כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.
חיידקים צורה מורכבת מיקרו-המוני microbiomes מעוצב על ידי חיידקים אינטראקציה, אורגניזמים גדולים יותר, הסביבה אביוטיים. בתנאי מעבדה, מושבת ריזוספירה באמצעות גידול בקטריה לקידום חיידקים (PGPB) יכול להגביר את הבריאות או פיתוח של צמחים מארחים ביחס לצמחים uncolonized. עם זאת, בהגדרות שדה, טיפולים חיידקיים עם PGPB לעתים קרובות לא מספקים יתרונות משמעותיים יבולים. הסבר אחד הוא כי זה עשוי להיות עקב אובדן של PGPB במהלך האינטראקציות עם חיידקים בקרקע אנדוגניים על תוחלת החיים של הצמח. אפשרות זו הייתה קשה לאישור, מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בקולוניזציה הראשונית ולא בתחזוקת PGPB בתוך קהילות הריון. היפותזה כאן היא כי האסיפה, דו-קיום, ותחזוקה של קהילות חיידקי מעוצבים על ידי תכונות דטרמיניסטיות של הסביבה מיקרוזוספירה, וכי אינטראקציות אלה עלולות להשפיע על הישרדות PGPB בהגדרות מקוריות. כדי ללמוד התנהגויות אלה, הידרופוני צמח-צמיחה ממוטבת באמצעות Arabidopsis thaliana לכמת ולהמחיש את ההתפלגות המרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברת צמיחה שונים סביבות. מערכת זו של המערכת ואת כלי השירות מאומתים אז עם היטב-למד PGPB פסאודומונס simiae. כדי לחקור כיצד נוכחות של מינים חיידקיים מרובים עשויים להשפיע על הקולוניזציה והדינמיקה תחזוקה על שורש הצמח, קהילה מודל משלושה זנים חיידקיים ( Arthrobacter, curtobacterium, ו microbacterium מינים) מבודדים במקור מתוך מבנה הבית . זה מראה כי הנוכחות של מינים אלה חיידקים מגוונים ניתן למדוד באמצעות זה ידרופוני צמח-maintanence שיטת, אשר מספק אלטרנטיבה מבוססי רצף לימודי הקהילה החיידקית. מחקרים עתידיים באמצעות מערכת זו עשויים לשפר את ההבנה של התנהגות חיידקית של microbiomes צמח רב מינים לאורך זמן, בתנאים סביבתיים שינוי.
הרס יבול על ידי מחלות חיידקי ופטרייתי תוצאות הוריד מזון והוא יכול לשבש באופן חמור את היציבות הגלובלית1. מבוסס על גילוי כי חיידקים בקרקעות מדכאים אחראים על הגדלת בריאות הצמח2, מדענים שאלו אם מיקרובידום הצמח יכול להיות ממונף כדי לתמוך בצמיחה הצמח על ידי שינוי הנוכחות והשפע של מסוים מין חיידקי3. חיידקים שנמצאו כדי לסייע בצמיחה הצמח או פיתוח הם באופן קולקטיבי הצומח צמיחה-קידום חיידקים (PGPB). לאחרונה, מחקרים השתנו פשוט לזיהוי PGPB פוטנציאלי כדי להבין כיצד אינטראקציה בין הממלכה בקרקע, סביב שורשים, או בתוך הריון (האזור שמסביב ישירות וכולל משטח השורש) עשוי להשפיע PGPB פעילות4.
הקולוניזציה של ריזוספירה על ידי PGPB יכול להגביר את הבריאות או התפתחות של צמחים מארחים בתגובה לשעולים מגוונים ביחס הצמחים לבטל הכובש5. עם זאת, התוצאות הן לעתים קרובות יותר משתנה בתנאי הקרקע הילידים לעומת אלה שנצפו בחממה מבוקרת היטב הגדרות מעבדה6. השערה אחת להבדל זה היא כי הצמיחה או התנהגות של pgpb יכול להיות מעוכבים על ידי חיידקים הקרקע הילידים או פטריות בשדות7,8. השפעות מועילות על ידי חיידקים ריזוספירה תלויים בדרך כלל על היכולת של חיידקים 1) לאתר ולנוע לעבר השורש, 2) ליישב את השורש באמצעות היווצרות ביוilm, ו 3) אינטראקציה עם הצמח המארח או פתוגנים באמצעות ייצור של מולקולה קטנה מטבוליטים7,9. כל אחד מאותם התנהגויות מושבת עשוי להיות מושפע על ידי נוכחות ופעילות של חיידקים שכנים10.
