Summary
Een procedure wordt gepresenteerd om te visualiseren van proteïne kinase een activiteiten in hoofd-vaste, gedragen muizen. Een verbeterde A-kinase activiteit Reporter, tAKARα, wordt uitgedrukt in corticale neuronen en toegankelijk gemaakt voorbeeld vorming door middel van een craniaal venster. Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie wordt gebruikt om PKA-activiteiten in vivo te visualiseren tijdens gedwongen motoriek.
Abstract
Neuromodulatie oefent een krachtige controle over de hersenfunctie uit. Dysfunctie van neuromodulatoire systemen resulteert in neurologische en psychiatrische stoornissen. Ondanks hun belang, zijn technologieën voor het bijhouden van neuromodulatoire gebeurtenissen met cellulaire resolutie net begonnen te ontstaan. Neuro modulatoren, zoals dopamine, noradrenaline, acetylcholine, en serotonine, trigger intracellulaire signalering gebeurtenissen via hun respectieve G eiwit-gekoppelde receptoren te moduleren neuronale prikkelbaarheid, synaptische communicatie, en andere neuronale functies, waardoor de informatieverwerking in het neuronale netwerk wordt gereguleerd. De bovengenoemde neuro modulatoren convergeren op het kamp/proteïne kinase A (PKA) traject. Daarom werd in vivo PKA-beeldvorming met eencellige resolutie ontwikkeld als een uitlezen voor neuromodulatoire gebeurtenissen op een manier die analoog is aan calcium beeldvorming voor neuronale elektrische activiteiten. Hierin wordt een methode gepresenteerd om de PKA-activiteit te visualiseren op het niveau van individuele neuronen in de cortex van hoofd-gefixeerde muizen. Om dit te doen, wordt een verbeterde A-kinase activiteit Reporter (AKAR), genaamd tAKARα, gebruikt, die is gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Deze genetisch gecodeerde PKA-sensor wordt in de motorische cortex geïntroduceerd via in utero-elektroporation (IUE) van DNA-plasmiden, of stereotaxic injectie van Adeno-associated virus (AAV). FRET changes worden afgebeeld met behulp van Two-photon fluorescentie Lifetime Imaging microscopie (2pFLIM), dat voordelen biedt ten opzichte van ratiometrische FRET metingen voor het kwantificeren van het FRET signaal in lichtverstrooiing hersenweefsel. Om PKA-activiteiten te bestuderen tijdens gedwongen motoriek, wordt tAKARα afgebeeld via een chronisch craniale venster boven de cortex van wakker, hoofd-vaste muizen, die rennen of rusten op een gemotoriseerde loopband met snelheidscontrole. Deze beeldvormings benadering zal van toepassing zijn op vele andere hersengebieden om overeenkomstige door gedrag geïnduceerde PKA-activiteiten en andere op FLIM gebaseerde sensoren voor in vivo-beeldvorming te bestuderen.
Introduction
Neuromodulatie, ook bekend als langzame synaptische transmissie, legt sterke controle over de hersenfunctie tijdens verschillende gedrags toestanden, zoals stress, opwinding, aandacht, en motoriek1,2,3, 4. ondanks het belang ervan, is de studie van wanneer en waar neuromodulatory gebeurtenissen plaatsvinden nog in de kinderschoenen. Neuro modulatoren, met inbegrip van acetylcholine, dopamine, noradrenaline, serotonine, en vele neuropeptides, activeren G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs), die op zijn beurt trigger intracellulaire tweede Messenger trajecten met een breed venster van tijdschema's variërend van seconden tot uren. Terwijl elke neuromodulator activeert een aparte set van signalering van gebeurtenissen, de Camp/proteïne kinase a (PKA) traject is een gemeenschappelijk stroomafwaarts traject voor vele neuro modulatoren1,5. De Camp/pKa traject regelt neuronale prikkelbaarheid, synaptische transmissie, en plasticiteit6,7,8,9, en daarom, stemt de neuronale netwerk dynamiek. Omdat verschillende neuronen of neuronale typen Express verschillende soorten of niveaus van neuromodulator receptoren10, de intracellulaire effecten van de dezelfde extracellulaire neuromodulator kunnen heterogenen over verschillende neuronen, en dus, moeten worden bestudeerd met cellulaire resolutie. Tot nu toe, het blijft uitdagend om te controleren van neuromodulatory gebeurtenissen in individuele neuronen in vivo tijdens gedrag.
Om de spatiotemporele dynamiek van neuromodulatie te bestuderen, is een geschikte opname modaliteit vereist. Microdialyse en Fast-scan cyclische voltammetrie worden vaak gebruikt voor het bestuderen van de release van neuro modulatoren, maar ze missen de ruimtelijke resolutie voor het bewaken van cellulaire gebeurtenissen11,12. Analoog aan calcium dynamica wordt gebruikt als een proxy voor neuronale elektrische activiteit in de populatie Imaging13, pKa Imaging kan worden gebruikt om te lezen neuromodulatory gebeurtenissen over een neuronale populatie bij cellulaire resolutie. Het huidige protocol beschrijft het gebruik van een verbeterde A-kinase activity Reporter (AKAR) om PKA-activiteiten in vivo te monitoren tijdens het gedrag van dieren. De hier beschreven methode zorgt voor gelijktijdige beeldvorming van neuronale populaties op subcellulaire resolutie met een tijdelijke resolutie die fysiologische neuromodulatoire gebeurtenissen bijhoudt.
Akars zijn samengesteld uit een donor en een acceptor fluorescerende eiwitten gekoppeld door een pKa fosforylatie substraat peptide en een Forkhead geassocieerde (FHA) domein dat bindt aan de fosforylated serine of Threonine van de ondergrond14,15. Na activering van het PKA-traject is de substraat Peptide van AKAR gefosforyleerd. Dientengevolge, het FHA domein bindt aan de fosforylated substraat peptide, waardoor de twee fluor Foren in de nabijheid, aangeduid als de gesloten staat van AKAR. De gesloten toestand van een gefosforyleerd AKAR resulteert in verhoogde Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen de donor en acceptor fluophores. Aangezien het aandeel fosforylated akars gerelateerd is aan het niveau van PKA-activiteit16, kan de hoeveelheid fret in een biologisch monster worden gebruikt om het niveau van PKA-activiteit16,17,18te kwantificeren, 19,20.
Vroege versies van AKARs werden voornamelijk ontworpen voor tweekleurige ratiometrische beeldvorming14. Bij beeldvorming dieper in hersenweefsel lijdt de ratiometrische methode aan signaalvervorming als gevolg van golflengte afhankelijke lichtverstrooiing17,18,21. Zoals hieronder besproken, elimineert fluorescentie Lifetime Imaging microscopie (flim) dit probleem omdat flim alleen fotonen meet die worden uitgezonden door de donor de18,21. Hierdoor wordt de FLIM kwantificering van FRET niet beïnvloed door de weefsel diepte17. Daarnaast kan een "donkere" (d.w.z. lage kwantum opbrengst [QY]) variant van de acceptor de worden gebruikt. Dit bevrijdt een kleurkanaal om Multiplexed meting van orthogonale neuronale eigenschappen mogelijk te maken via gelijktijdige beeldvorming van een tweede sensor of een morfologische marker17,19,20.
