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Neuroscience

प्रोटीन Kinase कल्पना एक गतिविधि में सिर तय व्यवहार चूहे Vivo दो-फोटोन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी में उपयोग

doi: 10.3791/59526 Published: June 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

एक प्रक्रिया प्रोटीन kinase एक गतिविधियों सिर में निर्धारित, चूहों व्यवहार की कल्पना करने के लिए प्रस्तुत किया है. एक बेहतर ए-किनेज़ गतिविधि संवाददाता, tAKAR, cortical न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है और एक कपाल खिड़की के माध्यम से इमेजिंग के लिए सुलभ बनाया. दो-फोटोन फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी लागू चलन के दौरान विवो में पीकेए गतिविधियों की कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

Abstract

तंत्रिकामॉडुलन मस्तिष्क समारोह पर शक्तिशाली नियंत्रण डालती है। न्यूरोमॉड्यूलेटरी सिस्टम के रोग मस्तिष्क संबंधी और मनोरोग विकारों में परिणाम. उनके महत्व के बावजूद, सेलुलर संकल्प के साथ neuromodulatory घटनाओं पर नज़र रखने के लिए प्रौद्योगिकियों बस उभरने लगे हैं. Neuromodulators, जैसे डोपामाइन, norepinephrine, acetylcholine, और सेरोटोनिन, उनके संबंधित जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के माध्यम से intracellular संकेतन घटनाओं को ट्रिगर करने के लिए न्यूरॉन उत्तेजक उत्तेजना, synaptic संचार, और अन्य न्यूरॉन कार्य करता है, जिससे न्यूरोनल नेटवर्क में सूचना संसाधन को विनियमित. उपर्युक्त न्यूरोमॉड्यूलेटर कैम्प/प्रोटीन किनेज ए (पीकेए) मार्ग पर अभिसरित होते हैं। इसलिए, एकल सेल संकल्प के साथ विवो पीकेए इमेजिंग में न्यूरोमॉड्यूलेटरी घटनाओं के लिए न्यूरोनल विद्युत गतिविधियों के लिए कैल्शियम इमेजिंग के अनुरूप तरीके से एक रीडआउट के रूप में विकसित किया गया था। इसमें, एक विधि सिर तय व्यवहार चूहों के प्रांतस्था में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के स्तर पर PKA गतिविधि कल्पना करने के लिए प्रस्तुत किया है. ऐसा करने के लिए, एक बेहतर ए-kinase गतिविधि रिपोर्टर (AKAR), tAKAR$ कहा जाता है, प्रयोग किया जाता है, जो F$rster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) पर आधारित है. यह आनुवंशिक रूप से एनकोडेड पीकेए सेंसर को डीएनए प्लाज्मिड के यूटेरो इलेक्ट्रोपोट्रेशन (आईयूई) या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के माध्यम से मोटर कॉर्टेक्स में पेश किया जाता है। FRET परिवर्तन दो-फोटोन फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (2pFLIM) का उपयोग कर छवि बनाई जाती है, जो प्रकाश-स्कैटिंग मस्तिष्क के ऊतकों में FRET संकेत की मात्रा के लिए अनुपातमीट्रिक FRET माप से अधिक लाभ प्रदान करता है। लागू चलन के दौरान PKA गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए, tAKAR$ जाग के प्रांतस्था के ऊपर एक पुरानी कपाल खिड़की के माध्यम से छवि है, सिर तय चूहों, जो चलाने के लिए या एक गति नियंत्रित मोटर चालित ट्रेडमिल पर आराम. इस इमेजिंग दृष्टिकोण इसी व्यवहार प्रेरित PKA गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए कई अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए लागू हो जाएगा और अन्य FLIM आधारित सेंसर के लिए विवो इमेजिंग में.

Introduction

न्यूरोमॉडुलन, जिसे धीमी गति से सिंपटिक ट्रांसमिशन के रूप में भी जाना जाता है, विभिन्न व्यवहार राज्यों के दौरान मस्तिष्क समारोह पर मजबूत नियंत्रण लगाता है, जैसे तनाव, कामोत्तेजना, ध्यान, और चलन1,2,3, 4.इसके महत्व के बावजूद, कब और कहाँ neuromodulatory घटनाओं जगह ले का अध्ययन अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है. acetylcholine सहित neuromodulators, डोपामाइन, noradrenaline, सेरोटोनिन, और कई neuropeptides, जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) को सक्रिय, जो बारी में ट्रिगर intracellular दूसरा दूत रास्ते समय स्केल की एक विस्तृत खिड़की के साथ सेकंड से घंटे के लिए. जबकि प्रत्येक न्यूरोमोड्यूलेटर संकेतन घटनाओं का एक विशिष्ट सेट ट्रिगर करता है, सीएएमपी/प्रोटीन किनेज़ ए(पीकेए) मार्ग कई न्यूरोमॉड्यूलेटर 1,5के लिए एक आम डाउनस्ट्रीम मार्ग है। CAMP/PKA मार्ग न्यूरॉन उत्तेजकता को नियंत्रित करता है, synaptic संचरण, और plasticity6,7,8,9, और इसलिए, न्यूरॉन नेटवर्क गतिशीलता धुनों. क्योंकि विभिन्न न्यूरॉन्स या न्यूरॉन विभिन्न प्रकार या neuromodulator रिसेप्टर्स के स्तर को व्यक्त10, एक ही extracellular neuromodulator के intracellular प्रभाव विभिन्न न्यूरॉन्स भर में विषम हो सकता है, और इस प्रकार, होना चाहिए सेलुलर संकल्प के साथ अध्ययन किया. तारीख करने के लिए, यह व्यवहार के दौरान vivo में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स में neuromodulatory घटनाओं पर नजर रखने के लिए चुनौतीपूर्ण रहता है.

neuromodulation के spatiotemporal गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक उपयुक्त रिकॉर्डिंग मोडलिटी की आवश्यकता है। माइक्रोडायलिसिस और फास्ट-स्कैन चक्रीय वोल्टमिति का उपयोग अक्सर न्यूरोमॉड्यूलेटरों की रिहाई का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, लेकिन वे सेलुलर घटनाओं11,12पर नजर रखने के लिए स्थानिक संकल्प की कमी करते हैं। जनसंख्या इमेजिंग में न्यूरॉन विद्युत गतिविधि के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा कैल्शियम गतिशीलता के अनुरूप13,PKA इमेजिंग सेलुलर संकल्प पर एक न्यूरॉन आबादी भर में neuromodulatory घटनाओं को पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान प्रोटोकॉल पशु व्यवहार के दौरान vivo में PKA गतिविधियों पर नजर रखने के लिए एक बेहतर A-kinase गतिविधि रिपोर्टर (AKAR) के उपयोग का वर्णन करता है। यहाँ वर्णित विधि एक अस्थायी संकल्प है कि शारीरिक neuromodulatory घटनाओं पटरियों के साथ subcellular संकल्प पर न्यूरॉन आबादी के एक साथ इमेजिंग के लिए अनुमति देता है.

AKARs एक दाता और एक स्वीकारकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन से बना रहे हैं एक PKA फॉस्फोरिलेशन सब्सट्रेट पेप्टाइड और एक फोर्कहेड संबद्ध (FHA) डोमेनहै कि सब्सट्रेट के फॉस्फोरीलेटिड serine या threonine के लिए बांधता है 14,15. PKA मार्ग के सक्रियण पर, AKAR के सब्सट्रेट पेप्टाइड फॉस्फोरीलेटाइज्ड है. नतीजतन, FHA डोमेन फॉस्फोरीलेट सब्सट्रेट पेप्टाइड को बांधता है, जिससे दो फ्लोरोफोर्स को निकट निकटता में लाना, जिसे AKAR की बंद स्थिति के रूप में संदर्भित किया जाता है। दाता और ग्राही फ्लोरोफोर्स के बीच एक फॉस्फोरिलेटा हुआ AKAR की बंद अवस्था का परिणाम बढ़ जाता है। चूंकि फॉस्फोरिलेट्ड AKARs का अनुपात पीकेए गतिविधि16के स्तर से संबंधित है , इसलिए जैविक नमूने में FRET की मात्रा का उपयोग PKA गतिविधि16,17,18के स्तर की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, 19,20.

AKARs के प्रारंभिक संस्करण मुख्य रूप से दो रंग अनुपात मिट्रिक इमेजिंग14के लिए डिजाइन किए गए थे। जब मस्तिष्क के ऊतकों में गहराई से इमेजिंग, अनुपातमेट्रिक विधि तरंगदैर्ध्य पर निर्भर प्रकाश प्रकीर्णन17,18,21के कारण संकेत विरूपण से ग्रस्त है। जैसा कि नीचे चर्चा की गई है, फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) इस समस्या को समाप्त करता है क्योंकि FLIM केवल दाता फ्लोरोफोर द्वारा उत्सर्जित फोटॉनों के उपाय18,21. परिणामस्वरूप, FRET के फ़्लाय परिमाणीकरण ऊतक-गहराई17से प्रभावित नहीं होता है। इसके अलावा, एक "अंधेरे" (यानी, कम क्वांटम उपज [QY]) स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर के संस्करण का इस्तेमाल किया जा सकता है. यह एक रंग चैनल को मुक्त करता है ताकि दूसरे संवेदक या एक आकृतिक मार्कर17,19,20के एक साथ इमेजिंग के माध्यम से ऑर्थोगोनल न्यूरोनल गुणों के बहुसंकेतित माप को सुविधाजनक बनाया जा सके .

