Summary
Hier stellen wir eine Methode für die ex vivo-Kultur der langen Murinknochen in den Phasen des Fetales und Neugeborenen vor, die für die Analyse der Knochen-und Knorpelentwicklung und der Homöostase unter kontrollierten Bedingungen geeignet ist, während der In-vivo-Prozess rekapituliert wird.
Abstract
Lange Knochen sind komplexe und dynamische Strukturen, die sich aus der endochondralen Verknöcherung über ein Knorpel-Zwischenprodukt ergeben. Der eingeschränkte Zugang zu gesunden menschlichen Knochen macht den Einsatz von Säugetiermodellen wie Maus und Ratte besonders wertvoll, um verschiedene Aspekte des Knochenwachstums und der Homöostase zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht die Entwicklung ausgeklügelter genetischer Werkzeuge bei Mäusen komplexere Studien über langes Knochenwachstum und fordert eine Ausweitung der Techniken, die zur Untersuchung des Knochenwachstums verwendet werden. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die ex vivo Murinknochenkultur vor, das es ermöglicht, Knochen und Knorpel streng kontrolliert zu untersuchen und den größten Teil des In-vivo-Prozesses zu rekapitulieren. Die beschriebene Methode ermöglicht die Kultur einer Reihe von Knochen, darunter Tibia, Femur und Metatarsal-Knochen, aber wir haben uns hier hauptsächlich auf die tibiale Kultur konzentriert. Darüber hinaus kann es in Kombination mit anderen Techniken, wie Zeitraffer-Live-Bildgebung oder medikamentöse Behandlung verwendet werden.
Introduction
Das Organwachstum muss eng abgestimmt werden, um das Auftreten von Wachstumsstörungen zu verhindern, und beinhaltet die Regulierung mehrerer Zelltypen, molekularer Wege und Kreuzungen zwischen verschiedenen Körperteilen. Bildgebende Techniken sind unerlässlich, um die Veränderungen zu bewältigen, die im Laufe der Zeit in einem wachsenden Embryo auftreten, sowohl unter normalen Bedingungen, als auch nach einer Störung, die im System induziert wird. Embryonen mit intrauterinischer Entwicklung, wie die weit verbreiteten Nagetiermodelle, stellen eine zusätzliche Herausforderung für die Live-Bildgebung und die medikamentöse Behandlung dar, die teilweise durch den Einsatz von Ex-vivo-Kulturtechniken bewältigt werden kann. Um die In-vivo-Prozesse erfolgreich zu rekapitulieren und aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen, ist es entscheidend, die richtigen kultivierenden Bedingungen für jedes Organ oder Gewebe zu finden.
Die meisten Knochen des Säugetierskeletts wachsen durch endochondrale Verknöcherung, wo der embryonale Knorpel (bestehend aus Zellen, die Chondrozyten genannt werden) das Längswachstum antreibt und nach und nach durch Knochen ersetzt wird. Dieser Prozess geschieht an den Wachstumsplatten, die sich am Ende der langen Knochen befinden, wo drei Zonen unterschieden werden können: Ruht, proliferativ und hypertrophisch1,2. Zunächst die runden Vorläuferchchen in der Ruhezone Übergang in die Radspalnar chondrozyten in der proliferativen Zone. In der nächsten Phase der Differenzierung werden diese Chondrozyten hypertrophisch und beginnen, Typ X Kollagen zu spülen. Hypertrophe Chondrozyten orchestrieren die folgenden Schritte der Verknöcherung: Sie scheiden Schlüsselsignalmoleküle aus, wie Bindegewebswachstumsfaktor, Knochenmorphogenetische Proteine und indischer Igel, und lenken die Mineralisierung der Matrix, rekrutieren Die Blutgefäße bis zum zentralen Teil des Knochens, und nach der Apoptose,erlaubenOsteoblasten (Knochenbildende Zellen), in die Matrix einzudringen, umdie primäre Verknöcherung Zentrum 3,4zubilden. Die mineralisierte Matrix erleichtert das Eindringen von Blutgefäßen, durch die Osteoblasten wandern, um diesen abgebauten Knorpel durch eine Knochenmatrix5zu ersetzen. Die meisten Osteoblasten dringen in die Knorpelmatrix aus dem Perichondrium ein, einer Faserschicht, die den Knorpel 6 umhüllt. Alternativ kann ein Anteil hypertrophischer Chondrozyten überleben und sich zu Osteoblasten7,8,9 transdifferenzieren. Die endgültige Länge des Knochens ist auf das angesammelte Wachstum des flüchtigen Knorpels zurückzuführen, dessen Wachstumsrate wiederum von der Anzahl und Größe der hypertrophen Chondrozyten und ihrer Matrixproduktion10 abhängt. Darüber hinaus wurde vor kurzem gezeigt, dass die Dauer der letzten Hypertrophie-Phase mit der letzten Länge des Knochens 11korreliert. Daher ist eine strenge Regulierung der Proliferation und Differenzierung dieser Zellen erforderlich, um die richtige Knochengröße zu gewährleisten.