Flim Imaging kwantificeert de tijd dat een de in de opgewonden toestand doorbrengt, d.w.z. de fluorescentie levensduur18. De terugkeer van een de naar de grond staat, dus het einde van de opgewonden toestand, vaak gelijktijdig met de uitstoot van een foon. Hoewel de emissie van een foon voor een individueel opgewonden molecuul stochastisch is, is de gemiddelde fluorescentie levensduur een kenmerk van die specifieke fluorophore. Wanneer een zuivere populatie fluoroforen tegelijkertijd opgewonden is, zal de resulterende fluorescentie één exponentieel verval volgen. De tijds constante van dit exponentiële verval komt overeen met de gemiddelde fluorescentie levensduur, die meestal varieert van één tot vier nanoseconden voor fluorescerende eiwitten. De terugkeer van een opgewonden donor de naar de grond staat kan ook voorkomen door fret. In aanwezigheid van fret wordt de fluorescentie levensduur van de donor de verlaagd. De ongefosforyleerde AKARs vertonen een relatief langere levensduur van de donor fluorescentie. Na fosforylering door PKA vertoont de sensor een kortere levensduur omdat de donor-en acceptor-fluoroforen in de buurt van elkaar worden gebracht en de FRET toeneemt. De kwantificering van de fluorescentie levensduur in een populatie van AKARs vertegenwoordigt daarom het niveau van PKA activiteit.
Vroege versies van AKARs zijn niet met succes gebruikt voor in vivo beeldvorming bij eencellige resolutie. Dit is voornamelijk te wijten aan de lage signaalamplitude van de AKAR-sensoren voor fysiologische activaties17. Onlangs, door het systematisch vergelijken van beschikbare AKAR-sensoren voor twee-Fobe fluorescentie levensduur beeldvormings microscopie (2pFLIM), werd een sensor genaamd FLIM-AKAR gevonden om beter te presteren dan alternatieve sensoren. Bovendien werden een reeks FLIM-AKAR varianten genaamd targeted AKARs (tAKARs) ontwikkeld om de PKA activiteit te visualiseren op specifieke subcellulaire locaties: microtubuli (tAKARα), cytosol (tAKARβ), actine (takarδ), filamenteuze actine (takarε), membraan (tAKARγ), en postsynaptische dichtheid (Takari). Onder tAKARs, tAKARα verhoogde de amplitude van het signaal opgewekt door noradrenaline door 2,7-fold. Dit is in overeenstemming met de kennis dat de meerderheid van pKa in neuronen zijn verankerd aan microtubuli in rusttoestand22,23. tAKARα was de beste performer onder bestaande AKARs voor 2pFLIM. Bovendien, tAKARα gedetecteerd fysiologisch relevante PKA activiteit opgewekt door meerdere neuro modulatoren, en de uitdrukking van tAKARα veranderd neuronale functies17.
Onlangs werd tAKARα met succes gebruikt om PKA-activiteiten te visualiseren in Head-Fixed met muizen17. Er werd aangetoond dat gedwongen motoriek de PKA-activiteit veroorzaakte in het SOMA van de oppervlakkige laag neuronen (laag 1 tot en met 3, tot een diepte van ~ 300 μm van Pia) in de motor, het vat en de visuele cortices. De motoriek-geactiveerde PKA activiteit was deels afhankelijk van signalering via β-adrenerge receptoren en D1 dopamine receptoren, maar werd niet beïnvloed door een D2 dopamine receptor antagonist. Dit werk illustreert het vermogen van tAKARs om neuromodulatie-gebeurtenissen in vivo te volgen met behulp van 2pFLIM.
In het huidige protocol wordt de gehele methode voor PKA-activiteit beeldvorming in in het hoofd vaste wakker muizen tijdens een afgedwongen bewegings paradigma beschreven in zes stappen. Ten eerste, de toevoeging van 2pFLIM-capaciteiten aan een conventionele twee-Fobe Microscoop (Figuur 1). Ten tweede, de aanleg van een gemotoriseerde loopband (Figuur 2). Ten derde, de uitdrukking van de tAKARα-sensor in de cortex van de muis door in utero-elektroporation (IUE) van DNA-plasmiden, of stereotaxus injectie van Adeno-associated virus (AAV). Uitstekende protocollen voor operaties voor iue24,25 en stereotaxic injectie van virale deeltjes26 zijn eerder gepubliceerd. De belangrijkste parameters die we gebruikten, worden hieronder beschreven. De installatie van een craniaal venster. Uitstekende protocollen zijn eerder gepubliceerd voor craniale Window chirurgie27,28. Verschillende stappen die zijn gewijzigd van de standaardprotocollen worden beschreven. Ten vijfde, presteren in vivo 2pFLIM. Zesde, de analyses van 2pFLIM beelden (Figuur 3 en Figuur 4). Deze aanpak moet gemakkelijk toepasbaar zijn op vele andere hoofd-vaste gedrags paradigma's en hersengebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van Oregon Health and Science University.
1.2pFLIM Microscoop Setup
- Installeer een foton timing tellings module (ptcm, tabel met materialen) en maak verbinding met de computer (Figuur 1) volgens de handleiding van de fabrikant.
Opmerking: De ptcm is meestal een computer bord dat een "Sync" input ontvangt voor de laser Pulse timing en een foton input van de fotomultiplicator Tube (PMT). Het ontvangt ook Klok timing voor pixels, lijnen en kaders, van twee-Photon Imaging Control software. De PTCM gebruikt de klok signalen om afzonderlijke fotonen in verschillende pixels en kaders te scheiden. - Voeg een fotodiode toe met > 200 MHz bandbreedte om de laser timing te meten. Plaats een standaard glazen dekglaasje in het lichtpad om een kleine fractie van het laserlicht weer te geven in de fotodiode die loodrecht op het lichtpad is geplaatst (Figuur 1). Sluit de uitgang van de fotodiode aan op de "Sync" ingang van de PTCM.
Opmerking: Veel moderne lasers uitvoeren ook de laser timing. Voor deze lasers, de fotodiode is niet nodig, en men kan direct de laser timing uitgang aansluiten op de Sync ingang van de PTCM. -
Wissel de bet, in het geval van de tAKARα, de groene kanaal PMT, met een lage ruis, Fast GaAsP PMT (Figuur 1). Sluit de PMT-uitgang aan op de signaal ingang van de PTCM.
- Voeg een optionele signaalsplitter toe (Figuur 1) als gelijktijdige verwerving van de intensiteit door het conventionele Two-photon Imaging Channel gewenst is. Sluit de PMT-uitgang aan op de signaalsplitter en verbind de splitter uitgang met de PTCM en de conventionele twee-Photon Imaging module.
