Summary
Burada, hem fetal hem de yenidoğan aşamalarında uzun duvar kemiklerinin ex vivo kültürü için bir yöntem sunuyoruz, kontrollü koşullarda kemik ve kıkırdak gelişimini ve homeostazisini analiz etmek için uygun ve in vivo sürecini yeniden özetlemekteyiz.
Abstract
Uzun kemikler karmaşık ve dinamik yapıları, bir kıkırdak ara yoluyla endokondral ossifikasyon ortaya çıkar. Sağlıklı insan kemiklerine sınırlı erişim, özellikle kemik büyümesi ve homeostasis farklı yönlerini bakmak için, fare ve sıçan gibi memeliler modellerinin kullanımı değerli hale getirir. Ayrıca, fareler içinde sofistike genetik araçların geliştirilmesi uzun kemik büyümesi daha karmaşık çalışmalar sağlar ve kemik büyümesini incelemek için kullanılan tekniklerin bir genişleme ister. Burada, ex vivo murine kemik kültürü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz, bu da kemik ve kıkırdak araştırmasına sıkı kontrollü bir şekilde izin verirken, in vivo sürecinin çoğunu yeniden özetleyin. Tarif edilen yöntem, Tibia, femur ve Metatarsal kemikler de dahil olmak üzere bir dizi kemik kültürünü sağlar, ancak burada esas olarak tibial kültüre odaklanıyoruz. Dahası, zaman aşımı canlı görüntüleme veya ilaç tedavisi gibi diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir.
Introduction
Organ büyümesi, büyüme bozukluklarının görünümünü önlemek için sıkı bir şekilde ayarlanmalıdır ve vücudun farklı bölgelerinde birden fazla hücre tipi, moleküler yol ve Crosstalk düzenlenmesi içerir. Görüntüleme teknikleri, zaman içinde büyüyen bir embriyo içinde meydana gelen değişiklikleri ele almak için esastır, hem normal koşullarda, hem de bir pertürasyon sonra sistemde indüklenir. Yaygın olarak kullanılan kemirgen modelleri gibi intrauterin gelişimi ile embriyolar, ex vivo kültür tekniklerini kullanarak kısmen üstesinden gelebilmek için canlı görüntüleme ve ilaç tedavisi için ek bir zorluk sunar. İn vivo süreçlerin başarıyla reapitasyon ve anlamlı sonuçlar elde etmek için, her organ veya doku için doğru kültür koşullarını bulmak için çok önemli olur.
Memelinin iskelet çoğu kemikleri endokondral ossifikasyon ile büyür, burada embriyonik kıkırdak (kondrositler denilen hücrelerden oluşan) uzunlamasına büyüme sürücü ve kademeli olarak kemik değiştirilir. Bu süreç, üç bölge ayırt edilebilir uzun kemikler, sonunda bulunan büyüme plakaları, olur: dinlenme, proliferatif ve hipertrofik1,2. İlk olarak, dinlenme bölgesinde yuvarlak progenitör kondositler proliferatif bölgede bisiklet sütunlu kondositler içine geçiş. Farklılaşma bir sonraki aşamasında, bu kondrositler hipertrofik haline gelir ve tip X kollajen salgıcı başlar. Hipertrofik kondrositler ossifikasyon sonraki adımlarını düzenler: Bunlar bağlantı dokusu büyüme faktörü, kemik morfogenetik proteinler ve Hint kirpi gibi anahtar sinyalizasyon moleküllerini salgılaştırır ve matrisin mineralizasyonu doğrudan, işe kemiğin orta kısmına kan damarlarının, ve, apoptozis üzerine, osteoblastlar izin (kemik şekillendirme hücreleri) Primer ossifikasyon merkezi oluşturmak için matris istila etmek3,4. Mineralize matris, Osteoblastların bir kemik matrisiyle bu bozulmuş kıkırdak yerine göç ettiği kan damarlarının nüfuz etmesini kolaylaştırır5. Çoğu osteoblastlar perikhondrium kıkırdak matris istila, kıkırdak sarar fibröz bir tabaka6. Alternatif olarak, hipertrofik kondrositlerin bir oranı, osteoblastlar7,8,9' a karşı hayatta kalabilecektir. Kemiğin son uzunluğu, büyüme oranı hipertrofik kondrositlerin sayısına ve boyutuna ve matris üretimini10' a bağlı olan geçici kıkırdak birikiminin kaynaklanmaktadır. Ayrıca, son hipertrofisi aşamasının süresinin, kemik11' in son uzunluğu ile ilişkili olduğu son zamanlarda gösterildi. Bu nedenle, uygun kemik boyutunu sağlamak için bu hücrelerin proliferasyonu ve farklılaşma sıkı düzenleme gereklidir.