Trotz des umfangreichen Wissens, das im Laufe der Jahre über die Organisation und Entwicklung der Wachstumsplatten erworben wurde, basieren die meisten dieser Schlussfolgerungen auf der Beobachtung von festen histologischen Abschnitten. Die Abtrennung von Gewebeabschnitten liefert wertvolle Informationen über diesen Prozess, kann aber mit technischen Artefakten geritten werden, so dass es nicht immer zuverlässig verwendet werden kann, um morphologische oder Größenänderungen zwischen verschiedenen Stadien zu schätzen. Da das Knochenwachstum ein dynamischer Prozess ist, bieten die statischen zweidimensionalen (2D) Bilder einen begrenzten Einblick in die Bewegung der Zellen in der Wachstumsplatte, während Zeitraffer-Abbildungen auf lebendem Gewebe wertvolle Informationen über das Verhalten der Chondrozyten in der Wachstumsplatte.
All diese Einschränkungen können mit Ex-vivo-Knochenkulturen gelöst werden. Während die Knochenkulturprotokolle schon vor einiger Zeit entwickelt wurden, wurden sie auf Murine-lange Knochen limitiert. Die meisten Studien verwenden die Kichererbse aufgrund der technischen Vorteile, die das Kickmodell 12,13bietet. Organotypische Kulturen (air/liquide Schnittstelle) wurden auf schicke embryonale Oberschenkel angewendet, die 10 Tage lang in der Kulturgepflegt wurden 14. Die ausgeklügelten genetischen Werkzeuge, die in der Maus zur Verfügung stehen, machen dieses Modell sehr attraktiv, um in der ex vivo Knochenkultur verwendet werden. Die Studien, die Mäuse benutzten, um das Knochenwachstumzuuntersuchen, arbeiteten hauptsächlich mit Metatarsal-Knochen 15, wahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Größeund größeren Anzahl pro Embryo 16. Obwohl traditionell als lange Knochen betrachtet, Metatarsi in die Seneszenz (gekennzeichnet durch reduzierte Vermehrung und Involvierung der Wachstumsplatte 17) früher als andere lange Knochen in vivo, und daher ihr kontinuierliches Wachstum ex vivo nicht Rechreibe der In-vivo-Prozess wirklich. Für die Zwecke dieses Artikels werden wir den Begriff lange Knochen für Knochen aus den Regionen der proximalen und mittleren Gliedmaßen verwenden. Mehrere frühere Studien verwendeten lange Murinknochen, wie Tibia, in Ex-vivo-Kulturen und beobachteten ein erhebliches Wachstum des Knorpels, aber wenig Verknöcherung 18. Wir haben in letzter Zeit auch tibiale Kulturen verwendet, vor allem, um die Chondrozyten-Dynamikzu studieren 19. Andere Studien verwendeten Oberschenkelköpfe von jungen Mäusen 20 oder nur den distalen Teil des Oberschenkels für Kultur21. Einige neuere Arbeiten verbinden erfolgreich die ex vivo-Kultur der vollen Knochen mit Zeitraffer-Bildgebung, um dreidimensionale (3D) Filme von Chondrozyten im lebendenMausgewebe 22,23zuerwerben. Den Autoren gelang es, bisher unbemerkte Ereignisse bei der Neuordnung der Chondrozyten in die proliferative Zone23 zu beobachten, in einem guten Beispiel für die mögliche Anwendung der Knochen-Ex-vivo-Kultur. Die Alternative, also die Analyse statischer Bilder, erfordert indirekte und komplexe Techniken. Dies wurde durch eine aktuelle Studie veranschaulicht, die die Bedeutung von transversal orientierten Klonen für das Knorpelwachstum bewertet, bei der die genetische Verfolgung mit mehrfarbigen Reporter-Mausstämmen in Verbindung mit mathematischer Modellierung 24 verwendet wurde. Daher könnte die ex vivo-Kultur dazu beitragen, schneller und unkomplizierter Einblicke in dynamische Prozesse zu gewinnen.
