Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

دراسة سمية الجسيمات النانوية أكسيد الزنك في ثقافة الخلية وفي Drosophila melanogaster

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

نحن نصف بروتوكول مفصل لتقييم الملامح السمية للجسيمات النانوية أكسيد الزنك (ZnO NPs) على وجه الخصوص، ونوع موت الخلايا في الخلايا البشرية MRC5 الخلايا الليفية وتشكيل ROS في ذبابة الفاكهة Drosophila.

Abstract

الجسيمات النانوية أكسيد الزنك (ZnO NPs) لديها مجموعة واسعة من التطبيقات، ولكن عدد التقارير عن السمية المرتبطة NP ZnO نمت بسرعة في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، فإن الدراسات التي توضح الآليات الأساسية للسمية الناجمة عن NP ZnO ضئيلة. حددنا ملامح سمية ZnO NPs باستخدام كل من في المختبر وفي النماذج التجريبية في الجسم الحي. ولوحظ انخفاض كبير في قدرة الخلايا على البقاء في الخلايا التي تتعرض لها الخلايا المضادة للخلايا من قبل شركة ZNO والخلايا الليفية الرئوية من قبل شركة MRC5، مما يدل على أن الـ ZnO NPs تمارس تأثيرات سامة للخلايا. وبالمثل، من المثير للاهتمام، القناة الهضمية المعرضة لZnO NPs أظهرت زيادة كبيرة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في ذبابة الفاكهة دروسوفيلا. ويلزم إجراء المزيد من الدراسات المتعمقة لإجراء تقييم للمخاطر من أجل زيادة استخدام المستهلكين للملوثات غير المنخفضة من النينيو.

Introduction

تشير تقنية النانو إلى تطبيق المواد النانوية التي تستخدم في جميع المجالات العلمية، بما في ذلك الطب وعلوم المواد والكيمياء الحيوية. على سبيل المثال، يتم استخدام NPs ZnO المعروفة بتشتت الأشعة فوق البنفسجية، والاستشعار الكيميائي، والخصائص المضادة للميكروبات، فضلا عن الموصلية الكهربائية العالية، في إنتاج مختلف المنتجات الاستهلاكية مثل تغليف المواد الغذائية، ومستحضرات التجميل، المنسوجات والمطاط والبطاريات، ومحفز لمعالجة غاز الذيل السيارات، والتطبيقات الطبية الحيوية ذات الصلة1،2،3.

ومع ذلك، فإن التطبيقات المتنامية للمنتجات القائمة على NP ZnO، مما أدى إلى زيادة تعرض الإنسان للNO NPs، أثارت مخاوف بشأن آثارها السلبية المحتملة على صحة الإنسان. وقد أظهر عدد من الدراسات الخلوية في المختبر أن NPs ZnO يمكن أن تحفز الإجهاد التأكسدي، والسمية الخلوية المتصلة autophagy، التهاب، والسمية الجينية4،5،6،7،8 . وتجدر الإشارة إلى أن سمية الـ ZnO NPs يفترض أنها ناجمة عن انحلال الزنك لتحرير أيونات زن2+ ، وكذلك التفاعل السطحي لZnO ، مما يؤدي إلى الاختلالات الأيونية والأيضية الخلوية التي ترتبط بضعف التوازن الأيوني واختلال التوازن الأيوني واختلال التوازن الأيوني وخلل في التوازن الأيوني و تثبيط النقل أيون4،7،9،10. والأهم من ذلك، أظهرت الدراسات أن توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هو إحدى الآليات الرئيسية الكامنة وراء السمية المرتبطة بـ ZnO NPs. وقد ثبت عدم كفاية النشاط المضاد للأكسدة بعد إهانة ROS لتكون مسؤولة عن الحصول على السمية الخلوية وتلف الحمض النووي9. كما تم الإبلاغ عن الآثار السامة للNPs ZnO في النماذج الحيوانية، بما في ذلك القوارض1،حمار وحشي11،12،فضلا عن اللافقاريات Drosophila13.

