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Immunology and Infection

सेल संस्कृति में और Drosophila मेलेनोगैस्टर में जस्ता ऑक्साइड नैनोकणों का विषाक्तता अध्ययन

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

हम विशेष रूप से जस्ता ऑक्साइड नैनोकणों (nO NPs) के विषाक्त प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, मानव एमआरसी 5 फेफड़ों के फाइब्रोब्लास्ट्स में सेल मौत के प्रकार और फल मक्खी Drosophilaमें ROS गठन .

Abstract

जिंक ऑक्साइड नैनोकणों (nO NPs) अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है, लेकिन nO एनपी संबद्ध विषाक्तता पर रिपोर्टों की संख्या हाल के वर्षों में तेजी से वृद्धि हुई है. हालांकि, अध्ययन है कि nO एनपी प्रेरित विषाक्तता के लिए अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट अल्प कर रहे हैं. हमने इन विट्रो और विवो प्रयोगात्मक मॉडलदोनों का उपयोग करके nO NPs की विषाक्तता प्रोफाइल निर्धारित किया है। सेल व्यवहार्यता में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई थी $nO एनपी उजागर MRC5 फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट्स, दिखा रहा है कि nO एन पी एस साइटोटॉक्सिक प्रभाव डालती है। इसी प्रकार, दिलचस्प बात यह है कि एन ओ एन पी के संपर्क में आने वाले आंत ने फल मक्खी ड्रोसोफिलामें प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के स्तर (आरओएस) में नाटकीय वृद्धि का प्रदर्शन किया। उपभोक्ताओं द्वारा एन ओ एन पी के बढ़ते उपयोग के लिए जोखिम मूल्यांकन स्थापित करने के लिए और अधिक गहन अध्ययन किए जाने की आवश्यकता है।

Introduction

नैनो प्रौद्योगिकी नैनोसाइज़्ड सामग्री के अनुप्रयोग को संदर्भित करता है जो सभी वैज्ञानिक क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है, जिसमें चिकित्सा, सामग्री विज्ञान, और जैव रसायन शामिल हैं। उदाहरण के लिए, एन ओ एन पी जो उनकी पराबैंगनी प्रकीर्णन, रासायनिक संवेदन, और एंटी-माइक्रोबायल गुणों, साथ ही उच्च विद्युत चालकता के लिए जाना जाता है, खाद्य पैकेजिंग, सौंदर्य प्रसाधन जैसे विभिन्न उपभोक्ता उत्पादों के उत्पादन में उपयोग किया जाता है, वस्त्र, रबर, बैटरी, ऑटोमोबाइल पूंछ गैस उपचार के लिए उत्प्रेरक, और जैव चिकित्सा से संबंधित अनुप्रयोगों1,2,3.

तथापि, एन ओ एनपी आधारित उत्पादों के बढ़ते अनुप्रयोगों, जिससे एन ओ एनपी के मानव जोखिम में वृद्धि हुई है, ने मानव स्वास्थ्य पर उनके संभावित प्रतिकूल प्रभावों पर चिंता व्यक्त की है। इन विट्रो सेलुलर अध्ययनों की एक संख्या का प्रदर्शन किया है कि nO एन पी ऑक्सीडेटिव तनाव, autophagy से संबंधित साइटोटॉक्सिसिटी, सूजन, और जीनोटॉक्सिसिटी4,5,6,7,8 प्रेरित कर सकते हैं . विशेष रूप से, nO NPs की विषाक्तता को $n के विघटन के कारण माना जाता है n 2+ आयनों को मुक्त करने के लिए, साथ ही nO की सतह प्रतिक्रिया, सेलुलर आयनिक और चयापचय असंतुलन है कि बिगड़ा आयनिक homeostasis और एक के साथ जुड़े हुए हैं में जिसके परिणामस्वरूप आयनपरिवहन4 ,7,9,10का निषेध . महत्वपूर्ण बात, अध्ययनों से पता चला है कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी (आरओएस) प्राथमिक तंत्र में से एक है जो कि एन ओ एन पी एस-संबद्ध विषाक्तता के अंतर्निहित है। ROS अपमान के बाद अपर्याप्त एंटी ऑक्सीडेटिव गतिविधि साइटोटॉक्सिसिटी और डीएनए क्षति9प्राप्त करने के लिए जिम्मेदार होना दिखाया गया है। एन ओ एन पी के जहरीले प्रभाव भी पशु मॉडलों में सूचित किए गए हैं , जिनमें कृंतक1, जेब्राफिश11,12, साथ ही अकशेरुकी ड्रोसोफिला13भी शामिल हैं .