Hier stellen wir eine Methode zur Murine-Langknoch-Kultur vor, die mit verschiedenen molekularen Behandlungen und/oder mit Zeitraffer-Live-Bildgebung kombiniert werden kann. Dieses Protokoll passt die Methoden an, die in früheren Berichten15,18,25verwendet werden, spricht aber einige zusätzliche Probleme an und konzentriert sich auf lange Knochen wie die Tibia und nicht auf metatarsale Knochen. Schließlich untersucht sie das Potenzial, statistisch starke Paßvergleiche zu verwenden, indem sie linke und rechte Knochen getrennt in Anwesenheit verschiedener Substanzen kultiviert.
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Protocol
Alle Experimente sollten nach den lokalen staatlichen und institutionellen Richtlinien des ethischen Umgangs mit Labortieren durchgeführt werden.
1. Vorbereitungen vor dem Tag der Knochenkultur
- Richten Sie zeitliche Maus-Matratzen ein, um Föten und Welpen ab dem embryonalen Tag 14.5 (E14.5) und weiter zu erhalten.
NOTE: Die Kultur der langen Knochen kann erfolgreich auf verschiedene Mausstämme angewendet werden; Im vorliegenden Protokoll werden übergezüchtete Schweizer Webster-Wildmäusen verwendet. - Bereiten Sie das Sektionsmedium vor (angepasst von Houston et al.15): Verdünnung des minimalen essenziellen Mediums (α-MEM) oder Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) in Phosphat-gepufferte Saline (PBS) und 2 mg/mL Rinder-Serum Albumin (BSA) und Filtersterilize Durch einen Spritzfilter mit einem Durchmesser von 0,22 μm mit 33 mm. Aliquots bei-20 ° C aufbewahren.
- Am Tag vor der Gewinnung der Föten, Bereiten Sie das serumfreie Knochenkulturmedium vor, das sich aus DMEM zusammensetzt, das 0,2% BSA, 0,5 mM L-Glutamin, 40 U/mL penicillin/streptomycin, 0,05 mg/mL Ascorbinsäure und 1 mM betaglycerophosphat enthält. Filtern Sie sterilisieren Sie durch einen 0,22 μm großen Spritzenfilter mit einem Durchmesser von 33 mm und lagern Sie bis zu einem Monat bei 4 ° C.
- Am Tag der Kultur und vor der Mäusekäge, bereiten 24-Brunnen-Teller und 60 mm Geschirr mit Sektionsmittel und halten sie eiskalt. Das Knochenkulturmedium in einem 37 ° C-Wasserbad vorwärmen. Spray 80% (v/v) Ethanol (Pinzette und kleine Schere), die für die Fötus-Handhabung verwendet werden. Übertragen Sie ein binokulares Geltungsbereich auf einen Biosicherheitsschrank der Klasse II.
2. Kultur von Fetus und Neugeborenen Tibia und Femur
- Die schwangere Maus durch Gebärmutterhalskrebs in der gewünschten Gestationsphase (von E14.5 bis E18.5) kultivieren. Wenn neugeborene Welpen verwendet werden, entfernen Sie sie von der Mutter eine nach der anderen und keulen durch Enthauptungen.
- Legen Sie die Maus auf ihren Rücken und sterilisieren Sie den Bauchbereich, indem Sie 80% (v/v) Ethanol auf ihre Oberfläche sprühen.
- Schneiden Sie die Haut und den Bauchmuskel mit einer kleinen Schere, um auf die Gebärmutterhorne zuzugreifen.
- Mit Pinzette und kleiner Schere die Gebärmutter aus der Bauchhöhle ziehen, das Mesometrium entfernen und die Basis der Hörner schneiden. Legen Sie die Gebärmutter in eine 60 mm Petrischale mit eiskaltem Trennmittel und halten Sie die Kulturschale während der gesamten Prozedur auf Eis.
- Die Petrischale mit der Gebärmutter in den Biosicherheitsschrank übertragen und dort ab sofort arbeiten.
- Trennen Sie einzelne Föten mit einer Schere, indem Sie zwischen den Säcken schneiden.
- Übertragen Sie einzelne Sack unter einem Trennsteremikroskop in einer sauberen 60-mm-Schale mit Trennmittel und öffnen Sie sie mit Pinzetten, um die Föten von den Plazenta zu trennen und von Membranen zu reinigen.
