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Immunology and Infection

Estudio de toxicidad de nanopartículas de óxido de zinc en el cultivo celular y en Drosophila melanogaster

Published: September 19, 2019 doi: 10.3791/59510
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4
1NUS Environmental Research Institute & Department of Anatomy, National University of Singapore, 2NUS Environmental Research Institute & School of Public Health, National University of Singapore, 3Department of Civil and Environmental Engineering, National University of Singapore, 4Department of Anatomy, National University of Singapore

Summary

Describimos un protocolo detallado para evaluar los perfiles toxicológicos de nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) en particular, el tipo de muerte celular en fibroblastos pulmonares MRC5 humanos y la formación de ROS en la mosca de la fruta Drosophila.

Abstract

Las nanopartículas de óxido de zinc (ZnO NP) tienen una amplia gama de aplicaciones, pero el número de informes sobre la toxicidad asociada a ZnO NP ha crecido rápidamente en los últimos años. Sin embargo, los estudios que aclaran los mecanismos subyacentes para la toxicidad inducida por ZnO NP son escasos. Determinamos los perfiles de toxicidad de los NP de ZnO utilizando modelos experimentales in vitro e in vivo. Se observó una disminución significativa en la viabilidad celular en los fibroblastos pulmonares MRC5 expuestos a ZnO NP, lo que muestra que los NP de ZnO ejercen efectos citotóxicos. Del mismo modo, curiosamente, el intestino expuesto a los NP de ZnO exhibió un aumento dramático en los niveles reactivos de las especies de oxígeno (ROS) en la mosca de la fruta Drosophila. Se requieren estudios más detallados para establecer una evaluación del riesgo para el aumento del uso de LOS NP de ZnO por parte de los consumidores.

Introduction

La nanotecnología se refiere a la aplicación de materiales de tamaño nanométrico que se utilizan en todos los campos científicos, incluyendo la medicina, la ciencia de los materiales y la bioquímica. Por ejemplo, los NP ZnO que son conocidos por su dispersión ultravioleta, detección química y propiedades antimicrobianas, así como alta conductividad eléctrica, se utilizan en la producción de diversos productos de consumo como envases de alimentos, cosméticos, textiles, cauchos, baterías, catalizadores para el tratamiento de gas de cola de automóviles, y aplicaciones biomédicas1,2,3.

Sin embargo, las crecientes aplicaciones de los productos basados en ZnO NP, que conducen a una mayor exposición humana a los NP de ZnO, han suscitado preocupaciones sobre sus posibles efectos adversos sobre la salud humana. Varios estudios celulares in vitro han demostrado que los NP de ZnO pueden inducir estrés oxidativo, citotoxicidad relacionada con la autofagia, inflamación y genotoxicidad4,5,6,7,8 . En particular, se supone que la toxicidad de znO NP es causada por la disolución de Zn para liberar iones Zn2+, así como la reactividad superficial de ZnO, lo que resulta en los desequilibrios iónicos y metabólicos celulares que están relacionados con la homeostasis iónica deteriorada y una inhibición del transporte iónico4,7,9,10. Es importante destacar que los estudios han demostrado que la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) es uno de los principales mecanismos subyacentes a la toxicidad asociada a los NP de ZnO. Se ha demostrado que la insuficiente actividad antioxidante después del insulto ROS es responsable de provocar la citotoxicidad y el daño al ADN9. Los efectos tóxicos de znO NP también se han divulgado en modelos animales, incluyendo roedores1, pez cebra11,12, así como el invertebrado Drosophila13.

