Summary
特に酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NPs)の毒性プロファイルを評価するための詳細なプロトコルについて説明し、ヒトMRC5肺線維芽細胞における細胞死の種類および果実フライドロソフィラにおけるROS形成について説明する。
Abstract
酸化亜鉛ナノ粒子(ZnO NP)は幅広い用途を持っていますが、ZnO NP関連毒性に関する報告の数は近年急速に増加しています。しかし、ZnO NP誘発毒性の根本的なメカニズムを解明する研究はスキャン可能である。インビトロとインビボ実験モデルの両方を用いてZnO NPの毒性プロファイルを決定した。ZnO NP曝露MRC5肺線維芽細胞では細胞生存率の有意な減少が認され、ZnO NPが細胞傷害作用を発揮することを示した。同様に、興味深いことに、ZnO NPに曝露された腸は、フルーツフライショウジョウバエにおける活性酸素種レベル(ROS)の劇的な増加を示した。消費者によるZnO NPの使用率の増加に対するリスク評価を確立するためには、より詳細な研究が必要である。
Introduction
ナノテクノロジーとは、医学、材料科学、生化学など、あらゆる科学分野で使用されるナノサイズの材料の応用を指します。例えば、紫外線散乱、化学センシング、抗微生物性、高い電気伝導性で知られるZnO NPは、食品包装、化粧品など様々な消費財の製造に活用されています。繊維、ゴム、電池、自動車テールガス処理用触媒、および生物医学関連アプリケーション1、2、3.
しかし、ZnO NPベースの製品の急増は、ZnO NPへの人間の暴露の増加につながる、人間の健康に対する潜在的な悪影響に関する懸念を提起している。インビトロ細胞研究の数は、ZnO NPが酸化ストレス、オートファジー関連細胞毒性、炎症、および無毒性4、5、6、7、8を誘発できることを実証しました.特に、ZnO NPの毒性は、Zn2+イオンを自由に溶解し、ZnOの表面反応性によって引き起こされると仮定され、その結果、細胞イオン性および代謝不均衡が生じ、イオン性恒常性障害およびイオン輸送の阻害4,7,9,10.重要なことに、研究は、活性酸素種(ROS)の生成がZnO NPs関連毒性の基礎となる主要なメカニズムの一つであることを示しています。ROS侮辱後の不十分な抗酸化活性は、細胞毒性およびDNA損傷9を引き起こす原因であることが示されている。ZnO NPの毒性効果は、げっ歯類1、ゼブラフィッシュ11、12、ならびに無脊椎動物のショウジョウバエ13を含む動物モデルでも報告されている。
ショウジョウバエは、化学物質およびナノ材料(NM)14、15の毒性スクリーニングのための確立された代替動物モデルとして機能する。重要なのは、ヒトとショウジョウバエの間には高いレベルの遺伝的類似性があり、NMなどの環境汚染物質に対する生物学的応答を評価するための生体内モデルとしてのショウジョウバエの使用を正当化する。16.さらに、その小さなサイズ、短い寿命、遺伝的なアメニティ、および容易で、費用効果が大きい維持のためにショウジョウバエを使用することの多くの利点がある。さらに、ショウジョウバエは遺伝学、分子、発生生物学の研究に広く採用されており、2000年に完全なゲノムが完全に配列され、様々なハイスループットスクリーニングに適しています。そして、未解決の生物学的問題に取り組むために17,18,19,20,21.近年、ショウジョウバエにおける異なるタイプのNPを用いた免疫毒性に関する多くの研究が15、22、23、24で報告されている。ショウジョウバエを用いた研究から得られたこの基本的な新しい知識は、ナノトキシトロジーの理解に関するより多くの洞察を提供するのに役立ちました。
ROSは、特に、金属ベースのNP25によって引き起こされる細胞毒性および無毒性の既知の原因である。ROSは、分子酸素よりも高い活性特性を有する酸素含有化学種である。スーパーオキシドラジカル(O2-)などのフリーラジカルは、過酸化水素(H2O2)などの非ラジカル分子がROSとして作用しうる。正常な生理学的状態の下では、それらは細胞恒常性26を維持する必要があるが、抗酸化防御システムの過剰産生または不自由による過剰なROSは酸化ストレスを引き起こし、タンパク質への損傷を引き起こす可能性があり、脂質およびデオキシリボ核酸(DNA)27.例えば、ROSレベルが増加し、グルタチオン(GSH)レベルが伴って減少するにつれて、アデノシン三リン酸(ATP)合成の中断が起こり、乳酸脱水素酵素(LDH)レベルが培地中で増加し、細胞死27で終わる。
ここでは、培養哺乳動物細胞とショウジョウバエを用いて細胞解析や遺伝子解析を行い、ZnO NPの潜在的な悪影響を判定するプロトコルを提供する。ZnO NPの毒性試験に用いられる方法の概要を図1に示す。