NOTE: Arbeiten Sie mit einem Embryo nach dem anderen, während Sie den Rest auf Eis halten. - Die Föten verdappen und den Körper auf eine saubere, neue 60-mm-Schale mit einer 1 ml geschnittenen Sterilpipette übertragen.
- Entfernen Sie die Haut der Föten oder Welpen mit Pinzetten von hinten und schälen Sie sie bis zu den Zehen.
- Die Hinterbeine vom Körper trennen, indem sie mit der Pinzette in der Nähe der Wirbelsäule schneiden und auf eine saubere Schüssel mit eiskaltem Trennmittel übertragen.
- Trennen Sie die Tibia vom Oberschenkel mit Pinzette, indem Sie sie sorgfältig zwischen den Oberflächenknorpel von distalem Oberschenkel und proximaler Tibia einführen.
- Entfernen Sie die Hüftknochen vom proximalen Oberschenkel und den Kalcaneus-Knochen und die Fibel aus der Tibia.
- Entfernen Sie das weiche Gewebe vorsichtig aus dem Oberschenkel und der Tibia, indem Sie es abknacken und abziehen.
NOTE: Es ist wichtig, so viel Weichteilgewebe wie möglich zu entfernen, wobei besonders darauf geachtet wird, das Gewebe zu entfernen, das die beiden Knorpelstmasten verbindet, aber die Beschädigung des Knorpels, des Perichondriums und der Knochen zu vermeiden. - Die vier Knochen (links und rechts Tibias und Oberschenkel) in den ersten Brunnen der 24-Brunnen-Platte mit einer Kunststoff-1 mL sterilen Pipette legen. Alternativ, um die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf den linken und rechten Gliedmaßen zu vergleichen, legen Sie kontralaterale Gliedmaßen in verschiedenen Brunnen.
NOTE: Bei der Übergabe der Knochen auf die Brunnen sollte besonders darauf geachtet werden, da sie leicht an der Pipette haften können. - Gehen Sie mit so vielen Föten wie nötig auf die gleiche Weise vor.
NOTE: Ändern Sie die Schüssel mit dem zertrennlichen Medium, sobald es zu bewölkt wird, da es wichtig ist, die zerschnittenen Knochen klar zu sehen. -
Wenn alle gewünschten Knochen auf die Brunnen übertragen werden, entfernen Sie das Trennmedium mit einer Kunststoff-1 mL sterile Pipette und achten Sie besonders darauf, die Knochen nicht zu saugen.
- Je nach Zweck des Experiments können Bilder von den Knochen aufgenommen werden, bevor das Trennmedium entfernt wird, als Zeiterpunkt Null des Experiments. Machen Sie Fotos mit einem Mikroskop, das an einer Digitalkamera befestigt ist, und kommentieren Sie die Belichtung und die verwendete Skala. Um einfache und zuverlässige Messungen zu gewährleisten, fotografieren Sie mit gutem Kontrast, um den mineralisierten Teil zu unterscheiden.
- Fügen Sie jedem Brunnen 1 ml Kulturmedium hinzu. Wenn eine Behandlung auf den Knochen (Doxycyclin, Tamoxifen, Wachstumsfaktoren, etc.) beabsichtigt ist, sollte sie jetzt hinzugefügt werden.
- Um die Wirkung der Wachstumshemmung in den Kulturbedingungen zu beobachten, behandeln Sie die linken Tibien mit Retinosäure (RA, 500 nM), während Sie die rechte Tibien mit einem entsprechenden Fahrzeugvolumen inkubieren (Dimethylsulfoxid [DMSO], Endkonzentration 0,1%) Als Kontrolle.
- Lassen Sie die Knochen für zwei Tage oder länger in einem Zellkultur-Inkubator unter normalen Bedingungen der Zellkultur wachsen (bei 37 ° C in einem 5% CO2 Inkubator).
- Um die Proliferation zu beurteilen, fügen Sie 5-Ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) oder 5-Bromo-2 '-deoxyuridine (BrdU) bei einer Endkonzentration von 10 μM 1 − 2 h vor der Fixierung in das Medium ein.
NOTE: Die Lagerkonzentration der EdU beträgt 20 mM.
CAUTION: EdU und BrdU sind thymidine Analoga und können giftig und mutagene sein. - Tauen Sie 4% Paraformaldehyd (PFA) und fixieren Sie die Knochen durch Eintauchen in PFA in einzelnen 2 mL Röhren.