Drosophila रासायनिक संस्थाओं और नैनो सामग्री (एनएम)14,15की विषाक्तता स्क्रीनिंग के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित वैकल्पिक पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि मानव और Drosophila के बीच आनुवंशिक और शारीरिक समानता के उच्च स्तर है कि इस तरह के एनएम के रूप में पर्यावरण contaminants के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक में विवो मॉडल के रूप में Drosophila के उपयोग को सही ठहराते हैं 16. इसके अलावा, इसके छोटे आकार, लघु आयु, आनुवंशिक अमेठी, और आसान और लागत प्रभावी रखरखाव के कारण ड्रोसोफिला का उपयोग करने के कई फायदे हैं। इसके अलावा, Drosophila व्यापक रूप से आनुवंशिकी, आणविक और विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अपनाया गया है, कभी के बाद से अपनी पूरी जीनोम पूरी तरह से साल पहले 2000 में अनुक्रम था, इसलिए यह उच्च throughput स्क्रीनिंग की एक किस्म के लिए उपयुक्त बनाने और अनसुलझे जैविक प्रश्नों से निपटने के लिए17,18,19,20,21. हाल के वर्षों में द्रौपदी में विभिन्न प्रकार के एनपी का उपयोग करके इम्यूनोटॉक्सिसिटी से संबंधित अनेक अध्ययनों की सूचना15,22,23,24में प्राप्त की गई है . Drosophila का उपयोग कर अध्ययन से प्राप्त इस मौलिक नए ज्ञान नैनोटॉक्सिलोजी की हमारी समझ में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद मिली है।

ROS साइटोटॉक्सिसिटी और जेनोटॉक्सिसिटी के लिए एक प्रसिद्ध अपराधी है जो एन पी एस, विशेष रूप से धातु आधारित एन पी एस25के कारण होता है। ROS आणविक ऑक्सीजन की तुलना में उच्च प्रतिक्रियाशील गुणों के साथ ऑक्सीजन युक्त रासायनिक प्रजातियों रहे हैं। मुक्त कण जैसे सुपरऑक्साइड आमूल-चूल (व्2-)तथा यहां तक कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड (ह2व्2) जैसे गैर-मूली अणु भी रॉस के रूप में कार्य कर सकते हैं। सामान्य शारीरिक स्थिति के तहत, वे सेलुलर homeostasis बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं26, हालांकि, अत्यधिक ROS अत्यधिक उत्पादन या एंटीऑक्सीडेंट रक्षा प्रणाली के dyregation के कारण ऑक्सीडेटिव तनाव पैदा कर सकता है, प्रोटीन को नुकसान करने के लिए अग्रणी, लिपिड और deoxyribonucleic एसिड (डीएनए)27| उदाहरण के लिए, के रूप में ROS स्तर में वृद्धि और glutathione (GSH) स्तर सहवर्ती रूप से कम हो जाती है, एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) संश्लेषण के विघटन जगह लेता है और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) स्तर मध्यम में बढ़ जाती है, सेल मौत27में समापन .