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Protocol
1. 生細胞/固定細胞に関する蛍光活性化細胞選別(FACS)分析
- 15分間のサスペンションでZnOのニオネート。
- 培養細胞の治療に1mg/mL ZnO NPストック溶液を用いて、様々な濃度(例えば、0、10、25、50,100および200 μg/mL)でZnO NPを調用する。
- 種子MRC5ヒト肺線維芽細胞(1 x 105細胞/ウェル)を1日前に6ウェル培養プレート上に、その後、8時間、16時間、24時間のZnO NPの2mL(三重)で細胞を処理する。
- 各時点で、5分間300 x gで遠心分離して細胞を収集する。
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS)で細胞ペレットを2回洗浄します。
- 0.1M HEPES/ナトリウム(NaOH)、1.4M塩化ナトリウム(NaCl)、および25mM塩化ナトリウム(CaCl2)で構成される1x結合バッファーで細胞を再中断し、100 μL当たり1x105細胞の濃度で再濁させる。
- フルオレセインイソチオシアネート(FITC)アネキシンV染色物5μL、ヨウ化プロピジウム(PI)DNA染色の5μLを加え、暗い暗闇の中で室温(RT;25°C)で15分間細胞をインキュベートします。
- フローサイトメトリーで細胞をソートする前に、1x結合バッファーの追加の400 μLでサンプルをトップアップします。サンプルごとに最低 10,000 個の細胞が分析されます。
- 得られた中央値の強度を使用して棒グラフを集計します。
2.ショウジョウバエへのZnO GPの暴露
- バイアルに異なる濃度のナノ粒子の1 mLを追加し、続いて9 mLのフライフードを加え、0.1 mg/mL、0.25mg/mLまたは0.5mg/mL ZnO NPsの最終濃度を作ります。
- ピペットを使用してバイアルに完全に食品とナノ粒子を混合します。
- ZnO NPを含むフライフードを使用前に少なくとも2~3時間冷却してください。
- 大人のオスとメスのハエを5日間バイアルに入れ、食べ物の表面に卵(白い斑点として現れる)を交尾させ、産卵できるようにします。
- 親のハエを取り除き、卵が4つの異なる発達段階(胚、幼虫、子犬、大人の段階)で構成されるさらなる発達を受けることを可能にする。
3. フライの解剖
- 分析のためにバイアルの壁から後期3rdのスター幼虫を収集します。新たに産卵した卵は、通常、RTで72-120 h後に遅い3rdの幼虫に発達する。
- 解剖皿をきれいにし、解剖媒体/PBSで井戸を満たします。
- 一対の鉗子を使用して、立体顕微鏡下で幼虫(後期3rd instar)を解剖する。
- 鉗子の先端を使用して小さな穴を作り、幼虫のキューティクル層を開きます。慎重に腸を引き出し、シュナイダーのショウジョウバエ培地を含む1.5mLのマイクロ遠心分離管に入れ、4%パラホルムアルデヒド(PF)の1mLを使用して固定工程に入れます。
- 3.5免疫染色などの後続の実験のために、RTで10分間PFの腸を固定します。
4. ジヒドロエチジウム(DHE)染色を用いたROS検出
- 手順 2.1 で説明したように、ZnO NP のさまざまな濃度で幼虫を治療します。
- セクション3に記載されている第3の第3の星幼虫からの腸の解剖に続いて、組織染色が行われる前にRTでシュナイダーのショウジョウバエ培地で腸をインキュベートする。シュナイダーの培地の1mLにDHE色素の1μL(30mMのストック濃度から)を溶解し、10-30 μM DHE色素の最終作業濃度を作ります。
- 暗闇の中でRTで5分間腸をインキュベートし、5分ごとにシュナイダーの培地を使用して3回洗浄します。
- 4%PF(オプションステップ)で腸を固定し、4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含むアンチフェードマウント媒体で、ガラススライドに腸を取り付けます。共焦点顕微鏡下で画像をキャプチャします。
5. ImageJソフトウェアを用いて蛍光を測定する
- 蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して取得した蛍光画像をImageJソフトウェアに読み込む。
- [分析]メニューをクリックし、[測定値を設定]を選択します。
- 面積積分強度や平均グレー値などの出力メジャーを選択します。
- [測定]をクリックします。