Büyüme plakalarının örgütlenmesi ve geliştirilmesi konusunda yıl içinde elde edilen önemli bilgiye rağmen, bu sonuçların çoğu sabit histolojik bölümlerin gözlemlenmesi üzerine kuruludur. Doku bölümleme bu süreç hakkında değerli bilgiler sağlar, ancak teknik eserler ile basılabilir, bu nedenle her zaman güvenilir farklı aşamaları arasında morfolojik veya boyutu değişiklikleri tahmin etmek için kullanılamaz. Ayrıca, kemik büyümesi dinamik bir süreçtir, statik iki boyutlu (2D) görüntüler büyüme plakasında hücrelerin hareketi içine sınırlı bir anlayış sunar, canlı doku zaman atlamalı görüntüleme davranışı hakkında değerli bilgiler sunabilir iken kondrocytes büyüme plakası.
Tüm bu sınırlamalar ex vivo kemik kültürlerini kullanarak potansiyel olarak çözülebilir. Kemik kültürü protokolleri bir süre önce geliştirilirken, duvar uzun kemiklere sınırsız olarak uygulanmıştır. Çalışmaların çoğu Chick modeli12,13tarafından sunulan teknik avantajları nedeniyle civciv kemikleri kullanın. Organotypic kültürler (hava/sıvı arayüz), 10 gün14için kültürde tutulan Chick embriyonik femurs, uygulandı. Mouse 'ta bulunan sofistike genetik araçlar bu modeli ex vivo kemik kültüründe kullanılmak üzere çok cazip hale getirmek. Fareler kemik büyümesi bakmak için kullanılan çalışmalar Metatarsal kemikler ile çoğunlukla çalıştı15, muhtemelen küçük boyutu ve daha büyük sayılar embriyo başına elde nedeniyle16. Geleneksel olarak uzun kemikler olarak kabul rağmen, metatarsi (azalan proliferasyon ve büyüme plakası17) daha önce diğer uzun kemikler içinde vivo ile karakterize ve bu nedenle sürekli büyüme ex vivo değil, yaşlanma girin Gerçekten in vivo süreci özetlemek. Bu makalenin amaçları için, proksimal ve ara ekstremite bölgelerden kemikler için uzun kemikler terimi kullanacağız. Birkaç önceki çalışmalar, Tibia gibi uzun murine kemikleri, ex vivo kültürlerde kullanılan ve kıkırdak ama küçük ossifikasyon önemli bir büyüme gözlenen18. Ayrıca son zamanlarda, özellikle kondrosit dinamikleri19çalışma tibial kültürler kullanılır. Diğer çalışmalar genç fareler20 ya da sadece kültür21için femur distal kısmı femoral kafaları kullandı. Bazı daha yeni eserler başarıyla üç boyutlu (3D) kondrocytes filmleri canlı fare dokusu22,23elde etmek için zaman atlamalı görüntüleme ile tam kemik ex vivo kültürü birleştirir. Yazarlar, kemik ex vivo kültürünün potansiyel uygulama iyi bir örnek proliferatif bölge23 kondrositlerin yeniden düzenlenmesi daha önce fark edilmemiş olayları gözlemlemek başardı. Alternatif, yani, statik görüntüleri analiz, dolaylı ve karmaşık teknikler gerektirir. Bu kıkırdak büyüme için transversally odaklı klonlar önemini değerlendirmek son bir çalışma tarafından örneklenmiştir, matematiksel modelleme ile birleştiğinde çok renkli muhabir fare suşları ile genetik izleme kullanıldı24. Bu nedenle, ex vivo kültür daha hızlı ve daha basit bir şekilde dinamik süreçlere anlayış elde etmenize yardımcı olabilir.
Burada, farklı moleküler tedaviler ve/veya zaman aşımı canlı görüntüleme ile kombine edilebilir murine uzun kemikler kültürü için bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol15,18,25önceki raporlarda kullanılan yöntemleri uyarlar, ancak bazı ek sorunları giderir ve uzun kemikler gibi Tibia, Metatarsal kemikler yerine odaklanır. Son olarak, farklı maddelerin varlığını ayrı olarak sol ve sağ kemikler kültür tarafından istatistiksel olarak güçlü eşleştirilmiş karşılaştırmalar kullanma potansiyelini araştırıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Laboratuvar hayvanlarının etik olarak işlenmesi için yerel hükümet ve kurumsal yönergelerin ardından yapılmalıdır.
1. kemik kültürü gününden önce preparatlar
- Embriyonik gün 14,5 (E 14.5) ve daha sonra fetus ve pups elde etmek için zamanlanmış fare matings ayarlayın.