FLIM इमेजिंग समय है कि एक फ्लोरोफोर उत्तेजित राज्य में खर्च करता है, अर्थात्, फ्लोरोसेंट जीवनकाल18की मात्रा निर्धारित करता है. जमीन राज्य के लिए एक फ्लोरोफोर की वापसी, इस प्रकार उत्साहित राज्य के अंत, अक्सर एक फोटॉन के उत्सर्जन के साथ सहवर्ती. हालांकि एक व्यक्ति उत्साहित अणु के लिए एक फोटॉन के उत्सर्जन stochastic है, एक जनसंख्या में मतलब फ्लोरोसेंट जीवनकाल है कि विशेष रूप से फ्लोरोफोर की एक विशेषता है. जब फ्लोरोफोर की एक शुद्ध आबादी एक साथ उत्साहित कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट एक भी घातीय क्षय का पालन करेंगे. इस घातीय क्षय के समय स्थिरक मतलब फ्लोरोसेंट जीवनकाल, जो आम तौर पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए एक से चार नैनोसेकंड के लिए पर्वतमाला से मेल खाती है. एक उत्साहित दाता फ्लोरोफोर की जमीन राज्य में वापसी भी FRET द्वारा हो सकता है. FRET की उपस्थिति में, दाता फ्लोरोफोर के फ्लोरोसेंट जीवनकाल कम हो जाता है। Unphosphorylated AKARs एक अपेक्षाकृत लंबे समय तक दाता फ्लोरोसेंट जीवनकाल प्रदर्शन. PKA द्वारा फॉस्फोरिलेशन पर, सेंसर एक छोटे जीवनकाल दर्शाती है क्योंकि दाता और स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर एक दूसरे के पास लाया जाता है और FRET बढ़ जाती है। AKARs की आबादी में फ्लोरोसेंट जीवनकाल के परिमाण इसलिए PKA गतिविधि के स्तर का प्रतिनिधित्व करता है.

AKARs के प्रारंभिक संस्करणों को एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर विवो इमेजिंग में सफलतापूर्वक उपयोग नहीं किया गया है. यह मुख्य रूप से शारीरिक सक्रियणों के लिए AKAR सेंसर के कम संकेत आयाम के कारणहै 17. हाल ही में, व्यवस्थित दो-फोटोन फ्लोरोसेंट जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (2pFLIM) के लिए उपलब्ध AKAR सेंसर की तुलना करके, FLIM-AKAR नामक एक सेंसर वैकल्पिक सेंसरों को बेहतर प्रदर्शन करने के लिए पाया गया था। इसके अलावा, FLIM-AKAR वेरिएंट की एक श्रृंखला लक्षित AKARs (tAKARs) कहा जाता है विशिष्ट subcellular स्थानों पर पीकेए गतिविधि कल्पना करने के लिए विकसित किए गए थे: microtubules (tAKAR$), साइटोसोल (tAKAR]), actin (tAKAR]), फिलामेंटस actin (tAKAR ]), झिल्ली (tAKAR], और पोस्टिनैप्टिक घनत्व (tAKAR $). तकाकरों में, टाकाआर ने नोरेपिनेफ्रिन द्वारा प्राप्त सिग्नल आयाम को 2.7 गुना बढ़ा दिया। यह इस ज्ञान के अनुरूप है कि न्यूरॉन्स में पीकेए के अधिकांश हिस्से को आराम की अवस्था22,23में माइक्रोट्यूल्स में लगाया जाता है . 2PFLIM के लिए मौजूदा AKARs के बीच tAKAR$ सबसे अच्छा प्रदर्शन किया गया. इसके अलावा, tAKAR] कई neuromodulators द्वारा प्राप्त शारीरिक रूप से प्रासंगिक पीकेए गतिविधि का पता चला, और tAKAR की अभिव्यक्ति न्यूरॉन कार्यों17में परिवर्तन नहीं किया.

हाल ही में, tAKAR] सफलतापूर्वक सिर में PKA गतिविधियों की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था तय व्यवहार चूहों17. यह दिखाया गया था कि लागू चलन सतही परत न्यूरॉन्स की सोमा में PKA गतिविधि ट्रिगर (परत 1 से 3, pia से $ 300 की गहराई तक) मोटर, बैरल में, और दृश्य cortices. चलन-ट्रिगर PKA गतिविधि भाग में था $-adrenergic रिसेप्टर्स और D1 डोपामाइन रिसेप्टर्स के माध्यम से संकेत पर निर्भर है, लेकिन एक D2 डोपामाइन रिसेप्टर विरोधी द्वारा प्रभावित नहीं था. यह काम 2pFLIM का उपयोग कर vivo में neuromodulation घटनाओं को ट्रैक करने के लिए tAKARs की क्षमता दिखाता है.

वर्तमान प्रोटोकॉल में, PKA गतिविधि इमेजिंग के लिए पूरी विधि सिर में तय जाग चूहों एक लागू चलन प्रतिमान के दौरान छह चरणों में वर्णित है. सबसे पहले, एक पारंपरिक दो-फोटोन माइक्रोस्कोप के लिए 2pFLIM क्षमताओं के अलावा (चित्र 1). दूसरा, मोटर चालित ट्रेडमिल का निर्माण (चित्र2)। तीसरा, डीएनए प्लाज्मिड के यूटेरो इलेक्ट्रोपोरेशन (आईयूई) में, या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन द्वारा माउस कॉर्टेक्स में टीएकेआर सेंसर की अभिव्यक्ति। IUE24,25 और वायरल कणों के stereotaxic इंजेक्शन के लिए सर्जरी के लिए उत्कृष्ट प्रोटोकॉल26 पहले प्रकाशित किया गया है. कुंजी पैरामीटर हम इस्तेमाल किया नीचे वर्णित हैं. फोर्थ, एक कपाल खिड़की की स्थापना. उत्कृष्ट प्रोटोकॉल पहले कपाल खिड़की सर्जरी27,28के लिए प्रकाशित किया गया है . मानक प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है जो कई चरणों का वर्णन किया गया है। पांचवें, vivo 2pFLIM में प्रदर्शन. छठी, 2pFLIM छवियों का विश्लेषण (चित्र3 और चित्र 4)। इस दृष्टिकोण को आसानी से कई अन्य सिर तय व्यवहार प्रतिमानों और मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए लागू किया जाना चाहिए.

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी तरीकों ओरेगन स्वास्थ्य और विज्ञान विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. 2pFLIM माइक्रोस्कोप सेटअप

  1. एक फोटॉन समय गिनती मॉड्यूल स्थापित करें (PTCM, सामग्री कीतालिका) और कंप्यूटर से कनेक्ट (चित्र1) निर्माता के मैनुअल के अनुसार.
    नोट: PTCM आम तौर पर एक कंप्यूटर बोर्ड है कि लेजर पल्स समय और photopliplier ट्यूब (पीएमटी) से एक फोटॉन इनपुट के लिए एक "सिंक" इनपुट प्राप्त करता है. यह भी पिक्सल, लाइनों, और फ्रेम के लिए घड़ी समय प्राप्त करता है, दो-फोटोन इमेजिंग नियंत्रण सॉफ्टवेयर से. PTCM घड़ी संकेतों का उपयोग करता है अलग अलग पिक्सल और फ्रेम में अलग अलग फोटॉनों.
  2. लेजर समय को मापने के लिए gt; 200 मेगाहर्ट्ज बैंडविड्थ के साथ एक photodiode जोड़ें। प्रकाश पथ के लंबवत स्थित फोटोडिओड में लेजर प्रकाश के एक छोटे अंश को प्रतिबिंबित करने के लिए प्रकाश पथ में एक मानक काँच का आवरण रखें (चित्र1)। PTCM के "सिंक" इनपुट करने के लिए photodiode उत्पादन कनेक्ट करें।
    नोट: कई आधुनिक लेज़रों भी लेजर समय उत्पादन. इन लेज़रों के लिए, photodiode आवश्यक नहीं है, और एक सीधे PTCM के सिंक इनपुट करने के लिए लेजर समय उत्पादन कनेक्ट कर सकते हैं.
  3. शेयर बाजार में पीएमटी, tAKAR के मामले में, हरी चैनल PMT, एक कम शोर के साथ, तेजी से GaAsP PMT (चित्र 1) . PTCM के संकेत इनपुट करने के लिए पीएमटी आउटपुट कनेक्ट करें।
    1. यदि पारंपरिक दो-फोटोन इमेजिंग चैनल के माध्यम से तीव्रता का एक साथ अधिग्रहण वांछित है तो एक वैकल्पिक संकेत विभाजक जोड़ें (चित्र 1)। संकेत विभाजक के लिए पीएमटी उत्पादन कनेक्ट और PTCM और पारंपरिक दो फोटोन इमेजिंग मॉड्यूल के लिए विपाटक उत्पादन कनेक्ट.
      नोट: GAASP PMTs पारंपरिक bialkali PMTs की तुलना में तेजी से एकल फोटॉन संकेत दे और फोटॉन समय का एक और अधिक सटीक निर्धारण के लिए अनुमति देते हैं. GaAsP PMTs के कुछ मॉडलों को परिवेश के तापमान से नीचे 10 डिग्री 35 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जा सकता है, जिससे अंधेरे की गिनती के दमन को कुछ सौ प्रति सेकंड के स्तर से नीचे (आमतौर पर $200 मायने / यह कम शोर स्तर फ्लोरोसेंट जीवनकाल की सटीक माप के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि शोर फोटॉन मायने रखता है आसानी से प्रतिष्ठित या फ्लोरोसेंट जीवनकाल वक्र से घटाया नहीं जा सकता है.
  4. एक बैंड-पास फ्लोरोसेंट उत्सर्जन फिल्टर जोड़ें जो ग्राभ संदूषण को कम करता है, यदि कोई हो, स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर से। उदाहरण के लिए, tAKAR $ के लिए, हरे चैनल के लिए एक 500 एनएम $ 20 एनएम बाधा फिल्टर स्वीकारकर्ता SREACh से संदूषण को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो एक अंधेरे है (QY $0.07) पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP)29,30. नियंत्रण सॉफ़्टवेयर के लिए उपयुक्त और PTCM उपयोगकर्ता मैन्युअल में वर्णित के रूप में अलग-अलग छवि पिक्सेल, रेखाएँ, और फ़्रेम के लिए घड़ी जैसे समय संकेतों को कनेक्ट करें. उपयुक्त डेटा नियंत्रण और प्राप्ति सॉफ़्टवेयर स्थापित करें।
    नोट: कुछ PTCM निर्माताओं (सामग्री की तालिका) 2pFLIM इमेजिंग के लिए अपने सॉफ्टवेयर प्रदान करते हैं. यहाँ, कस्टम सॉफ्टवेयर कहा जाता है FLIMimage प्रयोग किया जाता है, जो Yasuda लैब (मैक्स प्लैंक फ्लोरिडा, व्यक्तिगत संचार के माध्यम से) द्वारा विकसित किया गया था. कुछ दो-फोटोन अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) के लिए एक ऐड-ऑन उपयोगकर्ता समारोहकेरूप में यह सॉफ्टवेयर कार्य करता है। यह नियंत्रण और दो-photon इमेजिंग के दौरान उचित समय पर PTCM के साथ संचार 2pFLIM छवियों को प्राप्त करने के लिए.