Drosophila بمثابة نموذج حيواني بديل راسخلفحص السمية للكيانات الكيميائية والمواد النانوية (NMs)14،15. الأهم من ذلك، هناك مستويات عالية من التشابه الوراثي والفسيولوجي بين الإنسان وDrosophila التي تبرر استخدام Drosophila كنموذج في الجسم الحي لتقييم الاستجابات البيولوجية للملوثات البيئية مثل NMs 16.وعلاوة على ذلك، هناك العديد من المزايا لاستخدام Drosophila بسبب صغر حجمها، وعمرها القصير، والقدرة على الصيانة الوراثية، وصيانة سهلة وفعالة من حيث التكلفة. وعلاوة على ذلك، تم اعتماد دروسوفيلا على نطاق واسع لدراسة علم الوراثة، والبيولوجيا الجزيئية والتنموية، منذ أن تم تسلسل الجينوم الكامل قبل سنوات في عام 2000، مما يجعلها مناسبة لمجموعة متنوعة من الفرز عالية الإنتاجية ولمعالجة المسائل البيولوجية التي لم تحل17و18و19و20و21. في السنوات الأخيرة، تم الإبلاغ عن عدد من الدراسات المتعلقة بالسمية المناعية باستخدام أنواع مختلفة من الملوثات غير الالحكومية الوطنية في دروسوفيلا 15،22،23،24. وقد ساعدت هذه المعرفة الأساسية الجديدة التي تم الحصول عليها من الدراسات باستخدام Drosophila لتوفير المزيد من الرؤى في فهمنا للسمية النانوية.

ROS هو الجاني المعروف للسمية الخلوية والسمية الجينية الناجمة عن NPs، وعلى وجه الخصوص، NPs القائمة على المعادن25. ROS هي الأنواع الكيميائية التي تحتوي على الأكسجين مع خصائص رد الفعل أعلى من الأكسجين الجزيئي. الجذور الحرة مثل الجذر فوق أكسيد (O2-) وحتى، الجزيئات غير الراديكالية مثل بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)يمكن أن تكون بمثابة ROS. في ظل الحالة الفسيولوجية العادية، ومطلوب منهم للحفاظ على التوازن الخلوي26،ومع ذلك، ROS المفرط ة بسبب الإفراط في الإنتاج أو خلل تنظيم نظام الدفاع المضادة للأكسدة يمكن أن يسبب الإجهاد التأكسدي، مما يؤدي إلى تلف البروتينات، الدهون وحمض ديوكسيريبونوكليك (DNA)27. على سبيل المثال، مع زيادة مستويات ROS وانخفاض مستوى الجلوتاثيون (GSH) في وقت واحد، يحدث اضطراب الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ويرتفع مستوى اللاكتات dehydrogenase (LDH) في المتوسط، وبلغت ذروتها في موت الخلايا27.

هنا، نحن نقدم بروتوكولات لإجراء التحليلات الخلوية والوراثية باستخدام خلايا الثدييات المستزرعة ودروسوفيلا لتحديد الآثار السلبية المحتملة للNO NPs. ويرد في الشكل 1لمحة عامة عن الطريقة المستخدمة في دراسة سمية الملوثات غير السمية لـ ZnO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تحليل فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) على الخلايا الحية / الثابتة

  1. سونيكات ZnO NPs في تعليق لمدة 15 دقيقة.
  2. إعداد NPs ZnO بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال، 0 و10 و25 و50100 و200 ميكروغرام/مل) باستخدام 1 ملغ/مم زنو NP الأوراق المالية الحل للمخزون لعلاج الخلايا المستزرعة.
  3. بذور MRC5 الخلايا الليفية الرئة البشرية (1 × 105 خلايا / جيدا) على لوحة ثقافة 6 جيدا في اليوم مقدما، ومن ثم علاج الخلايا مع 2 مل من NPs ZnO (في triplicates) لمدة 8 ساعة، 16 ح، و 24 ح.
  4. في كل نقطة زمنية، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. غسل الكريات الخلية مرتين مع الفوسفات المخزنة المالحة المخزنة (PBS).
  6. إعادة تعليق الخلايا مع 1X العازلة ملزمة، والتي تتكون من 0.1 M HEPES / هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم( هيدروكسيد الصوديوم)، 1.4 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)، و 25 مل كلوريد الكالسيوم (CaCl2)،بتركيز 1 × 105 خلايا لكل 100 ميكرولتر.
  7. إضافة 5 ميكرولتر من الفلورسين إيزوثيوسينات (FITC) المرفق الخامس وصمة عار و 5 ميكرولتر من البربيديوم يوديد (PI) وصمة عار الحمض النووي، واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT؛ 25 درجة مئوية) في الظلام.
  8. قم بتعبئة العينات باستخدام 400 لتر إضافية من المخزن المؤقت للربط 1x قبل فرز الخلايا عن طريق قياس التدفق. يتم تحليل ما لا يقل عن 10،000 خلية لكل عينة.
  9. جدولة الرسم البياني الشريطي باستخدام الكثافة الوسيطة التي تم الحصول عليها.