Not: Uzun kemikler kültürü farklı fare suşları için başarıyla uygulanabilir; Mevcut protokolde, Isviçre Webster vahşi tip fareler dışarı kullanılır. - Diseksiyon ortamını hazırlayın (Houston ve al.15' ten uyarlanmıştır): seyreltmeli α-asgari esansiyel Orta (α-mem) veya Dulbecco 'Nun modifiye kartal Orta (dmem) 1/13 fosfat-tamponlu tuz (PBS) ve 2 mg/ml Sığır serum albümin (BSA) ve filtre sterilize 0,22 μm, 33 mm çapında şırınga filtresi ile. Alquots-20 °C ' de saklayın.
- Fetüsleri çıkarmadan önceki gün, 0,2% BSA, 0,5 mM L-glutamin, 40 U/mL penisilin/streptomisin, 0,05 mg/mL askorbik asit ve 1 mM betaglycerophosphate içeren DMEM 'den oluşan serum içermeyen kemik kültürü ortamını hazırlayın. 0,22 μm, 33 mm çapında şırınga filtresi ve 1 aya kadar 4 °C ' de muhafaza edilen filtre sterilize edilir.
- Kültür günü ve fare dağılmadan önce, 24-kuyu plakaları hazırlamak ve 60 mm yemek diseksiyon orta ve onları buz soğuk tutmak. 37 °C ' lik su banyosunda kemik kültürü ortamını ısıtın. Sprey 80% (v/v) etanol (cımbız ve küçük makas), fetus işleme için kullanılacak araçlar üzerinde. Bir sınıf II Biyogüvenlik kabinine dürbün kapsamını aktarın.
2. fetus ve yenidoğan Tibia ve femur kültürü
- İstenen Gestasyonel aşamada servikal çıkığı ile hamile fare Cull (e 14.5 den e 18.5 kadar). Eğer yenidoğan yavruları kullanılırsa, onları annenden tek tek çıkarın ve deptitasyon ile itlaf.
- Fareyi arkasına yerleştirin ve yüzeyinde% 80 (v/v) etanol püskürterek abdominal bölgeyi sterilize edin.
- Uterin boynuzları erişmek için küçük makas ile cilt ve karın kası kes.
- Rahim, cımbız ve küçük makas yardımıyla Karın boşluğundan ayıklayın, mezometriumu kaldırarak ve boynuzların tabanı kesme. Rahim bir 60 mm Petri çanak buz-soğuk diseksiyon orta ile yerleştirin ve tüm prosedür sırasında buz üzerinde kültür çanak tutmak.
- Biyolojik güvenlik kabinine rahim ile Petri tabağı aktarın ve şu andan itibaren orada çalışın.
- Saclar arasında kesim yaparak bireysel fetüsleri makas ile ayırın.
- Diseksiyon orta ile temiz bir 60 mm çanak bir diseksiyon mikroskoptan altında bireysel sac transfer ve plasentas fetüsleri ayırmak ve membranlar onları temizlemek için cımbız ile açın.
Not: Geri kalanı buzda tutarken, bir defada bir embriyo ile çalışın. - Fetüsleri kesip temizleyin ve vücudu 1 mL kesilmiş steril pipet ile temiz yeni 60 mm tabak ile aktarın.
- Geri başlayarak cımbız ile fetüslerin veya pups cilt çıkarın ve ayak parmakları kadar soyulmuş.
- Omurgaya yakın cımbız ile kesme ve buz-soğuk diseksiyon orta ile temiz bir çanak onları aktarmak bedeninden hindekstremite ayırın.
- Distal femur ve proksimal tibia yüzey kıkırdağı arasında dikkatle tanıtmak tarafından cımbız ile femur gelen Tibia ayırın.
- Proksimal femur ve kalkaneus kemik ve Tibia gelen fibula kalça kemikleri çıkarın.
- Dikkatlice femur ve Tibia dan kıstırma ve çekerek yumuşak doku çıkarın.
Not: Mümkün olduğunca çok yumuşak doku kaldırmak için önemlidir, iki kıkırdak direkleri bağlayan doku kaldırma özel bakım alarak, ama kıkırdak zarar kaçınarak, perichondrium, ve kemikler. - Plastik 1 ml steril pipet ile 24 kuyu plakasının ilk kuyusu içinde dört kemiği (sol ve sağ kaval ve femurs) yerleştirin. Alternatif olarak, sol ve sağ ekstremitelerde farklı tedavilerin etkisini karşılaştırmak için, farklı kuyularda kontralateral ekstremite yerleştirin.
Not: Kemikleri kuyulara aktarıldığında ekstra bakım alınmalıdır, böylece pipet kolayca yapışabilir. - Gerektiğinde birçok Fetüslerle aynı şekilde devam edin.
Not: Açıkça disseke kemikler görmek önemli olduğu gibi, çok bulutlu alır en kısa sürede diseksiyon orta ile çanak değiştirin. -
İstenilen tüm kemikler kuyulara aktarıldığında, diseksiyon ortamını plastik 1 ml steril pipet ile çıkarın ve kemikleri Aspire değil, ekstra özen yapın.