CAUTION: PFA ist giftig und als wahrscheinlicher menschlicher Karzinogen bezeichnet. Vermeiden Sie das Atmen von Paraformaldehyd-Pulver und Dämpfen. EdU und BrdU sind thymidine Analoga und können giftig und mutagene sein. - Nach einer kurzen 10-minütigen Fixierung in PFA bei Raumtemperatur, übertragen Sie Knochen an PBS für die Bildaufnahme zum Endzeitpunkt. Dann die Knochen wieder in den PFA legen, um sie über Nacht bei 4 ° C zu befestigen.
- Nach der Fixierung können Knochen für gewünschte nachgelagerte Anwendungen verarbeitet werden.
3. Messung und Analyse der vollen Länge des Beinen und der Mineralienregion
- Verwenden Sie eine Bildbearbeitungssoftware, um die Länge der Knochen zu messen, unter Berücksichtigung der Größe des Bildes. Messen Sie sowohl die Gesamtlänge des Knochens als auch die mineralisierte Region. Starten Sie die Messungen von den ersten dunklen Zellen an einem Ende bis zu den letzten am anderen Ende.
NOTE: Die mineralisierte Region zeichnet sich durch die dunklere Farbe aus und unterscheidet sich leicht vom Knorpel. - Um die Wachstumsrate zu berechnen, die als durchschnittliche Zunahme der Länge pro Tag definiert wird, teilen Sie die Differenz zwischen der endgültigen Länge des Knochens und der ursprünglichen, durch die Anzahl der Tage in der Kultur.
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Representative Results
Die Knochenkultur kann von verschiedenen Stufen aus durchgeführt werden. In Abbildung 1A-Dwird ein Vergleich zwischen kultivierter Tibia und frisch extrahierten in entsprechenden Stadien gezeigt. Die erste Beobachtung ist, dass bis zu zwei Tage Kultur die erreichte Größe mit dem in vivo Knochenwachstum sowohl für Knorpel als auch für mineralisierte Knochen vergleichbar ist (Abbildung 1A, B, D). Längere Kulturperioden führen zu größeren Unterschieden zwischen den kultivierten Knochen und den frisch extrahierten (Abbildung 1C). Darüber hinaus ist es, wie im Protokoll erwähnt, wichtig, das Weichteilgewebe zu entfernen, das beide Enden der Knochen verbindet, da sich sonst die Knochen verbiegen. Abbildung 1E zeigt ein Beispiel für eine Tibia, die mit unvollständiger Entfernung von Weichteilgewebe gegen eine Tibia ohne Weichteilgewebe angebaut wird.
Als nächstes wurden Tibien für 2 Tage kultiviert und ihre Länge gemessen. Wie in Abbildung 2A, B zusehen ist, kann die Messung der Gesamtlänge und des mineralisierten Teils mit einer Bildanalyse-Software durchgeführt werden. Wie De Luca et al. 26 zeigt, hat die Behandlung mit RAbereitsnach 2 Tagen Behandlung einen starken Einfluss auf das Wachstum der Tibien, und ein ähnliches Ergebnis wurde in unseren Kulturen beobachtet (Abbildung 2B-D). Wichtig ist, dass das Experiment mit gepaarten Knochen durchgeführt wurde, wobei der rechte Knochen als Kontrolle und der linke Knochen mit RA (Abbildung 2A, B, E)behandelt wurden, was hilft, die natürliche Variabilität der Knochengröße zwischen verschiedenen Exemplaren zu überwinden. So eignet sich die beschriebene Kultivierungsmethode, um die Wirkung verschiedener Verbindungen auf das Knochenwachstum zu beurteilen.
