Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

doi: 10.3791/59526 Published: June 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

절차는 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나제 A 활동을 시각화하기 위해 제시된다. 향상된 A-키나아제 활동 리포터, tAKARα는 피질 뉴런으로 표현되고 두개골 창을 통해 이미징에 접근할 수 있게 된다. 2 광자 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법은 강제운동 도중 생체 내 PKA 활동을 구상하기 위하여 이용됩니다.

Abstract

신경 변조는 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 발휘합니다. 신경 조절 시스템의 기능 장애는 신경 및 정신 장애에 결과. 그들의 중요성에도 불구 하 고, 세포 해상도 신경 변조 이벤트를 추적 하기 위한 기술은 등장 하기 시작. 도파민, 노르에피네프린, 아세틸콜린 및 세로토닌과 같은 신경 조절제는 각각의 G 단백질 결합 수용체를 통해 세포내 신호 전달 이벤트를 트리거하여 신경 흥분성, 시냅스 통신 및 기타 뉴런을 조절합니다. 신경 네트워크에서 정보 처리를 조절할 수 있습니다. 위에서 언급 한 신경 조절제는 cAMP / 단백질 키나아제 A (PKA) 통로에 수렴합니다. 따라서, 단일 세포 해상도를 가진 생체 내 PKA 이미징은 신경 전기 활동을 위한 칼슘 이미징과 유사한 방식으로 신경 조절 이벤트에 대한 판독으로 개발되었다. 본 명세서에서, 헤드 고정 행동 마우스의 피질에서 개별 뉴런의 수준에서 PKA 활성을 시각화하는 방법이 제시된다. 이를 위해, 개선 된 A-키나아제 활동 리포터 (AKAR), 라는 tAKARα, Förster 공명 에너지 전송 (FRET)를 기반으로 사용 됩니다. 이 유전자 부호화 된 PKA 센서는 DNA 플라스미드의 자궁 전기 천공 (IUE) 또는 아데노 관련 바이러스 (AAV)의 입체 적 주입을 통해 모터 피질에 도입됩니다. FRET 변화는 광산성 뇌 조직에서 FRET 신호를 정량화하기 위한 비율 메트릭 FRET 측정에 비해 이점을 제공하는 2광자 형광 평생 이미징 현미경(2pFLIM)을 사용하여 이미지화됩니다. 강제 운동 중 PKA 활동을 연구하기 위해 tAKARα는 속도 제어 전동 러닝 머신에서 실행하거나 쉬는 깨어있는 머리 고정 마우스의 피질 위의 만성 두개골 창을 통해 이미지화됩니다. 이 화상 진찰 접근은 생체 내 화상 진찰을 위한 그밖 FLIM 기지를 둔 센서에 대응하는 행동 유도한 PKA 활동을 공부하기 위하여 많은 그밖 두뇌 지구에 적용될 것입니다.

Introduction

또한 느린 시냅스 전송으로 알려진 신경 변조는 스트레스, 각성, 주의 및 운동과 같은 다른 행동 상태동안 뇌 기능에 대한 강력한 제어를 부과 1,2,3, 4. 그 중요성에도 불구하고, 신경 조절 이벤트가 일어나는 시기와 장소에 대한 연구는 아직 초기 단계에 있습니다. 아세틸콜린, 도파민, 노르아드레날린, 세로토닌 및 많은 뉴로펩타이드를 포함한 신경 조절제는 G 단백질 결합 수용체(GPCRs)를 활성화하여 광범위한 기간의 확장창을 통해 세포내 두 번째 메신저 경로를 트리거합니다. 초에서 시간까지. 각 신경 조절기는 신호 이벤트의 뚜렷한 세트를 트리거하는 동안, cAMP /단백질 키나제 A (PKA) 통로는많은 신경 조절제 1,5에대한 일반적인 다운스트림 통로입니다. cAMP/PKA 통로는 신경 흥분성, 시냅스 전송 및 가소성 6,7,8,9,따라서, 신경 네트워크 역학을 조정합니다. 다른 뉴런 또는 뉴런 유형이 신경 조절제 수용체의 다른 유형 또는 수준을 표현하기 때문에10,동일한 세포 외 신경 조절기의 세포 내 효과는 다른 뉴런에 걸쳐 이질적 일 수 있으며, 따라서, 세포 해상도로 공부했습니다. 날짜를, 그것은 행동 하는 동안 생체 내 개별 뉴런에서 신경 조절 이벤트를 모니터링 하는 도전 남아.

신경 변조의 시공간 역학을 연구하기 위해서는 적절한 기록 양식이 필요합니다. 미세 투석 및 빠른 스캔 주기적 voltammetry는 신경 조절제의 방출을 연구하는 데 자주 사용되지만 세포 이벤트를 모니터링하는 공간 해상도가 부족합니다11,12. 집단 화상 진찰13에 있는 신경 전기 활동에 대한프록시로 이용되고 있는 칼슘 역학과 유사하게, PKA 화상 진찰은 세포 해결책에 신경 인구에 걸쳐 신경 조절 사건을 판독하기 위하여 이용될 수 있습니다. 본 프로토콜은 동물 행동 동안 생체 내에서 PKA 활동을 모니터링하기 위해 개선된 A-키나아제 활성 리포터(AKAR)의 사용을 설명한다. 여기에 설명된 방법은 생리학적 신경 조절 이벤트를 추적하는 시간적 해상도로 세포 내 해상도에서 신경 인구의 동시 이미징을 허용합니다.

AR은 PKA 인산화 기질 펩타이드 및 기질의 인산화 세린 또는 스레오닌에 결합하는 지게차 관련(FHA) 도메인에 의해 연결된 공여자 및 수용체 형광 단백질(14,15)으로구성된다. PKA 통로의 활성화시, AKAR의 기질 펩티드는 인산화된다. 그 결과, FHA 도메인은 인산화된 기질 펩티드에 결합하여, 두 개의 형광단을 근접하게, 즉 AKAR의 폐쇄 상태라고 한다. 인산화된 AKAR의 폐쇄 상태는 기증자와 수용자 형광단 사이의 증가된 Förster 공명 에너지 전달(FRET)을 초래합니다. 인산화된 AR의 비율은 PKA 활성도 16의수준과 관련이 있기 때문에, 생물학적 샘플내의 FRET양은 PKA 활성의 수준을 정량화하는데 사용될 수 있다16,17,18, 19,20.

AR의 초기 버전은 주로 2색 비율 측정 이미징14를위해 설계되었습니다. 뇌 조직에 더 깊은 이미징을 할 때, 비율 측정 방법은 파장 의존광 산란으로 인해 신호 왜곡을 겪습니다17,18,21. 아래에 논의된 바와 같이, 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법 (FLIM)은 FLIM이 기증자 형광에 의해 방출된 광자만 측정하기 때문에 이 문제를 제거합니다18,21. 그 결과, FRET의 FLIM 정량화는 조직 심도(17)에 의해 영향을 받지 않는다. 또한, 수용기 형광단의 "다크"(즉, 낮은 양자 수율[QY]) 변이체가 사용될 수 있다. 이는 제2 센서 또는 형태학적마커(17,19,20)의동시 이미징을 통해 직교 뉴런 특성의 다중화 측정을 용이하게 하는 컬러 채널을 해제한다.

FLIM 이미징은 형광공이 흥분한 상태, 즉 형광 수명18에서보내는 시간을 정량화합니다. 불소가 지면 상태로 돌아오면, 따라서 흥분 상태의 끝은 종종 광자의 방출과 수반된다. 개별 흥분 분자에 대한 광자의 방출은 스토크이지만, 집단에서 평균 형광 수명은 특정 형광공의 특징입니다. 형광단의 순수한 인구가 동시에 흥분되면, 생성된 형광은 하나의 기하급수적 붕괴를 따를 것이다. 이 지수 붕괴의 시간 상수는 형광 단백질의 경우 일반적으로 1 ~ 4 나노 초 범위 평균 형광 수명에 해당합니다. 흥분한 공여자 형광단의 지상 상태로의 복귀는 또한 FRET에 의해 발생할 수 있다. FRET의 존재에서, 기증자 형광의 형광 수명이 감소된다. 인산화되지 않은 ALA는 상대적으로 더 긴 공여자 형광 수명을 나타낸다. PKA에 의한 인산화 시, 센서는 기증자와 수용자 형광체가 서로 가까이 가져오고 FRET가 증가하기 때문에 수명이 짧아지게 됩니다. 따라서 ALA의 집단에서형광 수명의 정량화는 PKA 활성의 수준을 나타낸다.