עיצבנו מערכת לכמת ולהמחיש את שלבי הקולוניזציה החיידקית הנפרדים של הריזוספירה (איור 1). גישה זו תסייע למחקרים לחקור מדוע תחזוקה לטווח ארוך PGPB הוא לפעמים לא נצפתה לאחר העברת צמחים לסביבות חדשות, כגון במהלך השתילה של שתילים מחוסנת מראש. Arabidopsis thaliana כפי שנבחרו כמודל צמח בשל השימוש הנרחב שלה לימודי מעבדה, כמו גם נתונים מספיק זמין על אינטראקציות מיקרוביאלית שלה11. ישנם שלושה שלבים במערכת: 1 . thaliana צמיחה, 2) מושבת חיידקים, ו 3) שמירה חיידקית (ראה איור 1). מכיוון ש -thaliana היא צמח יבשתי, היה חשוב להבטיח כי זה לא סבל לחץ מים מופרז במערכת ידרופוני12. בהשראת השיטות בשימוש על ידי Haney et al.13, השתילים גדלים על רשת פלסטיק כדי להפריד את לירות מתוך מדיום הצמיחה נוזל. מערכת זו אינה מהווה פגיעה בבריאות ובפיתוח של מארח הצמח, והיא משפרת את צמיחת ה -thaliana בנוזל משנת11. כמו הצמח לירות צף מעל פני השטח, השורשים חשופים לחלוטין הקולוניזציה על ידי חיידקים מחוסן לתוך בינוני נוזלי הצמיחה חיידקי. זה מתיר חיידקים של עניין להיבדק עבור מושבת חומרים מזינים כי הם התורמת ביותר לצמיחה, בעוד אז הסטה תנאים כדי לאפשר לצמח להמשיך לצמוח במדיום מזינים שנועד לתמוך בצמיחה שלה. שני השלבים כוללים טלטול קבוע כדי למנוע אנאוקאיה של שורש13. חיידקים יכולים להיות מדמיינו או כימות מן השורשים הצמח לאחר העברת מתוך מדיום או מדיום תחזוקה. מערכת ידרופוני זו היא גמישה מאוד, המאפשר תנאים ניסיוניים ומלחצים שהוחלו להשתנות בקלות בהתאם לאינטרסים של החוקרים.
שיטה זו מתוארת חשובה בהקשר של גוף הספרות הגדול יותר על אינטראקציות של חיידק הצמח, משום שהיא מספקת מערכת חזקה לחקר אינטראקציות אלה במשטח השורש, בעוד שניתן להתאמה אישית להעדפות הצמיחה של חיידקים שונים. מעבדות ביולוגיה של הצמח לעתים קרובות ביצוע ניסויים מושבת חיידק המפעל על מוצק אגר, המאפשר תנועה מישורי בלבד (אם זה) של חיידקים תוך דרישה גם מניפולציה הרסנית פוטנציאלי של צמחים במהלך ההעברה הבאה. לעומת זאת, מעבדות מיקרוביולוגיה מעדיפות לעתים קרובות את בריאותם של החיידקים בתוך הניסויים שלהם, לרעת הצמחים14,15. סדרי עדיפויות שונים אלה של מעבדות צמחים ומיקרוביולוגיה ממוקדת היסטורית הפכו את זה קשה להשוות את התוצאות בין קבוצות אלה, מאז כל אחד בדרך כלל מייעל את התנאים הניסיוניים כדי לייעל את האורגניזם שלהם עניין15. מערכת צף-שינוי-צמח-הצמיחה המתואר כאן מונע שרידה צמח מלא, יתרון בולט למחקרים קודמים מונחה מיקרוביולוגיה, תוך שזמנית גם אופטימיזציה של הצמיחה והישרדות של חיידקים כדי להקל על הקולוניזציה. לפיכך, שיטת הטיפול שאנו מציגים כאן עשויה להתייחס לחששות משני הביולוגים של הצמח (על שחות יתר ומניפולציה מישוש של הצמח) תוך סיפוק הקריטריונים של מיקרוביולוגים (המאפשרים התפתחות שונה של הגידול בקטריאלי ומספר אינטראקציות של מינים)7. פרוטוקול זה נועד להיות ישימה לשימוש עם חיידקים שונים, צמחים, ותנאים סביבתיים.
צמחים בכל הסביבות אינטראקציה עם אלפים למיליוני חיידקים שונים ופטריות5,7. אינטראקציות אלה יכולות להשפיע בצורה שלילית וחיובית על בריאות הצמח, עם השפעות פוטנציאליות על תפוקת יבול וייצור מזון. העבודה האחרונה מרמזת גם כי התיישבות משתנה של יבולים על ידי PGPBs עשוי ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מחקר שסופקו על ידי המחלקה למחקר ביולוגי וסביבתי של אנרגיה (DOE-BER 0000217519 כדי E.A.S.), הקרן הלאומית למדע (השראה IOS-1343020 ל-E. A. S). SLH תמך גם על ידי תוכנית המלגות למחקר בוגרת קרן המדע הלאומית. אנו מודים לד ר ג’פריס דאדל על מתן זנים חיידקיים ותובנה לא יסולא בפז. אנו מודים לד ר אנדרו קליין ומת ג’יי פאוורס להצעות נסיוניות. לבסוף, SLH רוצה להודות לקשרים על מדיה חברתית על שהזכיר לנו כי הפצת המדע היא זכות ואחריות, במיוחד באמצעות אמצעים יצירתיים ונגישים.
Required Materials | |||
1.5 mL eppendorf tubes | any | N/A | |
24-well plates | BD Falcon | 1801343 | |
Aeraseal | Excel Scientific | BE255A2 | |
Autoclave | any | N/A | |
Bacteria of Interest | any | N/A | Stored at -80˚C in 40% glycerol preferred |
BactoAgar | BD | 2306428; REF 214010 | |
bleach | any | N/A | |
Conviron | any | N/A | Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21˚C, with inner power outlet |
Dessicator Jar: glass or heavy plastic | any | N/A | |
Ethanol | any | N/A | |
Flame | any | N/A | |
Forceps | any | N/A | |
Incubator | any | N/A | At optimal temperature for growth of specified bacteria |
Hydrochloric Acid | any | N/A | |
Lennox LB Broth | RPI | L24066-1000.0 | |
Microcentrifuge | any | N/A | |
Micropipetters | any | N/A | Volumes 5 µL to 1000 µL |
Microscope (preferably fluorescence) | any | N/A | Could be light if best definition not important |
MS Salts + MES | RPI | M70300-50.0 | |
Orbital Plate Shaker | any | N/A | Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours |
Petri Dishes | any | N/A | 50 mL total volume |
Reservoirs | any | N/A | |
Spectrophotometer | any | N/A | |
Standard Hole Punch | any | N/A | Approximately 7mm punch diameter |
Sterile water | any | N/A | |
Surgical Tape | 3M | MMM1538-1 | |
Teflon Mesh | McMaster-Carr | 1100t41 | |
Ultrasonicator | any | N/A | |
Vortex Mixer | any | N/A | |
X-gal | GoldBio | x4281c | other vendors available |
Suggested Materials | |||
24 Prong Ultrasonicator attachment | any | N/A | For sonicating multiple samples at once. Can be done individually |
Alumaseal II | Excel Scientific | FE124F | |
Glass beads | any | N/A | |
Multipetter/Repetter | any | N/A | |
Sterile 96-well plates | any | N/A | For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes |
Biological Materials Used | |||
Arabidopsis thaliana seeds | any | N/A | We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks |
Arthrobacter nicotinovorans | Levy, et al. 2018 | ||
Curtobacterium oceanosedimentum | Levy, et al. 2018 | ||
Microbacterium oleivorans | Levy, et al. 2018 | ||
Pseudomonas simiae WCS417r | Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017 |