- 蛍光のない領域を選択して、背景を設定します。
- Excel スプレッドシートにデータをエクスポートし、次に示すように計算を使用して、補正された総細胞蛍光 (CTCF) を決定します。
CTCF = 統合密度 - (選択した細胞Xの平均蛍光部のバックグラウンド測定値の蛍光) - 棒グラフを作成し、統計分析を実行します。
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Representative Results
NP露光細胞を細胞染色試薬キットで処理し、続いてフローサイトメトリーを用いて細胞選別を行った。ZnO NP処理細胞(下、右パネル)は、対照細胞(R5、下部、左パネル)よりも早期(R3)/後期アポトーシス細胞(R6)の割合が高い。壊死細胞死はR4(上、右パネル)で示される(図2)。ZnO NP処理MRC-5線維芽細胞に関するFITC/アネキシンVアッセイの結果を図2に示す。
ショウジョウバエ実験では、様々な濃度で超音波処理されたZnO NPを10mLチューブで飛ばすために添加し、ピペットコントローラを用いてよく混合した(図3)。バイアルから採取した後期の3番目のインスター幼虫を立体顕微鏡下で解剖した。幼虫は、残りの食物の残骸を取り除くために最初に洗浄された(図4)。外側のキューティクル層は、内臓を露出させるために引き裂かれた。腸は特徴的な長く半透明な外観によって同定された(一方、他の器官は顕微鏡下で不透明で薄い黄色がくい)(図5)。腸を慎重に取り除き、壊れることなく、氷上の固定性を含む新しいマイクロ遠心管に移しました(図6)。
腸内のDHEプローブの強度などの蛍光強度を定量するために、画像をJPEGまたはTIFF形式でエクスポートし、ImageJソフトウェアで開きました。分析用の腸内の部分を選択して同定し、例えば、中腸または後腸領域、および対象領域(ROI)の蛍光強度を測定した。異なる実験群の相対的強度を比較するために、前項で説明したのと同じ定量共焦点顕微鏡法を用いて行った。蛍光強度の比較のために、パラメータは負の未処理対照を用いて設定した。未処理制御の較正強度に基づく信号強度の計算は、異なる実験群間の直接比較を可能にした。図7は、異なる濃度でZnO NPに曝露された第3種星幼虫腸におけるDHE信号の平均強度を示す。ZnO NP治療の0.5mg/mLで処置した幼虫の腸は、最も高い蛍光強度を示した。
すべての実験群間の相対的強度の差をさらに集計し、統計分析を行い、定性的および定量的な結果を提供した(図8)。
図1:ZnO NPの毒性試験に用いる方法の概要インビトロ作業では、ZnO NP処理細胞をフローサイトメトリー分析の前に染色した。生体内作業では、腸を3rdインスター幼虫から解剖し、続いてDHE染料および画像取得による染色を行った。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:FITCおよびPE染色に基づいて異なる集団に分離された細胞のドットプロット。ピクトグラムは、MRC-5上のZnO-NPの24時間治療によるFITC/アネキシンVアッセイの結果を示す。その後、異なる段階での細胞の統計分析を行うことができます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ZnONP含有フライフード培地の調製。(A)フライフードの原料を水に加え、膨らまかし、5分間煮込み(B)攪拌しながら50°Cまで冷却した後、ニパギンを加えて十分に混合した。(C)ナノ粒子のマスターミックスを調製する(総体積は最終食品体積の10%を超えない)。(D)培地は、次にアリクォートされ、様々な濃度でZnO NPと混合し、貯蔵前に完全に冷却させた。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:腸全体の解剖手順。(A)3rdの幼虫を解剖ディスクに移す。(B)鉗子を使って幼虫を優しく保持し、(C)生理食べ物の残骸を生理食べ物で洗い流す。(D)腸や他の内臓に触れることなく、キューティクルをそっと引き裂きます。(E)後続の手順のために生理食谷に腸を入れておく。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:消化管/腸の解剖学。ショウジョウバエ幼虫から抽出された腸は、異なる発達起源、すなわち前腸、中腸、および後腸の3つの離散ドメインに分けられる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:DHEを使用した腸組織の染色。(A)成長培地とDHE(最終濃度30μM)を含むマスターミックスを調出す。