यहाँ, हम nO एन पी एस के संभावित प्रतिकूल प्रभाव निर्धारित करने के लिए सुसंस्कृत स्तनधारी कोशिकाओं और Drosophila का उपयोग कर सेलुलर और आनुवंशिक विश्लेषण प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. nO NPs के विषाक्तता अध्ययन के लिए प्रयुक्त विधि का अवलोकन चित्र 1 में दर्शायागया है।

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Protocol

1. फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटनी (FACS) लाइव पर विश्लेषण /

  1. 15 मिनट के लिए निलंबन में Sonicate nO एन पी एस.
  2. सुसंस्कृत कोशिकाओं के उपचार के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल जेडएनओ एनपी स्टॉक समाधान का उपयोग करते हुए विभिन्न सांद्रता (उदाहरण के लिए, 0, 10, 25, 50,100 और 200 ग्राम/एमएल) पर nO एन पी एन एन एन एन एन एन एन एन एन स्टॉक समाधान तैयार करें।
  3. बीज MRC5 मानव फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट्स (1 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) एक 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट पर एक दिन अग्रिम में, और फिर nO NPs के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं का इलाज (trilicates में) के लिए 8 एच, 16 एच, और 24 ज.
  4. प्रत्येक समय बिंदु पर, 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा।
  5. फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ सेल छर्रों को दो बार धोएं।
  6. 1x बाइंडिंग बफर के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, जो 0.1 एम HEPES/सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH), 1.4 एम सोडियम क्लोराइड (NaCl), और 25 m कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2)से बना है, प्रति 100 डिग्री सेल्सियस की एकाग्रता पर।
  7. Fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) Annexin V दाग और प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) डीएनए दाग के 5 डिग्री एल जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (आरटी; 25 डिग्री सेल्सियस) अंधेरे में।
  8. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिकाओं को छांटने से पहले 1x बाइंडिंग बफर के अतिरिक्त 400 $L के साथ नमूनों को ऊपर करें। 10,000 कोशिकाओं की एक न्यूनतम प्रत्येक नमूने के लिए विश्लेषण किया है.
  9. प्राप्त मध्य तीव्रता का उपयोग करके बार चार्ट को सारणीबद्ध करें।

2. ड्रोसोफिला के लिए एन ओ एन पी एस का एक्सपोजर

  1. शीशियों में विभिन्न सांद्रता में 1 एमएल नैनोकणों को जोड़ें, इसके बाद 9 एमएल फ्लाई फूड के बाद 0.1 मिलीग्राम/एमएल, 0.25 मिलीग्राम/एमएल या 0.5 मिलीग्राम/एमएल एनओ एनपी की अंतिम सांद्रता बनाएं।
  2. पिपेट का उपयोग करशीशियों में भोजन के साथ नैनोकणों को अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. उपयोग करने से पहले कम से कम 2-3 एच के लिए ठंडा करने के लिए nO एन पी युक्त मक्खी भोजन की अनुमति दें।
  4. वयस्क पुरुष और महिला 5 दिनों के लिए शीशियों में मक्खियों का परिचय, और उन्हें दोस्त और अंडे देने के लिए अनुमति देते हैं (जो सफेद धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं) भोजन की सतह पर.
  5. माता-पिता की मक्खियों को निकालें, और अंडे को आगे के विकास से गुजरना अनुमति दें, जिसमें 4 विभिन्न विकासात्मक चरण (भ्रूण, लार्वा, प्यूपल और वयस्क चरण) होते हैं।

