Summary
We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het evalueren van de toxicologische profielen van zinkoxide nanodeeltjes (ZnO NPs) in het bijzonder, het type celdood in humane MRC5 Long fibroblasten en ROS vorming in de fruitvlieg Drosophila.
Abstract
Zinkoxide nanodeeltjes (ZnO NPs) hebben een breed scala aan toepassingen, maar het aantal rapporten over ZnO NP-geassocieerde toxiciteit is de afgelopen jaren snel gegroeid. Echter, studies die de onderliggende mechanismen voor ZnO NP-geïnduceerde toxiciteit verhelderden zijn scanty. We bepaalden de toxiciteits profielen van ZnO NPs met behulp van zowel in vitro als in vivo experimentele modellen. Een significante afname van de levensvatbaarheid van de cel werd waargenomen in ZnO NP-blootgestelde MRC5 Long fibroblasten, waaruit blijkt dat ZnO NPs cytotoxische effecten uitoefent. Evenzo, interessant, gut blootgesteld aan ZnO-NPs tentoongesteld een dramatische toename van reactieve zuurstof soorten niveaus (ROS) in de fruitvlieg Drosophila. Meer diepgaande studies zijn nodig om een risicobeoordeling voor het toegenomen gebruik van ZnO NPs door consumenten vast te stellen.
Introduction
Nanotechnologie verwijst naar de toepassing van nano-sized materialen die worden gebruikt in alle wetenschappelijke gebieden, met inbegrip van de geneeskunde, materialen wetenschap, en biochemie. Bijvoorbeeld, ZnO NPs die bekend staan om hun ultraviolet verstrooiing, chemische sensing, en anti-microbiële eigenschappen, evenals hoge elektrische geleidbaarheid, worden gebruikt in de productie van verschillende consumentenproducten zoals voedsel verpakking, cosmetica, textiel, rubbers, accu's, katalysator voor de behandeling van auto-staart gassen, en biomedische-gerelateerde toepassingen1,2,3.
De ontluikende toepassingen van ZnO-producten op basis van NP, die leiden tot een toegenomen menselijke blootstelling aan ZnO NPs, hebben echter bezorgdheid geuit over hun potentiële nadelige gevolgen voor de menselijke gezondheid. Een aantal in vitro cellulaire studies hebben aangetoond dat ZnO NPs kan induceren oxidatieve stress, autophagy-gerelateerde cytotoxiciteit, ontsteking, en genotoxiciteit4,5,6,7,8 . Met name, de toxiciteit van ZnO NPs wordt verondersteld te worden veroorzaakt door de ontbinding van Zn tot vrije Zn2 + ionen, evenals de oppervlakte reactiviteit van ZnO, resulterend in de cellulaire Ionische en metabole onevenwichtigheden die zijn gekoppeld aan verminderde Ionische homeostase en een remming van Ion transport4,7,9,10. Belangrijk, studies hebben aangetoond dat de generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is een van de primaire mechanismen onderliggende ZnO NPs-geassocieerde toxiciteit. Onvoldoende anti-oxidatieve activiteit na ROS-belediging is aangetoond dat zij verantwoordelijk zijn voor het opwekken van de cytotoxiciteit en DNA-schade9. De toxische effecten van ZnO NPs zijn ook gerapporteerd in diermodellen, waaronder knaagdieren1, zebravis11,12, evenals de ongewerveld Drosophila13.
Drosophila fungeert als een goed opgezet alternatief diermodel voor toxiciteits screening van chemische entiteiten en nanomaterialen (nm's)14,15. Belangrijk is dat er een hoge mate van genetische en fysiologische gelijkenis bestaat tussen humaan en Drosophila die het gebruik van Drosophila rechtvaardigt als een in vivo model voor het evalueren van biologische reacties op milieuverontreinigingen zoals nm's 16. Bovendien zijn er veel voordelen van het gebruik van Drosophila vanwege zijn geringe omvang, korte levensduur, genetische geschiktheid en eenvoudig en kosteneffectief onderhoud. Bovendien is Drosophila op grote schaal goedgekeurd voor de studie van genetica, moleculaire en ontwikkelingsbiologie, sinds zijn volledige genoom jaren geleden volledig is gesequenced terug in 2000, waardoor het geschikt is voor een verscheidenheid aan hoge doorvoer screening en voor het aanpakken van onopgeloste biologische vragen17,18,19,20,21. In de afgelopen jaren zijn een aantal studies gerelateerd aan immunotoxiciteit met behulp van verschillende soorten NPs in Drosophila gemeld15,22,23,24. Deze fundamentele nieuwe kennis verkregen uit de studies met Drosophila heeft geholpen om meer inzicht te geven in ons begrip van nano toxicologie.