- Deneme amacına bağlı olarak, denemenin timepoint sıfır olarak diseksiyon orta çıkarmadan önce resimler kemikler alınabilir. Dijital kameraya bağlı bir mikroskop ile fotoğraf çekin ve kullanılan pozlama ve ölçek ek açıklama ekleyin. Kolay ve güvenilir ölçümler sağlamak için, mineralize parçayı ayırt etmek için iyi kontrast içeren resimler çekin.
- Her iyi kültür orta 1 mL ekleyin. Herhangi bir tedavi kemikler (Doksisiklin, tamoksifen, büyüme faktörleri, vb) üzerinde tasarlanmıştır, şimdi eklenmesi gerekir.
- Kültür koşullarında büyüme inhibisyonu etkisini gözlemlemek için, retinoik asit (ra, 500 Nm) ile sol kaval tedavi, araç eşdeğer bir hacim ile doğru tifite inkükleme sırasında (dimetil sülfoxid [DMSO], nihai konsantrasyon 0,1%) bir kontrol olarak.
- Standart hücre kültürü koşullarında (37 °C ' de% 5 CO2 kuluçta) bir hücre kültürü kuluçta iki gün veya daha fazla büyümek için kemikleri bırakın.
- Proliferasyon değerlendirmek için, 5-etynyl-2'-deoxyuridine (EdU) veya 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) orta 10 μM 1 − 2 h son konsantrasyonda, fiktasyon önce ekleyin.
Not: EdU 'nın stok konsantrasyonu 20 mM 'dir.
Dikkat: EdU ve BrdU, timidin analogları ve toksik ve mutajisik olabilir. - Çözülme 4% paraformaldehit (PFA) ve bireysel 2 mL tüplerde PFA daldırma tarafından kemikleri düzeltin.
Dikkat: PFA toksik ve olası bir insan kanserojen olarak belirlenir. Civarında formaldehite tozu ve buharları nefes kaçının. EdU ve BrdU, timidin analogları ve toksik ve mutajisik olabilir. - Oda sıcaklığında PFA 'da kısa bir 10 dk sabitleme sonrasında, son zaman noktasında resim edinme için kemikleri PBS 'ye aktarın. Sonra 4 °C ' de gece sabitleme için kemikleri PFA 'ya geri yerleştirin.
- Sabitleme kemikleri istenen akış uygulamaları için işlenebilir sonra.
3. kemik ve mineralize bölgenin tam uzunluğunun ölçülmesi ve Analizi
- Görüntünün ölçeğini dikkate alarak, kemiklerin uzunluğunu ölçmek için bir görüntü düzenleme yazılımı kullanın. Kemik ve mineralize bölgenin toplam uzunluğunu ölçün. İlk karanlık hücrelerdeki ölçümleri, diğer ucunda son olanlar kadar bir ucunda başlatın.
Not: Mineralize bölge koyu renk ile karakterize ve kolayca kıkırdak ayırt edilir. - Büyüme hızını hesaplamak için, günlük uzunluğu ortalama artış olarak tanımlanan, kemik son uzunluğu ve ilk bir kültür gün sayısı arasındaki farkı bölmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kemik kültürü farklı aşamalardan başlayarak yapılabilir. Şekil 1a-D, kültürlü Tibia ve eşdeğer aşamalarında taze çıkarılan olanlar arasında bir karşılaştırma gösterilir. İlk gözlem, elde edilen iki günlük kültürün, hem kıkırdak hem de mineralize kemik (Şekil 1a, B, D) için in vivo kemik büyümesi ile karşılaştırılabilir olması. Daha uzun kültür dönemleri, kültürlü kemikler ile taze çıkarılan (Şekil 1C) arasında daha büyük farklılıklara yol açar. Ayrıca, protokolde belirtildiği gibi, kemiklerin her iki ucunda bağlanan yumuşak doku kaldırmak için çok önemlidir, aksi halde kemikler bükecek. Şekil 1E bir Tibia yumuşak doku olmadan bir Tibia karşı yumuşak doku tamamlanmamış kaldırılması ile yetiştirilen bir örnek gösterir.
Sonra, kaval 2 gün boyunca kültürlü ve uzunluğu ölçülmüştür. Şekil 2a, B'de görüldüğü gibi, Toplam uzunluk ve mineralize parçanın ölçümü bir görüntü analiz yazılımı ile gerçekleştirilebilir. De Luca ve al.26' da görüldüğü gıbı, Ra ile tedavi 2 gün tedavi yaptıktan sonra tisapın büyümesi üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir ve kültürimizde benzer bir sonuç gözlenmiştir (Şekil 2B-D). Daha da önemlisi, deney, eşikli kemikler kullanılarak, sağ kemikle kontrol ve sol RA ile tedavi edilen (Şekil 2a, B, E), farklı numuneler arasındaki kemik boyutunda doğal değişkenlik üstesinden gelmenize yardımcı olur. Böylece, açıklanan kültür yöntemi kemik büyümesi üzerinde farklı bileşiklerin etkisini değerlendirmek için uygundur.