3. मक्खी का विच्छेदन

  1. विश्लेषण के लिए शीशियों की दीवार से देर से 3rd instar लार्वा ले लीजिए. ताजा रखी अंडे आम तौर पर आरटी में 72-120 एच के बाद देर से 3rd instar लार्वा में विकसित।
  2. विच्छेदन डिश को साफ करें और विच्छेदन माध्यम/पीबीएस के साथ अच्छी तरह से भरें।
  3. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत लार्वा (देर से 3rd instar) को अलग करें, बलप्स की एक जोड़ी का उपयोग कर।
  4. एक छोटे से छेद बनाने के लिए और लार्वा की क्यूटिकल परत को खोलने के लिए संदंश की नोक का उपयोग करें। ध्यान से पेट बाहर खींच और यह एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब Schneider Drosophila मध्यम युक्त में जगह है, फिक्सिंग कदम से पहले 4% paraformaldehyde (पीएफ) के 1 एमएल का उपयोग कर.
  5. 3.5 आरटी में 10 मिनट के लिए पीएफ में आंत को ठीक करें, बाद के प्रयोगों के लिए, जैसे इम्यूनोस्टेनिंग।

4. ROS पता लगाने Dihydroethidium (DHE) दाग का उपयोग कर

  1. चरण 2-1 में वर्णित nO NPs की विभिन्न सांद्रता ओंक के साथ लार्वा का उपचार करें।
  2. धारा 3 के तहत वर्णित के रूप में 3rd instar लार्वा से आंत के विच्छेदन के बाद, ऊतक धुंधला किया जाता है इससे पहले कि आरटी पर Schneider के Drosophila माध्यम में आंत इनक्यूबेट। Schneider के माध्यम के 1 एमएल में DHE डाई (30 mM के स्टॉक एकाग्रता से) के 1 डिग्री एल भंग, 10-30 डिग्री M DHE डाई की एक अंतिम काम एकाग्रता बनाने.
  3. अंधेरे में आरटी पर 5 मिनट के लिए आंत इनक्यूबेट करें, और फिर हर 5 मिनट के लिए श्नाइडर के माध्यम का उपयोग करके तीन बार धोएं।
  4. 4% पीएफ (वैकल्पिक कदम) के साथ आंत को ठीक करें और आंत को कांच की स्लाइडपर पर माउंट करें, एंटी-फैड बढ़ते मध्यम के साथ जिसमें 4 डिग्री,6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोल (डीएपीआई) शामिल हैं। एक confocal माइक्रोस्कोप के तहत छवियों पर कब्जा.

5. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर फ्लोरोसेंट मापने

  1. ImageJ सॉफ्टवेयर में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी या confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्राप्त कब्जा कर लिया फ्लोरोसेंट छवियों आयात।
  2. विश्लेषण मेनू पर क्लिक करें और माप सेट करें का चयन करें.
  3. आउटपुट माप जैसे क्षेत्र एकीकृत तीव्रता और माध्य धूसर मान का चयन करें।
  4. मापेंक्लिक करें.
  5. पृष्ठभूमि सेट करने के लिए फ्लोरोसेंट के बिना किसी क्षेत्र का चयन करें।
  6. डेटा को Excel स्प्रेडशीट में निर्यात करें और नीचे दिखाए गए अनुसार परिकलन का उपयोग करके सही कुल सेल फ्लोरोसेंट (CTCF) निर्धारित करें.
    CTCF - एकीकृत घनत्व - (पृष्ठभूमि रीडिंग के चयनित सेल एक्स माध्य फ्लोरोसेंट के क्षेत्र)
  7. बार चार्ट का निर्माण करें और सांख्यिकीय विश्लेषण करें.

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Representative Results

एनपी उजागर कोशिकाओं सेल धुंधला अभिकर्मक किट के साथ संसाधित किया गया, प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग कर सेल छँटाई के बाद. [nO एनपी इलाज कोशिकाओं (नीचे, दाएँ पैनल) जल्दी के एक उच्च प्रतिशत प्रदर्शन (R3) / देर apoptotic कोशिकाओं (R6) नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में (R5, नीचे, बाएँ पैनल). नेक्रोटिक सेल मृत्यु को त्4 (ऊपर, दाएँ फलक)(चित्र 2) द्वारा निरूपित किया जाता है। $nO NP-treated एमआरसी-5 फाइब्रोब्लास्ट्स पर FITC/Annexin V परख के परिणाम चित्र 2में दिखाए गए हैं।