Opmerking: Gaasp pmts geven snellere single-foton signalen dan conventionele bialkali pmts en zorgen voor een preciezere bepaling van de foton timing. Bepaalde modellen van GaAsP PMTs kunnen worden gekoeld tot 10 − 35 °C onder de omgevingstemperatuur, waardoor de onderdrukking van donkere graven tot een niveau onder een paar honderd per seconde (meestal ≤ 200 tellingen/s). Dit lage geluidsniveau is belangrijk voor het nauwkeurig meten van fluorescentie levensduur, omdat Noise foton niet gemakkelijk kan worden onderscheiden of afgetrokken van de fluorescentie Lifetime curve.
- Voeg een optionele signaalsplitter toe (Figuur 1) als gelijktijdige verwerving van de intensiteit door het conventionele Two-photon Imaging Channel gewenst is. Sluit de PMT-uitgang aan op de signaalsplitter en verbind de splitter uitgang met de PTCM en de conventionele twee-Photon Imaging module.
- Voeg een band-pass fluorescentie-emissie filter toe dat de spectrale contaminatie, indien van de enige, minimaliseert van de acceptor fluorophore. Voor takarα wordt bijvoorbeeld een barrière filter van 500 nm ± 20 Nm voor het groene kanaal gebruikt om de verontreiniging van het sreach te verminderen, wat een donker (QY ~ 0,07) geel fluorescerend eiwit (yfp)29,30is. Verbind timing signalen, zoals de klokken voor individuele beeldpixels, lijnen en kaders, afhankelijk van de besturingssoftware en beschreven in de gebruikershandleiding van PTCM. Installeer de juiste software voor gegevensbeheer en acquisitie.
Opmerking: Sommige PTCM-fabrikanten (tabel met materialen) leveren hun software voor 2pFLIM Imaging. Hier wordt aangepaste software genaamd FLIMimage gebruikt, die werd ontwikkeld door het Yasuda Lab (Max Planck Florida, via persoonlijke communicatie). Deze software functioneert als een add-on gebruikersfunctie voor bepaalde twee-photon acquisitie software (tabel van materialen). Het controleert en communiceert met de PTCM op de juiste timing tijdens Two-photon Imaging om 2pFLIM-afbeeldingen te verkrijgen.
2. bouw van een gemotoriseerde loopband
Opmerking: Het ontwerp van de op maat gebouwde gemotoriseerde loopband wordt weergegeven in Figuur 2.
- Snijd een Foam roller (Ø = 200 mm) tot 150 mm in lengte met een fijne ijzerzaag. Als alternatief, lijm de twee helften van een schuim bal samen en plaats tape over de naad. Lijm eventueel een rubberen mat met profiel op de roller om de tractie op de roller te vergroten.
- Boor een 1/4 inch diameter gat door het midden van de roller aan de platte kant van de roller of boor een 1/4 inch diameter gat door het midden van elke helft van de bal als de Foam Ball wordt gebruikt.
-
Installeer een 1/4 inch diameter stalen as door het gat. Lijm de Foam roller/Ball op de as met Foam-compatibele lijm. Wijzig desgewenst twee flexibele askoppelingen (1/4 inch binnendiameter) om de koppeling van de as aan de Foam roller/Ball te versterken.
Opmerking: Houd er rekening mee dat veel voorkomende lijmen schuim kunnen ontbinden.- Plaats voor elke askoppeling de askoppeling op de platte zijde en in het midden van de rechthoekige metalen plaat (0,7 mm x 15 mm x 76 mm). Las de plaat op de askoppeling. Boor een 1/4 inch gat in het midden van de plaat om toe te staan voor de installatie van de gemodificeerde askoppeling op de as en twee schroefgaten in de metalen plaat laterale van het centrum.
- Installeer de askoppeling op de as tegen de Foam roller/Ball. Als u de laatste gebruikt, buigt u de plaat enigszins om de kromming van de bal te passen. Plaats de schroeven in de laterale gaten om de roller/bal op de as vast te zetten.
- Boor en tik op een 3/8-32-schroefdraad in het midden van een kooi plaat en installeer de roterende encoder. Boor een schroefgat in de basis van de haakse motor beugel om de bevestiging van de motor op de post houder mogelijk te maken. Bevestig zowel de roterende encoder als de motor aan het uiteinde van de as met behulp van een flexibele askoppeling.
- Installeer de gemonteerde loopband op een aluminium brood bord met behulp van palen voor de motor en de roterende encoder (Figuur 2). Sluit de motor ingangen aan op de snelheidsregelaar en de roterende encoder uitgang naar een analoge ingang van de computer Data Acquisition (DAQ) Board.
Opmerking: De rotatiehoek snelheid wordt gecodeerd door de roterende encoder als voltage en wordt gedigitaliseerd met behulp van aangepaste software genaamd AnimalTracker geschreven in MATLAB. - Installeer de houder die compatibel is met de Hoofdplaat op een rechte hoek beugel. Installeer een solide paal op de brood plaat voor de loopband en installeer de gemonteerde kopplaat houder met de haakse beugel op de paal (Figuur 2). Zorg ervoor dat de kopplaat houder staven zijn uitgelijnd met de as, zodat de muis een adequate en comfortabele loop positie op de loopband kan nemen (figuur 2c).
3. expressie van tAKARα-sensor in de muis cortex
-
In utero elektroporation
- Bereid een DNA-oplossing voor iue door toevoeging van 0,2% eindconcentratie van snelle groene kleurstof (voor visualisatie tijdens injectie) aan een plasmide DNA (3 − 4 μg/μL; de sensor constructies met een CAG-promotor, sensor sequentie en een Groundhog Hepatitis-virus post-transcriptionele respons element [wpre] translationeel Enhancer) opgelost/verdund in water of tris-EDTA.
- Maak een getimede zwangere vrouwelijke muis (bijv. C57BL/6) voor IUE op e1624. Anesthetiseer de muis met Isofluraan (4% voor inductie en 1,5% voor onderhoud, op 95% O2 met 5% Co2) en breng subcutane injectie van peri-operatieve analgetica aan met 5 mg/kg Meloxicam en 4 mg/kg bupivacaine. Snijd de buikholte open met een scalpel en een schaar en stel de baarmoeder hoorns zorgvuldig bloot.
- Injecteer 1 μL DNA-oplossing per embryo in de laterale ventrikel van een halve bol, zoals eerder beschreven24.
- Voer regelmatig IUE24 voor corticale neuronen door het plaatsen van de positieve elektrode eind voet bij de cortex en met behulp van 5 100-MS vierkante pulsen (38 V) bij 1 Hz met een elektro porator.
Opmerking: verschillende corticale regio's kunnen worden gericht op elektroporation door het wijzigen van de positie van de eind voet van de elektrode ten opzichte van de laterale ventrikel.
-
Stereotaxic injectie
- Bereid een muis op postnatale dag 30 voor stereotaxic chirurgie26. Anesthetiseer de muis zoals beschreven in stap 3.1.2., en breng subcutane injectie toe van peri-operatieve analgetica die 5 mg/kg carprofen bevatten.