ALA의 초기 버전은 단세포 해상도에서 생체 내 이미징에 성공적으로 사용되지 않았습니다. 이는 주로 생리적 활성화(17)에 대한 AKAR 센서의낮은 신호 진폭 에 기인한다. 최근에는 2광자 형광 평생 이미징 현미경 검사법(2pFLIM)에 사용할 수 있는 AKAR 센서를 체계적으로 비교하여 FLIM-AKAR라는 센서가 대체 센서를 능가하는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 표적으로 한 AKAR (tAKARs)에게 불린 일련의 FLIM-AKAR 이체는 특정 세포소 위치에서 PKA 활동을 구상하기 위하여 개발되었습니다: 마이크로소튜블 (tAKARα), 시토졸 (tAKARβ), 액틴 (tAKARδ), 필라멘트 액틴 (tAKARθ), 막 (tAKARγ), 및 후성 밀도 (tAKARθ). tAKAR중, tAKARα는 노르에피네프린에 의해 유도된 신호 진폭을 2.7배 증가시였다. 이는 뉴런에서 PKA의 대다수가 휴식 상태22,23에서미세소관에 고정된다는 지식과 일치한다. tAKARα는 2pFLIM에 대한 기존 AR 중 최고의 성과를 보였습니다. 더욱이, tAKARα는 다중 신경조절기에 의해 유도된 생리학적 관련 PKA 활성을 검출하고, tAKARα의 발현은 신경 기능17을변화시키지 않았다.

최근, tAKARα는 헤드 고정 된 행동 마우스(17)에서PKA 활동을 시각화하는 데 성공적으로 사용되었다. 운동운동이 운동, 배럴 및 시각 코르티케에서 피상층 뉴런(층 1~3, 피아로부터 ~300 μm의 깊이까지)의 소마에서 PKA 활성을 유발한 것으로 나타났다. 운동 트리거된 PKA 활동은 β-아드레날린 수용체 및 D1 도파민 수용체를 통한 신호화에 부분적으로 의존했지만, D2 도파민 수용체 길항제에 의해 영향을 받지 않았다. 이 작품은 2pFLIM을 사용하여 생체 내에서 신경 변조 이벤트를 추적하는 tAKARs의 능력을 보여줍니다.

현재 프로토콜에서, 시행된 운동 패러다임 동안 헤드 고정 깨어 있는 마우스에서 PKA 활성 이미징을 위한 전체 방법은 6단계로 설명된다. 먼저, 종래의 2광자 현미경에 2pFLIM 기능을첨가하였다(도 1). 둘째, 전동 러닝머신의 시공(도 2). 셋째, DNA 플라스미드의 자궁 전기천공화(IUE)에 의해 마우스 피질에서 tAKARα 센서의 발현, 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)의 입체주입. IUE24,25 및 바이러스 성 입자(26)의 입체 주입에 대한 수술을위한 우수한 프로토콜은 이전에 출판되었다. 우리가 사용하는 주요 매개 변수는 아래에 설명되어 있습니다. 앞으로, 두개골 창의 설치. 우수한 프로토콜은 이전에 두개골 창 수술대한 출판된 27,28. 표준 프로토콜에서 수정된 몇 가지 단계가 설명되어 있습니다. 다섯째, 생체 내 2pFLIM에서 수행. 여섯째, 2pFLIM 이미지의 분석(도34). 이 접근법은 다른 많은 머리 고정 행동 패러다임 및 뇌 영역에 쉽게 적용 되어야 합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

여기에 설명된 모든 방법은 오리건 보건 과학 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 2pFLIM 현미경 설치

  1. 제조업체 설명서에 따라 광자 타이밍 카운팅 모듈(PTCM, 재료표)을 설치하고 컴퓨터에 연결합니다(그림 1).
    참고: PTCM은 전형적으로 광증층 튜브(PMT)로부터 레이저 펄스 타이밍 및 광자 입력에 대한 "동기화" 입력을 수신하는 컴퓨터 보드이다. 또한 2광자 이미징 제어 소프트웨어에서 픽셀, 선 및 프레임에 대한 클럭 타이밍을 수신합니다. PTCM은 클럭 신호를 사용하여 개별 광자를 다른 픽셀과 프레임으로 분리합니다.
  2. >200MHz 대역폭의 포토다이오드를 추가하여 레이저 타이밍을 측정합니다. 레이저 광의 작은 분획을 광이오디오드에 반사하도록 광경로에 표준 유리 커버슬립을배치하여 광경로에 수직으로 배치하였다(도 1). 포토다이오드 출력을 PTCM의 "동기화" 입력에 연결합니다.
    참고: 많은 현대 레이저는 또한 레이저 타이밍을 출력. 이러한 레이저의 경우 포토다이오드가 필요하지 않으며 레이저 타이밍 출력을 PTCM의 동기화 입력에 직접 연결할 수 있습니다.
  3. 낮은 노이즈, 빠른 GaAsP PMT(그림 1)로, tAKARα의 경우, 녹색채널 PMT의 경우 PMT를 교환한다. PMT 출력을 PTCM의 신호 입력에 연결합니다.
    1. 선택적 신호 스플리터(도 1)를 추가하면 종래의 2광자 이미징 채널을 통해 강도를 동시에 획득하는 것이 요구된다. PMT 출력을 신호 스플리터에 연결하고 스플리터 출력을 PTCM 및 기존 2광자 이미징 모듈에 연결합니다.
      참고: GaAsP PMT는 기존의 비알칼리 PMT보다 더 빠른 단일 광자 신호를 제공하며 광자 타이밍을 보다 정밀하게 측정할 수 있습니다. GaAsP PMT의 특정 모델은 주변 온도보다 10-35°C 낮으로 냉각될 수 있으므로 다크 카운트를 초당 수백 개 이하의 수준으로 억제할 수 있습니다(일반적으로 ≤200 카운트/s). 이 낮은 노이즈 레벨은 노이즈 광자 수를 형광 수명 곡선에서 쉽게 구별하거나 빼을 수 없기 때문에 형광 수명을 정밀하게 측정하는 데 중요합니다.
  4. 수용기 형광단의 스펙트럼 오염을 최소화하는 밴드 패스 형광 방출 필터를 추가합니다. 예를 들어, tAKARα의 경우, 녹색 채널에 대한 500 nm ±20 nm 장벽 필터는 수용자 sREACh로부터의 오염을 감소시키기 위해 사용되며, 이는 어두운(QY~0.07) 황색 형광 단백질(YFP)29,30이다. 제어 소프트웨어에 적합하고 PTCM 사용자 설명서에 설명된 개별 이미지 픽셀, 선 및 프레임에 대한 시계와 같은 타이밍 신호를 연결합니다. 적절한 데이터 제어 및 수집 소프트웨어를 설치합니다.
    참고: 일부 PTCM제조업체(재료 표)는 2pFLIM 이미징을 위한 소프트웨어를 제공합니다. 여기, FLIMimage라는 사용자 정의 소프트웨어가 사용된다, 야스다 연구소에 의해 개발 된 (맥스 플랑크 플로리다, 개인 통신을 통해). 이 소프트웨어는 특정 2 광자 수집 소프트웨어(재료표)에 추가 사용자 기능으로 작동합니다. 2pFLIM 이미지를 획득하기 위해 2광자 이미징 중에 적절한 타이밍에 PTCM을 제어하고 통신합니다.

2. 전동 러닝 머신 의 건설

참고: 맞춤형 전동 러닝머신의 디자인은 그림2에 나와 있습니다.

  1. 폼 롤러(Ø = 200mm)를 미세쇠톱으로 길이 150mm로 자른다. 또는 폼 볼의 두 반쪽을 함께 붙이고 이음새 위에 테이프를 놓습니다. 선택적으로 롤러에 프로파일이 있는 고무 매트를 접착제로 붙이면 롤러의 견인력이 높아지도록 합니다.
  2. 롤러의 평평한 면에서 롤러의 중심을 통해 1/4 인치 직경의 구멍을 뚫거나 폼 볼을 사용하는 경우 공의 각 절반의 중간을 통해 1/4 인치 직경의 구멍을 뚫습니다.
  3. 구멍을 통해 직경 1/4 인치 강철 차축을 설치합니다. 폼 호환 접착제를 사용하여 폼 롤러 / 볼을 액슬에 붙입니다. 선택적으로, 두 개의 유연한 샤프트 커플링(1/4 인치 내경)을 수정하여 액슬과 폼 롤러/볼의 결합을 강화합니다.
    참고: 많은 일반적인 접착제는 거품이 용해 될 수 있습니다.
    1. 각 샤프트 커플링의 경우 샤프트 커플링을 평평한 면과 직사각형 금속 판의 중앙(0.7mm x 15mm x 76mm)에 배치합니다. 샤프트 커플링에 플레이트를 용접합니다. 플레이트 중앙에 1/4 인치 구멍을 뚫어 변형된 샤프트 커플링을 액슬에 설치하고 두 개의 나사 구멍을 중앙에서 금속 판 측면으로 설치할 수 있습니다.
    2. 샤프트 커플링을 폼 롤러/볼에 대고 액슬에 설치합니다. 후자를 사용하는 경우, 공의 곡률에 맞게 플레이트를 약간 구부립니다. 나사를 측면 구멍에 배치하여 액슬의 롤러/공을 고정합니다.
  4. 케이지 플레이트 중앙에 있는 3/8-32 나사산드릴을 드릴및 탭하고 로터리 인코더를 설치합니다. 나사 구멍을 직각 모터 브래킷의 베이스에 드릴링하여 모터를 포스트 홀더에 부착할 수 있도록 합니다. 유연한 샤프트 커플링을 사용하여 회전식 인코더와 모터를 액슬 끝에 부착합니다.
  5. 모터 및 회전 인코더용 포스트를 사용하여 알루미늄 브레드 보드에조립된 러닝머신을 설치합니다(그림 2). 모터 입력을 속도 컨트롤러에 연결하고 회전 인코더 출력을 컴퓨터 데이터 수집(DAQ) 보드의 아날로그 입력에 연결합니다.
    참고: 회전 각도 속도는 회전 인코더에 의해 전압으로 인코딩되며 MATLAB에 작성된 AnimalTracker라는 사용자 지정 소프트웨어를 사용하여 디지털화됩니다.
  6. 헤드플레이트 호환 홀더를 직각 브래킷에 설치합니다. 러닝머신 앞의 빵 판에 단단한 포스트를 설치하고 포스트에 직각 브래킷이 있는 조립헤드플레이트홀더를 설치합니다(그림 2). 헤드플레이트 홀더 바가 액슬과 정렬되어 마우스가 러닝머신에서 적절하고 편안한 보행 위치를 채택할수 있도록 합니다(그림 2C).

3. 마우스 피질에서 tAKARα 센서의 식

  1. 자궁 전기 에서
    1. 플라스미드 DNA(3−4 μg/μL; CAG 프로모터, 센서 서열 및 우드척 간염 바이러스를 포함하는 센서 구성)에 빠른 녹색 염료(주입 시 시각화용)의 최종 농도를 0.2% 추가하여 IUE에 대한 DNA 솔루션을 준비합니다. 전사 후 반응 요소 [WPRE] 번역 증강) 용해/물 또는 트리스-EDTA에 희석.
    2. E1624에서IUE를 위해 시간 적시 임산부 마우스(예: C57BL/6)를 준비합니다. 이소플루란으로 마우스를 마취 (유도 4%, 유지 보수 1.5%, O2 95% O2 5%CO2)를 바르고 5 mg/kg 멜록시캄 과 4 mg/kg 부피바카인을 함유한 피하 진통제를 발라주세요. 메스와 가위로 복강을 열고 자궁 뿔을 조심스럽게 노출시다.
    3. 앞서 설명한 바와 같이 한 반구의 측면 심실에서 배아 당 DNA 용액 1 μL을 주입한다24.
    4. 피질에 양극 말단 발을 배치하고 전기 포더로 1Hz에서 5 개의 100 ms 정사각형 펄스 (38 V)를 사용하여 피질 뉴런에 대한 일반 IUE24를 수행합니다.
      참고: 다른 피질 영역은 측면 심실을 기준으로 전극 말단 발의 배치를 변경하여 전기 천공을 대상으로 할 수 있습니다.
  2. 스테레오택시 주입
    1. 생후 30일에 마우스를 준비하여 입체외과수술(26)한다. 3.1.2.단계에서 설명한 대로 마우스를 마취시키고, 5 mg/kg 카프로펜을 함유하는 회음부 진통제의 피하 주사를 적용한다.
    2. AAV 혈청형 2/1(AAV2/1)을 경험적으로 결정된 역가(~1 x 10 9-1010 게놈/μL)에 hSyn-tAKARα-WPRE를 표현하여 주사기 여과(0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 막) 인산완충세액수액을 하였다.
    3. 모터 피질에 대한 다음 좌표에서 스테레오 현미경에서 핸드 헬드 드릴을 사용하여 ~ 500 μm 직경의 구멍을 드릴 : 0.5 mm 전방 브레그마, 1.2 mm 측면 에서 중간선.
    4. 인젝터(예: 맞춤형 플런저/유리 파이펫 홀더가 있는 오일 유압 조작기)를 전동 조작기에 장착합니다. 브레그마-람다 평면을 기준으로 주사 바늘을 15° 각도로 놓습니다. 전방 후방 및 등쪽 복부 축을 따라 각각 700 μm 및 200 μm 진행에 해당하는 x-및 z-축을 가로질러 대각선 이동을 프로그래밍합니다.
      참고: 의도된 이미징 필드 바로 위에 있는 조직에 손상을 방지하기 위해, AAV 입자는 bregma-lambda 평면에 비해 비스듬히 주입된다.
    5. 주사 바늘의 끝을 드릴 구멍 중앙의 피아에 놓고 위에서 설명한 대각선 운동 (~25 μm / s)을 천천히 실행합니다. 이 절차는 사출의 중심을 1.2 mm 전방에서 bregma, 1.2 mm 측면에서 중간선, 0.2 mm 의 피아 아래에 배치합니다.
    6. 희석 된 바이러스 입자 20 nL (~10 nL / 분)을 주입하십시오. 적어도 10 분 기다렸다가 천천히 주사 바늘을 철회하십시오 (~12.5 μm / s).
    7. 스테레오택 주사 절차를 완료하고 접착제 / 피부26.

4. 두개골 창 설치

  1. IUE(섹션 3.1) 또는 바이러스 입자(섹션 3.2)의 입체주사를 통해 tAKARα를 발현하는 마우스상에 두개골 창을 30일에서 60일 사이에 배치한다. 바이러스 성 입자에 감염된 마우스의 경우 바이러스 주입 후 적어도 2 주 후에 두개골 창을 구현하십시오. 앞서 설명한 대로 cranial 창을 설치27,28, 다음 세부 정보와 함께. 3.1.2.단계에서 설명한 대로 마우스를 마취시키고, 4 mg/kg에서 회음부 진통제 0.075 mg/kg 부프레넥스 및 항염증제 덱사메타손의 피하 주사를 적용한다.
  2. 회막을 제거하고 목 근육을 철회하십시오. 수술 후 목 근육의 노출을 피하기 위해 조직 접착제로 두개골에 피부의 가장자리를 접착제.
  3. 메스를 사용하여 부드럽게 긁어 두개골에서 골막을 건조하고 제거합니다. 이미징 헤드플레이트(내경 8mm)를 배치하여 의도한 이미징 필드를 둘러싸습니다. 치아 아크릴 시멘트 다음 시아노 아크릴레이트 기반 접착제를 사용하여 두개골에 헤드 플레이트를 접착제. 최적의 접착을 위해 헤드플레이트가 노출된 두개골과 말린 두개골위에 놓여 있는지 확인하십시오. 접착제 가속기는 경화를 가속화하는 데 사용할 수 있습니다.
  4. 치과 용 드릴을 사용하여 의도 한 이미징 필드 (단계 3.2.3에 지정된 좌표)보다 직경이 5mm의 원을 그리고 경막 미를 노출시다.
  5. 전체 두개골 창을 커버하는 듀라 표면에 인공 경도라고도 하는 투명 폴리머의 얇은 층을 적용합니다. 중합체는 경막 미더를 보호하고 안정화합니다. 멸균 원형 커버슬립(직경 5mm)을 경구 에 놓습니다. 치아 아크릴 시멘트 다음 창의 가장자리 주위에 적용 시아노 아크릴레이트 접착제로 커버 슬립을 고정합니다.

5. 생체 내 2 광자 형광 평생 화상 진찰 현미경 검사법

  1. 두개골 창의 설치 후 2주 이상에서 2pFLIM 이미징을 시작합니다(섹션 4). 마우스를 습관화하기 위한 이미징 연구가 시작되기 전에 마우스를 자주 취급하고 스크러핑하여 스트레스로 인한 실험 간섭을 최소화합니다.
  2. 2광자 레이저를 제어하는 소프트웨어를 사용하여 2광자 여기 레이저 파장을 960nm로 설정합니다.
  3. 4% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시다. 꼬리 꼬집기와 호흡 속도를 관찰하여 적절한 마취를 확인합니다. 즉, 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 없어야하며 호흡 속도는 초당 ~ 1 호흡으로 감소되어야합니다. 불필요한 절차 시간을 최소화하고 마취가 2 ~ 3 분 동안만 지속되기 때문에 눈 윤활유는 사용되지 않습니다.
  4. 마취된 마우스를 전동 러닝머신(도2C)으로옮기고 마우스의 헤드플레이트를 러닝머신 셋업의 헤드플레이트 홀더에 장착합니다(자세한 내용은 도 2 참조). 70% 에탄올로 마우스의 두개골 창 커버슬립 표면을 청소합니다.
  5. 전동 러닝머신을 장착된 마우스를 2pFLIM 목표 아래에 놓습니다. 두개골 창 덮개 슬립과 목표 사이에 증류수 한 방울을 바칩니다.
  6. 장착된 마우스가 마취에서 깨어나서 러닝머신과 현미경 환경에 적어도 10분 동안 익숙해지게 하십시오.
  7. 에피 조명 아래의 사출 위치로 이동합니다. 후속 이미징 세션 동안 동일한 관심 영역(ROI)의 이미징을 돕기 위해 밝은 시야 아래에 있는 피덕셜 기능(즉, 혈관)을 문서화합니다.
  8. 뇌 조직에서 방출된 빛 이외의 들어오는 빛을 제거합니다. 에피 조명 광원을 끄고 2pFLIM 장비의 인클로저를 닫습니다. 하드웨어 명령 전압 제어를 켜서 2pFLIM PMT를 활성화합니다.
  9. 깨어있는 마우스에서 tAKARα 양성 소마타를 이미징하기 위한 다음 권장 설정을 사용하여 2pFLIM 획득 소프트웨어 FLIMimage를 사용하여 z-stack 2pFLIM 이미지를 획득한다. 프레임 평균을 3프레임으로 설정하고, 스캔 속도를 2ms/line으로, 이미지 크기를 128 x 128픽셀로, 시야를 90-100μm로 설정합니다. 준비 및 하드웨어 구성에 따라 이미징 설정을 조정합니다.
  10. FLIMview에서 획득한 이미지를 검사합니다(사내에서 개발된 사용자 지정 소프트웨어; 섹션 6 참조). 5.9단계 에 이어 이미징 설정을 조정하여 광자 수를 최적화하고 광표백을 최소화합니다.
    참고: 생체 내에서 tAKARα 양성 소종의 일생 이미징을 위한 ROI에서 실행 가능한 통합 광자 수는 특정 자극으로부터 발생하는 신호 진폭에 따라 ~1,000-10,000 광자입니다(토론 참조).
    1. 필요한 경우 시야 감소, 스캐닝 속도 감소, 레이저 전력 증가, 평균 프레임 수 증가를 사용하여 통합 된 광자 수를 늘리고 수명 추정 오차를 줄입니다. 동시에 최소한의 필수 레이저 파워, 프레임 평균화 및 스캐닝 속도를 사용하여 광표백을 최소화해야 합니다.
  11. 5.10단계에서 결정된 설정을 사용하여 z-스택 획득을 반복함으로써 일정한 시간 간격(예를 들어, 30~60초마다)으로 이미지화한다. 러닝머신 제로 속도로 최소 15분 동안 베이스라인 2pFLIM 이미지를 획득합니다.
  12. 러닝머신 회전 속도를 2pFLIM 이미지를 획득하는 동안 15분 동안 ~15cm/s로 설정합니다. 러닝머신 회전을 끄고 20분 동안 영상을 계속하여 강제 운동을 중단한 후 PKA 활성 의 지속 시간을 평가합니다.

6. 2pFLIM 이미지 분석

  1. FLIMview에서 획득한 이미지를 열고 FLIMview에서 다음 매개 변수를 설정합니다.
    참고:
    매개 변수 세부 정보는 설명에 설명되어 있습니다.
    1. FLIMview에서 단일 광자 계수(SPC) 최소 및 최대 범위 필드를 클릭합니다. 일반적으로 각각 1.2-2와 10−12 ns 사이의 적절한 최소 및 최대 SPC 범위 값을 입력합니다.
    2. FLIMview에서 t0 값 필드를 클릭하고 t0 값(일반적으로 ~2ns)을 입력합니다. FLIMview에서 수명 휘도 최소 임계값 필드를 클릭하고 원하는 임계값을 5-30 광자로 입력합니다.
  2. 새 그룹 단추(N)를 클릭하고 실험 그룹 이름을 할당합니다. 이렇게 하면 추가된 각 FLIM 이미지의 데이터를 결합하는 그룹이 생성됩니다.
  3. FLIMview의 Roi 컨트롤 모듈에서 ROI 버튼을 클릭하고 tAKARα 양성 소마 주위에 ROI를 그립니다. FLIMview의 z 스택 제어 슬라이더에서 하부 및 상부 z 한계를 이동하여 z 스택 범위를 줄이면 다른 z 깊이의 배경 광자에서 발생하는 신호 오염을 최소화할 수 있습니다.
  4. + 버튼을 클릭하여 FLIM 이미지를 그룹에 추가합니다(6.2단계). Calc 버튼을 클릭하여 ROI 및 수명 추정 오차(δδ)에 대한 평균 수명(LT, 평균 광자 방출 시간[MPET]이라고도 함)을 계산합니다.
  5. 만성 2pFLIM 이미징 시리즈에서 다음 파일을 엽니다. 6.4단계를 반복합니다. 시간이 지남에 따라 조직이 표류할 수 있기 때문에 ROI 및 z-stack 범위의 위치를 조정하여 시간이 지남에 따라 동일한 tAKARα 양성 소종을 측정해야 합니다.
  6. 그룹 컨트롤 모듈의 드롭다운 메뉴에서 deltaMPET/MPET0을 선택합니다. 기준선# 필드를 클릭하고 인덱스(들)를 입력합니다(예: 6.3단계에서 만든 그룹의 처음 5개 이미지에 대해 1 2 3 4 5)를 입력합니다. 이렇게 하면 기준 수명(LT 0)을계산하는 데 사용되는 이미지가 정의됩니다.
  7. 플롯을 클릭하여 정의된 ROI에서 실험 중에 tAKARα의 FLIM 응답(ΔLT/LT 0)을 포함하는 그래프를 생성합니다. 해당 기준 선회 수명(LT 0)에 의한 개별ROI의 정규화된 변경(ΔLT)을 통해 다른 ROI에서 운동 중 PKA 활동을 비교할 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FRET-FLIM 센서는 신경 변조에 관여하는 cAMP/PKA 경로를 포함하여 다양한 신호 전달 경로를 시각화할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 2pFLIM과 함께 최근에 개발된 tAKARα 센서를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 PKA 활동을 시각화합니다. 대부분의 기존 2광자 현미경은 그림 1에 나와 있는 것처럼 3~4개의 구성 요소를 추가하여 2pFLIM 기능으로 업그레이드할 수 있습니다(섹션 1 참조). 2pFLIM 획득 이미지에서 FRET를 시각화하기 위해 픽셀당 수집된 광자 타이밍의 히스토그램 플롯에서 평균 수명의 정량화를 수행하였다(도3A,B). 평균 수명은 PKA 활성화가 수명의 감소로 이어지기 때문에 높은(차가운 색상) 및 낮음(따뜻한 색상)이 각각 낮고 높은 PKA 활동을 나타내는 의사 색 이미지를 사용하여 시각화되었습니다. SPC 범위를 올바르게 설정하려면 주의를 기울여야 합니다. 이 범위는 하드웨어 에지 아티팩트를 최소화한 레이저 펄스 간격(예: 80MHz의 펄스 속도 12.5ns) 내에서 설정해야 합니다(섹션 6 및 토론 참조). ROI 내에서PKA 활동의 계산은 주어진 ROI 내에서 모든 픽셀의 LT를 결합하여 수행하였다(도3C,D). 헤드 고정 된 깨어 마우스기저 수명 1.3 및 1.8 ns (그림3E). 헤드 고정 된 깨어 있는 마우스에서 모터 피질에서 tAKARα의 이미징은 기저 및 강제 운동 동안 세포 분해능으로PKA 활성의 실시간 정량화를 허용하였다(도 4). 실험은 며칠 및 몇 달에 걸쳐 반복될 수 있습니다. 강제 운동은 마우스 모터 피질17의표면 층 내의 뉴런의 집단에서 PKA 활동을 트리거합니다. 이러한 PKA 활성은 β-아드레날린 및 D1 수용체(17)의 활성화를통한 신경 변조에 의존한다.

Figure 1
그림 1: 2pFLIM 시스템의 개략적. 2pFLIM은 노란색 강조 하드웨어 구성 요소를 추가하여 기존의 2 광자 현미경에 구현 될 수있다 : 광자 타이밍 카운팅 모듈, 저잡음 빠른 광 증식 튜브 (PMT), 포토 다이오드 (레이저가없는 경우에만 필요) 레이저 타이밍을 위한 출력 신호) 및 선택적 신호 스플리터. 이 그림은 Ma et al.17에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 맞춤형 전동 러닝머신 설계. (A) 앞면(왼쪽 위), 측면(오른쪽 상단), 상단 뷰(왼쪽 아래)에서 러닝머신 디자인의 회로도가 있습니다. 러닝머신(폼 볼) 차축은 회전식 인코더와 모터에 연결되어 있으며, 이 모터는 견고한 알루미늄 빵 플레이트의 두 기둥에 집합적으로 장착됩니다. 직각 브래킷의 헤드플레이트 호환 홀더는 견고한 포스트에 고정되어 러닝머신 위에 배치됩니다. 회로도 도면은 배율을 조정하지 않습니다. 전면(B) 및 측면 (C) 러닝 머신의 사진을 볼 수 있습니다. 러닝머신에서 마우스의 적절한 위치는 패널 C에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 2pFLIM 데이터의 정량화. (A) 각 픽셀의 의사 색이 있는 FLIM 이미지는 해당 픽셀의 모든 광자의 평균 수명(LT)을 기준으로 레이저 타이밍을 기준으로 나타냅니다. (B) 단일 픽셀 내의 광자 도착 시간(패널 A의보라색 사각형)을 히스토그램(왼쪽 패널)으로 플롯하였다. 단일 광자 계수 범위(SPC, 회색)를 결정하기 위해 통합 경계를 설정하였다. SPC 범위 내에서 광자 타이밍의 적분은 총 광자 수로 나눈 다음 t 0(1.65ns, 파선)으로 차감하여 평균 수명(LT, 파선선과 점선 사이의 거리)이 1.74ns입니다. 전체 시야의 평균 수명(패널 A의 연한 파란색 사각형)의 평균 수명을 정량화하는 것은 모든 픽셀(오른쪽 패널)에서 수집된 광자 타이밍의 통합을 포함하여 평균 수명을 1.7ns로 생성합니다. 인세트는 반 로그 배율에서 동일한 데이터를 표시합니다. (C와 D) 관심 지역당 평균 수명(ROI) 정량화 (C) 2pFLIM 이미지의 대표적인 예. 2개의 ROI는 모터 피질의 층 2/3에 있는 2개의 somata 의 주위에 그려졌습니다. (D) 각 ROI 내의 모든 픽셀에 통합된 광자 타이밍 분포(왼쪽 패널). 셀 ROI는 색으로 코딩(패널 C에도시된 바와 같이) 적색, 셀 1; 파란색, 셀 2. 정규화된 광자 카운트는 두 ROI(오른쪽 패널, 평균 수명, 셀 1, 셀 1.33 ns, 셀 2, 1.73 ns) 간의 광자 타이밍 분포를 비교할 수 있습니다. 인세트는 반 로그 배율에서 동일한 데이터를 표시합니다. (e) 모터 피질의 표면 층에서 254 개의 이미지 된 세포로부터의 평균 기초 수명의 분포 플롯. L1 세포 (n = 186 세포 / 11 동물, 왼쪽 패널), 피아 아래 100 μm 이내 거주, AAV2 / 1-hSyn-tAKARα-WPRE의 입체 주입 후 tAKARα를 발현, L2 / 3 피라미드 세포 (n = 68 세포 / 4 동물, 오른쪽 패널), 적어도 150 μm 아래 거주 CAG-tAKARα-WPRE DNA 구조의 IUE 후 tAKARα를 발현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: tAKARα는 운동 피질에서 운동 유도 PKA 활동을 추적한다. (A) 대표적인 강도(왼쪽 패널) 및 모터 피질에서 3개의 L1 세포의 수명(중간 및 우측 패널) 이미지. 셀 ROI는 색상으로 코딩되었다: 오렌지, 셀 1; 파란색, 셀 2; 노란색, 셀 3. (B) 기저 상태 동안 셀 1(상부 패널)에서 측정된 광자 타이밍 분포(중간 패널 Α에서측정된 주황색 트레이스) 및 강제 운동(오른쪽 패널 A에서측정된 바와 같이 연한 주황색 트레이스). 정규화된 광자 개수는 광자 타이밍 분포를 직접 비교할 수 있습니다(하부 패널, 평균 수명: 기저, 1.72 ns, 운동, 1.42 ns). 인세트는 반 로그 배율에서 동일한 데이터를 표시합니다. (C) Δ수명/수명0(ΔLT/LT 0)해당 셀의 트레이스(위쪽 패널, 패널 A참조)와 강제 운동 속도(하부 패널). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

이 프로토콜은 FRET-FLIM 센서 tAKARα를 사용하여 머리 고정 된 행동 마우스에서 신경 변조 트리거 PKA 활성을 시각화하는 것을 보여줍니다. 본 출원은 얻어진 FLIM 신호가 생리학적 신경조절 이벤트(17)와 관련이 있음을 입증하기 위해 시험관내 및생체내 tAKARα의 광범위한 시험 및 특성화에 기초한다. 여기서, 하나의 생체 내 응용 프로그램, 운동 유도 PKA 활성 모터 피질에서, 뇌에 센서를 전달하기위한 절차를 설명하기 위해 사용, 이미징을위한 동물 수술, 행동 및 이미징 데이터 수집을위한 하드웨어 및 소프트웨어 요구 사항 및 데이터 분석을 이미징하기 위한 소프트웨어 및 알고리즘을 제공합니다.

tAKARα 센서는 Dna 플라스미드 또는 AAV 입자의 입체 주사의 IUE에 의해 피질에 도입된다. 전기 화 파라미터 및 DNA 농도에 따라, IUE는 피질25에서상대적으로 넓은 영역에 걸쳐 피질 뉴런의 다양한 라벨링 밀도를 초래한다. IUE를 사용하여 표지된 피질 층은 수술이 수행될 때 배아 단계에 의해 결정됩니다. AAV 입자의 입체 주사는 정의된 뇌 소영역 내에서 많은 세포를 이미지화하는 것이 원할 때 사용된다. 그것은 일반적으로 주입 센터에서 조밀 하 게 표시 된 뉴런 결과 고 점점 센터에서 더 희소 한 라벨. 중요한 것은, 뇌 내 세포의 감염 효율은 사용되는 AAV 혈청형에 의존한다. AAV2/1은 상대적으로 낮은 역행 라벨링 활동을 가진 피질, 탈라믹 및 줄무늬 뉴런에서 큰 효율성을 제공합니다. 어떤 AAV 혈청형이 표적 뇌 영역과 세포 유형에 가장 효율적인지 경험적으로 확립하는 것이 좋습니다. 두 형질감염 방법 모두 성공적으로 tAKARα를 발현시켰다. 표현 레벨의 "스위트 스팟"은 경험적으로 결정됩니다.

강제 운동 결과 증가 PKA 활동 계층에 2/3 모터 피 질의 뉴런. 현재 2pFLIM은 마우스의 헤드 고정으로 인해 테스트 가능한 동작의 범위를 제한합니다. 그러나 이동/이동 작업에서 자극을 보고하는 것부터 가상 현실의 공간 방향에 이르기까지 행동 패러다임의 목록이 계속 증가하고 있습니다31,32,33 . 또한, 개선된 방법은 바늘 과 같은 그라데이션 지수(GRIN) 렌즈 13(미공개 관찰)을 통해 줄무늬, 편도체 및 해마와 같은 심부 뇌 영역에서 이미징을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 신경 변조 이벤트의 생체 내 시각화를 위한 tAKARα 및 2pFLIM의 사용을 상세히 하는 본 프로토콜은 머리 고정 행동 패러다임의 맥락에서 많은 뇌 영역에 용이하게 적용가능해야 한다.

곡선 피팅을 사용하여 픽셀당 수명 또는 ROI를 계산하는 것은 계산 시간이 오래 걸리며 픽셀당 제한된 총 광자 수는 종종 피팅 오류를 초래합니다. 따라서 평균 수명(LT)은 수명(θ)17,34에대한 근사치로 산술적으로 계산됩니다.


Equation 1(수학식 1)


여기서 SPC최소및 SPCmax는 측정 창(SPC) 테두리이고 F(t)는 형광 수명 붕괴 곡선입니다. 즉, 각 계산된 볼륨(픽셀 또는 ROI, 도 3A)에대해 광자 타이밍 분포는 히스토그램으로 플롯된다(도3B). SPC 범위 내에서 이 분포의 가중적 일체(가중치가 있는 시간)는 총 광자 수로 나누어 평균 방출 시간을 초래한다. 이 시간은 t 0으로수정됩니다. 수명 이미지(그림3A)를 생성하기 위해 이 절차는 각 픽셀에 대해 수행되지만 ROI당 수명 계산(그림3C,D)은 ROI 볼륨 내의 임계값을 초과하는 모든 픽셀의 모든 광자를 통합합니다. 수명 추정 오차(δδ)는 통합 강도(N광자: 총 광자 수)를 사용하여 계산됩니다.


Equation 2(수학식 2)

수명 추정 오차를 최소화하기 위해 적절한 신호 감지FRET-FLIM을 생성하려면 ROI당 충분한 광자를 수집해야 합니다. 원하는 신호 대 잡음 비(SNR)를 달성하기 위해 δδ는 다음 방정식을 충족해야 합니다.


Equation 3(수학식 3)


예를 들어, 운동 피질내의 신경 소종에서 운동 중의 전형적인 측정(LT = 1.57 ns, N광자 = 9075, ΔLT = 0.15 ns; 4, 셀 1) 다음의 수명 추정 오차를 산출합니다.

δδ0.016 Equation 4 Equation 5 Equation 4 ns (방정식 4)

신호 대 잡음 비의 결과:

SNR Equation 4 Equation 6 Equation 7 Equation 4 = 9.4 (방정식 5)

원하는 SNR이 5에 불과한 경우 ΔLT = 0.15 ns가 주어지면 δδ는 다음을 허용합니다.

Equation 8

최소 총 광자 수가 필요합니다.

Equation 9

위에서 설명한 대로 수명 정량화에는 SPC 범위, t0및 수명 휘도 최소 임계값과 같은 여러 매개 변수를 적절하게 설정해야 합니다. SPC 범위는 하드웨어 측정 창 내에서 방출된 광자의 측정 창을 결정합니다(수학식 1; 하드웨어 측정 창은 일반적으로 레이저가 80MHz에서 반복됨에 따라 0-12.5 ns임). 이 프로토콜에 사용되는 PTCM에 에지 아티팩트가 있기 때문에 이 필요합니다. SPC 범위는 에지 아티팩트를 포함하지 않고 대부분의 기증자 광자 수명 분포를 통합하도록 설정되어 있습니다. 평균 수명을 계산하기 위해, 측정 윈도우로부터의 평균 광자 타이밍은 t 0으로 차감되며, 이는 윈도우 내의 레이저 펄스의 타이밍에 해당한다(수학식 1, 도 3A,B)17,34. t 0은 신호 케이블 길이 또는 PTCM 설정을 변경하여 조정할 수 있으며, 일반적으로 하드웨어 측정 창의 시작부터 ~2 ns로 조정됩니다. 시스템의 초기 특성화 후, 전형적으로 거의 이상적인 이미징 조건(예를 들어, 5 μM 플루오레세인 용액을 이미징할 때)에서 수행된 SPC 범위와 t 0은 모두 주어진 하드웨어 구성의 고정 파라미터로서 설정된다. 총 광자 수가 임계값보다 같거나 높은 픽셀만 표시 및 분석에 포함되도록 수명 광도 최소 임계값이 설정됩니다. 이를 통해 자동 형광, 주변 광원 및 자발적PMT 다크 카운트를 포함한 배경 광자 수로 인한 노이즈를 효과적으로 줄일 수 있습니다. 이 임계값은 경험적으로 결정됩니다.

생체 내 2pFLIM 이미징을 위한 성공적인 FRET-FLIM 센서에는 적어도 세 가지 공통 기능이 있습니다. 첫째, 형광단의 선택에 관하여, 광자 수집 효율은 일반적으로 두뇌 조직에 있는 가혹한 광 산란 때문에 부분적으로 생체 내 화상 진찰 환경에서 도전적인 밑에 낮습니다. 동시에, 바람직한 SNR을 달성하기 위해 많은 수의 검출 된 광자가 필요합니다 (0.03의 ΔLT / LT 0에 대해 1의 SNR을 달성하기 위해 ≥1,000 광자가 필요합니다. 방정식 2 및 3 참조). 따라서, 높은 광자 예산을 가진 기증자 형광파 (즉, 형광포가 표백되기 전에 검출 가능한 광자의 최대 수)가 선호됩니다. 현재, 2 광자 여기에서 그들의 광자 예산의 관점에서 다른 기증자 형광단의 체계적인 비교가 없습니다. 경험적으로, eGFP는 녹색/노란색 스펙트럼의 다른 많은 형광단에 비해 광안정하면서 상대적으로 밝기 때문에 FRET-FLIM 센서의 생체 내 사용에 훌륭한 공여자 형광포가 됩니다. 또한, FRET의 최적 정량화를 위해, 단일 지수 형광 수명 부패를 가진 공여자 형광단이 선호된다. eCFP와 같은 비율 측정 화상 진찰을 위한 많은 일반적으로 이용되는 공여공 형광 단백질은, 다중 지수 형광 일생 부패가, 형광단의 혼합 인구로 이루어져 있다는 것을 건의합니다. 이러한 형광 단백질은 따라서 FRET-FLIM21에적합하지 않습니다. 공여부 형광단과는 달리, 수용기 형광단의 낮은 양자 수율은 FRET-FLIM 센서에 유익할 수 있다. "어두운" 저조도 형광성 불소 sREACh는 tAKARs에 사용됩니다. 수용기 형광단의 낮은 양자 수율은 공여자 형광공 방출 스펙트럼에서 광자 오염을 최소화하고 적색 스펙트럼에서 두 번째 형광 센서 또는 형태학적 마커의 동시 이미징을 위한 하나의 형광 검출 채널을 해제합니다. tAKARα의 경우.

둘째, 결합 분획 범위에 걸쳐 충분한 SNR을 획득하기 위해, ~0.5-0.7의 최적 FRET 효율이21을선호한다. 신호, 즉 주어진 공여자-수락자 결합 비율 변화에 따른 평균 수명 변화는 FRET의 효율에 의존한다. 그러나 FRET 효율과 평균 수명 변화 사이의 이러한 관계는 비선형입니다. FRET 효율이 하나에 접근하는 경우, 바운드 상태의 공여자 형광단은 거의 광자를 방출하지 않습니다. 따라서 결합 비율이 100%가 아니라면(수용자 불소가 100%29로성숙되지 않았기 때문에 결코 그렇지 않습니다) 평균 수명은 개방 상태에서 공여체 형광포의 수명에 접근하고, 바운드 상태 센서를 검출하는 능력 감소. tAKARα에 대한 FRET 효율은 유리한 범위 내에서 ~0.7로 추정된다.

셋째, FRET-FLIM 센서는 동물 생리학과 관련된 민감도 및 운동학이 있는 신호를 보고해야 합니다. 센서 감도 및 역학은 생체 내에서 사용하기 전에 시험관 내에서 광범위하게 테스트되어야 하며, 필요한 경우 기판 결합 도메인 친화도 및 역학 조정, 링커 최적화 및 세포내 세포체 조절과 같은 다양한 접근법을 사용하여 조정할 수 있습니다. 센서를 타겟팅할 수 있습니다. 이전 작품에서, tAKARα는 내인성 도파민의 방출에 의해 유도된 PKA 활성을 검출할 수 있고, 센서의 역학 및 감도가 공지된 PKA 의존적 생물학적 과정과 일치한다는 것을 확립하였으며, 이는 노르에피네프린으로 유도된다. 느린 후 과분극 전류의 비활성화17. 더욱이, tAKARα의 발현은 전기생리학17및 개별 척추의 구조적 가소성의 측정(미공 관찰)에 의해 분석된 바와 같이 뉴런 기능을 변화시키는 것으로 나타나지 않는다.

2pFLIM 이미징의 현재 기술적 한계는 데이터 처리 및 광자 계수 처리량과 관련이 있습니다. 첫째, FLIM은 각 픽셀에 대해 광자 도착 시간을 저장해야 합니다. PTCM의 메모리 크기는 얻을 수 있는 픽셀 해상도를 제한합니다. 여기에 설명된 PCTM의 경우 이미지 프레임당 최대 256 x 256 픽셀을 64포인트 시간 해상도로 달성할 수 있습니다. 또한 보드에서 컴퓨터 스토리지로의 FLIM 이미지 데이터의 전송 속도는 상대적으로 느려지므로 해상도 및 샘플링 주파수에 실질적인 제한이 있습니다. 메모리 용량 및 데이터 처리의 지속적인 기술 적 개선은 미래에 이러한 제한을 해결할 수 있습니다. 둘째, 일반적으로 사용되는 PTC는 아날로그-디지털 시스템이며 광자 감지 재설정 시간(예: "데드 타임")에 의해 제한됩니다. 이는 하나의 광자를 검출한 후 PTCM이 다음 100-125 ns18,21에대한 후속 광자의 도착을 등록하지 않음을 의미한다. 또한, 수명 측정은 레이저 펄스 (소위 "더미 업")후 첫 번째 도착 광자쪽으로 편향된다. 이러한 경우 광자 계수 속도는 s당 7광자 10개로 제한됩니다. 대부분의 전형적인 2 광자 이미징 정권에서 이것은 큰 문제가 아니지만, 광자 계수 속도 제한을 초과하지 않도록주의해야합니다. 데드 타임이 짧거나 기가헤르츠 연속 데이터 수집 시스템이 있는 최신 PTCM은 이러한 제한을 완화할 수 있습니다(후자의 경우 옐런 및 Mongeon18참조).

cAMP/PKA, Akt/PKB, PKC 및 ERK와 같은 신호 경로를 위한 형광 센서는 지속적으로 생성되고16,35를최적화하고 있습니다. 대부분의 현재 센서의 경우, 까다로운 생체 내 이미징 환경에서 뛰어난 성능을 발휘하려면 추가적인 특성화및 최적화가 필요합니다. 특히 신호 진폭이 증가하면 제곱 관계가 있는 광자 예산에 대한 수요가 감소하므로 신호 진폭이 증가하는 것이 중요합니다. tAKARα의 경우, 노르에피네프린과 같은 내인성 신경 조절제에 대한 반응 진폭은 이전 최고의 센서에 비해 2.7배 향상되었습니다. 이것은 필수 광자에서 ~ 7 배 감소로 변환. 실제로, 이것은 행동17동안 동물에서 거짓 부정(즉, 비응답자)의 수를 크게 감소시였다. 관찰된 최대 tAKARα 신호는 ~30%(ΔLT/LT 0)입니다. 현재까지 이 신호는 유사한 종류의 FRET 센서에 대해 보고된 가장 큰 FLIM 신호입니다. 추가개선은 또한 수용기 플루오로포어 및 FHA의 친화성을 인산화된 스레오닌으로 최적화함으로써 가능할 수 있다. 또한, 동일한 신호 경로의 상이한 측면을 모니터링하는 센서의 사용은 생체 내 신호 경로의 조절을 기계적으로 조사하는 강력한 접근법을 제공할 수 있다. 미래에, 생체 내에서 신경 변조 신호 경로를 시각화하는 FLIM 센서의 성공적인 응용 프로그램은 신경 변조가 행동 마우스의 그대로 신경 네트워크에서 발생하는 위치와 시기에 관한 중요한 통찰력을 제공 할 것입니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

테스 J. 라마이어, 루스 프랭크, 마이클 A. 무니악 박사와 맥스 플랑크 플로리다의 야스다 료헤이 박사에게 2pFLIM 인수 소프트웨어에 감사드립니다. 이 작품은 두 개의 브레인 이니셔티브 어워드 U01NS094247 (H.Z. 및 T.M.) 및 R01NS104944 (H.Z. 및 T.M.), R01 교부금 R01NS081071 (T.M.), R21 교부금 R21NS097856 (H.Z)에 의해 지원되었습니다. 모든 상은 미국 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소에서.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm cellulose acetate syringe filter Nalgene 190-2520 Step 3.2.2.
16x 0.8 NA water-immersion objective Nikon MRP07220 Step 5.5.
3-pin cable US digital CA-MIC3-SH-NC Step 2.5. To connect rotation sensor to the DAQ input of the microscope
Aluminum bread board Thorlabs MB1012 Step 2.5.
AnimalTracker MATLAB software N/A N/A Step 2.5 and sections 5 - 6. Will be provided upon request to the lead author
Band-pass barrier filter Chroma ET500-40m Step 1.4.
Cage plate Thorlabs CP01 Step 2.4. Used as mount for rotation sensor
Carbon steel burrs for micro drill, 0.5 mm tip diameter FST 19007-05 Steps 3.2.3. and 4.4.
Circular coverslip (5 mm diameter) VWR 101413-528 Step 4.5.
Custom-made injection needle holder N/A N/A Step 3.2.4. Technical details provided upon request to the lead author
Dental acrylic Yates Motloid 44114 Steps 4.3. and 4.5.
Dental drill; Microtorque ii Ram products 66699 Steps 3.2.3. and 4.4.
Dowsil transparent polymer The Dow Chemical Company 3-4680 Step 4.5. Artificial dura
Electroporation electrode Bex LF650P5 Step 3.1.4.
Electroporator Bex CUY21 Step 3.1.4.
Fast green FCF Sigma-aldrich F7258-25G Step 3.1.1.
FLIMimage MATLAB software N/A N/A Section 5. Kindly provided by Dr. Ryohei Yasuda, Max Planck Florida
FLIMview MATLAB software N/A N/A Sections 5. and 6. Will be provided upon request to the lead author
Foam-compatible glue (Gorilla White Glue) Gorilla 5201204 Step 2.3.
Headplate N/A N/A Step 4.3. Technical details provided upon request to the lead author
Headplate holder N/A N/A Step 2.6. Technical details provided upon request lead author, used in combination with mounting post bracket and right-angled bracket
Hydraulic micromanipulator Narishige MO-10 Step 3.2.4.
Krazy glue Krazy glue KG82648R Step 4.3. Cyanoacrylate-based glue
Low-noise fast photomultiplier tube Hamamatsu H7422PA-40 or H10769PA-40 Step 1.3.
MATLAB 2012b Mathworks N/A Steps 2.6, and sections 5, and 6. Used to run microscope acquisition and data analysis software
Motor Zhengke ZGA37RG Step 2.4.
Motor speed controller Elenker EK-G00015A1-1 Step 2.5.
Motorized micromanipulator Sutter MP-285 Step 3.2.4.
Mounting base Thorlabs BA1S Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with PH4 and TR2
Mounting post Thorlabs P14 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with PB2
Mounting post base Thorlabs PB2 Step 2.6. Used for headplate holder post in combination with P14
Mounting post bracket Thorlabs C1515 Step 2.6. Used in combination with right-angle bracket and headplate holder
Optical post Thorlabs TR2 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and PH4
Phosphate-buffered saline Ν/Α Ν/Α Step 3.2.2. Protocol: Cold Spring Harbor Protocols 2006, doi: 10.1101/pbd.rec8247
Photodiode Thorlabs FDS010 Step 1.2.
Photon timing counting module Becker and Hickl SPC-150 Step 1.1.
Plasmid: tAKARα (CAG-tAKARα-WPRE) Addgene 119913 Step 3.1.3.
Post holder Thorlabs PH4 Step 2.5. Used for posts for motor and sensor in combination with BA1S and TR2
Right-angle bracket Thorlabs AB90 Step 2.6 Used in combination with mounting post bracket and headplate holder
Rotation encoder US digital MA3-A10-250-N Step 2.4.
Rubber mat Rubber-Cal B01DCR5LUG Step 2.1.
Shaft coupling (1/4 inch x 1/4 inch) McMaster 6208K433 Steps 2.3. and 2.4.
ScanImage 3.6 Svoboda Lab/Vidrio Technology N/A Steps 5.9. and 6.1.
Signal splitter Becker and Hickl HPM-CON-02 Step 1.3.1.
Stainless steel axle (diameter 1/4 inch, L = 12 inch) McMaster 1327K66 Step 2.3.
Stereotaxic alignment systsem David kopf 1900 Steps 3.2. and 4.1. modified; Sutter micromanipulator, custom-made injection needle holder, hydraulic micromanipulator
Two-photon microscope N/A N/A Section 5. Built based on Modular in vivo multiphoton microscopy system (MIMMS) from HHMI Janelia Research Campus (https://www.janelia.org/open-science/mimms)
Vetbond tissue adhesive 3M 14006 Step 3.2.6.
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyn-tAKARα-WPRE) Addgene 119921 Step 3.2.2.
White PE foam roller (8 inch x 12 inch) Fabrication enterprises INC. 30-2261 Step 2.1.1.
White polystyrene fom ball halves GrahamSweet 200mm diameter 2 hollow halves Step 2.1.1.
Zipkicker PACER PT29 Step 4.3. Hardening accelerator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greengard, P. The Neurobiology of Slow Synaptic Transmission. Science. 294, (5544), 1024-1030 (2001).
  2. Petersen, S. E., Posner, M. I. The attention system of the human brain: 20 years after. Annual Review of Neuroscience. 35, (2), 73-89 (2012).
  3. Sun, Y., Hunt, S., Sah, P. Norepinephrine and Corticotropin-Releasing Hormone: Partners in the Neural Circuits that Underpin Stress and Anxiety. Neuron. 87, (3), 468-470 (2015).
  4. Berke, J. D. What does dopamine mean? Nature Neuroscience. 21, (6), 787-793 (2018).
  5. Chen, Y., et al. Endogenous Gαq-Coupled Neuromodulator Receptors Activate Protein Kinase A. Neuron. 96, (5), 1070-1083 (2017).
  6. Madison, D. V., Nicoll, R. A. Cyclic adenosine 3’,5’-monophosphate mediates beta-receptor actions of noradrenaline in rat hippocampal pyramidal cells. The Journal of Physiology. 372, (1), 245-259 (1986).
  7. Yasuda, H., Barth, A. L., Stellwagen, D., Malenka, R. C. A developmental switch in the signaling cascades for LTP induction. Nature Neuroscience. 6, (1), 15-16 (2003).
  8. Pedarzani, P., Storm, J. F. PKA mediates the effects of monoamine transmitters on the K+ current underlying the slow spike frequency adaptation in hippocampal neurons. Neuron. 11, (6), 1023-1035 (1993).
  9. Brandon, E. P., Idzerda, R. L., McKnight, G. S. PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Current Opinion in Neurobiology. 7, (3), 397-403 (1997).
  10. Radnikow, G., Feldmeyer, D. Layer- and Cell Type-Specific Modulation of Excitatory Neuronal Activity in the Neocortex. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (January), (2018).
  11. Kennedy, R. T. Emerging trends in in vivo neurochemical monitoring by microdialysis. Current Opinion in Chemical Biology. 17, (5), 860-867 (2013).
  12. Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker’s Guide to Voltammetry: Acute and Chronic Electrodes for In Vivo Fast-Scan Cyclic Voltammetry. ACS Chemical Neuroscience. 8, (2), 221-234 (2017).
  13. Hamel, E. J. O., Grewe, B. F., Parker, J. G., Schnitzer, M. J. Cellular level brain imaging in behaving mammals: An engineering approach. Neuron. 86, (1), 140-159 (2015).
  14. Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics of protein kinase A activity visualized by FRET-based reporters. Biochemical and Biophysical Research Communications. 348, (2), 716-721 (2006).
  15. Zhang, J., Ma, Y., Taylor, S. S., Tsien, R. Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (26), 14997-15002 (2001).
  16. Chen, Y., Saulnier, J. L., Yellen, G., Sabatini, B. L. A PKA activity sensor for quantitative analysis of endogenous GPCR signaling via 2-photon FRET-FLIM imaging. Frontiers in Pharmacology. 5, (April), 1-12 (2014).
  17. Ma, L., et al. A Highly Sensitive A-Kinase Activity Reporter for Imaging Neuromodulatory Events in Awake Mice. Neuron. 99, (4), 665-679 (2018).
  18. Yellen, G., Mongeon, R. Quantitative two-photon imaging of fluorescent biosensors. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 24-30 (2015).
  19. Tang, S., Yasuda, R. Imaging ERK and PKA Activation in Single Dendritic Spines during Structural Plasticity. Neuron. 93, (6), 1315-1324 (2017).
  20. Tillo, S. E., et al. Liberated PKA Catalytic Subunits Associate with the Membrane via Myristoylation to Preferentially Phosphorylate Membrane Substrates. Cell Reports. 19, (3), 617-629 (2017).
  21. Yasuda, R. Imaging spatiotemporal dynamics of neuronal signaling using fluorescence resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 16, (5), 551-561 (2006).
  22. Theurkauf, W. E., Vallee, R. B. Molecular characterization of the cAMP-dependent protein kinase bound to microtubule-associated protein 2. Journal of Biological Chemistry. 257, (6), 3284-3290 (1982).
  23. Zhong, H., et al. Subcellular dynamics of type II PKA in neurons. Neuron. 62, (3), 363-374 (2009).
  24. Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation. Journal of Neuroscience Methods. 143, (2), 151-158 (2005).
  25. Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. Journal of Visualized Experiments. (107), e53303 (2016).
  26. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors. Journal of Visualized Experiments. (45), 1-4 (2010).
  27. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), 18-19 (2008).
  28. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4, (8), 1128-1144 (2009).
  29. Murakoshi, H., Lee, S. J., Yasuda, R. Highly sensitive and quantitative FRET-FLIM imaging in single dendritic spines using improved non-radiative YFP. Brain Cell Biology. 36, (1-4), 31-42 (2008).
  30. Murakoshi, H., Shibata, A. C. E., Nakahata, Y., Nabekura, J. A dark green fluorescent protein as an acceptor for measurement of Förster resonance energy transfer. Scientific Reports. 5, 1-11 (2015).
  31. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS ONE. 9, (2), (2014).
  32. Yu, K., et al. The central amygdala controls learning in the lateral amygdala. Nature Neuroscience. 20, (12), 1680-1685 (2017).
  33. Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, (7266), 941-946 (2009).
  34. Yasuda, R. Imaging intracellular signaling using two-photon fluorescent lifetime imaging microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 7, (11), 1121-1128 (2012).
  35. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nature Cell Biology. 20, (10), 1215-1225 (2018).
생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).More

Jongbloets, B. C., Ma, L., Mao, T., Zhong, H. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (148), e59526, doi:10.3791/59526 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter