生体内での2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いて頭固定振る舞いマウスにおけるタンパク質キナーゼの活動を可視化する
Summary
タンパク質キナーゼAの活動を可視化する手順を提示し、マウスの頭部固定、振る舞いをする。改良されたA-キナーゼ活性レポーターtAKARαは皮質ニューロンで発現され、頭蓋の窓を通してイメージングのためにアクセス可能にされる。2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡は、強制移動中の生体内でのPKA活性を可視化するために使用されます。
Abstract
神経変調は、脳機能に強力な制御を行使します。.神経調節システムの機能不全は、神経学的および精神的障害をもたらす。その重要性にもかかわらず、細胞分解能を持つ神経調節イベントを追跡する技術が出現し始めたばかりです。ドーパミン、ノルエピネフリン、アセチルコリン、セロトニンなどの神経調節因子は、それぞれのGタンパク質結合受容体を介して細胞内シグナル伝達イベントを引き起こし、神経興奮性、シナプス伝達、およびその他の神経学的刺激性を調節する。ニューロンネットワークにおける情報処理を調節する。上記の神経調節剤は、cAMP/タンパク質キナーゼA(PKA)経路に収束する。そこで、単細胞分解能を有する生体内PKAイメージングは、神経電気活動に対するカルシウムイメージングに類似した方法で神経調節イベントの読み出しとして開発された。本明細書では、頭部固定振る舞うマウスの皮質における個々のニューロンのレベルでPKA活性を可視化する方法が提示される。これを行うには、Förster共鳴エネルギー伝達(FRET)に基づく改良されたA-キナーゼ活性レポーター(AKAR)がtAKARαと呼ばれる使用されます。この遺伝的にコードされたPKAセンサは、DNAプラスミドの子宮エレクトロポレーション(IUE)、またはアデノ関連ウイルス(AAV)の立体注射を介して運動皮質に導入される。FRETの変化は、光散乱脳組織におけるFRET信号を定量するための比量的FRET測定に対する利点を提供する2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡(2pFLIM)を使用して画像化されます。強制移動中のPKA活動を研究するために、tAKARαは、目を覚ます、頭固定マウスの皮質の上の慢性頭蓋窓を通して画像化され、速度制御された電動トレッドミルで実行または休息します。このイメージングアプローチは、対応する行動誘発PKA活動を研究し、生体内イメージングのための他のFLIMベースのセンサに適用されます。
Introduction
神経変調は、遅いシナプス伝達としても知られており、ストレス、覚醒、注意、移動1、2、3、などの異なる行動状態の間に脳機能を強力に制御します。4.その重要性にもかかわらず、神経調節イベントがいつどこで起こるかの研究はまだ初期段階にある。アセチルコリン、ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン、および多くの神経ペプチドを含む神経調節剤は、Gタンパク質結合受容体(GPCR)を活性化し、その結果、広範囲のタイムスケールの広いウィンドウを持つ細胞内第2のメッセンジャー経路をトリガーする秒から時間まで。各ニューロモジュレータは、シグナル伝達イベントの明確なセットをトリガするが、cAMP/タンパク質キナーゼA(PKA)経路は、多くのニューロモジュレータ1、5のための共通の下流経路である。cAMP/PKA経路は、神経興奮性、シナプス伝達、可塑性6、7、8、9を調節し、したがって、ニューロンネットワークダイナミクスを調整する。異なるニューロンまたはニューロンタイプが異なるタイプまたはレベルのニューロモジュレーター受容体10を発現するので、同じ細胞外神経調節剤の細胞内効果は異なるニューロン間で不均一であり、したがって、細胞分解能で研究。今日まで, 行動中に生体内の個々のニューロンの神経調節イベントを監視することは困難なまま.
神経変調の時空間ダイナミクスを研究するには、適切な記録モダリティが必要である。微小透析および高速スキャン環状ボルタンメトリーは、神経調節剤の放出を研究するために頻繁に使用されるが、それらは細胞事象11、12を監視する空間分解能を欠いている。集団イメージング13におけるニューロン電気活動のプロキシとして使用されているカルシウムダイナミクスに類似して、PKAイメージングは、細胞分解能でニューロン集団全体の神経調節イベントを読み出すために使用されてもよい。本プロトコルは、動物の行動中に生体内でPKA活動を監視するために改良されたA-キナーゼ活動レポーター(AKAR)の使用について説明する。ここで説明する方法は、生理的神経調節的事象を追跡する時間的分解能を有する細胞内分解能でニューロン集団の同時イメージングを可能にする。
Akarsは、PPKAリン酸化基質ペプチドおよび基質14、15のリン酸化セリンまたはスレオニンに結合するフォークヘッド関連(FHA)ドメインによって連結されたドナーおよび受諾蛍光タンパク質から構成される。PKA経路の活性化に際して、AKARの基質ペプチドがリン酸化される。その結果、FHAドメインはリン酸化基質ペプチドに結合し、それによって2つの蛍光体を近接させ、AKARの閉じた状態と呼ばれる。リン酸化AKARの閉じた状態は、ドナーとインセプター蛍光体との間のフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)の増加をもたらす。リン酸化ALEVELの割合はPKA活性16のレベルに関連しているので、生体試料中のFRETの量は、PKA活性16、17、18のレベルを定量するために使用することができる。19、20.
AAKAの初期のバージョンは、主に2色比比イメージング14用に設計されました。脳組織をより深くイメージングする場合、レシオメトリック法は波長依存性光散乱17、18、21による信号歪みに苦しむ。以下に説明するように、蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)は、FLIMがドナー蛍光素18、21によって放出される光子のみを測定するので、この問題を排除する。その結果、FRETのFLIM定量は組織深度17の影響を受けない。また、アクセプター蛍化素子の「暗い」(すなわち、低量子収率[QY])変異体を使用することができる。これは第2のセンサーまたは形態マーカー17、19、20の同時イメージングを介して直交神経特性の多重測定を容易にするために色チャネルを解放する。
FLIMイメージングは、蛍光素子が励起状態で過ごす時間、すなわち、蛍光寿命18を定量化する。蛍光素が地上状態に戻ると、励起状態の終わりは、しばしばフォトンの放出と共に起来する。個々の励起分子に対する光子の放出は確率的であるが、集団においては平均蛍光寿命がその特定の蛍光素の特徴である。蛍光色素の純粋な集団が同時に興奮すると、得られた蛍光は単一の指数関数的崩壊に続く。この指数関数的減衰の時間定数は、蛍光タンパク質の平均蛍光寿命に相当し、通常は蛍光タンパク質の1〜4ナノ秒の範囲である。興奮したドナー蛍煙症の地上状態への復帰は、FRETによっても起こりうる。FRETの存在下では、ドナー蛍光の寿命が減少する。非リン酸化AkaRは、比較的長いドナー蛍光寿命を示す。PKAによるリン酸化時に、ドナーとインセプター蛍光体が互いに近づき、FRETが増加するため、センサの寿命が短くなります。したがって、AkaRの集団における蛍光寿命の定量は、PKA活性のレベルを表す。
AAKAの初期のバージョンは、単一細胞分解能での生体内イメージングにうまく使用されていません。これは主に生理的活性化17に対するAKARセンサの低信号振幅によるものです。近年、2光子蛍光寿命撮像顕微鏡(2pFLIM)に利用可能なAKARセンサを系統的に比較することにより、FLIM-AKARと呼ばれるセンサが代替センサを上回ることがわかった。さらに、微小管(tAKARα)、シトゾール(tAKARβ)、アクチン(tAKARδ)、フィラメントアクチン(tAKARε)、膜(tAKARγ)、特定の細胞下の場所でのPKA活性を可視化するために、標的AkaR(tAKARγ)と呼ばれる一連のFLIM-AKAR変異体が開発されました。ポストナプティック密度(tAKAR)。タカーの中で、tAKARαはノルエピネフリンによって引き起こされた信号振幅を2.7倍増加させた。これは、ニューロン中のPKAの大部分が安静状態22,23の微小管に固定されているという知識と一致している。tAKARαは、2pFLIMの既存のAAKAの中で最高のパフォーマーでした。さらに、tAKARαは、複数の神経調節剤によって引き起こされた生理学的に関連するPKA活性を検出し、およびtAKARαの発現は神経機能17を変化させなかった。
最近、tAKARαは、頭部固定振る舞いマウス17におけるPKA活性の可視化に成功した。強制移動は、運動、バレル、および視覚皮質における表面層ニューロン(層1~3、ピアからの約300μmの深さまで)の相馬におけるPKA活性を引き起こしたことが示された。移動誘発PKA活性は、β-アドレナリン受容体およびD1ドーパミン受容体を介したシグナル伝達に部分的に依存していたが、D2ドーパミン受容体拮抗薬の影響を受けなかった。この研究は、2pFLIMを用いて生体内の神経変調イベントを追跡するタカーの能力を示す。
現在のプロトコルでは、強制移動パラダイム中の頭部固定覚醒マウスにおけるPKA活性イメージングの方法全体を6つのステップで説明する。まず、従来の2光子顕微鏡に2pFLIM機能を添加する(図1)。第二に、電動トレッドミルの建設(図2)。第3に、DNAプラスミドの子宮エレクトロポレーション(IUE)、またはアデノ関連ウイルス(AAV)の立体注射によるマウス皮質におけるtAKARαセンサの発現。IUE 24、25およびウイルス粒子26の立体注射のための外科のための優秀なプロトコルは、以前に公開されている。使用した主なパラメータを以下に説明します。前に、頭蓋の窓のインストール。優れたプロトコルは、頭蓋窓手術27、28のために以前に公開されています。標準プロトコルから変更されたいくつかの手順について説明します。第5に、生体内2pFLIMで行う。6番目に、2pFLIM画像の解析(図3および図4)。このアプローチは、他の多くのヘッド固定行動パラダイムおよび脳領域に容易に適用されるべきである。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、頭固定振る舞いマウスにおける神経変調誘発PKA活性を可視化するためにFRET-FLIMセンサtAKARαの使用を示す。このアプリケーションは、得られたFLIM信号が生理的神経調節イベント17に関連していることを実証するために、vitroおよびインビボにおけるtAKARαの広範な試験および特性に基づいている。ここでは、生体内アプリケーションの1つは、運動皮質にお?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
テス・J・ラマイヤー氏、ルース・フランク氏、マイケル・A・ムニアック博士に対し、編集とコメントをいただき、2pFLIM買収ソフトウェアを提供するマックス・プランク・フロリダの安田良平博士に感謝します。この作品は、2つのBRAINイニシアチブ賞U01NS094247(H.ZとT.M.)とR01NS104944(H.ZとT.M.)、R01助成金R01NS081071(T.M.)、およびR21グラントR21NS097856(H.Z.)によってサポートされました。すべての賞は、神経障害と脳卒中の国立研究所からされています, 米国.
Materials
| 0.2 μm cellulose acetate syringe filter | Nalgene | 190-2520 | Step 3.2.2. |
| 16x 0.8 NA water-immersion objective | Nikon | MRP07220 | Step 5.5. |
| 3-pin cable | US digital | CA-MIC3-SH-NC | Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope |
| Aluminum bread board | Thorlabs | MB1012 | Step 2.5. |
| AnimalTracker MATLAB software | N/A | N/A | Step 2.5 and sections 5 – 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Band-pass barrier filter | Chroma | ET500-40m | Step 1.4. |
| Cage plate | Thorlabs | CP01 | Step 2.4. Used as mount for rotation sensor |
| Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter | FST | 19007-05 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Circular coverslip (5mm diameter) | VWR | 101413-528 | Step 4.5. |
| Custom-made injection needle holder | N/A | N/A | Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author |
| Dental acrylic | Yates Motloid | 44114 | Steps 4.3. and 4.5. |
| Dental drill; Microtorque ii | Ram products | 66699 | Steps 3.2.3. and 4.4. |
| Dowsil transparent polymer | The Dow Chemical Company | 3-4680 | Step 4.5. Artificial dura |
| Electroporation electrode | Bex | LF650P5 | Step 3.1.4. |
| Electroporator | Bex | CUY21 | Step 3.1.4. |
| Fast green FCF | Sigma-aldrich | F7258-25G | Step 3.1.1. |
| FLIMimage MATLAB software | N/A | N/A | Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida |
| FLIMview MATLAB software | N/A | N/A | Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author |
| Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) | Gorilla | 5201204 | Step 2.3. |
| Headplate | N/A | N/A | Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author |
| Headplate holder | N/A | N/A | Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket |
| Hydraulic micromanipulator | Narishige | MO-10 | Step 3.2.4. |
| Krazy glue | Krazy glue | KG82648R | Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue |
| Low-noise fast photomultiplier tube | Hamamatsu | H7422PA-40 or H10769PA-40 | Step 1.3. |
| MATLAB 2012b | Mathworks | N/A | Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software |
| Motor | Zhengke | ZGA37RG | Step 2.4. |
| Motor speed controller | Elenker | EK-G00015A1-1 | Step 2.5. |
| Motorized micromanipulator | Sutter | MP-285 | Step 3.2.4. |
| Mounting base | Thorlabs | BA1S | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2 |
| Mounting post | Thorlabs | P14 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2 |
| Mounting post base | Thorlabs | PB2 | Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14 |
| Mounting post bracket | Thorlabs | C1515 | Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder |
| Optical post | Thorlabs | TR2 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4 |
| Phosphate-buffered saline | Ν/Α | Ν/Α | Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247 |
| Photodiode | Thorlabs | FDS010 | Step 1.2. |
| Photon timing counting module | Becker and Hickl | SPC-150 | Step 1.1. |
| Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119913 | Step 3.1.3. |
| Post holder | Thorlabs | PH4 | Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2 |
| Right-angle bracket | Thorlabs | AB90 | Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder |
| Rotation sensor | US digital | MA3-A10-250-N | Step 2.4. |
| Rubber mat | Rubber-Cal | B01DCR5LUG | Step 2.1. |
| Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) | McMaster | 6208K433 | Steps 2.3. and 2.4. |
| ScanImage 3.6 | Svoboda Lab/Vidrio Technology | N/A | Steps 5.9. and 6.1. |
| Signal splitter | Becker and Hickl | HPM-CON-02 | Step 1.3.1. |
| Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) | McMaster | 1327K66 | Step 2.3. |
| Stereotaxic alignment systsem | David kopf | 1900 | Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator |
| Two-photon microscope | N/A | N/A | Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms) |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 14006 | Step 3.2.6. |
| Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) | Addgene | 119921 | Step 3.2.2. |
| White PE foam roller (8 x 12 inch) | Fabrication enterprises INC. | 30-2261 | Step 2.1.1. |
| White polystyrene fom ball halves | GrahamSweet | 200mm diameter 2 hollow halves | Step 2.1.1. |
| Zipkicker | PACER | PT29 | Step 4.3. Hardening accelerator |
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