Drosophila sirve como un modelo animal alternativo bien establecido para el cribado de toxicidad de entidades químicas y nanomateriales (NMs)14,15. Es importante destacar que existen altos niveles de similitud genética y fisiológica entre el ser humano y Drosophila que justifican el uso de Drosophila como modelo in vivo para evaluar las respuestas biológicas a contaminantes ambientales como los NM 16. Además, hay muchas ventajas de usar Drosophila debido a su pequeño tamaño, corta vida útil, amenabilidad genética y mantenimiento fácil y rentable. Además, Drosophila ha sido ampliamente adoptada para el estudio de la genética, la biología molecular y del desarrollo, desde que su genoma completo fue completamente secuenciado hace años en 2000, por lo que es adecuado para una variedad de cribado de alto rendimiento y para abordar las cuestiones biológicas no resueltas17,18,19,20,21. En los últimos años, se han notificado varios estudios relacionados con la inmunotoxicidad utilizando diferentes tipos de NP en Drosophila 15,22,23,24. Este nuevo conocimiento fundamental obtenido de los estudios con Drosophila ha ayudado a proporcionar más información sobre nuestra comprensión de la nanotoxicología.

ROS es un conocido culpable de citotoxicidad y genotoxicidad causada por los NP, en particular, los NP a base de metal25. ROS son especies químicas que contienen oxígeno con propiedades reactivas más altas que el oxígeno molecular. Los radicales libres como el radical superóxido (O2-) e incluso, moléculas no radicales como el peróxido de hidrógeno (H2O2) pueden actuar como ROS. Bajo condición fisiológica normal, se requieren para mantener la homeostasis celular26,sin embargo, ROS excesiva debido a la sobreproducción o desregulación del sistema de defensa antioxidante puede causar estrés oxidativo, lo que conduce a daños a las proteínas, lípidos y ácido desoxirribonucleico (ADN)27. Por ejemplo, a medida que los niveles de ROS aumentan y el nivel de glutatión (GSH) disminuye de forma concomitante, se produce la interrupción de la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP) y el nivel de lactato deshidrogenasa (LDH) aumenta en el medio, culminando en la muerte celular27.

Aquí, proporcionamos protocolos para realizar análisis celulares y genéticos utilizando células de mamíferos cultivadas y Drosophila para determinar los posibles efectos adversos de los NP de ZnO. En la Figura 1se muestra una descripción general del método utilizado para el estudio de toxicidad de los NP de ZnO.

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Protocol

1. Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) en células vivas/fijas

  1. Sonicate ZnO NP en suspensión durante 15 min.
  2. Preparar los NP de ZnO en varias concentraciones (por ejemplo, 0, 10, 25, 50,100 y 200 g/ml) utilizando 1 mg/ml de solución de stock ZnO NP para el tratamiento de células cultivadas.
  3. Semilla MRC5 fibroblastos pulmonares humanos (1 x 105 células/pozo) en una placa de cultivo de 6 pocillos con un día de antelación, y luego tratar las células con 2 ml de ZnO NP (en triplicados) durante 8 h, 16 h y 24 h.
  4. En cada punto de tiempo, recoger las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min.
  5. Lave los gránulos celulares dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS).
  6. Resuspender las células con 1x tampón de unión, que se compone de 0,1 M HEPES/hidróxido sódico (NaOH), cloruro de sodio de 1,4 M (NaCl) y 25 mM de cloruro de calcio (CaCl2), a una concentración de 1 x 105 células por 100 oL.
  7. Añadir 5 l de isotiocianato de fluoresceína (FITC) De la mancha V de la fluoresceína (FITC) y 5 l de mancha de ADN de yoduro de propidium (PI), e incubar las células durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT; 25 oC) en la oscuridad.
  8. Recargar las muestras con un búfer de unión adicional de 400 l de 1x antes de clasificar las celdas por citometría de flujo. Se analiza un mínimo de 10.000 celdas para cada muestra.
  9. Tabular el gráfico de barras utilizando la intensidad mediana obtenida.

2. Exposición de los NP de ZnO a Drosophila

  1. Añadir 1 ml de nanopartículas a diferentes concentraciones en viales, seguido de 9 ml de alimentos para moscas para realizar una concentración final de 0,1 mg/ml, 0,25 mg/ml o 0,5 MG/ml de ZnO NP.
  2. Mezcle bien las nanopartículas con los alimentos en los viales utilizando la pipeta.
  3. Deje que los alimentos con mosca que contengan ZnO NP se enfríen durante al menos 2-3 horas antes de su uso.
  4. Introducir moscas macho y hembra adultos en los viales durante 5 días, y les permiten aparearse y poner huevos (que aparecen como manchas blancas) en la superficie de la comida.
  5. Retire las moscas parentales, y permita que los óvulos se sometan a un desarrollo posterior, que consta de 4 etapas de desarrollo diferentes (fase embrionaria, larval, pupal y adulta).