Ardından, kültürden sonra kemiklerin büyüme oranı değerlendirildi. Kemikler çıkarılan, ölçülen ve E 15.5, 16,5 veya P1 kültür, ve sabit ve iki gün sonra tekrar ölçülür. Hem uzunluklu toplam artış hem de mineralize parçanın uzunluğu ölçülmüştür (Şekil 3c). Kültür öncesi E 15.5 Tibia ve femur (Şekil 3A) ve denemenin son noktasında (Şekil 3B) bir örnek gösterilir. Grafik ve tablodan görülebilir (Şekil 3c, D), Tibia toplam uzunluğu tutarlı bir artış vardır, yaklaşık bir artışa karşılık gelen 9 − 29% ilk uzunluğundan. Bu, içinde gözlenen bir daha az artıştır vivo; Ana fark, distal daha büyük ve besin için daha az erişilebilir proksimal kıkırdak düzeyi nedeniyle muhtemeldir. Gerçekten de, EdU etiketleme bu bölgede kültüre sonra eşdeğer aşama (Şekil 4A, C) taze çıkarılan kemikler ile karşılaştırıldığında daha az pozitif hücreler gösterdi. Distal tibia EdU birleşme kültürlü ve taze çıkarılan kemikler benzer (Şekil 4b, D) distal kıkırdak bu aşamada27Tibia toplam büyüme yaklaşık üçte biri katkı, kültürde gözlenen büyüme oranı ile karşılaştırılabilir, bu yüzden analiz kemik bu kısmına odaklanmış olmalıdır öneriyoruz. Ayrıca, kültürlü kemikleri mineralizasyonu değerlendirdik ve bu bölgenin uzunluğundaki neredeyse hiçbir artış gözlemlemiyoruz. Fark, ex vivo kültüründe damar ve Osteoblastların istilası olmaması nedeniyle olabilir. Bu, kıkırdak büyüme çalışmaları birkaç gün boyunca uzatabilirsiniz göstermektedir, Eğer ilgi bölgesi kemiğin kemikleşmiş parçası ise, kültür dönemi daha kısa olmalıdır. Bu gözlem, daha uzun bir süre (6 güne kadar) kültürde Tibia tutarak doğrulandı. Şekil 5' te görüldüğü gibi, iskelet elemanının toplam uzunluğu önemli ölçüde artar, mineralize bölgede neredeyse hiçbir artış gözlemlenirken (Şekil 5c).
Genel olarak, bu sonuçlar uzun kemikler kültürünün genel kemik büyümesi ve özellikle kıkırdak dinamikleri değerlendirmek için farklı faktörlerin etkisini analiz etmek için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir. İyi kurulan metatarsal kültürler de bu amaçlar ile kullanılabilir iken, biz kültürlerin her iki tür birbirleriyle tamamlayan, metatarars ve uzun kemikler geri kalanı arasındaki içsel farklar verilen sunuyoruz.
Şekil 1: farklı zaman dilimleri için kültür Tibia örneği. (A-D) Yeni çıkarılan Tibia (üst) ve Tibia E 14.5 (alt) ve 2 gün (A), e 15.5 olarak çıkarılan ve 2 gün (B), e 16.5 ' de ayıklanan ve 4 gün (C) için kültürlü olarak çıkarılan ve yeni çıkarılan postnatal gün 2 (P2) ve postnatal gün 1 (P1) elde ve 1 gün (D) için kültürlü. Farklı kültür dönemlerinde kıkırdak büyümesi oldukça fizyolojik olarak kalırken, kemikleşmiş kısım, ilgili aşamada taze çıkarılan kemiğe kıyasla 2 günden uzun bir süre sonra bir büyüme gecikmesi gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm. (e) Tibia kültür 2 gün E 15.5 başlayarak; kemikleri iki uçları arasında yumuşak doku eksik kaldırılması kemik bükme neden olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu = 600 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2: retinoik asit (ra) tedavisi üzerine kemiklerin uzunluğunun ölçülmesi. (A-B) E 15,5 ' de çıkarılan tibias,% 0,1 DMSO (A) ve Ra (B) ile 2 gün boyunca büyüdü. Hem toplam uzunlukta hem de mineralize parçanın farkını unutmayın. Ölçek çubuğu = 1 mm. (c-D) Toplam Uzunluk (c) veya Tibia 'nin mineralize kısmı (D) kontrol durumu ve Ra varlığında 6 gün boyunca bir süre içinde değişir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma (SD) olarak gösterilir; Karşılaştırma, değişken olarak tedavi türü ile iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ile yapılır (p değerleri grafikte gösterilir). (E) ıkı DMSO (sağ Tibia) veya RA (sol Tibia) ile 2 gün için kültürlü eşleştirilmiş kemik uzunluğu karşılaştırması; Her nokta, koşul başına 3 biyolojik çoğaltır birini temsil eder. Eşleştirilmiş iki kuyruklu öğrencinin t-testi kullanıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3:48 saat sonra ex vivo kültüründen sonra Tibia 'nin toplam büyüme ve mineralizasyon karşılaştırması. (A) e 15.5 kaval ve uyluk sol (üst) ve sağ (alt) ekstremite önce kültür. (B) aynı kaval ve uyluk 2 günlük kültürden sonra takip. Ölçek çubuğu = 600 μm. (C) grafik farklı gelişimsel aşamalarında kültürlü kaval büyüme oranını temsil eden. Mineralize parçanın toplam büyümesi ve büyümesi değerlendirildi. (D) tüm kemiğin ilk ve son uzunluğunu ve mineralize kısmı e 15,5 ' de ve 2 gün sonra kültürden sonra ortaya çıkmadan önce gösteren tablo. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: Hantal büyüme plakaları kültürde çok proliferasyon göstermez. (A-B) E 15,5 ' den 2 gün boyunca gelişen proksimal (A) ve distal (B) tibial büyüme plakaları için edu boyama. (C-D) E 17.5 'de yeni çıkarılan proksimal (C) ve distal (D) tibial büyüme plakaları için edu boyama. Proksimal tibia EdU (+) hücrelerinin sayısının farkını unutmayın. Veriler arasında 6 uzuvların kültürlü çiftleri ve 3 taze ayıklanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: Tibia kültürünün uzun dönemleri önemli kıkırdak büyüme ama küçük mineralizasyon gösterir. Yeni çıkarılan Tibia E 15.5 (t = 0) (A) ve 6 gün sonra kültür (B). Kıkırdak büyüme ve mineralize parçanın büyümesi arasındaki farklılıkları unutmayın. Ölçek çubuğu = 1 mm (C) toplam uzunluğu ve mineralize bölgedeki değişiklikleri 6 gün boyunca gösteren grafik. n = 5 kültürlü tibias; Her zaman noktasında SD aşağıdaki gibidir: t = 0, tam uzunlukta = 0,0777, mineralize = 0,0213; t = 3 d, tam uzunlukta = 0,1495, mineralize = 0,056; t = 6 d, tam uzunlukta = 0,1193, mineralize = 0,0521. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kemik ex vivo kültür yöntemleri, kemik büyümesi28biyolojisi değerlendirmek için bir süre kullanılmıştır, ancak nadiren murine uzun kemikler uygulanmıştır. Görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi ile ex vivo kemik kültürü, in vivo koşullarına yakından benzeyen bir ortamda kemik büyümesini gerçek zamanlı olarak incelemek için cazip bir yol sunar. Bu senaryoda, uzun kemiklerin büyümesini in vivo kendi büyüme karşılaştırılabilir koşulları tanımlamak önemlidir.
Bu çalışmada, uzun kemik kültürü için, sınırlamalar ve olası uygulamaları ele alan basit ve uygun fiyatlı bir protokol açıklanmaktadır. Bu yöntemin en kritik adımı, kemiklerin izolasyonudur, bu da sağlam kalması ve kemik uçları arasında mümkün olduğunca az yumuşak doku ile birlikte kalmalıdır. Kemiklerin uçları arasında yumuşak doku bırakarak kemiğin normal büyümesini önleyecek ve Şekil 1E'de örneklenmiş olarak bükülmeye neden olur. Kemiklerin ucunda yumuşak doku sol olabilir, sonunda yok olacak gibi. Ekstra bakım gerektiren bir başka adım da kolayca plastik pipet sopa gibi, kültür plaka kemiklerin transferdir. Olası bir çözüm, kemiklerin pipet yapışmasını önlemeye yardımcı olan bir kaplama oluşturduğu için, kan ve doku parçalarını içeren diseksiyon orta ve yukarı pipetleme yapıyor.
Bir kez ayıklandığında, kemikler kadar 48 h için kültürüne karşılık gelen in vivo aşamaya karşılaştırılabilir boyuta ulaşmak. kemik uzunluğunu ölçmenin dışında, büyüme hızı (günde ortalama uzunluk artışı) bu koşullarda kolayca tahmin edilebilir. Ancak, büyüme oranı hesaplaması için bu yaklaşım daha uzun kültür dönemleri üzerinde geçerli değildir, burada29etiketleme kalcein gibi diğer yöntemlerin kullanılmalıdır. Erken kondrosit farklılaşma teşvik retinoik asit ile tedavi, kemik büyüme önemli bir azalma yol açar, bu kültür için bu sefer farklı maddelerin kemik üzerinde olabilir etkisini gözlemlemek için yeterli olduğunu düşündürmektedir Büyüme. Önemlisi, karşılaştırma de aynı örnekten eşleştirilmiş kemikler üzerinde yapıldı, böylece sol Tibia RA tedavi aldı ve sağ kontrol oldu. İstatistiksel olarak daha güçlü olan eşleştirilmiş karşılaştırmalar gerçekleştirme sağlar gibi bu kemik kültürü modelinin bir avantajdır.