ROS is een bekende boosdoener voor cytotoxiciteit en genotoxiciteit veroorzaakt door NPs, in het bijzonder, op metaal gebaseerde NPs25. ROS zijn zuurstof bevattende chemische soorten met hogere reactieve eigenschappen dan moleculaire zuurstof. Vrije radicalen zoals superoxide radicaal (O2-) en zelfs, niet-radicale moleculen zoals waterstofperoxide (H2O2) kunnen fungeren als Ros. Onder normale fysiologische aandoening, ze zijn vereist voor het handhaven van cellulaire homeostase26, echter, buitensporige Ros als gevolg van overproductie of disregulatie van de antioxidant afweersysteem kan oxidatieve stress veroorzaken, wat leidt tot schade aan eiwitten, lipiden en deoxyribonucleïnezuur (DNA)27. Bijvoorbeeld, als ROS niveaus toenemen en glutathion (GSH) niveau tegelijkertijd afneemt, verstoring van adenosinetrifosfaat (ATP) synthese plaatsvindt en lactaat dehydrogenase (LDH) niveau verhogingen in het medium, culmineren in celdood27.
Hier bieden we protocollen voor het uitvoeren van cellulaire en genetische analyses met behulp van gekweekte zoogdieren cellen en Drosophila om te bepalen van de mogelijke nadelige effecten van ZnO NPs. Een overzicht van de methode die wordt gebruikt voor de toxiciteitsstudie van ZnO NPs wordt weergegeven in Figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) analyse op levende/vaste cellen
- Sonicate ZnO NPs in suspensie voor 15 min.
- Bereid ZnO NPs in verschillende concentraties (bijv. 0, 10, 25, 50.100 en 200 μg/mL) met 1 mg/mL ZnO NP stockoplossing voor de behandeling van gekweekte cellen.
- Seed MRC5 menselijke Long fibroblasten (1 x 105 cellen/goed) op een 6-well cultuur plaat een dag van tevoren, en vervolgens behandelen de cellen met 2 ml ZnO NPs (in triplicates) voor 8 h, 16 h, en 24 h.
- Verzamel op elk moment de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten.
- Was de celpellets tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Respendeer de cellen met 1x bindings buffer, die bestaat uit 0,1 M HEPES/natriumhydroxide (NaOH), 1,4 M natriumchloride (NaCl) en 25 mM calciumchloride (CaCl2), met een concentratie van 1 x 105 cellen per 100 μL.
- Voeg 5 μl fluorescein isothiocyanaat (FITC) annexin V Stain en 5 μl propidium jodide (PI) DNA-vlek toe en inincuberen de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT; 25 °c) in het donker.
- Boven de monsters met een extra 400 μL van 1x bindende buffer voordat u de cellen sorteert doorstroming cytometrie. Voor elk monster worden minimaal 10.000 cellen geanalyseerd.
- Tablaat het staafdiagram met behulp van de verkregen mediaan intensiteit.
2. blootstelling van ZnO NPs aan Drosophila
- Voeg 1 mL nanodeeltjes in verschillende concentraties toe aan injectieflacons, gevolgd door 9 mL vlieg voedsel om een eindconcentratie van 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL of 0,5 mg/mL ZnO NPs te maken.
- Meng de nanodeeltjes met voedsel grondig in de injectieflacons met behulp van de pipet.
- Laat vlieg voedsel dat ZnO NPs bevat afkoelen voor ten minste 2-3 h voor gebruik.
- Introduceren volwassen mannelijke en vrouwelijke vliegen in de flesjes voor 5 dagen, en hen in staat stellen om te paren en eieren te leggen (die verschijnen als witte vlekken) op het oppervlak van het voedsel.
- Verwijder de ouderlijke vliegen, en laat de eieren te ondergaan verdere ontwikkeling, die bestaat uit 4 verschillende ontwikkelingsstadia (embryonale, larvale, exuviae en volwassen stadium).
3. dissectie van de Fly
- Verzamel late 3RD instar larven van de wand van de flesjes voor analyses. Vers gelegde eieren ontwikkelen normaliter tot laat 3RD instar larven na 72-120 uur bij RT.
- Reinig de dissectie schotel en vul de put met dissectie medium/PBS.