2. एक मोटर चालित ट्रेडमिल का निर्माण

नोट: कस्टम निर्मित मोटर चालित ट्रेडमिल का डिजाइन चित्र 2में दिखाया गया है।

  1. एक फोम रोलर कट (जेड 200 मिमी) करने के लिए 150 एक ठीक hacksaw के साथ लंबाई में मिमी. वैकल्पिक रूप से, एक फोम गेंद के दो हिस्सों को एक साथ गोंद और सीवन पर टेप जगह है. वैकल्पिक रूप से, रोलर पर कर्षण बढ़ाने के लिए रोलर पर प्रोफ़ाइल के साथ एक रबर चटाई गोंद।
  2. रोलर के फ्लैट पक्ष में रोलर के केंद्र के माध्यम से एक आधा इंच व्यास छेद ड्रिल या फोम गेंद का उपयोग किया जाता है, तो गेंद के प्रत्येक आधे के बीच के माध्यम से एक आधा इंच व्यास छेद ड्रिल।
  3. छेद के माध्यम से एक आधा इंच व्यास स्टील धुरा स्थापित करें. फोम संगत गोंद का उपयोग कर धुरा करने के लिए फोम रोलर / वैकल्पिक रूप से, फोम रोलर /गेंद को धुरा के युग्मन को मजबूत करने के लिए दो लचीला शाफ्ट युग्मन (1/4 इंच आंतरिक व्यास) को संशोधित करें।
    नोट: कई आम गोंद फोम भंग हो सकता है कि कृपया ध्यान दें.
    1. प्रत्येक शाफ्ट युग्मन के लिए, अपने फ्लैट पक्ष पर और आयत धातु प्लेट के केंद्र में शाफ्ट युग्मन स्थिति (0.7 मिमी x 15 मिमी x 76 मिमी). शाफ्ट युग्मन के लिए प्लेट वेल्ड. प्लेट के केंद्र में एक आधा इंच छेद ड्रिल धुरा और केंद्र से पार्श्व धातु प्लेट में दो पेंच छेद पर संशोधित शाफ्ट युग्मन की स्थापना के लिए अनुमति देने के लिए.
    2. फोम रोलर के खिलाफ धुरा पर शाफ्ट युग्मन स्थापित करें / यदि बाद का उपयोग कर, थोड़ा गेंद की वक्रता फिट करने के लिए थाली मोड़. धुरा पर रोलर /गेंद को ठीक करने के लिए पार्श्व छेद में शिकंजा रखें।
  4. ड्रिल और एक पिंजरे की थाली के केंद्र में एक 3/8-32 धागा नल और रोटरी एनकोडर स्थापित करें। पोस्ट होल्डर पर मोटर के लगाव की अनुमति देने के लिए दाएं कोण मोटर ब्रैकेट के आधार में एक पेंच छेद ड्रिल करें। एक लचीला शाफ्ट युग्मन का उपयोग कर धुरा के अंत करने के लिए दोनों रोटरी एनकोडर और मोटर संलग्न करें।
  5. मोटर और रोटरी एनकोडर के लिए पदों का उपयोग कर एक एल्यूमीनियम रोटी बोर्ड पर इकट्ठे ट्रेडमिल स्थापित करें (चित्र2)। गति नियंत्रक के लिए मोटर आदानों कनेक्ट, और कंप्यूटर डेटा अधिग्रहण (DAQ) बोर्ड के एक एनालॉग इनपुट करने के लिए रोटरी एनकोडर उत्पादन.
    नोट: रोटेशन कोणीय गति वोल्टेज के रूप में रोटरी एनकोडर द्वारा एनकोडेड है और कस्टम सॉफ्टवेयर का उपयोग कर digitized है AnimalTracker MATLAB में लिखा कहा जाता है.
  6. एक सही कोण ब्रैकेट के लिए headplate-संगत धारक स्थापित करें। ट्रेडमिल के सामने ब्रेड प्लेट पर एक ठोस पोस्ट स्थापित करें और पोस्ट पर दाएँ कोण वर्ग के साथ इकट्ठे हेडप्लेट धारक स्थापित करें (चित्र 2)। सुनिश्चित करें कि हेडप्लेट धारक सलाखों धुरा के साथ गठबंधन कर रहे हैं इस तरह है कि माउस ट्रेडमिल पर एक पर्याप्त और आरामदायक चलने की स्थिति को अपनाने कर सकते हैं (चित्र 2C) .

3. माउस कोर्टेक्स में tAKAR की अभिव्यक्ति सेंसर

  1. गर्भाशय विद्युत पोरेशन में
    1. एक प्लाज्मिड डीएनए (3 डिग्री 4 ग्राम/जेडएल) में तेजी से हरे रंग की 0.2% अंतिम एकाग्रता (इंजेक्शन के दौरान दृश्यकेत के लिए) जोड़कर आईयू के लिए डीएनए समाधान तैयार करें; सेंसर एक कैग प्रोमोटर, सेंसर अनुक्रम, और वुडचक हेपेटाइटिस वायरस युक्त निर्माण करता है पश् च-प्रतिलेखनीय अनुक्रिया तत्व [WPRE] अनुवादात्मक वृद्धि) जल या त्रिस-EDTA में भंग/
    2. E1624पर IUE के लिए एक समय पर गर्भवती मादा माउस (उदाहरण के लिए, C57BL/ आइसोफ्लुरेन के साथ माउस को एनेस्थेटाइज करें (4) प्रेरण के लिए और रखरखाव के लिए 1.5%, 95% O2 पर 5% CO2के साथ ) और 5 मिलीग्राम/किलो मेलोक्सीकैम युक्त पेरी-ऑपरेटिव एनाल्जेसिक के subcutaneous इंजेक्शन लागू करें और 4 मिलीग्राम/किलोग्राम बुपिवाकेन। एक स्केलपेल और कैंची की एक जोड़ी के साथ पेट की गुहा को खोलने में कटौती और ध्यान से गर्भाशय सींग का पर्दाफाश।
    3. एक गोलार्द्ध के पार्श्व निलय में प्रति भ्रूण डीएनए समाधान के1 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन, जैसा कि पहले 24 वर्णित किया गया था।
    4. कॉर्टेक्स पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड अंत पैर रखकर और एक इलेक्ट्रोपोरेटर के साथ 1 हर्ट्ज पर पांच 100-एमएस वर्ग दालों (38 वी) का उपयोग करके cortical न्यूरॉन्स के लिए नियमित रूप से IUE24 प्रदर्शन.
      नोट: विभिन्न cortical क्षेत्रों पार्श्व निलय के सापेक्ष इलेक्ट्रोड अंत पैर की नियुक्ति बदलकर इलेक्ट्रोपोट्रेशन के लिए लक्षित किया जा सकता है.
  2. स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन
    1. प्रसवोत्तर दिन 30 पर स्टीरियोटैक्सिक सर्जरी के लिए एक माउस तैयार26. माउस को चरण 3.1.2 में वर्णित के रूप में एनेस्थेटाइज करें, और 5 मिलीग्राम/किलोग्राम कार्प्रोफेन युक्त पेरी-ऑपरेटिव एनाल्जेसिक के उपचवनीय इंजेक्शन लागू करें।
    2. सिरिंज-फिल्टर्ड (0.2 डिग्री मी सेलूलोज एसेलेट झिल्ली) में एक अनुभवजन्य रूप से निर्धारित टिटर ($1 x 109x 10 10 जीनोम/जेडएल) को व्यक्त करने वाले एवी सीरोटाइप 2/1 (AAV2/1) फॉस्फेट-बफरेड लवणीय।
    3. मोटर प्रांतस्था के लिए निम्ननिर्देशपरक पर एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत एक हाथ में ड्रिल का उपयोग कर एक $ 500 डिग्री मीटर व्यास छेद ड्रिल: 0.5 मिमी पूर्वकाल bregma करने के लिए, 1.2 मिमी पार्श्व midline करने के लिए।
    4. एक मोटर चालित manipulator करने के लिए कस्टम बनाया प्लंजर / ग्लास पिपेट धारक के साथ एक इंजेक्टर (उदा., तेल हाइड्रोलिक manipulator, माउंट। ब्ग्मा-लैम्बडा विमान के सापेक्ष 15 डिग्री कोण पर इंजेक्शन की सुई रखें। एक्स- और ज़- अक्षों के पार एक विकर्ण गति कार्यक्रम एक 700 डिग्री उ और 200 डिग्री मीटर प्रगति के बराबर पूर्वकाल-पश्च और पृष्ठीय-अधर अक्षों के साथ क्रमशः।
      नोट: इरादा इमेजिंग क्षेत्र के ऊपर सीधे ऊतक को नुकसान से बचने के लिए, एएवी कणों को ब्रीग्मा-लैम्बडा विमान के सापेक्ष कोण पर इंजेक्ट किया जाता है।
    5. ड्रिल होल के केंद्र में पाइ पर इंजेक्शन सुई की नोक को स्थिति दें और धीरे-धीरे ऊपर वर्णित विकर्ण गति ($25 डिग्री मी/ इस प्रक्रिया में इंजेक्शन के केंद्र की स्थिति होगी 1.2 मिमी पूर्वकाल करने के लिए bregma, 1.2 मिमी मिडलाइन के लिए पार्श्व, 0.2 pia नीचे मिमी.
    6. पतला वायरल कणों के 20 एनएल इंजेक्शन ($10 nL/min)। कम से कम 10 मिनट प्रतीक्षा करें और धीरे-धीरे इंजेक्शन सुई ($12.5 $m/
    7. स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन प्रक्रिया समाप्त करें औरत्वचा को गोंद /

4. कपाल विंडो की स्थापना

  1. IUE (अनुभाग 3.1) या वायरल कणों के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन (अनुभाग 3.2) के माध्यम से tAKAR व्यक्त चूहों पर कपाल खिड़की की नियुक्ति प्रदर्शन, प्रसव के बाद के दिनों के बीच 30 और 60. वायरल कणों से संक्रमित माउस के लिए, वायरस इंजेक्शन के बाद कम से कम दो सप्ताह के बाद कपाल खिड़की को लागू करें। कपाल विंडो को पहले वर्णित27,28के रूप में निम्न विवरण के साथ स्थापित करें। माउस को चरण 3.1.2 में वर्णित के रूप में एनेस्थेटाइज करें, और पेरी-ऑपरेटिव एनाल्जेसिक के नीचे के इंजेक्शन को लागू करें 0.075 मिलीग्राम/किलोग्राम बुप्रनेक्स और एंटी-भड़काऊ एजेंट डेक्सामेथासोन पर 4 मिलीग्राम/
  2. पेरिओस्टेम निकालें और गर्दन की मांसपेशियों को वापस ले लें। सर्जरी के बाद गर्दन पेशी के जोखिम से बचने के लिए ऊतक चिपकने वाला के साथ खोपड़ी के लिए त्वचा के किनारे गोंद।
  3. धीरे एक स्केलपेल का उपयोग कर स्क्रैप करके खोपड़ी से किसी भी periosteum सूखी और हटा दें। इरादा इमेजिंग क्षेत्र के चारों ओर करने के लिए इमेजिंग हेडप्लेट (8 मिमी भीतरी व्यास) रखें। साइनोऐक्रिलेट-आधारित गोंद का उपयोग करके खोपड़ी के लिए हेडप्लेट को गोंद करें, जिसके बाद दंत ऐक्रिलिक सीमेंट होगा। इष्टतम आसंजन के लिए, सुनिश्चित करें कि हेडप्लेट उजागर और सूखे खोपड़ी पर टिकी हुई है। गोंद त्वरक सख्त में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. इरादा इमेजिंग क्षेत्र के ऊपर व्यास में 5 मिमी का एक चक्र ड्रा (चरण 3.2.3 में निर्दिष्ट के रूप में निर्देशांक) एक दंत ड्रिल का उपयोग कर और ड्यूरा मैटर का पर्दाफाश.
  5. पारदर्शी बहुलक की एक पतली परत लागू करें, यह भी कृत्रिम ड्यूरा कहा जाता है, ड्यूरा सतह के लिए पूरे कपाल खिड़की को कवर करने के लिए। बहुलक की रक्षा और ड्यूरा मेटर को स्थिर करेगा। ड्यूरा मैटर पर एक बाँझ परिपत्र कवरस्लिप (5 मिमी व्यास) रखें। दंत एक्रिलिक सीमेंट के बाद खिड़की के किनारों के आसपास लागू cyanoacrylate गोंद के साथ कवरस्लिप सुरक्षित.

5. विवो टू-फोटोन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी में

  1. पर या परे शुरू 2 सप्ताह के बाद कपाल खिड़की की स्थापना (अनुभाग 4). माउस को आदत बनाने के लिए इमेजिंग अध्ययन की शुरुआत से पहले माउस के लगातार हैंडलिंग और स्क्रफिंग के कारण तनाव के कारण प्रयोगात्मक हस्तक्षेप को कम करें।
  2. दो-फोटोन लेजर को नियंत्रित करने वाले सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 960 एनएम पर दो-फोटोन उत्तेजना लेजर तरंगदैर्ध्य सेट करें।
  3. 4% isoflurane का उपयोग कर माउस anaesthetize. पूंछ-पिंच द्वारा उचित एनेस्थेटाइजेशन की पुष्टि करें और श्वास दर को देख रहे हैं। अर्थात, पूंछ-पिंच का कोई जवाब नहीं होना चाहिए और सांस लेने की दर को प्रति सेकंड $ 1 सांस तक कम किया जाना चाहिए। अनावश्यक प्रक्रियात्मक समय को कम करने के लिए और क्योंकि संज्ञाहरण केवल दो से तीन मिनट के लिए रहता है, आंख स्नेहक का उपयोग नहीं कर रहे हैं.
  4. एनेस्थेटाइज्ड माउस को मोटरचालित ट्रेडमिल में स्थानांतरित करें (चित्र 2C) और ट्रेडमिल सेटअप के हेडप्लेट धारक को माउस की हेडप्लेट को माउंट करें (विवरण के लिए चित्र 2 देखें)। कपाल खिड़की की सतह को साफ करें 70% इथेनॉल के साथ माउस पर कवरस्लिप।
  5. 2pFLIM उद्देश्य के तहत घुड़सवार माउस के साथ motorized ट्रेडमिल प्लेस. कपाल खिड़की coverslip और उद्देश्य के बीच आसुत पानी की एक बूंद लागू करें.
  6. घुड़सवार माउस संज्ञाहरण से जाग और कम से कम 10 मिनट के लिए ट्रेडमिल और माइक्रोस्कोप वातावरण के लिए अनुकूल हो जाते हैं, जबकि घुड़सवार माउस संज्ञाहरण से जाग की निगरानी श्वसन दर.
  7. एपि-इल्युमिनेशन के तहत इंजेक्शन स्थान पर नेविगेट करें। बाद के इमेजिंग सत्रों के दौरान ब्याज के एक ही क्षेत्र (आरओआई) की इमेजिंग सहायता करने के लिए ब्राइटफील्ड के तहत दस्तावेज़ fiducial विशेषताएं (यानी, रक्त वाहिकाओं)।
  8. मस्तिष्क के ऊतकों से उत्सर्जित प्रकाश के अलावा किसी भी आने वाली प्रकाश को हटा दें। एपि-इल्युमिनेशन लाइट स्रोत को बंद करें और 2pFLIM रिग के बाड़े को बंद करें। हार्डवेयर कमांड वोल्टेज नियंत्रण पर स्विच करके 2pFLIM PMT को सक्रिय करें।
  9. जाग चूहों में इमेजिंग tAKAR-सकारात्मक somata के लिए निम्नलिखित की सिफारिश की सेटिंग्स के साथ 2pFLIM अधिग्रहण सॉफ्टवेयर FLIMimage का उपयोग कर एक z-स्टैक 2pFLIM छवि प्राप्त करें। फ़्रेम को 3 फ़्रेम्स पर औसत रूप से सेट करें, गति को 2 ms/line तक स्कैन करके, छवि आकार को 128 x 128 पिक्सेल तक और दृश्य के फ़ील्ड को 90$100$m तक सेट करें. तैयारी और हार्डवेयर कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर इमेजिंग सेटिंग्स समायोजित करें.
  10. FLIMview में अधिग्रहीत छवि का निरीक्षण करें (घर में विकसित कस्टम सॉफ्टवेयर; अनुभाग 6 देखें)। फोटॉन गिनती का अनुकूलन और photobleaching को कम करने के लिए चरण 5.9 के बाद इमेजिंग सेटिंग्स समायोजित करें।
    नोट: विवो में एक tAKAR-positive soma के जीवनकाल इमेजिंग के लिए एक आरओआई में एक व्यावहारिक एकीकृत फोटॉन गणना संकेत आयाम के आधार पर $1,000$10,000 फोटॉन है जो एक विशेष उत्तेजना से परिणाम देता है (चर्चादेखें )।
    1. जहां जरूरत है, देखने की एक कमी क्षेत्र का उपयोग करें, स्कैनिंग गति में कमी आई, लेजर शक्ति में वृद्धि हुई है, और फ्रेम की संख्या में वृद्धि एकीकृत फोटॉन गिनती बढ़ाने के लिए और जीवन भर आकलन त्रुटि को कम करने के लिए औसत किया जा करने के लिए. एक ही समय में, कम से कम आवश्यक लेजर शक्ति का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित हो, औसत फ्रेम, और speedbleaching को कम करने के लिए गति स्कैनिंग.
  11. एक नियमित समय अंतराल पर छवि (जैसे, हर 30 डिग्री 60 s) चरण 5.10 में निर्धारित सेटिंग्स का उपयोग कर z-स्टैक अधिग्रहण दोहरा द्वारा. शून्य ट्रेडमिल गति पर कम से कम 15 मिनट के लिए आधार रेखा 2pFLIM छवियों का अधिग्रहण.
  12. ट्रेडमिल रोटेशन गति को 15 मिनट के लिए 15 सेमी/ ट्रेडमिल रोटेशन बंद करने के बाद $ 20 मिनट के लिए इमेजिंग जारी रखें, मजबूर चलन की समाप्ति के बाद पीकेए गतिविधि की अवधि का आकलन करने के लिए।

6. 2pFLIM छवियों का विश्लेषण

  1. FLIMview में अधिग्रहीत छवियों को खोलें और FLIMview में निम्नलिखित पैरामीटर सेट करें।
    नोट:
    पैरामीटर विवरण DISCUSSION में वर्णित हैं।
    1. FLIMview में एकल फोटॉन गिनती (SPC) न्यूनतम और अधिकतम रेंज क्षेत्रों पर क्लिक करें. उपयुक्त न्यूनतम और अधिकतम SPC श्रेणी मान दर्ज करें, आम तौर पर क्रमशः 1.2$2 और 10 $12 ns के बीच होता है.
    2. FLIMview में t0 मान फ़ील्ड पर क्लिक करें और t0 मान दर्ज करें (आमतौर पर $2 ns). FLIMview में जीवनकाल luminance न्यूनतम सीमा मान फ़ील्ड पर क्लिक करें और 5 "30 फोटॉनों के लिए वांछित थ्रेशोल्ड मान दर्ज करें।
  2. नए समूह बटन(N) पर क्लिक करें और एक प्रयोग समूह का नाम असाइन करें. यह एक समूह जनरेट करेगा जो प्रत्येक जोड़ी गई FLIM छवि से डेटा को संयोजित करता है.
  3. FLIMview के Roi नियंत्रण मॉड्यूल में ROI बटन पर क्लिक करें और एक tAKAR$-सकारात्मक सोमा के आसपास एक ROI आकर्षित. z-स्टैक श्रेणी को कम करें, FLIMview में z-स्टैक नियंत्रण स्लाइडर्स में निम्न और ऊपरी z-सीमा को ले जाकर, अन्य z गहराई में पृष्ठभूमि फोटॉनों से उत्पन्न होने वाले सिग्नल संदूषण को कम करने के लिए।
  4. समूह (चरण 6.2) के लिए FLIM छवि जोड़ने के लिए + बटन पर क्लिक करें. मतलब जीवनकाल की गणना करने के लिए कैल्क बटन पर क्लिक करें (LT, जिसे आरओआई और जीवनकाल अनुमान त्रुटि ($) के लिए माध्य फोटॉन उत्सर्जन समय [MPET] भी कहा जाता है।
  5. पुरानी 2pFLIM इमेजिंग श्रृंखला में अगली फ़ाइल खोलें. चरण 6.4 दोहराएँ. समय के साथ एक ही tAKAR$-सकारात्मक सोमा को मापने के लिए ROI और z-स्टैक श्रेणी की स्थिति को समायोजित करना सुनिश्चित करें, क्योंकि समय के साथ ऊतक बहाव हो सकता है।
  6. समूह नियंत्रण मॉड्यूल के ड्रॉप-डाउन मेनू में deltaMPET/MPET0 का चयन करें। बेसलाइन ] फ़ील्ड पर क्लिक करें और इंडेक्स (es) दर्ज करें (उदाहरण के लिए, चरण 6.3) में बनाए गए समूह में पहले पांच छवियों के लिए 1 2 3 4 5). यह आधार रेखा जीवनकाल (LT 0) कीगणना करने के लिए उपयोग की गई छवि (ओं) को परिभाषित करेगा।
  7. परिभाषित ROIs में प्रयोग के दौरान TAKAR के FLIM प्रतिसाद ([LT/LT0) वाला ग्राफ़ उत्पन्न करने के लिए प्लॉट पर क्लिक करें. संगत आधार रेखा जीवनकाल (एलटी0) द्वारा अलग-अलग ROIs के जीवनकाल में सामान्यीकृत परिवर्तन विभिन्न ROIs में चलन के दौरान PKA गतिविधि की तुलना के लिए अनुमति देते हैं।

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Representative Results

FRET-FLIM सेंसर कई अलग अलग संकेतन रास्ते के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं, सहित CAMP / वर्तमान प्रोटोकॉल सिर तय व्यवहार चूहों में PKA गतिविधियों कल्पना करने के लिए 2pFLIM के साथ संयोजन में हाल ही में विकसित tAKAR - सेंसर का इस्तेमाल करता है. अधिकांश मौजूदा दो-फोटोन माइक्रोस्कोप को तीन से चार घटकों को जोड़कर 2pFLIM क्षमताओं के साथ उन्नत किया जा सकता है, जैसा कि चित्र 1 में सचित्र किया गया है (यह भी अनुभाग 1 देखें)। 2pFLIM-अधिग्रहित छवियों में FRET कल्पना करने के लिए, औसत जीवनकाल का परिमाण प्रति पिक्सेल एकत्र फोटॉन समय के हिस्टोग्राम भूखंडों पर किया गया था (चित्र 3A, बी)। मतलब जीवनकाल एक छद्म रंग छवि का उपयोग कर कल्पना की थी, जिसमें उच्च (ठंडा रंग) और कम (गर्म रंग) मतलब जीवन भर कम और उच्च PKA गतिविधियों का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमशः, के बाद से PKA सक्रियण जीवन भर की कमी की ओर जाता है. ध्यान SPC रेंज सही ढंग से सेट करने के लिए लिया जाना चाहिए; इस रेंज लेजर पल्स अंतराल के भीतर सेट किया जाना चाहिए (उदा., 12.5 एक पल्स दर के एन 80 मेगाहर्ट्ज) कम से कम हार्डवेयर बढ़त कलाकृतियों के साथ (यह भी अनुभाग 6 और DISCUSSION देखें). ROIs के भीतर PKA गतिविधि की गणना किसी दिए गए ROI (चित्र 3C,D) के भीतर सभी पिक्सेल के एलटी के संयोजन द्वारा की गई थी। सिर पर स्थिर जाग में चूहों बेसल जीवनकाल 1.3 और 1.8 एन के बीच थे (चित्र 3E) . सिर में मोटर प्रांतस्था में tAKAR$ की इमेजिंग निर्धारित जाग चूहों बेसल और लागू चलन के दौरान सेलुलर संकल्प के साथ पीकेए गतिविधि के वास्तविक समय परिमाणीकरण के लिए अनुमति दी (चित्र 4) . प्रयोग दिनों और महीनों में दोहराया जा सकता है. प्रेरक गति माउस मोटर प्रांतस्था17की सतही परतों के भीतर न्यूरॉन्स की आबादी में पीकेए गतिविधि को ट्रिगर करती है . यह PKA गतिविधि $-एड्रेनर्जिक और डी 1 रिसेप्टर्स17के सक्रियण के माध्यम से neuromodulation पर निर्भर है।

Figure 1
चित्र 1: 2pFLIM प्रणाली का Schematic. 2pFLIM पीले प्रकाश डाला हार्डवेयर घटकों के अलावा द्वारा एक पारंपरिक दो-फोटोमाइक्रोपर लागू किया जा सकता है: एक फोटॉन समय गिनती मॉड्यूल, एक कम शोर fastpliplier ट्यूब (PMT), एक photodiode (केवल जरूरत है अगर लेजर एक नहीं है लेजर समय के लिए उत्पादन संकेतन), और एक वैकल्पिक संकेत विभाजक. यह आंकड़ा मा एट अल17से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक कस्टम निर्मित मोटर चालित ट्रेडमिल का डिजाइन। (एक) सामने से ट्रेडमिल डिजाइन के Schematic (ऊपर बाएँ), पक्ष (ऊपर दाएँ), और शीर्ष विचारों (नीचे छोड़ दिया). ट्रेडमिल (फोम गेंद) धुरा एक रोटरी एनकोडर और एक मोटर है कि सामूहिक रूप से एक ठोस एल्यूमीनियम रोटी प्लेट पर दो पदों पर मुहिम शुरू कर रहे हैं से जुड़ा है. दाएँ कोण ब्रैकेट पर headplate-संगत धारक एक ठोस पोस्ट करने के लिए तय है और ट्रेडमिल के ऊपर तैनात है। Schematic चित्र पैमाने पर करने के लिए नहीं कर रहे हैं. फ्रंट (बी) और साइड (सी) ट्रेडमिल की तस्वीरें देखें। ट्रेडमिल पर माउस की उचित स्थिति पैनल सीमें दिखाई जाती है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: 2pFLIM डेटा की परिमाणीकरण. (ए) प्रत्येक पिक्सेल छद्म रंग के साथ एक FLIM छवि मतलब जीवनकाल (एलटी) का प्रतिनिधित्व करने के लिए, लेजर समय के सापेक्ष, उस पिक्सेल में सभी फोटॉनों की. () एक ही पिक्सेल के भीतर फोटॉन आगमन समय (पैनल में पूर्ण वर्ग ) एक हिस्टोग्राम (बाएं पैनल) में प्लॉट किया गया था। एकीकरण सीमाओं एकल फोटॉन गिनती रेंज (SPC, ग्रे) का निर्धारण करने के लिए सेट किए गए थे। SPC श्रेणी के भीतर, फोटॉन समय का अभिन्न अंग फोटॉनों की कुल संख्या से विभाजित किया गया था और फिर t0 (1.65 ns, डैश्ड लाइन) द्वारा घटाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप एक औसत जीवनकाल (एलटी, डैश्ड और डॉटेड लाइनों के बीच की दूरी) 1.74 ns. देखने के पूरे क्षेत्र के मतलब जीवनकाल के परिमाण (पैनल में हल्के नीले वर्ग ) सभी पिक्सल (दाएं पैनल) में एकत्र फोटॉन समय के एकीकरण शामिल है, 1.7 एन एस का एक मतलब जीवनकाल में जिसके परिणामस्वरूप. इनसेट अर्द्ध लॉग स्केल में एक ही डेटा दिखाते हैं. (सी और डी) ब्याज (आरओआई) के प्रति क्षेत्र माध्य जीवनकाल का परिमाणीकरण। (ग) 2pFLIM छवि का प्रतिनिधि उदाहरण. मोटर कॉर्टेक्स के परत 2/3 में दो सोमाटा के आसपास दो आरओआई तैयार किए गए थे। (D) प्रत्येक ROI (बाएं पैनल) में सभी पिक्सेल में एकीकृत फोटॉन समय वितरण. सेल ROIs रंग कोडित थे (जैसा कि पैनल सीमें दिखाया गया है ) लाल, सेल 1; नीला, सेल 2. सामान्य फोटॉन गणना एँ दो ROIs (सही पैनल, माध्य जीवनकाल; कक्ष 1, 1.33 ns; कक्ष 2, 1.73 ns) के बीच फोटॉन समय वितरण की तुलना के लिए अनुमति देते हैं। इनसेट अर्द्ध लॉग स्केल में एक ही डेटा दिखाते हैं. () मोटर प्रांतस्था की सतही परतों में 254 छवि वाली कोशिकाओं से माध्य आधार जीवनकाल का वितरण आलेख। L1 कोशिकाओं (n ] 186 कोशिकाओं/11 जानवरों, बाएँ पैनल), pia नीचे 100 डिग्री मीटर के भीतर रहने वाले, AAV2/1-hSyn-tAKAR-WPRE के एक स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के बाद tAKAR] व्यक्त की, और L2/3 पिरामिड कोशिकाओं (n ] 68 कोशिकाओं / एक सीएजी-टाकर-WPRE डीएनए निर्माण के IUE के बाद tAKAR$ व्यक्त किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: tAKAR] मोटर प्रांतस्था में लागू चलन प्रेरित PKA गतिविधियों पटरियों. (ए) प्रतिनिधि तीव्रता (बाएं पैनल) और जीवन भर (मध्य और दाएँ पैनल) मोटर प्रांतस्था में तीन L1 कोशिकाओं की छवियों. सेल ROIs रंग कोडित थे: नारंगी, सेल 1; नीला, सेल 2; पीला, सेल 3. () प्रकाश समय वितरण कक्ष 1 (ऊपरी पैनल) में बेसल हालत के दौरान मापा (नारंगी ट्रेस, के रूप में मध्य पैनल में मापा ]) और लागू चलन (loco., हल्के नारंगी ट्रेस, के रूप में सही पैनल में मापा ). सामान्य फोटॉन गिनती फोटॉन समय वितरण की सीधी तुलना के लिए अनुमति दी (कम पैनल, मतलब जीवनकाल: बेसल, 1.72 एन एस; चलन, 1.42 ns). इनसेट अर्द्ध लॉग स्केल में एक ही डेटा दिखाते हैं. () [ जीवन भर0 ( [एलटी/एलटी0) इसी कोशिकाओं के निशान (ऊपरी पैनल, पैनल देखें ) लागू चलन गति (कम पैनल) के साथ। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल FRET-FLIM सेंसर tAKAR के उपयोग को दर्शाता है सिर तय व्यवहार चूहों में neuromodulation-ट्रिगर PKA गतिविधि कल्पना करने के लिए. यह आवेदन विस्तृत परीक्षण और इन विट्रो में और विवो में की विशेषताओं पर आधारित है कि प्राप्त FLIM संकेत शारीरिक neuromodulatory घटनाओं17के लिए प्रासंगिक है. यहाँ, विवो आवेदन में से एक, मोटर प्रांतस्था में चलन प्रेरित PKA गतिविधि, मस्तिष्क को सेंसर देने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इमेजिंग के लिए पशु सर्जरी, हार्डवेयर और व्यवहार और इमेजिंग डेटा अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर आवश्यकताओं , और सॉफ्टवेयर और इमेजिंग डेटा विश्लेषण के लिए एल्गोरिदम.

TAKAR$ सेंसर डीएनए प्लाज्मिड या एएवी कणों के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन के IUE द्वारा प्रांतस्था के लिए पेश किया है। इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर और डीएनए सांद्रता के आधार पर, IUE प्रांतस्था25में एक अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र पर cortical न्यूरॉन्स के विभिन्न लेबलिंग घनत्व में परिणाम . IUE का उपयोग कर लेबल cortical परत भ्रूण चरण द्वारा निर्धारित किया जाता है जब सर्जरी किया जाता है. यह एक परिभाषित मस्तिष्क उपक्षेत्र के भीतर कई कोशिकाओं की छवि के लिए वांछित है जब एएवी कणों के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन का उपयोग किया जाता है। यह आम तौर पर इंजेक्शन केंद्र पर घने लेबल न्यूरॉन्स में परिणाम और तेजी से विरल लेबलिंग केंद्र से आगे. महत्वपूर्ण बात, मस्तिष्क के भीतर कोशिकाओं के संक्रमण दक्षता AAV serotype इस्तेमाल पर निर्भर है. AAV2/1 अपेक्षाकृत कम प्रतिगामी लेबलिंग गतिविधियों के साथ cortical, thalamic, और striatal न्यूरॉन्स में महान दक्षता प्रदान करता है. यह अनुभवजन्य रूप से स्थापित करने के लिए सलाह दी जाती है जो एएवी serotype लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र और सेल प्रकार के लिए सबसे कुशल है. दोनों transfection तरीकों सफलतापूर्वक tAKAR$ व्यक्त किया है. अभिव्यक्ति के स्तर के लिए "मीठा स्थान" अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है।

मोटर प्रांतस्था के परत 2/3 न्यूरॉन्स में PKA गतिविधियों में वृद्धि हुई चलन परिणाम. वर्तमान में, 2pFLIM माउस के सिर निर्धारण के कारण परीक्षण करने योग्य व्यवहार की श्रेणी को सीमित करता है। हालांकि, व्यवहार प्रतिमानों की एक बढ़ती सूची सफलतापूर्वक इस बाधा के भीतर लागू किया गया है, जानेमें उत्तेजनाओं रिपोर्टिंग से लेकर / . इसके अलावा, बेहतर तरीके गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों में इमेजिंग सक्षम हो सकता है, जैसे striatum, amygdala, और हिप्पोकैम्पस, एक सुई की तरह ढाल सूचकांक के माध्यम से (GRIN) लेंस13 (अप्रकाशित टिप्पणियों). इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल neuromodulation घटनाओं के vivo दृश्य में के लिए tAKAR और 2pFLIM के उपयोग का विवरण सिर तय व्यवहार प्रतिमानों के संदर्भ में कई मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए आसानी से लागू किया जाना चाहिए.

वक्र फिटिंग का उपयोग करके प्रति पिक्सेल या ROI का जीवनकाल की गणना गणना में समय लगता है, और प्रति पिक्सेल सीमित कुल फोटॉन गणना अक्सर फिटिंग त्रुटियों का परिणाम है। अतः माध्य आजीवन (एलटी) का अर्थ आजीवन (ज)17,34के लिए सन्निकटन के रूप में अभिकलित किया जाता है :


Equation 1(समीकरण 1)


जहां SPCमिनट, और SPCअधिकतम माप खिड़की (SPC) सीमाओं और एफ (टी) फ्लोरोसेंट जीवनकाल क्षय वक्र है. दूसरे शब्दों में, प्रत्येक परिकलित मात्रा (पिक्सेल या ROI, चित्र 3क) के लिए फोटॉन समय वितरण को हिस्टोग्राम (चित्र 3B)में प्लॉट किया जाता है. SPC श्रेणी के भीतर भारित अभिन्न (समय के साथ वजन जा रहा है) इस वितरण के कुल फोटॉन गिनती से विभाजित है एक औसत उत्सर्जन समय में परिणाम है. इस बार तो टी0के लिए सही है. लाइफ़टाइम छवि जनरेट करने के लिए (चित्र 3A) यह कार्यविधि प्रत्येक पिक्सेल के लिए की जाती है, जबकि जीवन भर प्रति ROI की गणना (चित्र 3C,D) सभी फोटॉनों को ROI वॉल्यूम में सीमा से ऊपर वाले सभी पिक्सेल से एकीकृत करती है. आजीवन आकलन त्रुटि ([] एकीकृत तीव्रता (Nफोटॉन: कुल फोटॉन गणना) का उपयोग करके गणना की जाती है:


Equation 2(समीकरण 2)

आजीवन अनुमान त्रुटि को कम करने के लिए, $ $ , और उपज उचित संकेत का पता लगाने FRET-FLIM के लिए पर्याप्त फोटॉनों के अधिग्रहण की आवश्यकता है रॉय प्रति. वांछित संकेत-से-शोर अनुपात (एसआर) प्राप्त करने के लिए निम्नलिखित समीकरण को भी पूरा करना होता है-


Equation 3(समीकरण 3)


उदाहरण के लिए, मोटर कॉर्टेक्स में एक न्यूरॉन सोमा में चलन के दौरान विशिष्ट माप (LT $ 1.57 ns, Nफोटॉन ] 9075, [LT ] 0.15 ns; चित्र 4, कक्ष 1) का जीवनकाल अनुमान त्रुटि उत्पन्न करता है:

Equation 4 Equation 5 ] Equation 4 0.016 एन एस (समीकरण 4)

जो एक संकेत करने के लिए शोर अनुपात में परिणाम:

SNR Equation 4 Equation 6 Equation 7 Equation 4 $ 9.4 (समीकरण 5)

यदि वांछित SNR केवल 5 है, तो दी गई [LT ] 0ण्15 ns a ] की अनुमति है:

Equation 8

जो की एक न्यूनतम कुल फोटॉन गिनती की आवश्यकता है:

Equation 9

जैसा कि ऊपर बताया गया है, आजीवन परिमाणीकरण केलिए कई पैरामीटर उचित रूप से सेट करने की आवश्यकता होती है, जैसे SPC श्रेणी, t 0, और आजीवन luminance न्यूनतम सीमा. SPC श्रेणी हार्डवेयर माप विंडो के भीतर उत्सर्जित फोटॉनों की माप विंडो निर्धारित करता है (समीकरण 1; हार्डवेयर माप विंडो आमतौर पर है 0$12.5 ns, के रूप में लेजर 80 मेगाहर्ट्ज पर दोहराता है). यह आवश्यक है क्योंकि PTCM इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल बढ़त कलाकृतियों है. SPC रेंज बढ़त कलाकृतियों सहित बिना दाता फोटॉन जीवनकाल वितरण के सबसे शामिल करने के लिए सेट कर दिया जाता है. औसत जीवनकाल की गणना करने के लिए, माप विंडो से माध्य फोटॉन समय t0द्वारा घटाया जाता है, जो विंडो के भीतर लेजर पल्स के समय से मेल खाता है (समीकरण 1, चित्र 3A,B)17,34. t0 संकेत केबल लंबाई या PTCM सेटिंग्स को बदलने के द्वारा समायोजित किया जा सकता है, और आम तौर पर हार्डवेयर माप विंडो के शुरू से $ 2 एन एस होना समायोजित किया जाता है. प्रणाली के प्रारंभिक लक्षणीकरण के बाद, आम तौर पर आदर्श इमेजिंग शर्तों के तहत किया (उदाहरण के लिए, जब इमेजिंग 5 डिग्री एम fluorcein समाधान), दोनों SPC रेंज और टी0 दिया हार्डवेयर विन्यास के निश्चित मापदंडों के रूप में सेट कर रहे हैं. लाइफटाइम luminance न्यूनतम थ्रेशोल्ड सेट किया गया है ताकि केवल एक कुल फोटॉन गिनती के साथ पिक्सल बराबर या थ्रेशोल्ड से अधिक प्रदर्शन और विश्लेषण में शामिल किया जाएगा. यह प्रभावी ढंग से पृष्ठभूमि फोटॉन मायने रखता है के कारण शोर कम कर देता है, autofluorence सहित, परिवेश प्रकाश, और सहज PMT अंधेरे मायने रखता है. यह थ्रेशोल्ड अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है।

विवो 2pFLIM इमेजिंग में के लिए सफल FRET-FLIM सेंसर कम से कम तीन आम विशेषताएं हैं. सबसे पहले, फ्लोरोफोर्स के चयन के बारे में, फोटॉन संग्रह दक्षता आमतौर पर मस्तिष्क के ऊतकों में गंभीर प्रकाश प्रकीर्णन के कारण भाग में विवो इमेजिंग वातावरण में चुनौतीपूर्ण के तहत कम है। एक ही समय में, पता चला फोटॉनों की एक उच्च संख्या के लिए एक वांछनीय SNR प्राप्त करने की आवश्यकता है ($1,000 फोटॉनों के लिए एक $LT/LT0 के लिए 1 की एक SNR प्राप्त करने के लिए आवश्यक होगा 0.03; समीकरण देखें 2 और 3). इसलिए, एक उच्च फोटॉन बजट के साथ एक दाता फ्लोरोफोर (यानी, एक फ्लोरोफोर ब्लीच किया जाता है से पहले डिटेक्टेबल फोटॉनों की अधिकतम संख्या) इष्ट है। वर्तमान में, दो फोटोन उत्तेजना के तहत उनके फोटॉन बजट के संदर्भ में विभिन्न दाता फ्लोरोफोर्स की कोई व्यवस्थित तुलना नहीं है। अनुभवजन्य रूप से, eGFP अपेक्षाकृत उज्ज्वल है, जबकि हरे/ पीले स्पेक्ट्रम में कई अन्य फ्लोरोफोर की तुलना में अधिक photostable जा रहा है, यह FRET-FLIM सेंसर के vivo उपयोग में के लिए एक महान दाता फ्लोरोफोर बना. इसके अलावा, FRET के इष्टतम परिमाणीकरण के लिए, एक एकल-अनुभवी फ्लोरोसेंट जीवनकाल क्षय के साथ दाता फ्लोरोफोर्स के पक्ष में हैं। कई आमतौर पर इस्तेमाल किया दाता फ्लोरोसेंट प्रोटीन ratiometric इमेजिंग के लिए, इस तरह के eCFP के रूप में, बहु घातीय फ्लोरोसेंट जीवनकाल क्षय है, सुझाव है कि वे फ्लोरोफोर की मिश्रित आबादी से मिलकर बनता है. ये फ्लोरोसेंट प्रोटीन इसलिए FRET-FLIM21के लिए आदर्श नहीं हैं. दाता फ्लोरोफोर के विपरीत, स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर की कम क्वांटम उपज FRET-FLIM सेंसर के लिए फायदेमंद हो सकती है। "अंधेरे" कम विकिरणी फ्लोरोफोर sREACh tAKARs के लिए प्रयोग किया जाता है. स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर की कम क्वांटम उपज दाता फ्लोरोफोर उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में फोटॉन संदूषण को कम करती है और लाल स्पेक्ट्रम में एक दूसरे फ्लोरोसेंट सेंसर या आकारिकी मार्कर के साथ-साथ इमेजिंग के लिए एक फ्लोरोसेंट डिटेक्शन चैनल को मुक्त करती है के मामले में tAKAR$.

दूसरा, बाइंडिंग अंश रेंज में पर्याप्त SNR प्राप्त करने के लिए, एक इष्टतम FRET-दक्षता की $0.5 $0.7 के पक्ष मेंहै 21. संकेत, यानी, एक दिया दाता-स्वीकारक बंधन अनुपात परिवर्तन के तहत मतलब जीवन भर परिवर्तन, FRET की दक्षता पर निर्भर है. FRET दक्षता और मतलब जीवन भर परिवर्तन के बीच यह संबंध है, तथापि, गैर रेखीय. यदि FRET दक्षता एक दृष्टिकोण, बाध्य राज्य में दाता fluorphoores प्रभावी ढंग से लगभग कोई फोटॉनों उत्सर्जन कर रहे हैं. इसलिए, जब तक बाइंडिंग अनुपात 100% है (यह मामला कभी नहीं है क्योंकि कोई ग्राही फ्लोरोफोर 100%29) मतलब जीवनकाल खुले राज्य में दाता फ्लोरोफोर के जीवनकाल तक पहुंचता है, और बाध्य राज्य सेंसर का पता लगाने की क्षमता घटाता. tAKAR$ के लिए FRET-दक्षता अनुकूल सीमा के भीतर $0.7 होने का अनुमान है।

तीसरा, FRET-FLIM सेंसर एक संवेदनशीलता और गतिज कि पशु शरीर क्रिया विज्ञान के लिए प्रासंगिक हैं के साथ संकेतों की रिपोर्ट करना चाहिए. सेंसर संवेदनशीलता और गतिकी व्यापक रूप से विवो में इसके उपयोग से पहले इन विट्रो में परीक्षण किया जाना चाहिए, और, यदि आवश्यक हो, तो इस तरह के समायोजन सब्सट्रेट बाध्यकारी डोमेन आत्मीयता और गतिकी, linker-optimization, और subcellular के रूप में दृष्टिकोण की एक किस्म का उपयोग कर tuned किया जा सकता है सेंसर का लक्ष्यीकरण. पिछले काम में, यह स्थापित किया गया था कि tAKAR] PKA गतिविधियों अंतर्जात डोपामाइन के रिलीज द्वारा प्राप्त का पता लगा सकते हैं, और यह कि गतिज और सेंसर की संवेदनशीलता एक ज्ञात PKA-निर्भर जैविक प्रक्रिया के साथ संरेखित करें, जो norepinephrine प्रेरित है धीमी गति से बाद hyperpolarization वर्तमान17की निष्क्रियता | इसके अलावा, tAKAR की अभिव्यक्ति न्यूरॉन कार्यों को बदलने के लिए प्रकट नहीं होता है, के रूप में electrophysiology द्वारा परख17 और व्यक्तिगत रीढ़ की संरचनात्मक प्लास्टिक की माप (अप्रकाशित टिप्पणियों).

2pFLIM इमेजिंग की वर्तमान तकनीकी सीमाओं डेटा हैंडलिंग और फोटॉन गिनती throughputs से संबंधित हैं. सबसे पहले, FLIM प्रत्येक पिक्सेल के लिए फोटॉन आगमन समय के भंडारण की आवश्यकता है. PTCM की स्मृति आकार प्राप्य पिक्सेल रिज़ॉल्यूशन को सीमित करता है। पीसीटीएम के लिए यहाँ वर्णित, एक 64-बिंदु समय संकल्प के साथ छवि फ्रेम प्रति 256 x 256 पिक्सेल तक प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, कंप्यूटर भंडारण के लिए बोर्ड से FLIM छवि डेटा के हस्तांतरण की गति अपेक्षाकृत धीमी है, फिर से, संकल्प और नमूना आवृत्ति पर व्यावहारिक सीमा डाल. स्मृति क्षमता और डेटा हैंडलिंग के सतत तकनीकी सुधार भविष्य में इन सीमाओं को हल कर सकते हैं. दूसरा, आमतौर पर इस्तेमाल PTCMs एनालॉग-टू-डिजिटल सिस्टम हैं और उनके फोटॉन डिटेक्शन रीसेट समय (यानी, "मृत समय") द्वारा सीमित हैं। इसका मतलब यह है कि एक फोटॉन का पता लगाने के बाद PTCM अगले 100 डिग्री 125 एन एस18,21के लिए किसी भी बाद फोटॉन (ओं) के आगमन रजिस्टर नहीं होगा . इसके अलावा, जीवन भर माप एक लेजर पल्स के बाद पहले आ फोटॉन की ओर पक्षपाती है (तथाकथित "पाइल-अप")। ये फोटॉन की गणना दरों को $lt;107 फोटॉनों प्रति एस तक सीमित करते हैं। हालांकि सबसे विशिष्ट दो फोटो इमेजिंग शासनों में यह एक बड़ी समस्या नहीं है, देखभाल फोटॉन गिनती दर सीमा से अधिक नहीं लिया जाना चाहिए. नए PTCMs कि कम मृत समय या एक गीगाहर्ट्ज सतत डेटा अधिग्रहण प्रणाली इस सीमा को कम कर सकते हैं (बाद में Yellen और Mongeon18देखने के लिए).

रास्ते के संकेत देने के लिए फ्लोरिसेंट सेंसर, जैसे सीएएमपी/पीकेए, अकट/पीकेबी, पीकेसी, और ईआरके, लगातार उत्पन्न किए जा रहे हैं और 16,35को अनुकूलित किया जा रहा है। वर्तमान सेंसर के अधिकांश के लिए, आगे की विशेषता और अनुकूलन vivo इमेजिंग वातावरण में चुनौतीपूर्ण में उत्कृष्टता प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. विशेष रूप से, वृद्धि हुई संकेत आयाम महत्वपूर्ण है, के रूप में संकेत आयाम में किसी भी वृद्धि एक वर्ग संबंध के साथ फोटॉन बजट पर मांग कम कर देता है. tAKAR] के लिए, इस तरह के norepinephrine के रूप में अंतर्जात neuromodulators के लिए अपनी प्रतिक्रिया आयाम, पिछले सबसे अच्छा सेंसर की तुलना में 2.7 गुना से सुधार किया गया था. यह आवश्यक फोटॉनों में $ 7 गुना कमी करने के लिए अनुवाद किया. व्यवहार में, यह बहुत व्यवहार के दौरान जानवरों में झूठी नकारात्मक (यानी, गैर responders) की संख्या कम17. अधिकतम tAKAR] संकेत मनाया है $30% ($LT/LT0). तारीख करने के लिए, यह सबसे बड़ा FLIM संकेत FRET सेंसर के समान वर्गों के लिए सूचना दी है. इसके अलावा सुधार भी स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर और फास्फोरिलेटिड थ्रॉनिन के लिए FHA की समानता का अनुकूलन करके संभव हो सकता है. इसके अलावा, सेंसर का उपयोग है कि एक ही संकेतन मार्ग के विभिन्न पहलुओं की निगरानी यंत्रवत् vivo में संकेतन रास्ते के विनियमन की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं. भविष्य में, FLIM सेंसर के सफल आवेदन vivo में neuromodulatory संकेतन रास्ते कल्पना करने के लिए जहां और जब neuromodulation व्यवहार चूहों के बरकरार न्यूरॉन नेटवर्क में जगह लेता है के बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम सुश्री Tess जे Lameyer, सुश्री रूथ फ्रैंक, और संपादन और टिप्पणियों के लिए डॉ माइकल ए मुनीक धन्यवाद, और डॉ Ryohei Yasuda मैक्स प्लैंक फ्लोरिडा में 2pFLIM अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के लिए. यह काम दो ब्राइन पहल पुरस्कार U01NS094247 (H.$. और T.M.) और R01NS1049444 (H.$. और T.M.), एक R01NS081071 (T.M.), और एक R21 अनुदान R21NS097856 (H.M.) द्वारा समर्थित किया गया था. सभी पुरस्कार राष्ट्रीय न्यूरोलॉजिकल विकार और स्ट्रोक, संयुक्त राज्य अमेरिका के संस्थान से हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cellulose acetate syringe filter Nalgene 190-2520 Step 3.2.2.
16x 0.8 NA water-immersion objective Nikon MRP07220 Step 5.5.
3-pin cable US digital CA-MIC3-SH-NC Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope
Aluminum bread board Thorlabs MB1012 Step 2.5.
AnimalTracker MATLAB software N/A N/A Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author
Band-pass barrier filter Chroma ET500-40m Step 1.4.
Cage plate Thorlabs CP01 Step 2.4. Used as mount for rotation sensor
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter FST 19007-05 Steps 3.2.3. and 4.4.
Circular coverslip (5 mm diameter) VWR 101413-528 Step 4.5.
Custom-made injection needle holder N/A N/A Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author
Dental acrylic Yates Motloid 44114 Steps 4.3. and 4.5.
Dental drill; Microtorque ii Ram products 66699 Steps 3.2.3. and 4.4.
Dowsil transparent polymer The Dow Chemical Company 3-4680 Step 4.5. Artificial dura
Electroporation electrode Bex LF650P5 Step 3.1.4.
Electroporator Bex CUY21 Step 3.1.4.
Fast green FCF Sigma-aldrich F7258-25G Step 3.1.1.
FLIMimage MATLAB software N/A N/A Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB software N/A N/A Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) Gorilla 5201204 Step 2.3.
Headplate N/A N/A Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author
Headplate holder N/A N/A Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket
Hydraulic micromanipulator Narishige MO-10 Step 3.2.4.
Krazy glue Krazy glue KG82648R Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue
Low-noise fast photomultiplier tube Hamamatsu H7422PA-40 or H10769PA-40 Step 1.3.
MATLAB 2012b Mathworks N/A Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software
Motor Zhengke ZGA37RG Step 2.4.
Motor speed controller Elenker EK-G00015A1-1 Step 2.5.
Motorized micromanipulator Sutter MP-285 Step 3.2.4.
Mounting base Thorlabs BA1S Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2
Mounting post Thorlabs P14 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2
Mounting post base Thorlabs PB2 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14
Mounting post bracket Thorlabs C1515 Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder
Optical post Thorlabs TR2 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4
Phosphate-buffered saline Ν/Α Ν/Α Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Photodiode Thorlabs FDS010 Step 1.2.
Photon timing counting module Becker and Hickl SPC-150 Step 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) Addgene 119913 Step 3.1.3.
Post holder Thorlabs PH4 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2
Right-angle bracket Thorlabs AB90 Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder
Rotation encoder US digital MA3-A10-250-N Step 2.4.
Rubber mat Rubber-Cal B01DCR5LUG Step 2.1.
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) McMaster 6208K433 Steps 2.3. and 2.4.
ScanImage 3.6 Svoboda Lab/Vidrio Technology N/A Steps 5.9. and 6.1.
Signal splitter Becker and Hickl HPM-CON-02 Step 1.3.1.
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) McMaster 1327K66 Step 2.3.
Stereotaxic alignment systsem David kopf 1900 Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator
Two-photon microscope N/A N/A Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Vetbond tissue adhesive 3M 14006 Step 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) Addgene 119921 Step 3.2.2.
White PE foam roller (8 inch x 12 inch) Fabrication enterprises INC. 30-2261 Step 2.1.1.
White polystyrene fom ball halves GrahamSweet 200mm diameter 2 hollow halves Step 2.1.1.
Zipkicker PACER PT29 Step 4.3. Hardening accelerator

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References

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प्रोटीन Kinase कल्पना एक गतिविधि में सिर तय व्यवहार चूहे Vivo दो-फोटोन फ्लोरेसेंस लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी में उपयोग
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Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).More

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).

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