Uzun süre kültürleme kıkırdak parçası önemli büyüme gösterir, ama mineralize bir büyüme bir gecikme, ve bu sonucu teknik uygulama seçerken dikkate almak önemlidir. Benzer sonuçlar Chick uyluk kadar için kültürlü gözlenen 10 genişlemiş epifizyal bölgesi ve azaltılmış terleme kemik yaka14göstermek gün, yanı sıra fare Tibia olarak kültür 6 gün18. Ayrıca, kıkırdak bölgesinde büyüme de homojen değildir: femur ve proksimal bölgenin hantal distal bölge basit difüzyon tarafından verimli bir şekilde besin almaz ve düzgün büyüyemez söz önemlidir. Bu bağlamda çalışmalar, kültürdeki gözlenen büyümeye benzer, toplam büyüme27' nin üçte birine katkıda bulunmak üzere tahmin edilen zıt büyüyen plakalara odaklanmalıdır. Kültürlü kemiklerin büyümesinde gecikme metatarsal kültürler için de tanımlanmıştır15.
Bu tür kültürün önemli bir önemi, kemiğin kemikleşmiş kısmının büyümesini yokluğudur. Osteoblastların periost 'dan kan damarlarının3,4 ile birlikte kıkırdak matrisini işgal ettiğini ve kemik izole edildiğinde bu sürecin kesin olarak bozulduğunda iyi kurulmuştur. Bu kültür koşullarında ossifikasyon yokluğunda açıklayabilir. Hipertrofik kondrosit transfarklılaşma da önemli bir osteoblastlar kaynağı olarak gösterildi7,8,9, ama bu sürecin de kısmen kan damarlarının varlığını gerektirir olsun, sırasında gibi görünüyor kırılma şifa30, ya da diğer bazı dokular ex vivo kültürlerde mevcut değil, daha fazla soruşturma gerekiyor. Ayrıca, kemik büyümesi31,32, uzun kemikler ve metatarsal kemikleri farklı etkiler, ancak bir ex vivo kültür kurulumunda yoktur şekillendirme mekanik yük önemini nitelendirdi. Bununla birlikte, açıklanan kültür yöntemi kondrosit dinamiklerini ve uzunlamasına büyümede değişiklikleri ölçmek için uygundur ve böylece belirli uygulamalarda kullanılabilir.
Genel olarak, açıklanan protokol, canlı zaman atlamalı görüntüleme13 gibi anahtar hücresel ve moleküler mekanizmaları, adres ek teknikler ile birleşebilir farklı aşamalardan başlayarak Kültür uzun kemikler için basit ve ucuz bir yöntem sağlar , 23 veya uyuşturucu tedavisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz bu protokol kuruldu onun desteği için Alexandra Joyner teşekkür etmek istiyorum, Edwina McGlinn ve yi-Cheng Chang retinoik asit paylaşımı için. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria devlet hükümeti ve Avustralya hükümeti hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine | Santa Cruz | CAS 61135-33-9 | |
| 5-Bromo-2′-deoxyuridine | Sigma | B5002 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| 60 mm TC-treated Center Well Organ Culture Dish, 20/Pack, 500/Case, Sterile | Falcon | 353037 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | CS4 | |
| Ascorbic acid | Sigma | A92902 | |
| Base unit for the scope | Zeiss | 435425-9100-000 | |
| Betaglycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| Binocular scope | Zeiss | STEMI-2000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) fraction v | Roche/Sigma | 10735086001 | |
| DigiRetina 500 camera | Aunet | ||
| Dissection kit | Cumper Robbins | PFS00034 | |
| DMEM | Gibco | 11960044 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Eppendorf 2 mL tubes | Eppendorf | 0030120094 | |
| Ethanol 96% | Merk | 159010 | |
| Forceps Dumont#5 Inox08 | Fine Science Tools | T05811 | |
| Heracell 150 CO2 incubator | Thermo Fisher | 51026282 | |
| Minimum Essential Medium Eagle | Sigma | M2279 | |
| Multiwell 24 well | Falcon | 353047 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Plastic pipettes 1 mL Sterile Individually wrapped | Thermo | 273 | |
| Syringe filter 0.2 um | Life Sciences | PN4612 | |
| Terumo syringe 20 mL | Terumo | DVR-5174 | |
| Tretinoin (retinoic acid) | Sigma | PHR1187-3X | |
| Trinocular scope | Aunet | AZS400T |
References
- Long, F., Ornitz, D. M.