Als nächstes wurde die Wachstumsrate der Knochen nach Kultur bewertet. Knochen wurden bei E15.5, 16,5 oder P1 extrahiert, gemessen und kultiviert und zwei Tage später wieder fixiert und gemessen. Sowohl die Gesamterhöhung der Länge als auch die Länge des mineralisierten Teils wurden gemessen (Abbildung 3C). Ein Beispiel von E15.5 Tibia und Oberschenkel vor Kultur (Abbildung 3A) und am Endpunkt des Experiments (Abbildung 3B) werden gezeigt. Wie aus dem Diagramm und der Tabelle (Abbildung 3C, D) ersehen ist, gibt es eine konstante Erhöhung der Gesamtlänge der Tibia, was einer ungefähren Steigerung von 9 − 29% von der ursprünglichen Länge entspricht. Das ist weniger Anstieg als der in vivo beobachtete; Der Hauptunterschied ist wahrscheinlich auf den Gehalt des proximalen Knorpels zurückzuführen, der größer ist als der distal und weniger für Nährstoffe zugänglich ist. Tatsächlich zeigte die EdU-Kennzeichnung in dieser Region weniger positive Zellen nach der Kultur im Vergleich zu frisch extrahierten Knochen der entsprechenden Stufe (Abbildung 4A, C). Ähnlich verhielt es sich bei den kultivierten und frisch extrahierten Knochen (Abbildung 4B, D). Der distale Knorpel trägt etwa ein Drittel zum Gesamtwachstum der Tibia in vivo in diesem Stadium 27 bei, Vergleichbar mit der in der Kultur beobachteten Wachstumsrate schlagen wir vor, dass sich die Analyse auf diesen Teil des Knochens konzentrieren sollte. Darüber hinaus haben wir die Mineralisierung der kultivierten Knochen bewertet und beobachten fast keine Zunahme der Länge dieser Region. Der Unterschied könnte durch das Fehlen von Gefäßen und Osteoblasten Invasion in der ex vivo Kultur. Dies deutet darauf hin, dass sich die Studien über das Knorpelwachstum über mehrere Tage erstrecken können, während, wenn die Region von Interesse der verknöcherte Teil des Knochens ist, die Periode der Kultur kürzer sein sollte. Diese Beobachtung wurde bestätigt, indem Tibia für einen längeren Zeitraum (bis zu 6 Tage) in der Kultur gehalten wurde. Wie in Abbildung5 zu sehen ist, steigt die Gesamtlänge des Skelettelements erheblich an, während im mineralisierten Bereich fast keine Zunahme beobachtet wird (Abbildung 5C).
Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Kultur der langen Knochen genutzt werden kann, um die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf das gesamte Knochenwachstum zu analysieren und insbesondere die Knorpeldynamik zu bewerten. Während auch etablierte metatarsale Kulturen mit diesen Zwecken verwendet werden können, gehen wir davon aus, dass sich beide Kulturen ergänzen, angesichts der inneren Unterschiede zwischen Metatarsalen und den übrigen langen Knochen.
Abbildung 1: Beispiel kultivierter Tibia für verschiedene Zeiträume. (A-D) Vergleich zwischen frisch extrahierter Tibia (oben) und Tibia, extrahiert bei E14.5 (unten) und 2 Tage lang kultiviert (A), extrahiert bei E15.5 und 2 Tage lang kultiviert (B), extrahiert bei E16.5 und 4 Tage lang kultiviert (C) und frisch extrahiert Postnatal Tag 2 (P2) und extrahiert am postnatalen Tag 1 (P1) und kultiviert für 1 Tag (D). Beachten Sie, dass das Knorpelwachstum nach verschiedenen Kultivierungszeiten zwar recht physiologisch bleibt, der verknöcherte Teil aber eine Wachstumsverzögerung nach einer Kulturzeit von mehr als 2 Tagen im Vergleich zum frisch extrahierten Knochen im entsprechenden Stadium aufweist. Skalierbalken = 1 mm. (E) Tibia für 2 Tage ab E15.5 kultiviert; Beachten Sie, dass die unvollständige Entfernung des Weichteilgewebes zwischen den beiden Enden der Knochen zur Biegung des Knochens führt. Skalierbalken = 600 μm.
Abbildung 2: Messung der Länge der Knochen nach der Retinosäure (RA)Behandlung. (A-B) Tibias wurde bei E15.5 extrahiert und 2 Tage lang mit 0,1% DMSO (A) und RA (B) angebaut. Beachten Sie den Unterschied sowohl in der Gesamtlänge als auch in dem mineralisierten Teil. Skalierbalken = 1 mm. (C-D) Veränderungen in der Gesamtlänge (C) oder des mineralisierten Teils (D) der Tibia über einen Zeitraum von 6 Tagen in Kontrollsituation und in Anwesenheit von RA. Die Ergebnisse werden als mittlere ± Standardabweichung (SD) angezeigt; Der Vergleich erfolgt durch eine zweiseitige Analyse der Varianz (ANOVA) mit der Art der Behandlung als Variable (p-Werte werden im Diagramm angezeigt). (E) Vergleich der Länge der paarigen Knochen, die für 2 Tage kultiviert wurden, entweder mit DMSO (rechte Tibia) oder RA (linke Tibia); Jeder Punkt stellt eines der drei biologischen Replikate pro Zustand dar. Gepaart zweiseitiger Schülert-Test wurde eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Vergleich des Gesamtwachstums und der Mineralisierung der Tibia nach 48 Stunden ex vivo-Kultur. (A) E15.5 Tibias und Oberschenkel von links (oben) und rechts (unten) Gliedmaßen vor der Kultivierung. (B) Die gleichen Tibien und Oberschenkel folgten nach der 2-tägigen Kultur. Skalierbalken = 600 μm. (C) Grafik, die die Wachstumsrate von Tibias darstellt, die in verschiedenen Entwicklungsstadien kultiviert werden. Sowohl das Gesamtwachstum als auch das Wachstum des mineralisierten Teils wurden bewertet. D) Tabelle, die die Anfangs-und Endlänge des gesamten Knochens und des mineralisierten Teils zeigt, bevor sie bei E15.5 und nach 2 Tagen in der Kultur kultiviert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Bild 4: Sperrige Wachstumsplatten zeigen in der Kultur nicht viel Verbreitung. (A-B) Die edU-Färbung für proximale (A) und distale (B) tibiale Wachstumsplatten, die aus E15.5 für 2 Tage kultiviert wurden. (C-D) Die EdU-Befärbung für proximale (C) und distale (D) tibiale Wachstumsplatten wird bei E17.5 frisch extrahiert. Beachten Sie den Unterschied in der Anzahl der EdU (+) Zellen in der proximalen Tibia. Die Daten umfassen 6 kultivierte Paar Gliedmaßen und 3 frisch extrahierte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Längere Perioden der Tibia-Kultur zeigen ein erhebliches Knorpelwachstum, aber wenig Mineralisierung. Frisch extrahierte Tibia bei E15.5 (t = 0) (A) und nach 6 Tagen in der Kultur (B). Beachten Sie die Unterschiede zwischen dem Knorpelwachstum und dem Wachstum des mineralisierten Teils. Skalierbalken = 1 mm (C) Grafik, die die Veränderungen der Gesamtlänge und der mineralisierten Region über einen Zeitraum von 6 Tagen zeigt. n = 5 kultivierte Tibias; SD zu jedem Zeitpunkt ist wie folgt: t = 0, volle Länge = 0,0777, mineralisiert = 0,0213; t = 3 d, volle Länge = 0,1495, mineralisiert = 0,56; t = 6 d, volle Länge = 0,1193, mineralisiert = 0,0521. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Methoden der Knochenkultur werden seit einiger Zeit verwendet, um die Biologie des Knochenwachstums 28zu beurteilen, wurden aber nur selten auf Murine-Langknochen angewendet. Mit der Entwicklung von bildgebenden Techniken bietet ex vivo Knochenkultur eine attraktive Möglichkeit, das Knochenwachstum in Echtzeit zu untersuchen, in einem Umfeld, das den In-vivo-Bedingungen sehr ähnlich ist. In diesem Szenario ist es wichtig, die Bedingungen zu definieren, unter denen das Wachstum der langen Knochen mit ihrem Wachstum in vivo vergleichbar ist.
In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein einfaches und erschwingliches Protokoll für eine lange Knochenkultur, das sich mit den Grenzen und möglichen Anwendungen befasst. Der kritischste Schritt dieser Methode ist die Isolierung der Knochen, die intakt und mit möglichst weniger Weichteilen zwischen den Enden des Knochens bleiben müssen. Wenn man Weichteilgewebe zwischen den Enden der Knochen lässt, verhindert man ein normales Wachstum des Knochens und führt zu Biegungen, wie in Abbildung 1Edargestellt. Weiches Gewebe an den Enden der Knochen kann zurückgelassen werden, da es irgendwann verschwindet. Ein weiterer Schritt, der besondere Sorgfalt erfordert, ist die Übertragung der Knochen auf die Kultivierungsplatte, da sie sich leicht an der Plastikpipette festhalten können. Eine mögliche Lösung ist das Auf-und Abschneiden von Trennmittel, das Blut-und Gewebeteile enthält, da es eine Beschichtung erzeugt, die hilft, die Knochen davon abzuhalten, an der Pipette zu kleben.