3. Disección de la mosca

  1. Recoger larvas de estrella de finales de la3a de la pared de los viales para su análisis. Los huevos recién puestos normalmente se desarrollan en larvas de estrella de finales de 3a después de 72-120 h en RT.
  2. Limpie el plato de disección y llene el pozo con medio de disección/PBS.
  3. Disecciona las larvas (finales de la3a estrella) bajo el estereomicroscopio, usando un par de fórceps.
  4. Usa la punta de los fórceps para hacer un pequeño agujero y romper la capa de cutícula de las larvas. Tire con cuidado del intestino y colóquelo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contenga el medio Drosophila de Schneider, antes del paso de fijación utilizando 1 ml de 4% de paraformaldehído (PF).
  5. 3.5Fijar el intestino en PF durante 10 minutos a RT, para experimentos posteriores, como inmunomancha.

4. Detección ROS con tinción de dihidroetidio (DHE)

  1. Tratar las larvas con varias concentraciones de NP ZnO como se describe en el paso 2.1.
  2. Después de la disección del intestino de las larvas de3a estrella como se describe en la sección 3, incubar el intestino en el medio Drosophila de Schneider en RT antes de realizar la tinción de tejido. Disolver 1 l de tinte DHE (a partir de la concentración de 30 mM) en 1 ml del medio de Schneider, haciendo una concentración de trabajo final de 10-30 m de tinte DHE.
  3. Incubar el intestino durante 5 minutos a RT en la oscuridad, y luego lavar tres veces usando el medio de Schneider por cada 5 minutos.
  4. Fije el intestino con 4% PF (paso opcional) y monte el intestino en diapositivas de vidrio, con medio de montaje anti-fade que contiene 4o,6-diamidino-2-fenilindo (DAPI). Captura imágenes bajo un microscopio confocal.

5. Medición de la fluorescencia mediante el software ImageJ

  1. Importe las imágenes de fluorescencia capturadas adquiridas mediante microscopía de fluorescencia o microscopía de escaneo láser confocal en el software ImageJ.
  2. Haga clic en el menú Analizar y seleccione Establecer medidas.
  3. Seleccione la medida de salida, como la intensidad integrada del área y el valor gris medio.
  4. Haga clic en Medir.
  5. Seleccione una región sin fluorescencia para establecer el fondo.
  6. Exporte los datos a la hoja de cálculo de Excel y determine la fluorescencia total de celdas (CTCF) corregida, utilizando el cálculo como se muestra a continuación.
    CTCF - Densidad Integrada - (área de la celda seleccionada X Fluorescencia media de las lecturas de fondo)
  7. Construir un gráfico de barras y realizar análisis estadísticos.

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Representative Results

Las células expuestas a NP se procesaron con el kit de reactivos de tinción de células, seguido de la clasificación de celdas mediante citometría de flujo. Las células tratadas con ZnO NP (panel inferior y derecho) exhiben un porcentaje más alto de células apoptoticas tempranas (R3)/tardías (R6) que las celdas de control (R5, inferior, panel izquierdo). La muerte de la célula necrótica se denota por R4 (panel superior, derecho)(Figura 2). Los resultados del ensayo FITC/Annexin V sobre fibroblastos MRC-5 tratados con ZnO NP se muestran en la Figura 2.

Para los experimentos de Drosophila, se añadieron NP ZnO sonicados a diversas concentraciones para volar alimentos en tubos de 10 ml y luego se mezclaron bien usando un controlador de pipeta(Figura 3). Las larvas de tercera estrella tardías recogidas de viales fueron diseccionadas bajo el estereomicroscopio. Las larvas se lavaron por primera vez para eliminar los restos de los alimentos restantes(Figura 4). La capa externa de la cutícula fue desgarrada para exponer los órganos internos. El intestino fue identificado por la característica apariencia larga y semitransparente (mientras que otros órganos aparecen opacos y amarillentos claros bajo el microscopio) (Figura 5). El intestino fue cuidadosamente removido, sin romperse, y transferido a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene fijador en hielo(Figura 6).

Para la cuantificación de la intensidad de la fluorescencia, como la intensidad de la sonda DHE en el intestino, las imágenes se exportaron en formatos JPEG o TIFF y se abrieron con el software ImageJ. Se seleccionó e identificó la parte del intestino para el análisis, por ejemplo, la región del intestino medio o posterior, y se midió la intensidad de fluorescencia de la región de interés (ROI). Para comparar las intensidades relativas de los diferentes grupos experimentales, empleamos el mismo método cuantitativo de microscopía confocal descrito en la sección anterior. Para la comparación de intensidades de fluorescencia, el parámetro se estableció utilizando el control negativo no tratado. Los cálculos de la intensidad de la señal sobre la base de las intensidades de calibración del control no tratado permitieron una comparación directa entre diferentes grupos experimentales. La Figura 7 muestra la intensidad media de la señal DHE en elintestino larvario instar 3 expuesto a los NP de ZnO a diferentes concentraciones. El intestino de las larvas tratadas con 0,5 mg/ml del tratamiento con ZnO NP mostró la mayor intensidad de fluorescencia.

Se tabularon las diferencias en las intensidades relativas entre todos los grupos experimentales y se realizaron análisis estadísticos, proporcionando resultados cualitativos y cuantitativos(Figura 8).

Figure 1
Figura 1: Descripción general del método utilizado para el estudio de toxicidad de los NP de ZnO. Para el trabajo in vitro, las células tratadas con ZnO NP se teñían antes del análisis de citometría de flujo. Para el trabajo in vivo, el intestino se diseccionó de larvas de3a instar, seguido de la tinción con tinte DHE y la adquisición de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Gráfica de puntos de células separadas en diferentes poblaciones en función de su tinción FITC y PE. Los pictogramas muestran los resultados del ensayo FITC/Annexin V con tratamiento de 24 horas de ZnO-NP en MRC-5. A continuación, se puede realizar un análisis estadístico de las células en diferentes etapas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Preparación del medio de alimentos mosca que contiene ZnO NP. (A) Los ingredientes para los alimentos con mosca se añaden al agua, se deja hinchar y se hierve durante 5 min. (B) Después de enfriar a 50 oC con agitación, Nipagin se añadió y se mezcló a fondo. (C) Preparar una mezcla maestra para las nanopartículas (volumen total no superior al 10% del volumen final de alimentos). (D) El medio se mezcla, se mezcla con los NP de ZnO a varias concentraciones y se deja enfriar completamente antes del almacenamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Todo el procedimiento de disección intestinal. (A) Transferir3a larvas instar a un disco de disección. (B) Utilice fórceps para sujetar suavemente una larva y (C) lavar el resto de los alimentos con salina. (D) Desgarrar suavemente la cutícula sin tocar el intestino y otros órganos internos. (E) Coloque el intestino en la salina para el procedimiento posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La anatomía del tracto digestivo/gut. El intestino extraído de la larva de Drosophila se divide en tres dominios discretos de diferente origen del desarrollo, a saber, el intestino, la parte media y la parte posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Manchado del tejido intestinal con DHE. (A) Preparar una mezcla maestra que contenga medio de crecimiento y DHE (una concentración final de 30 m). (B) Añadir la mezcla maestra en el pozo de un disco de disección. (C) Transfiera el tejido intestinal diseccionado al pozo que contiene la mezcla maestra DHE. (D) Incubar a RT durante 5 min y proteger el tejido de la luz; lavar 3x en PBS/solución salina para 5min. (E) Fijar en 4% PF durante 10 min; lavar el tejido tres veces con PBS (opcional). (F) Transfiera suavemente el intestino a un portaobjetos de vidrio, coloque plano sin tener ningún tejido plegado y monte con medio de montaje antes de cubrirlo con vidrio de cubierta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7

Figura 7: ZnO NP induceROS ROS en el intestino de las larvas de Drosophila. (a) La mancha DHE en el intestino de control muestra el nivel basal de ROS. (b y c) Las células intestinales tratadas muestran un aumento gradual de la intensidad de la DHE de manera dependiente de la dosis.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Cantidad de imágenes fluorescentes utilizando ImageJ. (A) Importe las imágenes capturadas. (B) Haga clic en el menú Analizar y seleccione Establecer medidas. (C) Seleccione la intensidad integrada del área y el valor gris medio. Seleccione una región sin fluorescencia para establecer el fondo. (D) Exportar los datos a Excel y calcular el CTCF para el análisis estadístico posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Con el fin de evaluar si ZnO NP puede inducir apoptosis en fibroblastos MRC5, utilizamos citometría de flujo para distinguir las células de la muerte de células necróticas o apoptoticas. En las células vivas normales, la fosfatidilserina (PS) se localiza en la membrana celular. Si se produce apoptosis, PS se traslada al prospecto extracelular de la membrana plasmática, lo que permite la unión de Annexin V etiquetado con fluoresceína (FITC Annexin V)29. Por otro lado, el yoduro de propidium rojo-fluorescente (PI), un tinte de unión a ácido nucleico, es impermeable a las células vivas y células apoptoticas, pero mancha las células muertas30. Esto nos permite identificar las células muertas (rojas y verdes), las células apoptoticas (fluorescencia verde) y las células vivas (poca o ninguna fluorescencia), utilizando un citómetro de flujo con la línea de 488 nm de un láser de argón-ion para excitación.

Para la tinción DHE del intestino Drosophila, es importante reconstituir el tinte con DMSO justo antes de comenzar el experimento, ya que el almacenamiento prolongado puede conducir a una autooxidación del tinte que convierte el tinte en color oscuro/púrpura31, 32. Además, las soluciones de stock reconstituidas también tienden a expirar con bastante rapidez, por lo que hay que prestar atención a la "fecha de caducidad". Alternativamente, se podrían utilizar sondas fluorogénicas como la versión verde de la sonda fototable, que tiene la capacidad añadida de ser multiplexada con manchas, y produce señales mucho más claras que DHE. El intestino diseccionado fue transferido al medio de Schneider que contiene el tinte en la concentración deseada sin agregado fijador. Esto es para permitir la incorporación del tinte en las células vivas, y por lo tanto la tinción se realiza en el medio de cultivo, para permitir una mejor respiración de las células.

Con respecto a la cuantificación de la tinción DHE, para empezar, evite la saturación de los píxeles en las celdas no tratadas de control. El programa de software de imágenes se utilizó para determinar el tiempo de exposición marcando visualmente píxeles saturados. La muestra no tratada se utilizó para establecer el tiempo de exposición y mantener los mismos parámetros al capturar imágenes para la comparación de la intensidad en diferentes grupos de tratamiento, lo que es importante para la cuantificación de la intensidad de la imagen de fluorescencia más adelante. Es esencial adquirir todas las imágenes (muestras de control y tratadas) utilizando el mismo sistema y los mismos ajustes/parámetros de adquisición, y el fondo debe estar estandarizado para todas las imágenes (para que haya consistencia para la resta de fondo)33.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

El estudio fue apoyado por el número de subvención R706-000-043-490. El estudio no representa la opinión del patrocinador de la subvención.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15% Methyl 4-Hydroxybenzoate Sigma Aldrich
4% Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Bacto Agar BD biosciences
cncCK6/TM3, Sb a gift from Dr. Kerppola T
Cornmeal, glucose, yeast brewer Sigma Aldrich
CyAn ADP with Summit Software DAKO https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf
Dihydroethidium (Hydroethidine) Thermo Fisher Scientific D11347
FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I BD biosciences 556547
Fluorescent microscope Olympus
Glucolin Supermarket
ImageJ software NIH
MRC5 human lung fibroblast ATCC CCL-171
Schneider’s Drosophila medium Thermo Fisher Scientific 21720-024
Vectashield antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO NIG-FLY
Zinc Oxide Nanoparticles Sigma Aldrich 721077 Refer Sheet 2

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