- Ontleden de larven (laat 3RD INSTAR) onder de stereomicroscoop met behulp van een paar tang.
- Gebruik de punt van de tang om een klein gaatje te maken en open de cuticula laag van de larven. Trek de darm voorzichtig uit en plaats deze in een micro centrifugebuis van 1,5 mL die het Drosophila medium van Schneider bevat, voorafgaand aan de fixatie stap met 1 ml 4% Paraformaldehyde (PF).
- 3.5 Bevestig de darm in PF gedurende 10 minuten bij RT, voor latere experimenten, zoals immunokleuring.
4. ROS-detectie met behulp van Dihydroethidium (DHE) kleuring
- Behandel larven met verschillende concentraties van ZnO NPs zoals beschreven in stap 2,1.
- Na het dissectie van de darm van 3RD instar larven zoals beschreven in rubriek 3, incuberen de darmen in het Drosophila medium van Schneider voordat weefsel kleuring wordt uitgevoerd. Los 1 μL DHE-kleurstof (uit de voorraad concentratie van 30 mM) op in 1 mL van het medium van Schneider, wat een uiteindelijke werkconcentratie van 10-30 μM DHE-kleurstof maakt.
- Inbroed de darm gedurende 5 minuten bij RT in het donker, en spoel vervolgens drie keer met het medium van Schneider voor elke 5 min.
- Bevestig de darm met 4% PF (optionele stap) en monteer de darm op glazen glijbanen, met anti-fade montage medium met 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Leg beelden vast onder een confocale Microscoop.
5. fluorescentie meten met ImageJ-software
- Importeer de vastgelegde fluorescentie beelden die zijn verkregen met behulp van fluorescentiemicroscopie of confocale laser scanning microscopie in de ImageJ-software.
- Klik op het menu analyseren en selecteer metingen instellen.
- Selecteer de uitvoer maat, zoals de geïntegreerde intensiteit van het gebied en de gemiddelde grijswaarde.
- Klik op meten.
- Selecteer een regio zonder fluorescentie om de achtergrond in te stellen.
- Exporteer de gegevens naar het Excel-werkblad en bepaal de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) met behulp van de berekening zoals hieronder wordt weergegeven.
CTCF = geïntegreerde dichtheid-(gebied van geselecteerde cel X gemiddelde fluorescentie van achtergrond metingen) - Een staafdiagram construeren en statistische analyses uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
NP-blootgestelde cellen werden verwerkt met de celkleuringsreagens Kit, gevolgd door celsortering met behulp van Flowcytometrie. ZnO NP-behandelde cellen (onder, rechter paneel) vertonen een hoger percentage vroege (R3)/late apoptotische cellen (R6) dan controle cellen (R5, onder, linker paneel). Necrotische celdood wordt aangeduid met R4 (boven, rechter paneel) (Figuur 2). De resultaten van de FITC/Annexin V-test op ZnO NP-behandelde MRC-5-fibroblasten zijn weergegeven in Figuur 2.
Voor de Drosophila experimenten werden gesoniceerde ZnO NPs bij verschillende concentraties toegevoegd om voedsel in 10 ml buisjes te vliegen en vervolgens goed te mengen met behulp van een pipet controller (Figuur 3). Late derde instar larven verzameld uit injectieflacons werden ontleed onder de stereomicroscoop. De larven werden eerst gewassen om restanten van voedsel te verwijderen (Figuur 4). De buitenste cuticula laag werd verscheurd om inwendige organen bloot. De darm werd geïdentificeerd door de karakteristieke lange en semi-transparante verschijning (terwijl andere organen ondoorzichtig en licht gelig onder de Microscoop lijken) (Figuur 5). De darm werd zorgvuldig verwijderd, zonder te breken, en overgebracht naar een nieuwe microcentrifuge buis met fixeermiddel op ijs (Figuur 6).
Voor de kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie, zoals de intensiteit van de DHE-sonde in de darm, werden de beelden geëxporteerd in JPEG-of TIFF-formaat en geopend met de ImageJ-software. Het deel van de darm voor analyse werd geselecteerd en geïdentificeerd, bijvoorbeeld de hepatopancreas of achterhand regio, en de intensiteit van de fluorescentie van het gebied van belang (ROI) werd gemeten. Om de relatieve intensiteiten van de verschillende experimentele groepen te vergelijken, hebben we dezelfde kwantitatieve confocale microscopie methode gebruikt als beschreven in de vorige sectie. Voor de vergelijking van fluorescentie intensiteiten werd de parameter ingesteld met behulp van de negatief onbehandelde controle. Berekeningen van de signaalintensiteit op basis van de kalibratie intensiteiten van de onbehandelde controle lieten een directe vergelijking tussen verschillende experimentele groepen. Figuur 7 toont de gemiddelde intensiteit van het dhe-signaal in de 3RD INSTAR larvale gut blootgesteld aan ZnO NPs in verschillende concentraties. De darm van larven behandeld met 0,5 mg/mL ZnO NP behandeling toonde de hoogste intensiteit van de fluorescentie.
De verschillen in relatieve intensiteiten tussen alle experimentele groepen werden verder getabelleerd, en statistische analyse werd uitgevoerd, waarbij zowel kwalitatieve als kwantitatieve resultaten werden verstrekt (Figuur 8).
Figuur 1: overzicht van de methode die wordt gebruikt voor toxiciteitsstudie van ZnO NPs. Voor in vitro werk, ZnO NP-behandelde cellen werden gekleurd voorafgaand aan Flowcytometrie analyse. Voor in vivo werk werd gut ontleed van 3RD instar larven, gevolgd door kleuring met dhe kleurstof en beeld verwerving. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: puntplot van cellen gescheiden in verschillende populaties op basis van hun FITC en PE kleuring. De pictogrammen tonen de resultaten van FITC/Annexin V assay met 24 h behandeling van ZnO-NPs op MRC-5. Statistische analyse van de cellen in verschillende stadia kan dan worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: bereiding van ZNO NP-bevattende Fly Food medium. A) ingrediënten voor vlieg voedsel worden toegevoegd aan water, mogen opzwellen en gekookt gedurende 5 min.B) na afkoelen tot 50 °c met roeren, werd nipagin grondig toegevoegd en gemengd. C) een Mastermix voor de nanodeeltjes voorbereiden (totaal volume van niet meer dan 10% van het uiteindelijke voedsel volume). (D) medium wordt vervolgens alicgeciteerd, vermengd met ZnO NPs bij verschillende concentraties en mag volledig afkoelen voor opslag. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: de hele gut dissectie procedure. A) Breng 3RD instar larven over naar een dissectie schijf. B) gebruik de tang om een larve zachtjes vast te houden en (C) het restant van voedsel met behulp van een zoutoplossing weg te spoelen. (D) scheur de cuticula voorzichtig los zonder de darmen en andere inwendige organen aan te raken. E) plaats de darmen in de zoutoplossing voor de daaropvolgende procedure. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: de anatomie van het spijsverteringskanaal/gut. De darm geëxtraheerd uit de larve Drosophila is onderverdeeld in drie discrete domeinen van verschillende ontwikkelings oorsprong namelijk de foregut, midgut, en hindgut. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: kleuring van het darmweefsel met DHE. A) een hoofdmix met groeimedium en dhe (een eindconcentratie van 30 μM) bereiden. B) Voeg de hoofdmix toe aan de put van een dissectie schijf. (C) Breng het ontleed darmweefsel over in de put met de dhe Master Mix. D) inincuberen op RT gedurende 5 minuten en het weefsel beschermen tegen licht; was 3x in PBS/Saline voor 5min. (E) Fix in 4% PF gedurende 10 min; was het weefsel drie keer met PBS (optioneel). (F) Breng de darmen voorzichtig over op een glazen glijbaan, leg plat zonder dat er weefsel is gevouwen en monteer met het afdekmedium voordat u het afdekglas bedekt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: ZnO NPs induceren Ros in de darm van Drosophila larven. (a) dhe vlek in controle darm toont het basale niveau van Ros. (b en c) behandelde darmcellen vertonen een geleidelijke toename van de intensiteit van de dhe in een dosisafhankelijke wijze. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 8: Kwantatie van fluorescerende afbeeldingen met ImageJ. (A) Importeer de vastgelegde afbeeldingen. (B) Klik op het menu analyseren en selecteer metingen instellen. (C) Selecteer het gebied geïntegreerde intensiteit en gemiddelde grijswaarde. Selecteer een regio zonder fluorescentie om de achtergrond in te stellen. (D) Exporteer de gegevens naar Excel en bereken de ctcf voor daaropvolgende statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om te beoordelen of ZnO NP apoptosis in MRC5 fibroblasten kan induceren, gebruiken we flow cytometrie om de cellen te onderscheiden van necrotische of apoptotische celdood. In normale levende cellen, fosfatidylserine (PS) is gelokaliseerd op de celmembraan. Als apoptosis optreedt, is PS transgelegen naar de extracellulaire bijsluiter van het plasma membraan, waardoor de binding van Annexin V gelabeld met fluoresceïne (FITC Annexin V)29. Aan de andere kant, de rood-fluorescerende propidium jodide (PI), een nucleïnezuur bindende kleurstof, is ondoorlatend voor levende cellen en apoptotische cellen, maar vlekken dode cellen30. Dit stelt ons in staat om de dode cellen (rood en groen), apoptotische cellen (groene fluorescentie) en levende cellen (weinig of geen fluorescentie) te identificeren met behulp van een flow-cytometer met de 488 nm-lijn van een argon-Ion-laser voor excitatie.
Voor DHE kleuring van de Drosophila gut, is het belangrijk om de kleurstof te reconstitueren met DMSO vlak voordat u het experiment start, omdat langdurige opslag kan leiden tot een auto-oxidatie van de kleurstof die de kleurstof in donkere/paars kleur31verandert, 32. Daarnaast hebben de gereconstitueerde voorraadoplossingen ook de neiging om vrij snel te vervallen, dus men moet letten op de "houdbaarheidsdatum". Als alternatief kunnen fluorogene sondes zoals de groene versie van de fotostabiele sonde, die het extra vermogen heeft om te worden gemultiplext met vlekken, en produceert veel duidelijker signalen dan DHE, kan worden gebruikt. De ontleed darm werd overgebracht naar het medium van Schneider met de kleurstof in de gewenste concentratie zonder fixeermiddel. Dit is om de opname van de kleurstof in levende cellen mogelijk te maken, en daarom wordt kleuring uitgevoerd in het kweekmedium, om een betere ademhaling van de cellen mogelijk te maken.
Met betrekking tot de kwantatie van DHE-kleuring, voor een begin, Vermijd verzadiging van de pixels in het besturingselement onbehandelde cellen. Het Imaging softwareprogramma is gebruikt om de belichtingstijd te bepalen door verzadigde pixels visueel te markeren. Het onbehandelde monster werd gebruikt om de blootstellingstijd in te stellen en dezelfde parameters te behouden bij het vastleggen van afbeeldingen voor een vergelijking van de intensiteit over verschillende behandelingsgroepen, wat belangrijk is voor de kwantificering van de fluorescentie beeld intensiteit later. Het is essentieel om alle afbeeldingen te verwerven (controle en behandelde monsters) met behulp van dezelfde systeem en acquisitie-instellingen/parameters, en de achtergrond moet worden gestandaardiseerd voor alle afbeeldingen (zodat er consistentie voor achtergrond aftrekken)33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De studie werd ondersteund door het subsidie nummer R706-000-043-490. De studie vertegenwoordigt niet de mening van de subsidie sponsor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15% Methyl 4-Hydroxybenzoate | Sigma Aldrich | ||
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Bacto Agar | BD biosciences | ||
| cncCK6/TM3, Sb | a gift from Dr. Kerppola T | ||
| Cornmeal, glucose, yeast brewer | Sigma Aldrich | ||
| CyAn ADP with Summit Software | DAKO | https://flow.usc.edu/files/2014/07/BC-Cyan-ADP-User-Guide-2016.pdf | |
| Dihydroethidium (Hydroethidine) | Thermo Fisher Scientific | D11347 | |
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD biosciences | 556547 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | ||
| Glucolin | Supermarket | ||
| ImageJ software | NIH | ||
| MRC5 human lung fibroblast | ATCC | CCL-171 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fisher Scientific | 21720-024 | |
| Vectashield antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wild-type Canton-S; Sod2N308/CyO | NIG-FLY | ||
| Zinc Oxide Nanoparticles | Sigma Aldrich | 721077 | Refer Sheet 2 |
References
- Kim, Y. R., et al. Toxicity of 100 nm zinc oxide nanoparticles: a report of 90-day repeated oral administration in Sprague Dawley rats. International Journal of Nanomedicine. 9 Suppl 2, 109-126 (2014).
- Xie, Y., He, Y., Irwin, P. L., Jin, T., Shi, X. Antibacterial activity and mechanism of action of zinc oxide nanoparticles against Campylobacter jejuni. Applied and Environmental Microbiology. 77, 2325-2331 (2011).
- Colvin, V. L. The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature Biotechnology. 21, 1166-1170 (2003).
