare di respirare la polvere e i vapori di paraformaldeide. EdU e BrdU sono analoghi della timidina e possono essere tossici e mutageni. - Dopo una breve fissazione di 10 minuti in PFA a temperatura ambiente, trasferire le ossa in PBS per l'acquisizione di immagini al punto finale. Poi riposiziona le ossa in PFA per il fissaggio notturno a 4 ° c.
- Dopo che le ossa di fissazione possono essere elaborate per le applicazioni downstream desiderate.
3. misurazione e analisi dell'intera lunghezza dell'osso e della regione mineralizzata
- Utilizzare un software di editing di immagini per misurare la lunghezza delle ossa, tenendo conto della scala dell'immagine. Misurare sia la lunghezza totale dell'osso e la regione mineralizzata. Avviare le misurazioni dalle prime celle scure ad una estremità fino a quelle dell'ultimo all'altra estremità.
Nota: La regione mineralizzata è caratterizzata dal colore più scuro e si distingue facilmente dalla cartilagine. - Per calcolare il tasso di crescita, definito come l'aumento medio di lunghezza al giorno, dividere la differenza tra la lunghezza finale dell'osso e quella iniziale per il numero di giorni in coltura.
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Representative Results
La coltura ossea può essere eseguita partendo da diverse fasi. Nella Figura 1a-D, viene mostrato un confronto tra la tibia coltivata e quelle appena estratte in fasi equivalenti. La prima osservazione è che fino a due giorni di cultura le dimensioni raggiunte sono paragonabili alla crescita ossea in vivo sia per la cartilagine che per l'osso mineralizzato (Figura 1a, B, D). Periodi di coltura più lunghi portano a differenze più grandi tra le ossa coltivate e la appena estratta (Figura 1C). Inoltre, come accennato nel protocollo, è fondamentale rimuovere i tessuti molli che collegano entrambe le estremità delle ossa, altrimenti le ossa si piegheranno. La Figura 1e Mostra un esempio di tibia coltivata con rimozione incompleta dei tessuti molli contro una tibia senza tessuto molle.
Successivamente, le tibia sono state coltivate per 2 giorni e la loro lunghezza è stata misurata. Come si può vedere nella Figura 2a, B, la misura della lunghezza totale e della parte mineralizzata può essere eseguita con un software di analisi delle immagini. Come mostrato da de luca et al.26, il trattamento con RA ha un forte effetto sulla crescita della tibia già dopo 2 giorni di trattamento e un risultato simile è stato osservato nelle nostre colture (Figura 2B-D). È importante sottolineare che l'esperimento è stato eseguito utilizzando ossa accoppiate, con l'osso destro come controllo e la sinistra trattata con RA (Figura 2a, B, e), che aiuta a superare la variabilità naturale nelle dimensioni dell'osso tra i diversi campioni. Così, il metodo di coltura descritto è adatto per valutare l'effetto di diversi composti sulla crescita ossea.
Successivamente, è stato valutato il tasso di crescita delle ossa dopo la coltura. Le ossa sono state estratte, misurate e coltivate a e 15.5, 16,5 o P1, e fissate e misurate di nuovo due giorni dopo. Sono stati misurati sia l'aumento totale della lunghezza che la lunghezza della parte mineralizzata (Figura 3C). Viene mostrato un esempio di e 15.5 tibia e femore prima della cultura (Figura 3A) e al punto finale dell'esperimento (Figura 3B). Come si può osservare dal grafico e dalla tabella (Figura 3C, D), vi è un costante aumento della lunghezza totale della tibia, corrispondente ad un aumento approssimativo del 9 − 29% dalla lunghezza iniziale. Questo è meno aumento rispetto a quello osservato in vivo; la differenza principale è probabilmente dovuta al livello della cartilagine prossimale, più grande del distale e meno accessibile ai nutrienti. Infatti, l'etichettatura EdU ha mostrato meno cellule positive in questa regione dopo la coltura rispetto alle ossa appena estratte di stadio equivalente (Figura 4a, C). L'incorporazione EdU nella tibia distale era simile nelle ossa coltivate e appena estratti (Figura 4B, D) la cartilagine distale contribuisce approssimativamente un terzo alla crescita totale della tibia in vivo in questa fase27, paragonabile al tasso di crescita osservato nella cultura, quindi proponiamo che l'analisi debba concentrarsi su questa parte dell'osso. Inoltre, abbiamo valutato la mineralizzazione delle ossa coltivate, e osservare quasi nessun aumento della lunghezza di questa regione. La differenza potrebbe essere dovuta all'assenza di invasione di vasi e osteoblasti nella cultura ex vivo. Ciò suggerisce che gli studi di crescita della cartilagine possono estendersi per diversi giorni, mentre se la regione di interesse è la parte ossificata dell'osso, il periodo della cultura dovrebbe essere più breve. Questa osservazione è stata confermata mantenendo la tibia nella cultura per un periodo più lungo (fino a 6 giorni). Come si può vedere nella Figura 5, la lunghezza totale dell'elemento scheletrico aumenta sostanzialmente, mentre non si osserva quasi nessun aumento della regione mineralizzata (Figura 5C).
Nel complesso, questi risultati suggeriscono che la cultura delle ossa lunghe può essere utilizzata per analizzare l'effetto di diversi fattori sulla crescita ossea complessiva e in particolare per valutare la dinamica della cartilagine. Mentre le colture metatarsali ben consolidate possono essere utilizzate anche con questi scopi, si presenta che entrambi i tipi di colture si completano a vicenda, date le differenze intrinseche tra metatarati e il resto delle ossa lunghe.
Figura 1: esempio di tibia coltivata per periodi di tempo diversi. (A-D) Confronto tra tibia appena estratta (in alto) e tibia estratta a e 14.5 (in basso) e coltivata per 2 giorni (a), estratta a e 15.5 e coltivata per 2 giorni (B), estratta a e 16.5 e coltivata per 4 giorni (C) e appena estratta a giorno dopo Natale 2 (P2) ed Estratto al giorno 1 (P1) postnatale e coltivato per 1 giorno (D). Si noti che, mentre la crescita della cartilagine rimane abbastanza fisiologica dopo diversi periodi di coltura, la parte ossificata Mostra un ritardo di crescita dopo il tempo di coltura più di 2 giorni rispetto all'osso appena estratto nella fase corrispondente. Barra di scala = 1 mm. (e) tibia coltivata per 2 giorni a partire da e 15.5; Si noti che la rimozione incompleta del tessuto molle tra le due estremità delle ossa porta alla flessione dell'osso. Barra di scala = 600 μm. fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: misura della lunghezza delle ossa al trattamento dell'acido retinoico (RA). (A-B) Tibias Estratto a E 15.5 e cresciuto per 2 giorni con 0,1% DMSO (A) e RA (B). Si noti la differenza sia nella lunghezza totale che nella parte mineralizzata. Barra di scala = 1 mm. (c-d) variazioni della lunghezza totale (c) o della parte mineralizzata (D) della tibia per un periodo di 6 giorni in situazione di controllo e in presenza di ra. I risultati sono mostrati come media ± deviazione standard (SD); confronto è fatto da analisi a due vie di varianza (ANOVA) con il tipo di trattamento come variabile (valorip sono mostrati nel grafico). (E) confronto della lunghezza delle ossa accoppiate coltivate per 2 giorni con DMSO (tibia destra) o RA (tibia sinistra); ogni punto rappresenta uno dei 3 replicati biologici per condizione. È stato utilizzato il t-test associato a due tailed Student. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: confronto tra crescita totale e mineralizzazione della tibia dopo 48 ore di coltura ex vivo. A) e 15.5 tibia e femori dagli arti di sinistra (superiore) e destra (inferiore) prima della coltura. B) le stesse tibia e femori seguite dopo la coltura di 2 giorni. Barra di scala = 600 μm. (C) grafico che rappresenta il tasso di crescita delle tibia coltivate in diverse fasi evolutive. Sono state valutate sia la crescita totale che la crescita della parte mineralizzata. D) tabella che mostra la lunghezza iniziale e finale dell'osso intero e la parte mineralizzata prima della coltura a e 15.5 e dopo 2 giorni di coltura. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: Piastre di crescita ingombranti non mostrano molta proliferazione nella cultura. (A-B) Colorazione EdU per placche prossimali (A) e distali (B) di crescita tibiale coltivate da e 15.5 per 2 giorni. (C-D) Colorazione EdU per lastre prossimali (C) e distali (D) di crescita tibiale appena estratte a e 17.5. Si noti la differenza nel numero di cellule EdU (+) nella tibia prossimale. I dati includono 6 coppie di arti coltivate e 3 estratti di fresco. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: periodi più lunghi di cultura della tibia mostrano una crescita sostanziale della cartilagine ma poca mineralizzazione. Tibia appena estratta a E 15.5 (t = 0) (a) e dopo 6 giorni in coltura (B). Notate le differenze tra la crescita della cartilagine e la crescita della parte mineralizzata. Barra di scala = 1 mm (C) grafico che mostra i cambiamenti nella lunghezza totale e nella regione mineralizzata per un periodo di 6 giorni. n = 5 tibias coltivate; SD ad ogni punto temporale è la seguente: t = 0, lunghezza intera = 0,0777, mineralizzata = 0,0213; t = 3 d, lunghezza intera = 0,1495, mineralizzata = 0,056; t = 6 d, lunghezza intera = 0,1193, mineralizzata = 0,0521. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
I metodi di coltura ossea ex vivo sono stati usati per un certo tempo per valutare la biologia della crescita ossea28, ma sono stati raramente applicati alle ossa lunghe murine. Con lo sviluppo di tecniche di imaging, la coltura ossea ex vivo offre un modo attraente per studiare la crescita ossea in tempo reale in un ambiente che assomiglia strettamente alle condizioni in vivo. In questo scenario, è importante definire le condizioni in cui la crescita delle ossa lunghe è paragonabile alla loro crescita in vivo.
Nel presente studio, descriviamo un protocollo semplice e conveniente per la cultura ossea lunga, affrontando le limitazioni e le possibili applicazioni. La fase più critica di questo metodo è l'isolamento delle ossa, che devono rimanere intatte e con come tessuto meno morbido tra le estremità dell'osso il più possibile. Lasciando il tessuto molle tra le estremità delle ossa impedirà la normale crescita dell'osso e indurre flessione, come è esemplificato nella Figura 1e. Il tessuto molle alle estremità delle ossa può essere lasciato, come finirà per scomparire. Un altro passo che richiede una maggiore attenzione è il trasferimento delle ossa alla piastra di coltura, in quanto possono facilmente aderire alla pipetta di plastica. Una possibile soluzione è Pipettare su e giù il mezzo di dissezione contenente sangue e pezzi di tessuto, in quanto crea un rivestimento che aiuta a impedire che le ossa si attacchino alla pipetta.
Una volta estratti, le ossa raggiungono dimensioni comparabili alla corrispondente fase in vivo quando coltivate fino a 48 h. oltre a misurare la lunghezza dell'osso, il tasso di crescita (aumento medio di lunghezza al giorno) può essere stimato facilmente in queste condizioni. Tuttavia, questo approccio per il calcolo del tasso di crescita non è valido per periodi di coltura più lunghi, dove devono essere utilizzati altri metodi, come l'etichettatura di calceina29. Il trattamento con acido retinoico, che promuove la differenziazione precoce dei condrociti, porta ad una sostanziale riduzione della crescita delle ossa, suggerendo che questo tempo per la coltura è sufficiente per osservare l'effetto che le diverse sostanze potrebbero avere sulle ossa crescita. È importante sottolineare che il confronto è stato fatto anche con le ossa accoppiate dello stesso esemplare, in modo che la tibia sinistra ricevesse il trattamento RA e la destra fosse il controllo. Questo è un vantaggio del modello di coltura ossea, in quanto consente l'esecuzione di confronti accoppiati, che sono statisticamente più potenti.
La coltura per più tempo mostra una crescita significativa della parte cartilaginea, ma un ritardo nella crescita di quella mineralizzata, ed è importante considerare questo risultato quando si sceglie l'applicazione della tecnica. Risultati simili sono stati osservati in femore di pulcino coltivate per un massimo di 10 giorni che mostrano una regione di epifisseal allargata e un collare osseo ridotto diafisarie14, così come in tibia del topo coltivata per 6 giorni18. Inoltre, è importante ricordare che nella regione della cartilagine la crescita non è omogenea: l'ingombrante regione distale del femore e la regione prossimale della tibia non ricevono nutrienti in modo efficiente da una semplice diffusione e non possono crescere adeguatamente. In questo contesto, gli studi dovrebbero concentrarsi sulle piastre di crescita opposta, che sono state stimate per contribuire a un terzo della crescita totale27, simile alla crescita osservata nella cultura. Il ritardo nella crescita delle ossa coltivate è stato descritto anche per le colture metatarsali15.
Una considerazione importante di questo tipo di cultura è l'assenza di crescita della parte ossificata dell'osso. È ben accertato che gli osteoblasti invadono la matrice cartilaginea dal periosteo insieme ai vasi sanguigni3,4 e questo processo è ovviamente interrotto quando l'osso è isolato. Ciò potrebbe spiegare l'assenza di ossificazione in condizioni di coltura. La transdifferenziazione dei condrociti ipertrofici è stata anche mostrata come una fonte importante di osteoblasti7,8,9, ma se questo processo richiede anche in parte la presenza di vasi sanguigni, come sembra fare durante guarigione della frattura30, o alcuni altri tessuti non presenti nelle colture ex vivo, ha bisogno di ulteriori indagini. Inoltre, è ben descritta l'importanza del carico meccanico nel plasmare la crescita ossea31,32, che influenza le ossa lunghe e le ossa metatarsali in modo diverso, ma è assente in una configurazione di coltura ex vivo. Tuttavia, il metodo di coltura descritto è adatto per misurare la dinamica dei condrociti e i cambiamenti nella crescita longitudinale e, quindi, può essere utilizzato per alcune applicazioni.
Nel complesso, il protocollo descritto fornisce un metodo semplice ed economico per le ossa lunghe della cultura partendo da diverse fasi, che possono essere accoppiate con tecniche aggiuntive per affrontare i principali meccanismi cellulari e molecolari, come l'imaging time-lapse in tempo reale13 , 23 o trattamento farmacologico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Alexandra Joyner per il suo sostegno quando questo protocollo è stato istituito, Edwina McGlinn e Yi-Cheng Chang per la condivisione di acido retinoico. L'Istituto australiano di medicina rigenerativa è supportato da sovvenzioni del governo statale di Victoria e del governo australiano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
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