Nach der Extraktion erreichen die Knochen eine vergleichbare Größe als die entsprechende In-vivo-Phase, wenn sie bis zu 48 Stunden kultiviert werden. Neben der Messung der Knochenlänge kann die Wachstumsrate (durchschnittliche Erhöhung der Länge pro Tag) unter diesen Bedingungen leicht geschätzt werden. Dieser Ansatz zur Berechnung der Wachstumsrate gilt jedoch nicht für längere Kultierungsperioden, in denen andere Methoden wie die Kalkeinkennzeichnung29zum Einsatz kommen sollten. Die Behandlung mit Retinosäure, die vorzeitige Chondrozyten-Differenzierung fördert, führt zu einer erheblichen Verringerung des Wachstums der Knochen, was darauf hindeutet, dass diese Zeit für die Kultivierung ist genug, um die Wirkung, die verschiedene Substanzen auf den Knochen haben könnten, zu beobachten Wachstum. Wichtig ist, dass der Vergleich auch auf gepaarten Knochen aus dem gleichen Exemplar durchgeführt wurde, so dass die linke Tibia die RA-Behandlung erhielt und die rechte die Kontrolle war. Das ist ein Vorteil des Knochenkulturmodells, da es die Durchführung von gepaarten Vergleichen ermöglicht, die statistisch stärker sind.
Die Kultivierung über längere Zeit zeigt ein signifikantes Wachstum des Knorpelteils, aber eine Verzögerung des Wachstums des mineralisierten, und es ist wichtig, dieses Ergebnis bei der Wahl der Anwendung der Technik zu berücksichtigen. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Kichererhemmen beobachtet, die für bis zu 10 Tage kultiviert wurden und eine vergrößerte Epiphydichtungsregion und einen reduzierten Diaphydid-Knochenkragen 14 aufweisen, sowie in der Maus Tibia, die für 6Tage 18kultiviertwurde. Außerdem ist zu erwähnen, dass im Knorpelbereich auch das Wachstum nicht homogen ist: Die sperrige distale Region des Oberschenkel-und der näheren Region der Tibia erhalten durch einfache Diffusion keine Nährstoffe effizient und können nicht richtig wachsen. In diesem Zusammenhang sollten sich die Studien auf die entgegengesetzten Anbauplatten konzentrieren, die schätzungsweisezueinem Drittel des Gesamtwachstums 27 beitragen, ähnlich dem beobachteten Wachstum der Kultur. Die Verzögerung des Wachstums der kultivierten Knochen wurde auch für Metatarsal-Kulturen15beschrieben.
Eine wichtige Überlegung dieser Art von Kultur ist das Fehlen des Wachstums des verknöcherten Teils des Knochens. Es ist bekannt, dass die Osteoblasten zusammen mit den Blutgefäßen 3,4 in die Knorpelmatrix aus dem Periosteum eindringen und dieser Prozess offensichtlich gestört wird, wenn Knochen isoliert werden. Dies könnte das Fehlen von Verknöchern unter kulturellen Bedingungen erklären. Die hypertrophe Chondrozyten-Transdifferenzierung wurde auch als wichtige Quelle der Osteoblasten 7,8,9gezeigt, aber ob dieser Prozess auch zum Teil das Vorhandensein von Blutgefäßen erfordert, wie es während der Bruchheilung30, oder ein anderes Gewebe, das nicht in Ex-vivo-Kulturen vorhanden ist, muss weiter untersucht werden. Darüber hinaus wird die Bedeutung der mechanischen Belastung bei der Gestaltung des Knochenwachstums31,32gut beschrieben, die lange Knochen und metatarsale Knochen unterschiedlich beeinflusst, aber in einem ex vivo kultivierenden Setup fehlt. Dennoch eignet sich die beschriebene Kultivierungsmethode zur Messung der Chondrozyten-Dynamik und Veränderungen des Längswachstums und kann somit für bestimmte Anwendungen eingesetzt werden.
Insgesamt bietet das beschriebene Protokoll eine einfache und kostengünstige Methode für die Kultur langen Knochen ab verschiedenen Stadien, die mit zusätzlichen Techniken gekoppelt werden können, um Schlüssel von zellulären und molekularen Mechanismen , wie Live-Zeitraffer-Bildgebung 13 , 23 oder medikamentöse Behandlung.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir möchten Alexandra Joyner für ihre Unterstützung bei der Einführung dieses Protokolls danken, Edwina McGlinn und Yi-cheng Chang für den Austausch von Retinosäure. Das australische Regenerative Medizininstitut wird mit Zuschüssen der Regierung von Victoria und der australischen Regierung unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K.
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