- De Angelis, I., et al. Comparative study of ZnO and TiO(2) nanoparticles: physicochemical characterisation and toxicological effects on human colon carcinoma cells. Nanotoxicology. 7, 1361-1372 (2013).
- Johnson, B. M., et al. Acute exposure to ZnO nanoparticles induces autophagic immune cell death. Nanotoxicology. 9, 737-748 (2015).
- Singh, N., et al. NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials. 30, 3891-3914 (2009).
- Song, W., et al. Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. Toxicology Letters. 199, 389-397 (2010).
- Wahab, R., et al. ZnO nanoparticles induced oxidative stress and apoptosis in HepG2 and MCF-7 cancer cells and their antibacterial activity. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 117, 267-276 (2014).
- Namvar, F., et al. Cytotoxic effects of biosynthesized zinc oxide nanoparticles on murine cell lines. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2015, (2015).
- Wong, S. W., Leung, P. T., Djurisic, A. B., Leung, K. M. Toxicities of nano zinc oxide to five marine organisms: influences of aggregate size and ion solubility. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396, 609-618 (2010).
- Hua, J., Vijver, M. G., Richardson, M. K., Ahmad, F., Peijnenburg, W. J. Particle-specific toxic effects of differently shaped zinc oxide nanoparticles to zebrafish embryos (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry. 33, 2859-2868 (2014).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Alaraby, M., Annangi, B., Hernandez, A., Creus, A., Marcos, R. A comprehensive study of the harmful effects of ZnO nanoparticles using Drosophila melanogaster as an in vivo model. Journal of Hazardous Materials. 296, 166-174 (2015).
- Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicology and Teratology. 32, 74-83 (2010).
- Ong, C., Yung, L. Y., Cai, Y., Bay, B. H., Baeg, G. H. Drosophila melanogaster as a model organism to study nanotoxicity. Nanotoxicology. 9, 396-403 (2015).
- Hoffmann, J. A., Reichhart, J. M. Drosophila innate immunity: an evolutionary perspective. Nature Immunology. 3, 121-126 (2002).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Jennings, B. H. Drosophila - a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14, 190-195 (2011).
- Adams, M. D., Sekelsky, J. J. From sequence to phenotype: reverse genetics in Drosophila melanogaster. Nature Reviews Genetics. 3, 189-198 (2002).
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287, 2185-2195 (2000).
- Ong, C., et al. Silver nanoparticles disrupt germline stem cell maintenance in the Drosophila testis. Scientific Reports. 6, (2016).
- Alaraby, M., Demir, E., Hernandez, A., Marcos, R. Assessing potential harmful effects of CdSe quantum dots by using Drosophila melanogaster as in vivo model. Science of the Total Environment. 530-531, 66-75 (2015).
- Barik, B. K., Mishra, M. Nanoparticles as a potential teratogen: a lesson learnt from fruit fly. Nanotoxicology. , 1-27 (2018).
- Jovanovic, B., et al. The effects of a human food additive, titanium dioxide nanoparticles E171, on Drosophila melanogaster - a 20 generation dietary exposure experiment. Scientific Reports. 8, (2018).
- Cao, Y. The Toxicity of Nanoparticles to Human Endothelial Cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1048, 59-69 (2018).
- Akhtar, M. J., Ahamed, M., Alhadlaq, H. A., Alshamsan, A. Mechanism of ROS scavenging and antioxidant signalling by redox metallic and fullerene nanomaterials: Potential implications in ROS associated degenerative disorders. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1861, 802-813 (2017).
- Akter, M., et al. A systematic review on silver nanoparticles-induced cytotoxicity: Physicochemical properties and perspectives. Journal of Advanced Research. 9, 1-16 (2018).
- Vecchio, G. A fruit fly in the nanoworld: once again Drosophila contributes to environment and human health. Nanotoxicology. 9, 135-137 (2015).
- Marino, G., Kroemer, G. Mechanisms of apoptotic phosphatidylserine exposure. Cell Research. 23, 1247-1248 (2013).
- Stoddart, M. J. Cell Viability Assays: Introduction. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. , Chapter 1 (2011).
- Yazdani, M. Concerns in the application of fluorescent probes DCDHF-DA, DHR 123 and DHE to measure reactive oxygen species in vitro. Toxicology in Vitro. 30, 578-582 (2015).
- Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. Analysis of kinetics of dihydroethidium fluorescence with superoxide using xanthine oxidase and hypoxanthine assay. Annals of Biomedical Engineering. 41, 327-337 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14.15 (2013).