ड्रोसोफिला प्रयोगों के लिए, विभिन्न सांद्रताओं में sonicated nO NPs को 10 एमएल ट्यूबों में भोजन उड़ानभरने के लिए जोड़ा गया और फिर पिपेट नियंत्रक का उपयोग करके अच्छी तरह से मिश्रित किया गया (चित्र 3)। शीशियों से एकत्र किए गए देर से तीसरे इनस्टार लार्वा को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत विभाजित किया गया। लार्वा को पहले बचे हुए भोजन के अवशेषों को हटाने के लिए धोया गया (चित्र 4) . आंतरिक अंगों को उजागर करने के लिए बाहरी क्यूटिकल परत को फाड़ दिया गया था। आंत की पहचान विशिष्ट दीर्घ एवं अर्धपारदर्शी रूप से की जाती है (जहाँ अन्य अंग सूक्ष्मदर्शी के नीचे अपारदर्शी और हल्के पीले दिखाई देते हैं)(चित्र 5)। आंत को बिना किसी तोड़-छटके सावधानी से हटा दिया गया और बर्फ पर स्थिर होने वाली एक नई माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया गया (चित्र 6)।

इस तरह के पेट में DHE जांच की तीव्रता के रूप में फ्लोरोसेंट तीव्रता की मात्रा के लिए, छवियों JPEG या झगड़ा प्रारूपों में निर्यात किया गया और ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ खोला गया. विश्लेषण के लिए आंत का हिस्सा चुना और पहचान की थी, उदाहरण के लिए, midgut या Hindgut क्षेत्र, और ब्याज के क्षेत्र के फ्लोरोसेंट तीव्रता (आरओआई) मापा गया था. विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के सापेक्ष तीव्रता की तुलना करने के लिए, हमने पिछले खंड में वर्णित समान मात्रात्मक confocal माइक्रोस्कोपी विधि का प्रयोग किया। फ्लोरोसेंट तीव्रता की तुलना के लिए, पैरामीटर नकारात्मक अनुपचारित नियंत्रण का उपयोग कर सेट किया गया था। अनुपचारित नियंत्रण के अंशांकन तीव्रता के आधार पर संकेत तीव्रता की गणना विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों के बीच एक सीधा तुलना की अनुमति दी. चित्र 7 विभिन्न सांद्रताओं पर nO NPs के संपर्क में 3rd instar लार्वा आंत में DHE संकेत की औसत तीव्रता से पता चलता है. एन ओ एनपी उपचार के 0.5 मिलीग्राम/एमएल के साथ इलाज किए गए लार्वा के आंत ने उच्चतम फ्लोरोसेंट तीव्रता को दिखाया।

सभी प्रायोगिक समूहों के बीच सापेक्ष तीव्रता में अंतर को और सारणीबद्ध किया गया और सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया, जो गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों परिणाम प्रदान करता है (चित्र 8)।

Figure 1
चित्र 1: nO NPs के विषाक्तता अध्ययन के लिए प्रयुक्त विधि का अवलोकन। इन विट्रो कार्य के लिए, एन ओ एनपी-उपचार कोशिकाओं को कोशिकामिति विश्लेषण प्रवाह से पहले दाग दिया गया था। विवो काम में के लिए, आंत 3rd instar लार्वा से अलग किया गया था, DHE डाई और छवि अधिग्रहण के साथ धुंधला द्वारा पीछा किया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: उनके FITC और पीई धुंधला के आधार पर अलग अलग आबादी में अलग कोशिकाओं के डॉट साजिश. चित्रलेख एमआरसी-5 पर एन ओ-एनपी के 24 एच उपचार के साथ FITC/Annexin वी परख के परिणाम दिखाते हैं। विभिन्न चरणों में कोशिकाओं का सांख्यिकीय विश्लेषण किया जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: एन ओ एनपी युक्त फ्लाई फूड माध्यम की तैयारी। (ए) मक्खी के भोजन के लिए सामग्री को पानी में मिलाया जाता है, फूलने की अनुमति दी जाती है, और 5 मिनट के लिए उबला हुआ (बी) 50 डिग्री सेल्सियस तक हिलाने के बाद, निपाजिन को मिलाया जाता है और अच्छी तरह से मिलाया जाता है। (सी)नैनोकणों के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करें (कुल मात्रा अंतिम खाद्य मात्रा के 10% से अधिक नहीं)। (घ)मध्यम को तब विभिन्न सांद्रताओं में एनओ एन पी के साथ मिलाया जाता है और भंडारण से पहले पूरी तरह से ठंडा होने की अनुमति दी जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: पूरे आंत विच्छेदन प्रक्रिया. (क)विच्छेदन डिस्क में 3rd इनस्टार लार्वा स्थानांतरित करें. (ठ) बल का प्रयोग लार्वा को धीरे-धीरे रखने के लिए करें, और (ग) लवण का उपयोग करके भोजन के बचे हुए को धो लें। (डी) आंत और अन्य आंतरिक अंगों को छुए बिना कटिकल को धीरे-धीरे फाड़ लें। (ई) बाद की प्रक्रिया के लिए पेट को लवण में रखें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: पाचन तंत्र की शरीर रचना / Drosophila लार्वा से निकाले गए आंत विभिन्न विकासात्मक मूल अर्थात् फोरगुट, मिडगट, और हिंदगट के तीन असतत डोमेन में विभाजित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: DHE के साथ आंत के ऊतकों का दाग. (ए) विकास माध्यम और DHE (30 डिग्री उ) की अंतिम सांद्रता वाले मास्टर मिश्रण को तैयार कीजिये। (बी)एक विच्छेदन डिस्क के अच्छी तरह से मास्टर मिश्रण जोड़ें. (ग) विच्छेदित आंत ऊतक को डीएचई मास्टर मिश्रण युक्त कुएं में स्थानांतरित करें। (डी)5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें और ऊतक को प्रकाश से बचाएं; 5min. (ई) के लिए पीबीएस/ पीबीएस (वैकल्पिक) के साथ तीन बार ऊतक धोने. (च)पेट को कांच की स्लाइड पर धीरे-धीरे स्थानांतरित करें, बिना किसी ऊतक को मोड़े बिना फ्लैट रखें और आवरण कांच के साथ कवर करने से पहले बढ़ते माध्यम के साथ माउंट करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7

चित्र 7: nO NPs Drosophila लार्वा के पेट में ROS प्रेरित. (क)नियंत्रण आंत में DHE दाग ROS के बेसल स्तर से पता चलता है. (ख और ग) उपचारित आंत कोशिकाएं खुराक पर निर्भर तरीके से DHE तीव्रता में क्रमिक वृद्धि दर्शाती हैं।  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: ImageJ का उपयोग कर फ्लोरोसेंट छवियों की मात्रा. (ए)कब्जा कर लिया छवियों आयात. (बी) विश्लेषण मेनू पर क्लिक करें और सेट मापका चयन करें . (ग) क्षेत्र एकीकृत तीव्रता और माध्य धूसर मान का चयन करें। पृष्ठभूमि सेट करने के लिए फ्लोरोसेंट के बिना किसी क्षेत्र का चयन करें। (घ)डेटा को एक्सेल में निर्यात करें और बाद के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए सीटीसीएफ की गणना करें। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

आदेश में अगर nO एनपी MRC5 फाइब्रोब्लास्ट्स में apoptosis प्रेरित कर सकते हैं का आकलन करने के लिए, हम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने के लिए नेक्रोटिक या apoptotic सेल मौत से कोशिकाओं को अलग. सामान्य जीवित कोशिकाओं में, फॉस्फेटिडिल्सरीन (पीएस) कोशिका झिल्ली में स्थानीयकृत है। यदि apoptosis होता है, पी एस प्लाज्मा झिल्ली के extracellular पत्रक में स्थानांतरित कर दिया है, Fluorescein के साथ लेबल Annexin वी की बाध्यकारी की अनुमति (FITC Annexin V)29. दूसरी ओर, लाल फ्लोरोरेसेंट प्रोपिडियम आयोडिड (पीआई), एक न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग डाई, जीवित कोशिकाओं और एपोटोटिक कोशिकाओं के लिए अपारगम्य है लेकिन मृत कोशिकाओं को दाग30. यह हमें मृत कोशिकाओं की पहचान करने की अनुमति देता है (लाल और हरे), apoptotic कोशिकाओं (हरी फ्लोरोसेंट) और जीवित कोशिकाओं (थोड़ा या कोई फ्लोरोसेंट), उत्तेजना के लिए एक argon आयन लेजर के 488 एनएम लाइन के साथ एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर.

Drosophila आंत के DHE धुंधला के लिए, यह DMSO के साथ डाई का पुनर्गठन करने के लिए बस से पहले आप प्रयोग शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में लंबे समय तक भंडारण डाई है कि अंधेरे में रंग बदल जाता है की एक ऑटो ऑक्सीकरण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं / 32. इसके अलावा, पुनर्गठित स्टॉक समाधान भी जल्दी ही समाप्त हो जाते हैं, इसलिए किसी को "समाप्ति तिथि" पर ध्यान देना पड़ता है। वैकल्पिक रूप से, fluorogenic जांच जैसे photostable जांच के हरे संस्करण है, जो जोड़ा करने के लिए दाग के साथ multiplexed होने की क्षमता है, और DHE से बहुत स्पष्ट संकेत पैदा करता है, इस्तेमाल किया जा सकता है. विच्छेदन आंत कोई fixative जोड़ा के साथ वांछित एकाग्रता पर डाई युक्त Schneider के माध्यम के लिए स्थानांतरित किया गया था. यह जीवित कोशिकाओं में डाई के समावेश की अनुमति है, और इसलिए धुंधला संस्कृति माध्यम में किया जाता है, कोशिकाओं के बेहतर श्वसन के लिए अनुमति देने के लिए.

DHE धुंधला की मात्रा के संबंध में, एक शुरुआत के लिए, नियंत्रण अनुपचारित कोशिकाओं में पिक्सल की संतृप्ति से बचें. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग संतृप्त पिक्सेल को विज़ुअल रूप से फ़्लैग करके एक्सपोजर समय निर्धारित करने के लिए किया गया था. अनुपचारित नमूना जोखिम समय सेट और एक ही मानकों को बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था जब विभिन्न उपचार समूहों जो बाद में फ्लोरोसेंट छवि तीव्रता के परिमाणीकरण के लिए महत्वपूर्ण है भर में तीव्रता की तुलना के लिए छवियों पर कब्जा. यह सभी छवियों (नियंत्रण और इलाज के नमूने) एक ही प्रणाली और अधिग्रहण सेटिंग्स / पैरामीटर का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, और पृष्ठभूमि सभी छवियों के लिए मानकीकृत किया जाना चाहिए (ताकि पृष्ठभूमि घटाव के लिए स्थिरता है)33.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

अध्ययन अनुदान संख्या R706-000-043-490 द्वारा समर्थित किया गया था. यह अध्ययन अनुदान प्रायोजक के दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व नहीं करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 151 जस्ता ऑक्साइड नैनोकणों विषाक्तता सेल मौत ऑक्सीडेटिव तनाव एमआरसी 5 कोशिकाओं Drosophila
सेल संस्कृति में और <em>Drosophila मेलेनोगैस्टर</em> में जस्ता ऑक्साइड नैनोकणों का विषाक्तता अध्ययन
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Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E.,… More

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E., Bay, B. H., Baeg, G. H. Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e59510, doi:10.3791/59510 (2019).

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