- Mackie, E. J., Ahmed, Y. A., Tatarczuch, L., Chen, K. S., Mirams, M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 40 (1), 46-62 (2008).
- Goldring, M. B., Tsuchimochi, K., Ijiri, K.
- Kronenberg, H. M.
- Mackie, E. J., Tatarczuch, L., Mirams, M. The skeleton: a multi-functional complex organ: the growth plate chondrocyte and endochondral ossification. The Journal of Endocrinology. 211 (2), 109-121 (2011).
- Maes, C., et al. Osteoblast precursors, but not mature osteoblasts, move into developing and fractured bones along with invading blood vessels. Developmental Cell. 19 (2), 329-344 (2010).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biology Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Zhou, X., et al. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genetics. 10 (12), e1004820 (2014).
- Wilsman, N. J., Bernardini, E. S., Leiferman, E., Noonan, K., Farnum, C. E. Age and pattern of the onset of differential growth among growth plates in rats. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 26 (11), 1457-1465 (2008).
- Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495 (7441), 375-378 (2013).
- Smith, E. L., Rashidi, H., Kanczler, J. M., Shakesheff, K. M., Oreffo, R. O. The effects of 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D3 and transforming growth factor-beta3 on bone development in an ex vivo organotypic culture system of embryonic chick femora. PloS One. 10 (4), e0121653 (2015).
- Li, Y., Li, A., Junge, J., Bronner, M. Planar cell polarity signaling coordinates oriented cell division and cell rearrangement in clonally expanding growth plate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Kanczler, J. M., Smith, E. L., Roberts, C. A., Oreffo, R. O. A novel approach for studying the temporal modulation of embryonic skeletal development using organotypic bone cultures and microcomputed tomography. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (10), 747-760 (2012).
- Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
- Abubakar, A. A., Noordin, M. M., Azmi, T. I., Kaka, U., Loqman, M. Y. The use of rats and mice as animal models in ex vivo bone growth and development studies. Bone & Joint Research. 5 (12), 610-618 (2016).
- Lui, J. C., et al. Differential aging of growth plate cartilage underlies differences in bone length and thus helps determine skeletal proportions. PLoS Biology. 16 (7), e2005263 (2018).
- Agoston, H., et al. C-type natriuretic peptide regulates endochondral bone growth through p38 MAP kinase-dependent and -independent pathways. BMC Developmental Biology. 7, 18 (2007).
- Rosello-Diez, A., Madisen, L., Bastide, S., Zeng, H., Joyner, A. L. Cell-nonautonomous local and systemic responses to cell arrest enable long-bone catch-up growth in developing mice. PLoS Biology. 16 (6), e2005086 (2018).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEy Reports. 5, 818 (2016).
- Okubo, N., et al. Prolonged bioluminescence monitoring in mouse ex vivo bone culture revealed persistent circadian rhythms in articular cartilages and growth plates. PloS One. 8 (11), e78306 (2013).
- Hirota, K., et al. Live imaging analysis of the growth plate in a murine long bone explanted culture system. Scientific Reports. 8 (1), 10332 (2018).
- Romereim, S. M., Conoan, N. H., Chen, B., Dudley, A. T. A dynamic cell adhesion surface regulates tissue architecture in growth plate cartilage. Development (Cambridge, England). 141 (10), 2085-2095 (2014).
- Kaucka, M., et al. Oriented clonal cell dynamics enables accurate growth and shaping of vertebrate cartilage. eLife. 6, (2017).
- Alvarez, J., et al. TGFbeta2 mediates the effects of hedgehog on hypertrophic differentiation and PTHrP expression. Development (Cambridge, England). 129 (8), 1913-1924 (2002).
- De Luca, F., et al. Retinoic acid is a potent regulator of growth plate chondrogenesis. Endocrinology. 141 (1), 346-353 (2000).
- Stern, T., et al. Isometric Scaling in Developing Long Bones Is Achieved by an Optimal Epiphyseal Growth Balance. PLoS Biology. 13 (8), e1002212 (2015).
- Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined medium. Bone and Mineral. 12 (3), 141-155 (1991).
- Erben, R. G. Handbook of histology methods for bone and cartilage. , Springer. 99-117 (2003).
- Hu, D. P., et al. Cartilage to bone transformation during fracture healing is coordinated by the invading vasculature and induction of the core pluripotency genes. Development (Cambridge, England). 144 (2), 221-234 (2017).
- Fritton, S. P., McLeod, K. J., Rubin, C. T. Quantifying the strain history of bone: spatial uniformity and self-similarity of low-magnitude strains. Journal of Biomechanics. 33 (3), 317-325 (2000).
- Duncan, R. L., Turner, C. H. Mechanotransduction and the functional response of bone to mechanical strain. Calcified Tissue International. 57 (5), 344-358 (1995).