- Verdund AAV-serotype 2/1 (AAV2/1) dat hSyn-tAKARα-WPRE uitdrukt op een empirisch bepaalde titer (~ 1 x 109− 1 x 1010 Genomes/μL) in spuit gefilterd (0,2 μm cellulose acetaat membraan) fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
- Boor een ~ 500 μm diameter gat met behulp van een handheld boor onder een stereomicroscoop op de volgende coördinaten voor de motorische cortex: 0,5 mm voorste naar bregma, 1,2 mm laterale naar middellijn.
- Monteer een injector (bijv. olie hydraulische manipulator, met op maat gemaakte plunjer/glazen pipet houder) aan een gemotoriseerde manipulator. Plaats de injectienaald in een hoek van 15 ° ten opzichte van het bregma-Lambda-vlak. Program meer een diagonale beweging over de x-en z-assen die equivalent zijn aan een progressie van 700 μm en 200 μm langs respectievelijk de anterieure-posterieure en de dorsale-ventrale assen.
Opmerking: Om beschadiging van het weefsel direct boven het beoogde beeldvormings veld te voorkomen, worden AAV-deeltjes geïnjecteerd onder een hoek ten opzichte van het bregma-Lambda-vlak. - Plaats de punt van de injectienaald bij de PIA in het midden van het boorgat en voer langzaam de diagonale beweging (~ 25 μm/s) uit die hierboven wordt beschreven. Deze procedure zal het centrum van de injectie positioneren op 1,2 mm voorste naar bregma, 1,2 mm laterale tot middelgrote lijn, 0,2 mm onder de PIA.
- Injecteer 20 nL verdunde virale deeltjes (~ 10 nL/min). Wacht ten minste 10 minuten en trek langzaam de injectienaald in (~ 12,5 μm/s).
- Voltooi de stereotaxic injectieprocedure en lijm/hecht de huid26.
4. installatie van het Cranial venster
- Voer de plaatsing van het schedel venster uit op muizen die tAKARα via IUE uitdrukken (punt 3,1) of stereotaxic injectie van virale deeltjes (punt 3,2), tussen postnatale dagen 30 en 60. Voor muizen die geïnfecteerd zijn met virale deeltjes, implementeert u het craniale venster ten minste twee weken na de virus injectie. Installeer het craniale venster zoals eerder beschreven27,28, met de volgende details. Anesthetiseer de muis zoals beschreven in stap 3.1.2., en toepassen van subcutane injectie van peri-operatieve analgetica 0,075 mg/kg Buprenex en ontstekingsremmende middel dexamethason bij 4 mg/kg.
- Verwijder het periosteum en trek de nekspier weg. Lijm de rand van de huid aan de schedel met weefsellijm om blootstelling van de nekspieren na de operatie te voorkomen.
- Droog en verwijder het periosteum van de schedel door zachtjes te schrapen met een scalpel. Plaats de Imaging Head Plate (binnendiameter van 8 mm) om het beoogde beeldvormings veld te omringen. Lijm de Hoofdplaat aan de schedel met behulp van op cyanoacrylaat gebaseerde lijm, gevolgd door tandheelkundige acryl cement. Voor een optimale hechting zorgt u ervoor dat de Hoofdplaat op de blootgestelde en gedroogde schedel rust. Lijm versneller kan worden gebruikt om de verharding te versnellen.
- Teken een cirkel van 5 mm in diameter boven het beoogde beeldveld (coördinaten zoals gespecificeerd in stap 3.2.3) met behulp van een tandheelkundige boor en stel de dura mater bloot.
- Breng een dun laagje transparant polymeer, ook wel kunstmatige Dura genoemd, aan op het Dura-oppervlak om het hele schedel venster te bedekken. Het polymeer zal de dura mater beschermen en stabiliseren. Plaats een steriele ronde afdek (5 mm diameter) op de dura mater. Bevestig de dekslip met Cyanoacrylaatlijm aangebracht rond de randen van het venster, gevolgd door tandheelkundige acryl cement.
5. in vivo Two-photon fluorescentie Lifetime beeld microscopie
- Start 2pFLIM Imaging op of na 2 weken na de installatie van het craniale venster (rubriek 4). Minimaliseer experimentele interferentie als gevolg van stress door frequente handling en scruffing van de muis voorafgaand aan het begin van het beeldvormings onderzoek om de muis aan te wennen.
- Stel de twee-foonexcitatie Laser golflengte in op 960 nm met behulp van de software die de Two-photon Laser bestuurt.
- Verdoving de muis met 4% isoflurane. Bevestig de juiste anesthetisering door de staart te knijpen en de Ademhalings frequenties te observeren. Dat wil doen, er mag geen reactie op de staart-knijpen en de ademhaling moet worden teruggebracht tot ~ 1 adem per seconde. Om onnodige procedurele tijd te minimaliseren en omdat de anesthesie duurt slechts twee tot drie minuten, Eye smeermiddelen worden niet gebruikt.
- Breng de verdovings muis over naar de gemotoriseerde loopband (figuur 2c) en monteer de Hoofdplaat van de muis op de kopplaat houder van de Setup van de loopband (Zie afbeelding 2 voor meer informatie). Reinig het oppervlak van de craniale Window afdek op de muis met 70% ethanol.
- Plaats de gemotoriseerde loopband met de gemonteerde muis onder de 2pFLIM-doelstelling. Breng een druppel gedistilleerd water aan tussen de craniale Window afdek en de doelstelling.
- Laat de gemonteerde muis wakker van anesthesie en worden geacclimeerd aan de loopband en de Microscoop-omgeving voor ten minste 10 min. monitor respiratie snelheid van de muis terwijl de gemonteerde muis wakker wordt van de anesthesie.
- Navigeer naar de injectieplaats onder epi-verlichting. Documenteer fiducial-functies (d.w.z. bloedvaten) onder brightfield om Imaging van hetzelfde interessegebied (ROI) te helpen tijdens volgende beeldvormings sessies.
- Elimineer elk binnenkomend licht anders dan het uitgezonden licht uit het hersenweefsel. Schakel de epi-verlichtings lichtbron uit en sluit de behuizing van de 2pFLIM rig. Activeer de 2pFLIM PMT door het inschakelen van de hardware commando voltage controle.
- Verkrijg een z-stack 2pFLIM image met behulp van de 2pFLIM acquisitie software FLIMimage met de volgende aanbevolen instellingen voorbeeld vorming tAKARα-positieve somata in wakker muizen. Stel kader gemiddelden in op 3 frames, scansnelheid naar 2 MS/lijn, Afbeeldingsgrootte tot 128 x 128 pixels en gezichtsveld tot 90 − 100 μm. Pas de beeldvormings instellingen aan op basis van de voorbereidings-en hardwareconfiguratie.
-
Inspecteer de verworven afbeelding in FLIMview (in eigen huis ontwikkelde aangepaste software; zie rubriek 6). Pas de beeldvormings instellingen aan na stap 5,9 om het aantal foton te optimaliseren en fotobleaching te minimaliseren.
Opmerking: Een werkbaar geïntegreerd foton-aantal in een ROI voor levenslange beeldvorming van een tAKARα-positief Soma in vivo is ~ 1000 − 10000 fotonen, afhankelijk van de amplitude van het signaal die voortvloeit uit een bepaalde stimulus (Zie discussie).- Gebruik waar nodig een verlaagd gezichtsveld, een lagere scansnelheid, een groter Laser vermogen en een groter aantal frames om de geïntegreerde foton-tellingen te verhogen en de levensduur schattings fout te verminderen. Zorg er tegelijkertijd voor dat u de minimale essentiële Laser voeding, frame middeling en scansnelheid gebruikt om fotobleaching te minimaliseren.
- Een regelmatig tijdsinterval (bijv. elke 30 − 60 s) door de overname van de z-stack te herhalen met behulp van de instellingen die zijn bepaald in stap 5,10. Verkrijg basislijn 2pFLIM afbeeldingen voor ten minste 15 min bij Zero loopband snelheid.
- Stel de rotatiesnelheid van de loopband in op ca. 15 cm/s gedurende 15 minuten tijdens het verkrijgen van 2pFLIM-beelden. Doorgaan met Imaging voor ≥ 20 min na het uitschakelen van de loopband rotatie, om te beoordelen van de duur van de PKA activiteit na beëindiging van geforceerde motoriek.
6. analyse van 2pFLIM beelden
-
Open de overgenomen afbeeldingen in FLIMview en stel de volgende parameters in de FLIMview in.
Opmerking: parameter Details worden in discussie beschreven.- Klik op de minimale en maximale bereik velden van de enkelvoudige foton Counting (SPC) in flimview. Voer de juiste minimale en maximale ABC-bereikwaarde in, meestal variërend tussen 1,2 − 2 en 10 − 12 NS.
- Klik op het veld t0 waarde in FLIMview en voer de waarde t0 in (meestal ~ 2 NS). Klik op het veld Lifetime luminantie minimumdrempel waarde in FLIMview en voer de gewenste drempelwaarde in op 5 − 30 fotonen.
- Klik op de knop nieuwe groep (N) en wijs de naam van een experimentgroep toe. Hiermee genereert u een groep die gegevens van elke toegevoegde FLIM-afbeelding combineert.
- Klik op de ROI -knop in de ROI Controls -module van flimview en teken een ROI rond een takarα-positief Soma. Verminder de z-stack bereik, door het verplaatsen van de onderste en bovenste z-limiet in de z-stack Control schuifregelaars in FLIMview, om te minimaliseren van signaal besmetting afkomstig van achtergrond fotonen in andere z diepten.
- Klik op de knop + om de flim-afbeelding toe te voegen aan de groep (stap 6,2). Klik op de calc -knop om de gemiddelde levensduur te berekenen (lt, ook wel gemiddelde foton-emissie tijd [mpet] genoemd), voor de ROI en de levensduur schattings fout (δτ).
- Open het volgende bestand in de chronische 2pflim Imaging Series. Herhaal stap 6,4. Zorg ervoor dat u de positie van het ROI en z-stack-bereik aanpast om hetzelfde tAKARα-positieve Soma na verloop van tijd te meten, omdat er in de loop van de tijd weefsel drift kan zijn.
- Selecteer de Deltampet/MPET0 in het vervolgkeuzemenu van de module groeps controles . Klik op het veld basislijn # en voer de index (ES) in (bijvoorbeeld 1 2 3 4 5 voor de eerste vijf afbeeldingen in de groep die in stap 6,3 is gemaakt). Hiermee definieert u de afbeelding (en) die wordt gebruikt om de levensduur van de basislijn te berekenen (LT0).
- Klik op plot om een grafiek met de flim Response (δlt/lt0) van takarα te genereren tijdens het experiment in de gedefinieerde Rois. Genormaliseerde veranderingen in levensduur (ΔLT) van individuele ROIs door de corresponderende levensduur van de basislijn (LT0) zorgen voor vergelijking van PKA-activiteit tijdens het motoriek over verschillende Rois.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FRET-FLIM-sensoren zorgen voor de visualisatie van vele verschillende signalerings trajecten, waaronder het cAMP/PKA-traject dat betrokken is bij neuromodulatie. Het huidige protocol maakt gebruik van de recent ontwikkelde tAKARα-sensor in combinatie met 2pFLIM om PKA-activiteiten te visualiseren in hoofd-gefixeerde muizen. De meeste bestaande twee-photon-microscopen kunnen worden geüpgraded met 2pFLIM-mogelijkheden door drie tot vier componenten toe te voegen, zoals geïllustreerd in Figuur 1 (Zie ook sectie 1). Om fret te visualiseren in 2pflim-verworven beelden, werd de kwantificering van de gemiddelde levensduur uitgevoerd op histogram plots van foton timing verzameld per pixel (Figuur 3a, B). De gemiddelde levensduur werd gevisualiseerd met behulp van een pseudo-gekleurd beeld, waarbij hoge (koude kleur) en lage (warme kleur) levensduur betekenen voor respectievelijk lage en hoge PKA-activiteiten, omdat PKA-activering leidt tot de afname van de levensduur. Er moet voor worden gezorgd dat het ABC-bereik correct wordt ingesteld; Dit bereik moet worden ingesteld binnen het laserpulsinterval (bijvoorbeeld 12,5 NS van een Pulsfrequentie van 80 MHz) met geminimaliseerde hardwarerand artefacten (Zie ook sectie 6 en discussie). Berekening van de PKA-activiteit binnen ROIs werd uitgevoerd door het combineren van de LT van alle pixels binnen een bepaalde ROI (figuur 3c, D). In Head-Fixed wakker muizen basale levensduur varieerden tussen 1,3 en 1,8 NS (figuur 3e). Beeldvorming van tAKARα in de motorische cortex in hoofd-vaste wakker muizen toegestaan voor de real-time kwantificering van PKA-activiteit met cellulaire resolutie tijdens basale en gedwongen motoriek (Figuur 4). Het experiment kan worden herhaald in dagen en maanden. Afgedwongen motoriek activeert PKA-activiteit in een populatie van neuronen binnen de oppervlakkige lagen van de muis motor cortex17. Deze PKA activiteit is afhankelijk van neuromodulatie via activering van β-adrenergic en D1 receptoren17.
Figuur 1: schematische weergave van een 2pFLIM-systeem. 2pflim kan worden geïmplementeerd op een conventionele twee-foton-microscoop door toevoeging van de gele gemarkeerde hardwarecomponenten: een foton timing tellings module, een geluiddempende snelle fotomultiplicator-buis (PMT), een fotodiode (alleen nodig als de laser geen output signalering voor laser timing), en een optionele signaalsplitter. Dit cijfer is gewijzigd van ma et al.17. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: ontwerp van een op maat gebouwde gemotoriseerde loopband. (A) Schematische voorstelling van het ontwerp van de loopband van voor (linksboven), zijkant (rechtsboven) en top-views (linksonder). De loopband (Foam Ball) as is aangesloten op een roterende encoder en een motor die collectief worden gemonteerd op twee palen op een massief aluminium brood plaat. De kopplaat-compatibele houder op de rechte hoek beugel is bevestigd aan een solide paal en gepositioneerd boven de loopband. Schematische tekeningen zijn niet op te schalen. Voorzijde (B) en zijkant (C) Bekijk foto's van de loopband. De juiste positionering van de muis op de loopband wordt weergegeven in paneel C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: de kwantificering van 2pFLIM-gegevens. A) een flim-afbeelding met elke pixel pseudo-gekleurd om de gemiddelde levensduur (lt) te vertegenwoordigen, ten opzichte van de laser timing, van alle fotonen in die pixel. B) de aankomsttijden van foton binnen één pixel (paars vierkant in paneel a) werden uitgezet in een histogram (linker paneel). Er werden integratie grenzen vastgesteld om het enkelvoudige foon telbereik (SPC, Gray) te bepalen. Binnen het ABC-bereik werd de integraal van de timing van foton gedeeld door het totale aantal fotonen en vervolgens afgetrokken door de t0 (1,65 NS, onderbroken lijn), resulterend in een gemiddelde levensduur (lt, afstand tussen onderbroken en gestippelde lijnen) van 1,74 NS. Kwantificering van de gemiddelde levensduur van het gehele gezichtsveld (licht blauw vierkant in paneel A) betrof de integratie van foton timing verzameld in alle pixels (rechter paneel), resulterend in een gemiddelde levensduur van 1,7 NS. Insets weergeven dezelfde gegevens in de schaal van een semi-logboek. (C en D) Kwantificering van de gemiddelde levensduur per regio van belang (ROI). C) representatief voorbeeld van een 2pFLIM-beeld. Twee ROIs werden getekend rond twee somata in laag 2/3 van de motorische cortex. (D) photon timing distributies geïntegreerd in alle pixels binnen elke ROI (linker paneel). Cel-ROIs zijn kleurgecodeerd (zoals weergegeven in deelvenster C) rood, cel 1; blauw, cel 2. Genormaliseerde foton tellingen kunnen vergelijking van foton timing distributies tussen de twee Rois (rechter paneel, gemiddelde levensduur; cel 1, 1,33 NS; cel 2, 1,73 NS). Insets weergeven dezelfde gegevens in de schaal van een semi-logboek. E) verdeelstuk van de gemiddelde basale levensduur van 254 afbeelding gemaakt cellen in de oppervlakkige lagen van de motorische cortex. L1 cellen (n = 186 cellen/11 dieren, linker paneel), wonende binnen 100 μm onder Pia, uitgedrukt tAKARα na een stereotaxic injectie van AAV2/1-hSyn-tAKARα-WPRE, en L2/3 piramidale cellen (n = 68 cellen/4 dieren, rechter paneel), wonende ten minste 150 μm onder Pia, uitgedrukt tAKARα na IUE van een CAG-tAKARα-WPRE DNA-constructie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: tAKARα houdt de gedwongen motoriek geïnduceerde PKA-activiteiten in de motorische cortex bij. (A) representatieve intensiteit (linker paneel) en levensduur (middelste en rechterdeel Vensters) van drie L1-cellen in de motorische cortex. Celrois waren kleurgecodeerd: oranje, cel 1; blauw, cel 2; geel, cel 3. B) fotomon-timing verdelingen gemeten in cel 1 (bovenste paneel) tijdens de basale toestand (oranje spoor, gemeten in middelste paneel Α) en gedwongen motoriek (loco., licht oranje spoor, gemeten in rechter paneel A). Genormaliseerde fotottellingen toegestaan voor directe vergelijking van foton timing Distribution (onderste paneel, gemiddelde levensduur: basaal, 1,72 NS; motoriek, 1,42 NS). Insets weergeven dezelfde gegevens in de schaal van een semi-logboek. C) δ-levens duur/levensduur0 (δlt/lt0) sporen van de corresponderende cellen (bovenste paneel, zie deelvenster A) met afgedwongen bewegingssnelheid (onderste paneel). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol demonstreert het gebruik van FRET-FLIM-sensor tAKARα om neuromodulatie-geactiveerde PKA-activiteit in hoofd-vaste muizen te visualiseren. Deze toepassing is gebaseerd op uitgebreide tests en karakterisaties van tAKARα in vitro en in vivo om aan te tonen dat het verkregen FLIM-signaal relevant is voor fysiologische neuromodulatoire gebeurtenissen17. Hier wordt een in vivo toepassing, motorische geïnduceerde PKA-activiteit in de motorische cortex, gebruikt om de procedures te beschrijven voor het leveren van de sensor aan de hersenen, dier chirurgie voorbeeld vorming, hardware-en softwarevereisten voor gedrag en imaging data-acquisitie en software en algoritmen voor Imaging data analyses.
De tAKARα-sensor wordt geïntroduceerd in de cortex door IUE van DNA plasmiden of stereotaxic injectie van AAV-deeltjes. Afhankelijk van de elektroporation parameters en DNA concentraties, resulteert IUE in verschillende etiketterings dichtheid van corticale neuronen over een relatief groot gebied in de cortex25. De corticale laag gelabeld met behulp van IUE wordt bepaald door het embryonale stadium wanneer de operatie wordt uitgevoerd. Stereotaxic injectie van AAV-deeltjes wordt gebruikt wanneer het gewenst is om veel cellen in een gedefinieerde hersen subregio te beelden. Het resulteert meestal in dicht gelabelde neuronen in het injectie centrum en steeds verspreide labeling verder van het centrum. Belangrijk, infectie efficiëntie van cellen in de hersenen is afhankelijk van het AAV-serotype gebruikt. AAV2/1 biedt grote efficiëntie in corticale, thalame, en striatale neuronen met relatief lage retrograde labeling activiteiten. Het wordt geadviseerd om empirisch vast te stellen welk AAV-serotype het meest efficiënt is voor de beoogde hersenregio en het celtype. Beide transfectie methoden hebben met succes tAKARα uitgedrukt. De "sweet spot" voor het uitdrukkings niveau is empirisch bepaald.
Gedwongen motoriek resulteert in verhoogde PKA-activiteiten in laag 2/3 neuronen van de motorische cortex. Momenteel beperkt 2pflim het bereik van de testbare gedragingen als gevolg van de hoofd fixatie van de muis. Echter, een steeds groeiende lijst van gedrags paradigma's zijn met succes geïmplementeerd binnen deze beperking, variërend van het rapporteren van stimuli in go/no-go taken naar ruimtelijke oriëntatie in Virtual Reality31,32,33 . Bovendien kunnen verbeterde methoden imaging in diepe hersengebieden mogelijk maken, zoals het striatum, amygdala en Hippocampus, via een naaldachtige gradiënt index (GRIN) lens13 (ongepubliceerde observaties). Daarom moet het huidige protocol waarin het gebruik van tAKARα en 2pFLIM voor in vivo visualisatie van neuromodulatie gebeurtenissen wordt gedetailleerd, gemakkelijk toepasbaar zijn op veel hersengebieden in de context van hoofd-vaste gedrags paradigma's.
Berekening van de levensduur per pixel of ROI met behulp van curve fitting is computationeel tijdrovend, en de beperkte totale foton aantal per pixel resulteert vaak in aanpassings fouten. Vandaar dat de gemiddelde levensduur (lt) rekenkundig wordt berekend als een benadering voor de levensduur (τ)17,34:
(Vergelijking 1)
waar SPCmin, en SPCMax zijn de meet Window (SPC) grenzen en F (t) de fluorescentie levensduur verval curve. Met andere woorden, voor elk berekend volume (pixel of ROI, Figuur 3a) wordt de distributie van de foton-timing uitgezet in een histogram (Figuur 3b). Binnen het ABC-bereik wordt de gewogen integraal (met de tijd dat het gewicht is) van deze verdeling gedeeld door het totale aantal fois dat resulteert in een gemiddelde emissie tijd. Deze tijd wordt vervolgens gecorrigeerd voor t0. Voor het genereren van een levenslange afbeelding (Figuur 3a) wordt deze procedure uitgevoerd voor elke pixel, terwijl de berekening van de levensduur per ROI (figuur 3c, D) alle fotonen integreert van alle pixels die boven de DREMPELwaarde binnen het ROI-volume liggen. De levensduur schattings fout (δτ) wordt berekend aan de hand van de geïntegreerde intensiteit (Nfoton: Total foton Count):
(Vergelijking 2)
Om de levensduur schattings fout, δτ en de juiste signaaldetectie FRET-FLIM te minimaliseren, is de aanschaf van voldoende fotonen per ROI vereist. Om een gewenste signaal-ruis verhouding (SRV) te bereiken, moet δτ ook aan de volgende vergelijking voldoen:
(Vergelijking 3)
Bijvoorbeeld, typische meting tijdens de motoriek in een neuronale Soma in de motorische cortex (lt = 1,57 NS, Nfoton = 9075, δlt = 0,15 NS; Figuur 4, cel 1) levert een levenslange schattings fout op van:
δτ 
0,016 NS (vergelijking 4)
wat resulteert in een signaal-ruis verhouding van:
SNR 
= 
9,4 (vergelijking 5)
Als een gewenste SNR slechts 5 is, krijgt ΔLT = 0,15 NS is een δτ toegestaan van:
waarvoor een minimale totale Fobe telling vereist is van:
Zoals hierboven beschreven, vereist levenslange kwantificering op passende wijze verschillende parameters instellen, zoals SPC bereik, t0, en Lifetime luminantie minimumdrempel waarde. Het ABC-bereik bepaalt het meet venster van uitgestoten fotonen in het venster hardwaremeting (vergelijking 1; het venster hardwaremeting is meestal 0 − 12,5 NS, omdat de laser wordt herhaald op 80 MHz). Dit is nodig omdat de PTCM gebruikt in dit protocol Edge-artefacten heeft. De SPC-reeks is ingesteld op het opnemen van de meeste van de donor foton levensduur distributie zonder de randartefacten. Om de gemiddelde levensduur te berekenen, wordt de gemiddelde foton-timing van het meet venster afgetrokken met t0, wat overeenkomt met de timing van de laserpuls in het venster (vergelijking 1, Figuur 3a, B)17,34. t0 kan worden aangepast door de lengte van de signaalkabel of de ptcm-instellingen te wijzigen en wordt meestal ingesteld op ~ 2 NS vanaf het begin van het venster hardware-meting. Na de initiële karakterisering van het systeem, meestal uitgevoerd onder de meest ideale beeldvormende condities (bijv. bij Imaging van 5 μM fluoresceïne-oplossing), worden zowel het ABC-bereik als de t0 ingesteld als vaste parameters van een bepaalde hardwareconfiguratie. De minimale drempelwaarde voor levensduur luminantie is zo ingesteld dat alleen pixels met een totaal aantal fotonen gelijk of hoger dan de drempelwaarde worden opgenomen in de weergave en analyse. Dit vermindert effectief het lawaai als gevolg van achtergrond foton graven, met inbegrip van auto fluorescentie, omgevingslicht, en spontane bet donkere tellingen. Deze drempelwaarde is empirisch bepaald.
Succesvolle FRET-FLIM-sensoren voor in vivo 2pFLIM-beeldvorming hebben ten minste drie gemeenschappelijke functies. Ten eerste, met betrekking tot de selectie van fluor Foren, is de efficiëntie van het verzamelen van foton meestal laag onder de uitdagende in vivo beeldvormings omgeving, deels als gevolg van ernstige lichtverstrooiing in hersenweefsel. Tegelijkertijd is een groot aantal gedetecteerde fotonen nodig om een wenselijk SNR te bereiken (≥ 1.000 fotonen zou nodig zijn om een SNR van 1 te bereiken voor een ΔLT/LT0 van 0,03; Zie vergelijkingen 2 en 3). Daarom is een donor de met een hoog fotonen-budget (d.w.z. het maximale aantal detecteerbare foonen voordat een de wordt gebleekt) begunstigd. Op dit moment is er geen systematische vergelijking van de verschillende donor fluoroforen op het gebied van het foor-budget onder twee-Fobe excitatie. Empirisch, EGFP is relatief helder terwijl het meer fotostabiel in vergelijking met vele andere fluor Foren in het groen/geel spectrum, waardoor het een grote donor de voor in vivo gebruik van fret-flim sensoren. Bovendien, voor een optimale kwantificering van FRET, zijn donateurs fluoroforen met een single-exponentiële fluorescentie levensduur verval begunstigd. Veel veelgebruikte donor fluorescerende eiwitten voor ratiometrische beeldvorming, zoals eCFP, hebben een multi-exponentiële fluorescentie levensduur van verval, wat suggereert dat ze bestaan uit gemengde populaties van fluoroforen. Deze fluorescerende eiwitten zijn daarom niet ideaal voor FRET-FLIM21. In tegenstelling tot de donor de kan een lage kwantum opbrengst van de acceptor de gunstig zijn voor fret-flim-sensoren. Het "donkere" laag-irstralend de sreach wordt gebruikt voor takars. Lage kwantum opbrengst van de acceptor de minimaliseert fotoron besmetting in het emissiespectrum van de donor de en bevrijdt één fluorescentiedetectie kanaal voor gelijktijdige beeldvorming van een tweede fluorescerende sensor of morfologie marker in het rode spectrum in het geval van tAKARα.
Ten tweede, om voldoende SNR over het bindende breuk bereik te verkrijgen, wordt een optimale FRET-efficiëntie van ~ 0,5 − 0,7 begunstigd21. Het signaal, d.w.z. de gemiddelde levenslange verandering onder een bepaalde donor-acceptor bindende ratio verandering, is afhankelijk van de efficiëntie van FRET. Deze relatie tussen FRET efficiency en gemiddelde levenslange verandering is echter niet-lineair. Als de FRET-efficiëntie nadert, zijn de donor fluoroforen in Bound-State effectief het uitzenden van bijna geen fotonen. Daarom, tenzij de binding ratio 100% is (dit is nooit het geval omdat geen acceptor de rijpt tot 100%29) de gemiddelde levensduur nadert de levensduur van de donor de in open toestand, en het vermogen van het detecteren van gebonden toestand sensoren Vermindert. De FRET-efficiency voor tAKARα wordt geschat op ~ 0,7, binnen het gunstige bereik.
Ten derde moeten FRET-FLIM-sensoren signalen rapporteren met een gevoeligheid en kinetiek die relevant zijn voor de dierlijke fysiologie. Sensor gevoeligheid en kinetiek moeten in vitro uitvoerig worden getest voorafgaand aan het gebruik in vivo en, indien nodig, kunnen worden afgestemd met behulp van een verscheidenheid aan benaderingen, zoals het aanpassen van substraat bindende domein affiniteit en kinetiek, linker-optimalisatie en subcellulaire gericht op de sensor. In het vorige werk werd vastgesteld dat tAKARα de PKA-activiteit kan detecteren die wordt opgewekt door de releases van endogene dopamine, en dat de kinetiek en gevoeligheid van de sensor zijn uitgelijnd met een bekend PKA-afhankelijk biologisch proces, dat noradrenaline-geïnduceerde inactivatie van de langzame after-hyperpolarisatie stroom17. Bovendien lijkt de uitdrukking van tAKARα niet te veranderen van neuronale functies, zoals getest door elektrofysiologie17 en meting van de structurele plasticiteit van individuele stekels (ongepubliceerde observaties).
De huidige technische beperkingen van 2pflim Imaging zijn gerelateerd aan de verwerking van gegevens en foton-tellings doorvoer. Ten eerste vereist flim de opslag van foton-aankomsttijden voor elke pixel. De geheugengrootte van de PTCM beperkt de verkrijgbare pixel resolutie. Voor de hier beschreven PCTM, kan tot 256 x 256 pixels per afbeeldingsframe met een 64-punt tijdresolutie worden bereikt. Bovendien is de overdrachtssnelheid van FLIM-beeldgegevens van boord naar computer opslag relatief traag, nogmaals, waardoor praktische limieten worden gesteld aan de resolutie en bemonsteringsfrequentie. Voortdurende technologische verbetering van de geheugencapaciteit en de verwerking van gegevens kunnen deze beperkingen in de toekomst oplossen. Tweede, veelgebruikte ptcm's zijn analoog-naar-digitaal systemen en worden beperkt door hun foton detectie tijden (d.w.z. "dode tijd"). Dit betekent dat na de detectie van een fotonon de ptcm de aankomst van een volgende foon (s) voor de volgende 100 − 125 NS18,21niet zal registreren. Bovendien is de levensduur-meting bevooroordeeld naar de eerste gearriveerde foton na een laserpuls (zogenaamde "pile-up"). Deze beperken de fotonen tellings percentages tot < 107 fotons per s. Hoewel dit in de meeste typische twee-Fobe beeldvormings regimes niet een groot probleem is, moet er op worden gelet dat de tellings limieten voor foton niet worden overschreden. Nieuwere Ptcm's met kortere dode tijd of een gigahertz systeem voor continue gegevensverwerving kunnen deze beperking verlichten (voor de laatste Zie Yellen en Mongeon18).
Fluorescerende sensoren voor signalering trajecten, zoals Camp/pKa, Akt/PKB, PKC en ERK, worden continu gegenereerd en geoptimaliseerd16,35. Voor de meeste van de huidige sensoren zijn verdere karakterisering en optimalisatie nodig om uit te blinken in de uitdagende in vivo imaging-omgeving. In het bijzonder is een verhoogde signaalamplitude belangrijk, omdat elke toename van de signaalamplitude de vraag naar foton-budgetten met een vierkante relatie vermindert. Voor tAKARα, haar respons amplitude aan endogene neuro modulatoren, zoals noradrenaline, werd verbeterd door 2,7-Fold in vergelijking met de vorige beste sensor. Dit vertaald naar een ~ 7-voudige afname van de vereiste fotonen. In de praktijk verminderde dit sterk het aantal valse negatieven (d.w.z. non-responders) bij dieren tijdens gedrag17. Het maximaal waargenomen tAKARα-signaal is ~ 30% (ΔLT/LT0). Tot op heden is dit het grootste FLIM-signaal dat wordt gerapporteerd voor vergelijkbare klassen van FRET sensoren. Verdere verbetering kan ook mogelijk zijn door het optimaliseren van de acceptor de en de affiniteit van de FHA aan de fosforylated Threonine. Bovendien kan het gebruik van sensoren die verschillende aspecten van hetzelfde signalerings traject bewaken, een krachtige benadering bieden om de regulering van de signalerings trajecten in vivo mechanisch te onderzoeken. In de toekomst zal de succesvolle toepassing van FLIM-sensoren om neuromodulerende signalerings trajecten in vivo te visualiseren belangrijke inzichten opleveren over waar en wanneer neuromodulatie plaatsvindt in intacte neuronale netwerken van muizen die zich gedragen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken mevrouw Tess J. Lameyer, mevrouw Ruth Frank, en Dr. Michael A. Muniak voor bewerkingen en commentaren, en Dr. Ryohei Yasuda bij Max Planck Florida voor 2pFLIM acquisitie software. Dit werk werd gesteund door twee BRAIN Initiative Awards U01NS094247 (H.Z. en T.M.) en R01NS104944 (H.Z. en T.M.), een R01 Grant R01NS081071 (T.M.), en een R21 Grant R21NS097856 (H.Z.). Alle prijzen zijn afkomstig van het Nationaal Instituut voor neurologische aandoeningen en beroerte, Verenigde Staten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5 mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation encoder | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 inch x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
References
- Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294 (5544), 1024-1030 (2001).
- Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35 (2), 73-89 (2012).
- Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87 (3), 468-470 (2015).
- Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21 (6), 787-793 (2018).
- Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96 (5), 1070-1083 (2017).
- Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372 (1), 245-259 (1986).
- Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6 (1), 15-16 (2003).
- Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11 (6), 1023-1035 (1993).
- Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7 (3), 397-403 (1997).
- Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12 (January), (2018).
- Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17 (5), 860-867 (2013).
- Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 221-234 (2017).
- Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86 (1), 140-159 (2015).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348 (2), 716-721 (2006).
- Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 14997-15002 (2001).
- Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5 (April), 1-12 (2014).
- Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99 (4), 665-679 (2018).
- Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
- Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93 (6), 1315-1324 (2017).
- Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19 (3), 617-629 (2017).
- Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16 (5), 551-561 (2006).
- Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257 (6), 3284-3290 (1982).
- Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62 (3), 363-374 (2009).
- Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
- Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36 (1-4), 31-42 (2008).
- Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
- Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20 (12), 1680-1685 (2017).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (11), 1121-1128 (2012).
- Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20 (10), 1215-1225 (2018).