(B)解剖ディスクのウェルにマスターミックスを追加します。(C)解剖した腸組織をDHEマスターミックスを含むウェルに移す。(D)RTで5分間インキュベートし、光から組織を保護します。PBS/生理生理で3倍を5分間洗浄する(E)10分間4%PFで固定する。PBS(オプション)でティッシュを3回洗浄します。(F)ガラススライドに腸をそっと移し、ティッシュを折りたたまずに平らに置き、カバーガラスで覆う前に取り付け媒体で取り付けます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:ZnO NPはショウジョウバエ幼虫の腸内でROSを誘導する。(a)制御腸内のDHE染色は、ROSの基底レベルを示す。(bおよびc)処理された腸細胞は、用量依存的な方法でDHE強度の徐々に増加を示す。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:ImageJを用いて蛍光画像を定量する。(A)キャプチャした画像をインポートします。(B) [分析]メニューをクリックし、[測定値を設定]を選択します。(C)積分強度と平均グレー値を選択します。蛍光のない領域を選択して、背景を設定します。(D) データを Excel にエクスポートし、後続の統計分析用に CTCF を計算します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ZnO NPがMRC5線維芽細胞にアポトーシスを誘導できるかどうかを評価するために、我々は細胞を壊死またはアポトーシス細胞死から区別するためにフローサイトメトリーを使用する。正常な生細胞では、ホスファチジルセリン(PS)は細胞膜に局在する。アポトーシスが発生した場合、PSは血漿膜の細胞外リーフレットに転移し、Fluoresin(FITCアネキシンV)29で標識されたアネキシンVの結合を可能にする。一方、赤蛍光プロピジウムヨウ化物(PI)は、核酸結合色素であり、生細胞およびアポトーシス細胞に対して不浸透性であるが、死細胞30を染色する。これにより、アルゴンイオンレーザーの488nmラインを持つフローサイトメーターを用いて、死細胞(赤と緑)、アポトーシス細胞(緑色蛍光)および生細胞(蛍光がほとんどない)を同定することができます。
ショウジョウバエ腸のDHE染色の場合、長時間保存すると染料が暗い/紫色に変わる色素の自動酸化につながる可能性があるため、実験を開始する直前にDMSOで染料を再構成することが重要です31、32.また、再構成された株式ソリューションもかなり早く期限切れになる傾向があるので、「有効期限」に注意を払う必要があります。あるいは、汚れを多重化する能力を持ち、DHEよりもはるかに明確な信号を生成するフォトテーブルプローブの緑色バージョンのような蛍光プローブを使用することができます。解剖した腸は、固定剤を加えなく所望の濃度で染料を含むシュナイダーの培地に移された。これは、生細胞中の色素の取り込みを可能にするため、したがって、染色が培養培地で行われ、細胞のより良い呼吸を可能にする。
DHE染色の定量に関しては、まず、未処理細胞を制御するピクセルの飽和を避ける。イメージングソフトウェアプログラムは、飽和ピクセルに視覚的にフラグを付けることによって露光時間を決定するために使用された。未処理のサンプルは、後で蛍光画像強度の定量化に重要である異なる処理群間の強度を比較するために画像をキャプチャする際に、露光時間を設定し、同じパラメータを維持するために使用されました。同じシステムと取得設定/パラメータを使用してすべての画像(制御および処理されたサンプル)を取得することが不可欠であり、背景はすべての画像に対して標準化されるべきである(背景減算のための一貫性があるように)33。
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Disclosures
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
研究は、補助金番号R706-000-043-490によってサポートされました。このスタディは、補助金スポンサーのビューを表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| Cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| ImageJ software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
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