2- تعرض الـ ZnO NPs لدروسوفيلا

  1. إضافة 1 مل من الجسيمات النانوية بتركيزات مختلفة في قارورة، تليها 9 مل من أغذية الذبابة لجعل التركيز النهائي من 0.1 ملغ /مل، 0.25 ملغم/مل أو 0.5 ملغم/مل زنو نمس.
  2. خلط الجسيمات النانوية مع الطعام جيدا في قارورة باستخدام ماصة.
  3. السماح للأغذية يطير التي تحتوي على NPs ZnO لتبرد لمدة 2-3 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
  4. إدخال الذباب الكبار الذكور والإناث في قارورة لمدة 5 أيام، والسماح لهم لزميله ووضع البيض (التي تظهر كبقع بيضاء) على سطح الطعام.
  5. إزالة الذباب الأبوي، والسماح للبيض للخضوع لمزيد من التنمية، والتي تتكون من 4 مراحل التنمية المختلفة (الجنينية، اليرقات، الجرو ومرحلة الكبار).

3. تشريح ذبابة

  1. جمع اليرقات في وقت متأخر 3rd instar من جدار القنينات للتحليلات. البيض الطازج تتطور عادة إلى اليرقات في وقت متأخر 3rd instar بعد 72-120 ساعة في RT.
  2. تنظيف طبق تشريح وملء البئر مع تشريح المتوسطة / PBS.
  3. تشريح اليرقات (في وقت متأخر 3rd instar) تحت المجهر المجسم، وذلك باستخدام زوج من الملقط.
  4. استخدام غيض من ملقط لجعل حفرة صغيرة وكسر فتح طبقة بشرة من اليرقات. سحب بعناية الأمعاء ووضعها في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل التي تحتوي على وسيط ة Drosophila شنايدر، قبل خطوة تحديد باستخدام 1 مل من 4٪ paraformaldehyde (PF).
  5. 3.5إصلاح الأمعاء في PF لمدة 10 دقيقة في RT، للتجارب اللاحقة، مثل تلطيخ المناعة.

4. الكشف عن ROS باستخدام ديهيدروثيديميوم (DHE) تلطيخ

  1. علاج اليرقات بتركيزات مختلفة من الـ ZnO NPs كما هو موضح في الخطوة 2-1.
  2. بعد تشريح الأمعاء من يرقات instarالثالثة كما هو موضح تحت القسم 3، احتضان الأمعاء في وسيط دروسوفيلا شنايدر في RT قبل تنفيذ تلطيخ الأنسجة. حل 1 ميكرولتر من صبغة DHE (من تركيز المخزون من 30 مل) في 1 مل من المتوسط شنايدر، مما يجعل تركيز العمل النهائي من 10-30 درجة مئوية صبغة DHE.
  3. قم باحتضان الأمعاء لمدة 5 دقائق في RT في الظلام، ثم اغسل ثلاث مرات باستخدام وسيط شنايدر لكل 5 دقائق.
  4. إصلاح القناة الهضمية مع 4٪ PF (خطوة اختيارية) وجبل الأمعاء على الشرائح الزجاجية، مع المضادة تتلاشى تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4′،6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI). التقاط الصور تحت المجهر البؤري.

5. قياس الفلورة باستخدام برنامج ImageJ

  1. استيراد الصور الفلورية التي تم التقاطها باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر البؤري إلى برنامج ImageJ.
  2. انقر على القائمة تحليل وحدد تعيين القياسات.
  3. حدد مقياس الإخراج مثل الكثافة المتكاملة للمنطقة ومتوسط القيمة الرمادية.
  4. انقر فوق قياس.
  5. حدد منطقة بدون فلورة لتعيين الخلفية.
  6. تصدير البيانات إلى جدول بيانات Excel وتحديد الفلورة الخلية الإجمالية المصوبة (CTCF)، باستخدام الحساب كما هو موضح أدناه.
    CTCF = الكثافة المتكاملة - (منطقة الخلية المختارة X متوسط الفلورة من قراءات الخلفية)
  7. إنشاء مخطط شريطي وإجراء تحليل إحصائي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تمت معالجة الخلايا المكشوفة NP مع مجموعة الكاشف تلطيخ الخلية، تليها فرز الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. تظهر الخلايا المعالجة بـ ZnO NP (أسفل، لوحة إلى اليمين) نسبة أعلى من الخلايا المبرمجة المبكرة (R3)/في وقت متأخر من خلايا التحكم (R5، أسفل، لوحة يسرى). يشير إلى موت الخلايا النخرية بواسطة R4 (أعلى، لوحة اليمين)(الشكل 2). وترد في الشكل 2نتائج التسياق الخامس للفيتك/الملحقين الخامس بشأن الخلايا الليفية التي تعالجها شركة ZNO من نوع NP MRC-5.

بالنسبة لتجارب دروسوفيلا، تمت إضافة NPs ZnO سونيكاتفيتركيزات مختلفة ليطير الطعام في أنابيب 10 مل ومن ثم مختلطة بشكل جيد باستخدام وحدة تحكم ماصة(الشكل 3). تم تشريح يرقات النجمة الثالثة المتأخرة التي تم جمعها من القنينات تحت المجهر المجسم. تم غسل اليرقات لأول مرة لإزالة بقايا المواد الغذائية المتبقية(الشكل 4). تم تمزيق طبقة بشرة الخارجي بعيدا لفضح الأعضاء الداخلية. تم تحديد الأمعاء من قبل مظهر مميز طويل وشبه شفاف (في حين أن الأجهزة الأخرى تظهر مبهمة وخفيفة مصفر تحت المجهر)(الشكل 5). تمت إزالة الأمعاء بعناية، دون كسر، ونقلها إلى أنبوب جديد للطرد المركزي الصغير يحتوي على المثبت على الجليد(الشكل 6).

لتكميم كثافة الفلورة مثل كثافة التحقيق DHE في الأمعاء، تم تصدير الصور في تنسيقات JPEG أو TIFF وفتحت مع برنامج ImageJ. وقد تم اختيار الجزء من القناة الهضمية للتحليل وتم تحديده، على سبيل المثال، منطقة ميدغوت أو الخلفية، وتم قياس شدة الفلورة في المنطقة ذات الاهتمام. وللمقارنة بين الكثافات النسبية لمختلف المجموعات التجريبية، استخدمنا نفس طريقة الفحص المجهري الكمية البؤرية الموصوفة في القسم السابق. للمقارنة بين كثافة الفلورة، تم تعيين المعلمة باستخدام عنصر التحكم غير المعالجة السالبة. وسمحت حسابات كثافة الإشارة على أساس كثافة المعايرة للتحكم غير المعالج بإجراء مقارنة مباشرة بين المجموعات التجريبية المختلفة. ويبين الشكل 7 متوسط كثافة إشارة DHE في القناة الهضمية اليرقانيةinstar الثالثة المعرضة لـ ZnO NPs بتركيزات مختلفة. وقد أظهرت القناة الهضمية لليرقات المعالجة بـ 0.5 ملغم/مل من علاج ZnO NP أعلى كثافة فلورة.

كما تم جدولة الاختلافات في الكثافة النسبية بين جميع المجموعات التجريبية، وأُجري تحليل إحصائي، مما وفر نتائج نوعية وكمية على حد سواء(الشكل 8).

Figure 1
الشكل 1: لمحة عامة عن الطريقة المستخدمة في دراسة السمية في الملوثات غير السمية في ZnO. للعمل في المختبر، كانت الخلايا المعالجة NP ZnO ملطخة قبل تحليل تدفق قياس الخلايا. في العمل الحي، تم تشريح الأمعاء من يرقات instarالثالثة، تليها تلطيخ مع صبغ DHE واكتساب الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: مخطط نقطة من الخلايا المفصولة إلى مجموعات سكانية مختلفة على أساس تلطيخ FITC وPE. وتظهر الصور الفوتوغرافية نتائج عملية قياس الـ FITC/Annexin V مع معالجة 24 ساعة من الـ ZnO-NPs على متن المركز الخامس. ويمكن بعد ذلك إجراء تحليل إحصائي للخلايا في مراحل مختلفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إعداد مادة الأغذية المتطايرة المحتوية على NP ZnO. (أ)يتم إضافة مكونات الطعام يطير إلى الماء، ويسمح لتنتفخ، والمغلي لمدة 5 دقائق.(ب)بعد التبريد وصولا الى 50 درجة مئوية مع التحريك، وأضيف نيباغين ومختلطة تماما. (ج)إعداد مزيج رئيسي للجسيمات النانوية (الحجم الإجمالي لا يتجاوز 10٪ من حجم الغذاء النهائي). (D)ثم يتم تسعير هادىء متوسط، مختلطة مع NPs ZnO في تركيزات مختلفة ويسمح لتبرد تماما قبل التخزين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: إجراء تشريح الأمعاء بأكمله. (أ)نقل 3يرقات نجمة إلى قرص تشريح. (ب)استخدام ملقط لعقد بلطف يرقة، و(ج)غسل بقايا الطعام باستخدام المالحة. (D)المسيل للدموع بلطف بشرة بعيدا دون لمس الأمعاء والأعضاء الداخلية الأخرى. (E)ضع الأمعاء في المالحة لإجراء لاحق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تشريح الجهاز الهضمي/ القناة الهضمية. وتنقسم الأمعاء المستخرجة من يرقات دروسوفيلا إلى ثلاثة مجالات منفصلة من أصل تنموي مختلف وهي الصدارة، والأمعاء الوسطى، والخلفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: تلطيخ أنسجة الأمعاء مع DHE. (أ)إعداد مزيج رئيسي يحتوي على متوسط النمو وDHE (تركيز نهائي من 30 درجة مئوية). (ب)إضافة المزيج الرئيسي في بئر قرص تشريح. (ج)نقل أنسجة الأمعاء تشريح في البئر التي تحتوي على مزيج الرئيسي DHE. (D)احتضان في RT لمدة 5 دقائق وحماية الأنسجة من الضوء. غسل 3X في PBS / المالحة لمدة 5min.(E)إصلاح في 4٪ PF لمدة 10 دقيقة؛ غسل الأنسجة ثلاث مرات مع PBS (اختياري). (F)نقل بلطف الأمعاء على شريحة زجاجية، ووضع شقة دون وجود أي الأنسجة مطوية وجبل مع تصاعد المتوسطة قبل تغطية مع غطاء الزجاج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7

الشكل 7: الـ ZnO NPs تحفز ROS في القناة الهضمية ليرقات دروسوفيلا. (أ)وصمة عار DHE في الأمعاء السيطرة يظهر المستوى القاعدي ة من ROS. (ب و ج)تظهر خلايا الأمعاء المعالجة زيادة تدريجية في كثافة DHE بطريقة تعتمد على الجرعة.  الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: تكميم الصور الفلورية باستخدام ImageJ. (أ)استيراد الصور التي تم التقاطها. (ب)انقر على القائمة تحليل وحدد تعيين القياسات. (C)حدد كثافة المنطقة المتكاملة ومتوسط القيمة الرمادية. حدد منطقة بدون فلورة لتعيين الخلفية. (د)تصدير البيانات إلى إكسيل وحساب CTCF للتحليل الإحصائي اللاحق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

من أجل تقييم ما إذا كان ZnO NP يمكن أن تحفز المبرمج في الخلايا الليفية MRC5، ونحن نستخدم قياس التدفق للتمييز بين الخلايا من موت الخلايا النخرية أو المبرمج. في الخلايا الحية العادية ، يتم توطين فوسفاتيديلسيرين (PS) في غشاء الخلية. في حالة حدوث المبرمج، يتم نقل PS إلى النشرة خارج الخلية من غشاء البلازما، مما يسمح لربط الملحق الخامس المسمى مع الفلورسين (FITC Annexin V)29. من ناحية أخرى، وأحمر الفلورسنت بروبيوديوم يوديد (PI)، وهو صبغة ملزمة حمض نووي، هو غير قابل للنفاذ إلى الخلايا الحية والخلايا المبرمجة ولكن البقع الخلايا الميتة30. وهذا يسمح لنا لتحديد الخلايا الميتة (الأحمر والأخضر)، والخلايا المبرمجة (الفلورة الخضراء) والخلايا الحية (الفلورة قليلا أو لا)، وذلك باستخدام تدفق مقياس الخلايا مع خط 488 نانومتر من ليزر الأرجون أيون للإثارة.

لتلطيخ DHE من الأمعاء Drosophila، من المهم إعادة تشكيل الصبغة مع DMSO قبل بدء التجربة، كما التخزين لفترات طويلة قد يؤدي إلى الأكسدة التلقائيللصبغة التي تحول الصبغة إلى لون داكن / الأرجواني31، 32- وبالإضافة إلى ذلك، فإن حلول الأسهم المعاد تشكيلها تميل أيضا إلى أن تنتهي بسرعة إلى حد ما، ولذلك يتعين على المرء أن يولي اهتماما لـ "تاريخ انتهاء الصلاحية". وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام تحقيقات فلورية مثل النسخة الخضراء من مسبار الصور، الذي لديه القدرة المضافة على أن تكون متعددة مع البقع، وتنتج إشارات أكثر وضوحاً بكثير من DHE. تم نقل الأمعاء تشريح إلى وسط شنايدر التي تحتوي على الصبغة في التركيز المطلوب مع عدم إضافة المثبتة. هذا هو للسماح لدمج الصبغة في الخلايا الحية، وبالتالي يتم تنفيذ تلطيخ في وسط الثقافة، للسماح لتحسين التنفس من الخلايا.

فيما يتعلق بالكم من تلطيخ DHE، لبداية، وتجنب تشبع بكسل في السيطرة على الخلايا غير المعالجة. تم استخدام برنامج التصوير لتحديد وقت التعرض عن طريق وضع علامة مرئية بالبكسل المشبعة. وقد استخدمت العينة غير المعالجة لتحديد وقت التعرض والحفاظ على نفس المعلمات عند التقاط الصور للمقارنة بين كثافة عبر مجموعات العلاج المختلفة وهو أمر مهم للقياس الكمي لكثافة صورة الفلورة في وقت لاحق. من الضروري الحصول على جميع الصور (عينات التحكم والمعالجة) باستخدام نفس النظام وإعدادات/معلمات الاكتساب، وينبغي توحيد الخلفية لجميع الصور (بحيث يكون هناك اتساق للطرح الخلفية)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

وقد تم دعم الدراسة من قبل رقم المنحة R706-000-043-490. ولا تمثل الدراسة رأي مقدم المنحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
  2. Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
  3. Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
  4. De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
  5. Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
  6. Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
  7. Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
  8. Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
  9. Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
  10. Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
  11. Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
  12. Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
  13. Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
  14. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
  15. Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
  16. Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
  17. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  18. Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
  19. Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
  20. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
  21. Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
  22. Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
  23. Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
  24. Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
  25. Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
  26. Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
  27. Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
  28. Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
  29. Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
  30. Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
  31. Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
  32. Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
  33. Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى العدد 151 جزيئات نانوية أكسيد الزنك سمية موت الخلايا الإجهاد التأكسدي خلايا MRC5 دروسوفيلا
دراسة سمية الجسيمات النانوية أكسيد الزنك في ثقافة الخلية وفي <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E.,… More

Ng, C. T., Ong, C. N., Yu, L. E., Bay, B. H., Baeg, G. H. Toxicity Study of Zinc Oxide Nanoparticles in Cell Culture and in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (151), e59510, doi:10.3791/59510 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter