Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

एंजाइमेटिक गतिविधि परख के लिए Filamentous कवक एस्पर्जिलस nidulans के एक टेप टैग की गई हिवन Deacetylase के एक कदम संवर्धन

doi: 10.3791/59527 Published: May 1, 2019

Summary

RpdA की तरह कक्षा 1 हिटोन deacetylases (HDACs) संभावित लक्ष्य के रूप में फंगल संक्रमण के इलाज के महत्व को प्राप्त किया है । यहां हम नल के विशिष्ट संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल-टैग की गईं एक hdac गतिविधि परख कि हिस्टोन deacetylase अवरोधकों की विट्रो प्रभावकारिता परीक्षण में अनुमति देता है के साथ संयुक्त rpda ।

Abstract

RpdA की तरह वर्ग 1 हिटोन डिएसिटाइलसिस (HDACs) फंगल संक्रमण के उपचार के लिए और कवक माध्यमिक चयापचयों के जीनोम खनन के लिए संभावित लक्ष्य के रूप में महत्व प्राप्त किया है । निरोधक स्क्रीनिंग, तथापि, शुद्ध एंजाइम गतिविधियों की आवश्यकता है । के बाद से कक्षा 1 deacetylases बहु प्रोटीन परिसरों के रूप में अपने कार्य डालती है, वे आम तौर पर सक्रिय नहीं है जब बैक्टीरिया में एक पॉलीपेप्टाइड के रूप में व्यक्त किया । इसलिए, अंतर्जात परिसरों को अलग किया जाना चाहिए, जो, जब आयन विनिमय और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी की तरह पारंपरिक तकनीकों लागू कर रहे हैं, श्रमसाध्य और समय लगता है । अग्रानुक्रम संबंध शुद्धि को कोशिकाओं से बहुप्रोटीन परिसरों को समृद्ध करने के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित किया गया है और इस प्रकार अंतर्जात एंजाइमों के अलगाव के लिए आदर्श हो गया है । यहां हम सी के पहले शुद्धीकरण कदम के माध्यम से सक्रिय RpdA परिसरों की एक कदम संवर्धन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान- Termingillus nidulansसे टैग की गईं rpda । शुद्ध परिसरों तो बाद में अवरोध करनेवाला एक deacetylase परख आवेदन स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एंजाइमी गतिविधि परख के साथ एक साथ प्रोटीन संवर्धन दो दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है ।

Introduction

हिस्टोवन deacetylases (hdacs) zn2 +-निर्भर hydrolytic एंजाइमों histone और अंय प्रोटीन के lysine अवशेषों से ऐसीटिल समूहों को हटाने में सक्षम हैं । अनुक्रम समानता के आधार पर, HDACs कई वर्गों1में वर्गीकृत कर रहे हैं । हाल ही में, कवक वर्ग 1 HDAC RpdA, बेकर के एक ortholog खमीर (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, को अवसरवादी कवक रोगज़नक़ के लिए आवश्यक होना दिखाया गया है धूमकुहर2। इसलिए, RpdA एक संभावित लक्ष्य के लिए फंगल संक्रमण2इलाज के रूप में महत्व प्राप्त किया है । विट्रो में deacetylase गतिविधि का मूल्यांकन एंजाइमी गुणों के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है और अवरोधक विकास के लिए उपन्यास पदार्थों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि एक codon-अनुकूलित संस्करण की Escherichia कोलाई में मानव HDAC1 के पुनः संयोजक अभिव्यक्ति हाल ही में3रिपोर्ट किया गया है, इस होस्ट में पूर्ण लंबाई rpda एक्सप्रेस का प्रयास विफल4। इसके अलावा, के बाद से कवक वर्ग 1 hdacs जैसे rpda और hosa multiprotein परिसरों के रूप में अपने कार्य डालती है, यह एंजाइमी अवरोध करनेवाला अध्ययन के लिए देशी अंतर्जात परिसरों का उपयोग करने के लिए अनुकूल है । हालांकि, बाधा कारकों और फंगल lysates में विभिंन HDACs की उपस्थिति के कारण, उत्प्रेरक पूरे प्रोटीन निष्कर्षों में मापा गतिविधि अपेक्षाकृत कम है और व्यक्तिगत एंजाइमों को नहीं सौंपा जा सकता है । इसके अलावा, तंतुमय कवक ए nidulans में पिछले अध्ययन एक वर्ग 2 hdac, hdaa, कवक के अर्क के वर्णलेखी भागों में प्रमुख deacetylase के रूप में पहचान की. इस प्रकार, कई पारंपरिक क्रोमेटोग्राफिक शुद्धि कदम कवक उपभेदों से गैर HdaA गतिविधि अलग करने के लिए आवश्यक हैं4. ए nidulans5 में टैंपरेरी एफ़िनिटी प्यूरीफिकेशन (टीएपी) कार्यनीति की शुरूआत से विशिष्ट डिएसिटिलेज गतिविधियों के संवर्धन में काफी ढील दी गई है । मूल नल टैग दो प्रोटीन एक डोमेन से बना है और एक calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड (cbp) एक तंबाकू खोदना वायरस प्रोटीज (tev) दरार साइट द्वारा अलग6। इस देशी शुद्धि और उनके संपर्क भागीदारों7सहित टैग प्रोटीन के क्षालन के लिए अनुमति देता है । जब गतिविधि के लिए समृद्ध प्रोटीन का उपयोग assays हैं, प्रोटीज दरार द्वारा देशी शर्तों के तहत हल्के क्षालन नल टैग शुद्धि की एक महत्वपूर्ण विशेषता है । एक GFP टैग प्रोटीन, उदाहरण के लिए, immobilized एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से समृद्ध किया जा सकता है, तथापि, मूल परिस्थितियों में नहीं किया जा सकता है ।

यहां हम एक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध कराने के सक्रिय RpdA परिसरों के पहले शुद्धि कदम के माध्यम से सी के लिए एक . nidulans (igg जुदाई और tev दरार से टैग rpda) बाद में अवरोध करनेवाला स्क्रीनिंग के लिए एक आवेदन हिस्टक डिएसिटाइललेस परख । के रूप में पर्याप्त साबित हो, समानता संवर्धन सिर्फ एक शुद्धि कदम के लिए भी सीमित है क्योंकि एंजाइमी गतिविधि दो कदम नल शुद्धि के बाद जब अकेले igg शुद्धि की तुलना में काफी कम हो गया था ।

फिर भी, शुरू की प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से अन्य टैग की गई एंजाइमों के संवर्धन के लिए लागू होना चाहिए वर्णक नियमन जैसे एसीटाइलट्रांस्लेसिस, methyltransferases, और demethylases में शामिल. ठोकर प्रोटोकॉल के दूसरे शुद्धि कदम appending द्वारा, प्रोटीन सह टैग के साथ शुद्ध-(उपंयास) एंजाइमी परिसरों के जटिल भागीदारों के रूप में माना जा सकता है ।

Protocol

1. एक nidulans की खेती

  1. निरोप तैयारी
    नोट: ऊष्मायन के अलावा सभी कदम एक स्तरीय प्रवाह कैबिनेट के तहत किया जाना चाहिए ।
    1. (जैसे tib 3212) ग्लिसेरल स्टॉक से (-८० ° c) ग्लूकोज/xylose ंयूनतम मध्यम (gxmm; प्रति लीटर ग्लूकोज की १०.० ग्राम, xylose की ०.५ जी, 1 एम di-अमोनियम टार्ट्रेट समाधान के 10 मिलीलीटर, ५० × नमक २६.० समाधान के 20 मिलीलीटर से बाहर लकीर केसीएल, २६.० जी MgSO4 · 7 ज2हे, ७६.० ग्राम ख2PO4, क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर], १,००० × hutner का पता लगाने के तत्वों के 1 मिलीलीटर8) १.५% सहित (w २००७/ ३७ ° c पर 2 – 3 दिनों के लिए सेक्यूबेट ।
      नोट: TIB 321 में एक Rpda:: एक xylose-inducible प्रमोटर, xylp(पी)10द्वारा नियंत्रित नल संलयन । यही कारण है कि जाइलोस उपरोक्त नुस्खा में शामिल है । जाइलोस छोड़ें जब उन उपभेदों को व्यक्त कर रहा हो जो xylp(p) नियंत्रण के अंतर्गत नहीं हैं ।
    2. conidial निलंबन समाधान (सीएसएस; ०.९% (w/v) NaCl, ०.०१% (v/v) polysorbate ८०) के १.५ मिलीलीटर के साथ बाँझ १.५ मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब तैयार करें ।
    3. गीला सीएसएस में एक डिस्पोजेबल टीका लूप, से चरण 1.1.1 से थाली से काट कोनिडिया और चरण 1.1.2 से ट्यूब में निलंबित ।
    4. स्थानांतरण १५० μl conidial निलंबन के प्रत्येक १० २५ सेमी के लिए2 सेल संस्कृति फ्लैक्स के निकास के साथ कैप युक्त gxmm एगर के साथ की खुराक और २०० μl सीएसएस ।
    5. एक बाँझ टीका लूप का उपयोग कर फ्लैक्स के भीतर conidial निलंबन फैला है और 2 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर फ्लैक्स सेते 3 दिन.
    6. कोनिडिया फसल के लिए, flask प्रति सीएसएस के 10 मिलीलीटर का उपयोग करें । एक फ्लास्क में समाधान डालो, कसकर प्रदान की पेंच टोपी के साथ फ्लास्क बंद और तेजी से फ्लास्क हिला ।
    7. फफूंद की सतह गीला करने के बाद, पूरी तरह से एक बाँझ टीका लूप के साथ शेष कोनिडिया बंद परिमार्जन ।
    8. ४० μm सेल एक बाँझ ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब पर रखा strainers के माध्यम से पास कोनिडिया और एक ट्यूब में पांच फ्लैक्स के निलंबन इकट्ठा ।
    9. १,००० × g में 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्राित्र ।
    10. Supernatant decant और प्रति ट्यूब सीएसएस के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
    11. एक ट्यूब में दोनों निलंबन इकट्ठा, सीएसएस के ४० मिलीलीटर के साथ खाली ट्यूब कुल्ला, निलंबन में जोड़ें, और के रूप में कदम 1.1.9 में वर्णित अपकेंद्रित्र ।
    12. Supernatant decant और सीएसएस के 4 मिलीलीटर में conidial गोली resuspend ।
    13. Conidial निलंबन के दो धारावाहिक 1:50 dilutions तैयार है और जिसके परिणामस्वरूप 1 में conidial की संख्या निर्धारित: 2, 500-11के रूप में वर्णित के रूप में एक गिनती चैंबर के साथ पतला निलंबन ।
  2. माइसीलिया की वृद्धि और संचयन
    1. एक स्तरीय प्रवाह कैबिनेट के तहत काम करते हुए, टीका लगाना 4-6 एक लीटर शंक्वाकार फ्लैक्स है जिसमें 5 × 106 conidia/एमएल के घनत्व में उपयुक्त की खुराक सहित gxmm के २५० मिलीलीटर और १८० rpm पर सेक्यूबेट 14-16 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. पनीर के कपड़े को फ्लास्क के ऊपर कीप में रखें और कपड़े के माध्यम से माइसेलिया को छान लें । संक्षेप में विआयनीकृत पानी के साथ धो लो ।
    3. पहले हाथ और फिर कागज तौलिए के बीच पनीर कपड़े में फंस माइसीलिया फैलाएंगे द्वारा जितना संभव हो नमी निकालें ।
    4. एक पेंच ढक्कन और तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश फ्रीज के साथ एक प्लास्टिक बीकर के लिए फ्लैट चादरें के रूप में सूखे माइसीलिया स्थानांतरण । यह निंनलिखित lyophilization प्रक्रिया के लिए एक उच्च क्षेत्र/
    5. Lyophilization से पहले-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए माइसीलिया स्टोर ।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है ।
    6. Lyophilize माइसीलिया रातोंरात ।
    7. बंद करो सुखाने की प्रक्रिया जब माइसीलिया के तापमान स्थिर रहता है (18-24 ज) । Beakers निकालें और तुरंत प्रदान की पेंच टोपियां के साथ सील ।
      नोट: जब कसकर सील, lyophilized माइसीलिया आरटी में कई हफ्तों के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

2. ठोकर-टैग HDAC के एक कदम संवर्धन (Bayram एट अल. २०१२ से अनुकूलित)12

  1. बफ़र्स और समाधान की तैयारी
    नोट: 2 जोड़ें-mercaptoethanol (etsh) और प्रोटीज अवरोधकों सीधे बफ़र्स करने के लिए उपयोग करने से पहले । क्रोमेटोग्राफी राल के लिए अशुद्धियों/contaminations की शुरुआत से बचने के लिए ०.२२ μm नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली के माध्यम से क्रोमेटोग्राफी के लिए इस्तेमाल सभी बफ़र्स फ़िल्टर । नीचे दिए गए चरणों में निर्देश प्रत्येक बफ़र की 1 L को तैयार करने के लिए देखें । 4 ° c पर बफ़र्स संग्रहीत करना ।
    1. निष्कर्षण बफर (B250): २५० मिमी NaCl, १०० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.५ (आरटी), ०.१% (v/v) TX-१००, 5 मिमी EtSH ।
      1. ट्रिक् स-एचसीएल के १२.३५ ग्राम, ट्रिक् स (मुक् त आधार) के २.६२ ग्राम और एनएसीएल के १३.२ ग्राम को विआयनित जल के ८०० मिलीलीटर में घोलें तथा 10 प्रतिशत (v/v) टीएक्स-१०० विलयन में 10 मिली की वृद्धि करें ।
      2. RT पर पीएच की जांच करें और या तो NaOH या एचसीएल [5 मीटर] के साथ पीएच ७.५ को समायोजित, यदि आवश्यक हो ।
      3. 1 L करने के लिए बनाने के लिए और एक ०.२२ μm नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली के माध्यम से फिल्टर ।
      4. उपयोग करने से पहले सीधे बफर के १०० मिलीलीटर (5 मिमी अंतिम एकाग्रता) प्रति EtSH की ३५ μL जोड़ें ।
    2. वाशिंग बफर २५० (WB250): २५० मिमी NaCl, ४० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.० (आरटी), ०.१% (v/v) TX-१००, 5 मिमी EtSH ।
      1. तैयार WB250 के रूप में B250 (2.1.1) के लिए वर्णित है, लेकिन Tris-HCl के ३.५९ जी के साथ, और Tris (मुक्त आधार) के २.०८ ग्राम ।
    3. वाशिंग बफर १५० (WB150): १५० मिमी NaCl, ४० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.० (आरटी), ०.१% (v/v) TX-१००, 5 मिमी EtSH ।
      1. B250 (2.1.1) के लिए वर्णित के रूप में WB150 तैयार है, लेकिन Tris-HCl के ३.५९ जी के साथ, Tris (मुक्त आधार) के २.०८ जी, और NaCl के ८.७७ जी ।
    4. Tev साम्यन बफर (tev): १५० मिमी nacl, ४० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.० (आरटी), ०.५ मिमी edta, ०.१% (v/v) TX-१००, 5 मिमी etsh ।
      1. WB150 के रूप में ही है लेकिन ०.५ मिमी अंतिम एकाग्रता के लिए EDTA जोड़ें ।
    5. TEV दरार बफर (TCB): १५० मिमी NaCl, ४० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ८.० (आरटी), ०.५ मिमी EDTA, ०.१% (v/v) TX-१००, 10% (v/v) ग्लिसेरोल, 5 मिमी EtSH ।
      1. ३.५९ के साथ चरण 2.1.1 में वर्णित के रूप में तैयार tris-HCl के २.०८ ग्राम tris (मुक्त आधार), और ८.७७ जी nacl l के और 1 l.
    6. ५० × प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल: 1 मिलीलीटर पानी में प्रोटेस अवरोधकों की एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉकटेल के 1 गोली भंग और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    7. टीबीएस-टी: ५० मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.६ (आरटी), ०.९% (w/वी) NaCl, ०.१% (v/
      1. चरण 2.1.1 में वर्णित के रूप में तैयार करें । Tris-HCl के ६.०६ ग्राम, Tris (मुक्त आधार) के १.४० ग्राम, NaCl के 9 g, और पॉलिसोबेट 20 के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    8. 5 × LSB (Laemmli नमूना बफर): ३१५ मिमी Tris-एचसीएल पीएच ६.८ (आरटी), 25% (v/v) EtSH, ५०% (v/v) ग्लिसरॉल, 10% (w/v) SDS, ०.०५% (w/v) ब्रोमोफीनॉल ब्लू ।
  2. प्रोटीन निकालने की तैयारी
    1. एक गेंद मिल के पीस जार में lyophilized माइसीलिया और एक पीसने की गेंद के १.५ ग्राम जोड़ें ।
      नोट: ताजा माइसीलिया के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है । जब ऐसा करने, ठंड से पहले के रूप में अच्छी तरह से संभव के रूप में माइसीलिया सूखी और ताजा माइसीलिया पीसने के लिए तरल नाइट्रोजन में पीस जार precool सुनिश्चित करें
    2. माइसीलिया पाउडर के लिए 25 हर्ट्ज पर 30 एस के लिए पीस ।
      नोट: मामलों में जहां कोई पीसने की मशीन उपलब्ध है, एक मोर्टार और मूसल का उपयोग कर एक पाउडर के लिए माइसीलिया पीसने, bayram एट अल द्वारा वर्णित के रूप में । १२
    3. एक 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब करने के लिए mycelial पाउडर स्थानांतरण ।
    4. बफर के साथ माइसीलिया के बाद मिश्रण की अनुमति देने के लिए जमीन माइसीलिया सहित अपकेंद्रित्र ट्यूब झुकाव.
    5. बर्फ के 6 मिलीलीटर-ठंड B250 सहित 1 × प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल mycelial पाउडर के प्रति ग्राम और एक छोटे से रंग के साथ मिश्रण क्रूड निकालने के पूर्ण homogenization जब तक प्राप्त की है । जब ताजा mycelia का उपयोग कर, Bayram एट अल को देखें । 12 निष्कर्षण बफर अनुपात के लिए सही बायोमास को प्राप्त करने के लिए ।
    6. 5 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें ।
    7. ट्यूब और एक अपकेंद्रित्र में एक संतुलन ट्यूब प्लेस और ≥ 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ४०,००० × g पर स्पिन । अपकेंद्रण के दौरान igg राल (कदम २.३) के साम्यन प्रदर्शन.
    8. अपकेंद्रण के बाद, एसडीएस-पृष्ठ विश्लेषण के लिए supernatant के 10 μL निकालें । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में नमूना रखें जिसमें ४० μL पानी और १२.५ μL 5 × LSB हो; चित्र 1में "Ex" के रूप में संदर्भित ।
    9. ध्यान से supernatant हटा (lysate मंजूरी दे दी) एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट और हस्तांतरण का उपयोग कर equilibrated igg मोती (2.3 कदम) युक्त स्तंभ पर और कसकर प्रदान की अंत टोपी का उपयोग बंद ।
  3. IgG राल के बराबर (कदम 2.2.7 के दौरान प्रदर्शन)
    1. एक 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल क्रोमेटोग्राफी कॉलम और पिपेट ३०० μl अच्छी तरह से निलंबित igg रेजिन (५०% घोल) स्तंभ में तैयार करें । B250 के साथ 10 मिलीलीटर के लिए कॉलम भरें और बफर के माध्यम से गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से प्रवाह करते हैं ।
    2. 1 × प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल सहित B250 के 1 मिलीलीटर जोड़ें और चलो के माध्यम से प्रवाह । स्तंभ के नीचे प्लग करें ।
  4. बैच शुद्धि के नल टैग HDAC
    1. क्रोमेटोग्राफी में समश्रोत मनकों से युक्त कॉलम और 10 आरपीएम पर एक रोटरी मिक्सर पर चरण 2.2.9 से लेइलेट को 4 ° c से 2-4 ज पर
    2. बैच बाइंडिंग के बाद, कैप निकालें और प्रवाह-थ्रू एकत्रित करने के लिए नीचे स्तंभ खोलें ।
    3. चरण 2.2.8 में वर्णित के रूप में SDS-पृष्ठ विश्लेषण के लिए एक नमूना लें; चित्र 1में "FT" के रूप में संदर्भित ।
    4. WB250 के 10 मिलीलीटर के साथ मोती धो लें । सबसे पहले, बफर के 1 मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए कॉलम टोपी से फंस मोतियों को हटाने के एक pipettor का उपयोग और बसे राल पर एक फ्लश में इस निलंबन हस्तांतरण के लिए मोती के पुनः निलंबन की अनुमति । फिर ऊपर, एक ढेर कैप का उपयोग बंद करें और एक सिकुड़नेवाला पंप से कनेक्ट करने के लिए स्तंभ भरें । लगभग 1-5 मिलीलीटर/मिनट के प्रवाह की दर को समायोजित करें । राल को सूखी चलने से रोकें ।
    5. दोहराएं चरण 2.4.4 तीन बार WB250 के साथ चार washes की कुल के लिए ।
    6. चरण 2.4.4 में वर्णित के रूप में TEB के 10 मिलीलीटर के साथ तीन बार मोती धोने ।
    7. नीचे क्रोमेटोग्राफी स्तंभ बंद करें, tcb के 1 मिलीलीटर में igg मोती को निलंबित, और जोड़ें 20 μ५० × प्रोटीज अवरोध करनेवाला कॉकटेल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से tev के 10 μl (~ 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक, S219V उत्परिवर्ती संस्करण में उत्पादित घर) ।
    8. कैप कॉलम और 10 rpm पर एक रोटरी मिक्सर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते के लिए प्रोटीन टैग की गईं HDAC के माध्यम से बंधे परिसर में रात भर ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से ऊंचा तापमान पर TEV डाइजेस्ट प्रदर्शन (16-25 डिग्री सेल्सियस), जो प्रतिक्रिया समय कम कर देता है, तथापि, प्रोटीन गिरावट के जोखिम को बढ़ा रहा है ।
    9. अगले दिन कॉलम खोलने और एक 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में eluate इकट्ठा । कैप से मोतियों को हटाने के लिए टीसीबी के ०.७ एमएल का इस्तेमाल करें और कॉलम की दीवार को खंगाल लें ।
    10. पिछले चरण जो खुद को एक ५० मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के भीतर रखा गया है से खुला 2 मिलीलीटर ट्यूब पर स्तंभ रखें ।
    11. एक मेज शीर्ष अपकेंद्रित्र में इस विधानसभा हस्तांतरण और 2 मिनट के लिए ३०० × g पर स्पिन । यह टीयूवी एलूएट है ।
      नोट: टैंडेम संबध शुद्धि करते समय, कैल्मॉड्यूलिन एफ़िनिटी चरण के इनपुट के रूप में TEV eluate का उपयोग करें. तुम भी TEV eluate विभाजित और HDAC गतिविधि दृढ़ संकल्प और दूसरे भाग के लिए नल शुद्धि को पूरा करने के लिए एक भाग का उपयोग कर सकते हैं ।
    12. TEV eluate से ५० μL निकालें और SDS-पृष्ठ के लिए 5 × LSB के १२.५ μL जोड़ें ( अंक 1 और 2में "TE" के रूप में संदर्भित) और बर्फ पर शेष eluate रखो ।
    13. प्रोटीनेज की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए, 5 मिनट के लिए 5% की 2 मिलीलीटर (v/ फिर, राल को पुनः निलंबित करने के लिए पहली एमएल का उपयोग करें ।
    14. एसिड eluate ले लीजिए और फिर ५० μL नमूना लेने के लिए और जोड़ने के १२.५ μL 5 × LSB ( चित्रा 1में "एई" के रूप में संदर्भित) । LSB पीला हो जाएगा जब अम्लीय समाधान करने के लिए जोड़ा. एसिड बेअसर करने के लिए, 1 μL के चरणों में 10 मीटर NaOH जोड़ें और नीले रंग में परिवर्तन फिर से जब तक अच्छी तरह से मिश्रण ।
    15. फिर से टीबीएस-टी के साथ IgG राल equilibrate एसिड बेअसर करने के लिए । एक ही टैग प्रोटीन के साथ पुन: उपयोग के लिए टीबीएस-टी/20% (v/v) इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर राल स्टोर ।
  5. क्षालन अंशों का भंडारण
    1. कई फ्रीज-thaw के चक्र से बचने के लिए ~ १०० μL अंशों में eluate aliquot ।
    2. तरल नाइट्रोजन में aliquots फ्रीज और-८० डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
      नोट: इस तरह से संग्रहीत नमूनों एंजाइमेटिक गतिविधि को खोने के बिना महीनों के लिए स्थिर हो जाएगा ।

3. एसडीएस द्वारा शुद्धि का विश्लेषण-पृष्ठ और पश्चिमी सोख्ता

  1. Sds-polyacrylamide जैल कास्टिंग के लिए मानक प्रोटोकॉल का प्रयोग करें या प्रीकास्ट जैल13का उपयोग करें । ९५ डिग्री सेल्सियस पर पिछले अनुभाग से denature जेल नमूने 5 मिनट के लिए, ≥ १५,००० × जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और लोड पर 12% जैल. अनुशंसित लोडिंग वॉल्यूम चित्रा 1की कथा में दिए गए हैं । Electrophorese में नमूने 1 × Tris-glycine sds-पृष्ठ रनिंग बफर १८० वी स्थिर पर 60 – 70 मिनट, जब तक ब्रोमोफीनॉल नीले मार्कर की sds-पृष्ठ लोड हो रहा है बफर जेल से बाहर माइग्रेट करने के लिए शुरू होता है ।
  2. जैल के चांदी धुंधला के लिए मानक प्रोटोकॉल का प्रयोग करें । उदाहरण के लिए, Blum एट अल के प्रोटोकॉल का उपयोग करें । १९८७14 कि भी एमएस विश्लेषण के साथ संगत है ।
  3. पश्चिमी सोख्ता15के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करें । नीचे प्रतिनिधि परिणामों की पीढ़ी के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सोख्ता प्रणाली का इस्तेमाल किया गया था ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर टीबीएस-टी में 5% (डब्ल्यू/वी) मिल्क पाउडर में एंटीबॉडी के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटी-कैलमॉड्यून बाइंडिंग प्रोटीन (एंटी-सीबीपी) के साथ जांच ब्लोट्स ।
    नोट: विरोधी CBP एंटीबॉडी टीयूवी दरार के बाद अभी भी मौजूद ठोकर टैग के हिस्से के खिलाफ निर्देश दिया है ।
  5. Blots का पता लगाने और विकास के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, विरोधी खरगोश IgG-alkaline फॉस्फेट संयुग्मी और एक BCIP/एनबीटी रंग विकास सब्सट्रेट नीचे प्रतिनिधि परिणामों की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया.

4. deacetylase परख विट्रो में प्रयोग [3एच] एसीटेट-लेबल चिकन जालीदार histones (Trojer एट अल. २००३ से अनुकूलित)4

  1. [3एच] एसीटेट-लेबल चिकन जालीदार histones की तैयारी के लिए Kölle एट अल १९९८16 के प्रोटोकॉल को देखें ।
  2. परख हालत प्रति triplicates में माप के लिए बर्फ पर तीन १.५ मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों स्थान । बफर-केवल पृष्ठभूमि नियंत्रण के लिए भी तीन ट्यूबों तैयार करते हैं ।
  3. प्रत्येक ट्यूब में WB150 के 25 μL रखो और कदम 2.4.11 से TEV eluate के 25 μL जोड़ें और बर्फ पर रखें ।
  4. एक ट्यूब को पहले से गरम करें 25 ° c करने के लिए इनक्यूबेटर ।
  5. प्रत्येक ट्यूब के लिए 10 μL लेबल वाले histones [१.५ मिलीग्राम/mL] के अलावा के लिए 15 s अंतराल (स्टॉप वॉच) का उपयोग करें ।
  6. परख शुरू करने से पहले, ऊपर ले [3एच] एसीटेट-लेबल चिकन histones के 10 μl और रोक घड़ी शुरू करते हैं ।
  7. शुरुआत के पांच सेकंड बाद लेबल वाले हिस्टोन्स डालकर ट्यूब को कसकर, भंवर को बंद कर इनक्यूबेटर में डाल दें ।
  8. 10 μL के लेबल वाले हिटों को जोड़ने के लिए 15 s अंतरालों का उपयोग करें और पिछले चरण में बताए अनुसार आगे बढ़ें ।
  9. ६० ंयूनतम ऊष्मायन के बाद 15 s अंतराल में प्रत्येक ट्यूब के लिए (1 मी HCl/0.4 M एसिटिक अम्ल) के ५० μL बंद समाधान जोड़ें; भंवर तुरंत । अम्लीय समाधान के अलावा के बाद, परख मिश्रण स्थिर है और अगले कदम तक आर टी पर रखा जा सकता है ।
  10. जारी [3एच] एसिटिक एसिड निकालने के लिए प्रत्येक ट्यूब करने के लिए एथिल एसीटेट की ८०० μl जोड़ें ।
  11. कसकर ट्यूबों और भंवर 5 एस के लिए प्रत्येक ट्यूब बंद करें ।
  12. एक माइक्रोअपकेंद्रित्र में ट्यूब प्लेस और १०,००० × जी पर 10 मिनट के लिए आरटी में स्पिन ।
  13. इस बीच, परख नमूना प्रति एक प्रस्फुरण शीशी तैयार करने और जलविरागी नमूनों के लिए प्रस्फुटन कॉकटेल के 3 मिलीलीटर जोड़ें ।
  14. अपकेंद्रण के बाद (कदम २.१२), ध्यान से तैयार प्रस्फुरण ट्यूबों के लिए ऊपरी कार्बनिक चरण के ६०० μL हस्तांतरण और ट्यूबों कसकर बंद करो ।
  15. एक तरल प्रस्फुटन काउंटर में hdac गतिविधि के लिए इसी रेडियोधर्मिता को मापने.

Representative Results

प्रस्तुत की एक विशिष्ट परिणाम के RpdA के एक कदम संवर्धन चित्रा 1 में दिखाया गया है (के रूप में संदर्भित "igg") । पूर्णता के लिए, हम भी प्रवाह के माध्यम से और क्षालन अंशों ("cft" और "CE") एक calmodulin राल द्वारा दूसरी शुद्धि कदम illustrating शामिल है ("कैम") के रूप में12वर्णित है । प्रदर्शित चांदी के दाग जेल (एक) स्पष्ट रूप से पहले आत्मीयता कदम है कि और भी आगे बढ़ जाता है जब टैंडेम शुद्धि प्रदर्शन की प्रभावकारिता दिखाता है । प्रोटीन निकालने और प्रवाह के माध्यम से में मौजूद सबसे प्रमुख प्रोटीन, तथापि, पहले से ही TEV eluate (ते) में समाप्त हो रहे हैं । यह ध्यान देने के लिए महत्वपूर्ण है कि tev क्षालन भागों > रहे हैं 100 × केंद्रित निकालने और प्रवाह के माध्यम से की तुलना में. तारांकों का चिह्न टैग RpdA (तुलना पैनल बी) । CBP (RpdA: CBP) सहित RpdA की गणना मेगावाट ८२ केडीए, तथापि, प्रोटीन लगभग १२० केडीए के एक बहुत अधिक स्पष्ट आणविक वजन पर migrates है । इस घटना को पहले देखा गया है और इसके C-टर्मिनस4,17के विशिष्ट गुणों को असाइन किया जा सकता है । इम्यूनोलॉट (बी) मजबूत संकेतों से पता चलता है कि लगभग १२० केडीए में पलायन cbp-टैग पूर्ण लंबाई RpdA (rpda:: CBP) tev eluate में ("ते"), calmodulin प्रवाह के माध्यम से ("cft"), और eluate ("CE") भागों । एसिड eluate में ("एई") एक थोड़ा बड़ा मेगावाट के साथ एक दूसरे संकेत दिखाई दे रहा है । यह नल के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है टैग की गईं RpdA कि TEV दरार द्वारा जारी नहीं किया गया था IgG राल के लिए बाध्य । आकार में अंतर प्रोटीन के 16 केडीए uncleaved RpdA के एक दोहराने से मेल खाती है:: ठोकर । उंमीद के रूप में, कोई बैंड विरोधी CBP एंटीबॉडी द्वारा जंगली प्रकार नियंत्रण भागों में (पैनल बी, "जंगली प्रकार") का पता लगाया जा सकता है ।

विशिष्ट HDAC अवरोध करनेवाला trichostatin एक (TSA) के साथ एक प्रतिनिधि deacetylase गतिविधि परख के परिणाम चित्रा 2में प्रदर्शित कर रहे हैं । यह परख मूलतः18 पौधों के लिए विकसित किया गया था और यह भी एक स्तनधारी deacetylases19,20के खिलाफ जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है । परख के लिए इस्तेमाल किया histones लेबल और16वर्णित के रूप में तैयार थे । समृद्ध RpdA परिसर के उत्प्रेरक गतिविधि पर TSA की सांद्रता बढ़ाने का प्रभाव ("ते ± TSA") दिखाया गया है । गतिविधि की संवेदनशीलता की पुष्टि की है कि मापा सीपीएम मूल्यों वास्तव में rpda के कारण कर रहे है और अविशिष्ट प्रोटीज गतिविधि की वजह से नहीं है । यह एक महत्वपूर्ण टिप्पणी के रूप में यह इंगित करता है कि TEV, जो बजाय उच्च एकाग्रता पर मौजूद है, HDAC गतिविधि परख के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । आदेश में RpdA के लिए मापा HDAC गतिविधि असाइन करने के लिए, एक जंगली प्रकार तनाव नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ("सह") । उंमीद के रूप में, केवल सीमांत HDAC गतिविधि (RpdA के लगभग 5-10%-समृद्ध भागों) जंगली प्रकार के TEV eluate में पाया गया था । दिलचस्प है, HDAC गतिविधि काफी दूसरी एफ़िनिटी शुद्धि कदम के बाद कम है ("CE") जब TEV eluate की तुलना में ।

Figure 1
चित्रा 1 । टैम-टैग किए गए RpdA के साथ समानता का संबंध । एक चांदी का दाग 10% एसडीएस-polyacrylamide जेल () और एक पश्चिमी दाग विरोधी cbp एंटीबॉडी के साथ जांच () प्रदर्शित कर रहे हैं । लेन लेबलिंग और लोड संस्करणों के रूप में इस प्रकार हैं: "M ": 2-l of 1:10 पतला अरंजित प्रोटीन मार्कर (चांदी दाग ), ३.५-l of prestained प्रोटीन मार्कर (वेस्टर्न ब्लॉट); "पूर्व": चरण 2.2.8 में तैयार के रूप में प्रोटीन निकालने के नमूने (2 μ1:10 कमजोर पड़ने, 5 μएल); "FT": IgG राल प्रवाह के रूप में नमूना के माध्यम से चरण में तैयार 2.4.3 (2 μ1:10 कमजोर पड़ने, 5 μएल); "AE": कदम 2.4.14 के एसिड eluate (10 μएल, 10 μएल); "TE": TEV दरार, कदम 2.4.12 (10 μएल, 10 μएल) द्वारा रातोंरात elल्यूशन के tev eluate; "CFT": कैल्मॉड्यून फ्लो-थ्रू (20 μL, 20 μL); "CE": calmodulin eluate (10 μL, 10 μL). चयनित मार्कर प्रोटीन का आकार पैनलों के बाईं ओर दर्शाया गया है । कोष्ठकों में दिए गए खंड चांदी के दाग और वेस्टर्न ब्लॉट, क्रमशः के लिए नमूना लोडिंग के अनुरूप हैं । सिल्वर-दाग जेल में तारक RpdA फ्यूजन प्रोटीन से संकेत मिलता है । बीसीआईपी/एनबीटी रंग विकास प्रणाली का उपयोग कर क्षारीय फॉस्फेट के साथ इम्यूनोलॉट (बी) का पता चला । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 । एक trichostatin की सांद्रता में वृद्धि के तहत HDAC गतिविधि परख Rpda निषेध की प्रभावकारिता का परीक्षण किया गया था 25 μl of संबध-शुद्ध पुनः संयोजक rpda ("ते") और 25 μl की 0, 10, ५०, और ५०० एनएम के hdac निरोधक TSA पतला rpda में-१६४० मध्यम । RPMI पृष्ठभूमि गतिविधि ("रिक्त") का आकलन करने के लिए उपयोग किया गया था । दूसरी calmodulin संबध चरण के बाद अंतिम eluate की गतिविधियों ("CE") और पहले संबंध शुद्धि चरण के बाद एक अचिह्नित तनाव की (नकारात्मक नियंत्रण, "Co") प्रदर्शित किए जाते हैं । गतिविधियों को समृद्ध RpdA के प्रतिशत के रूप में TSA (१००%, "TE") के बिना दिखाया जाता है । त्रुटि पट्टियां तीन replicates का मानक विचलन इंगित करते हैं । यह आंकड़ा Bauer एट al. २०१६2से संशोधित किया गया है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में तंतुमय कवक ए nidulans से इन विट्रो deacetylase गतिविधि के मूल्यांकन के लिए एक नल टैग वर्ग 1 hdac के एक एकल कदम संवर्धन का वर्णन है । ठोकर टैग मूलतः प्रोटीन की पहचान के लिए है बेकर खमीर में शुरू किया गया था टैग प्रोटीन के प्रोटीन बातचीत भागीदारों6। बाद में, टैग codon- एक. nidulans5 में इसके उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था । यहाँ हम वर्ग 1 HDAC RpdA के एक कदम संवर्धन के लिए ठोकर रणनीति के पहले आत्मीयता शुद्धि कदम के आवेदन के लिए एक सीधे आगे कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । दूसरा एफ़िनिटी शुद्धि चरण स्पष्ट रूप से शुद्धि के स्तर को बढ़ाता है, जो चारा-अन्योन्यक्रिया प्रोटीन की पहचान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । फिर भी, बस पहला कदम बाद गतिविधि परीक्षण के लिए सिफारिश की है, पहले कदम के बाद महत्वपूर्ण संदूषण की कमी के बाद से एक नियंत्रण प्रयोग एक जंगली प्रकार तनाव का उपयोग करके की पुष्टि की थी । इसके अलावा, जब पूर्ण नल की तुलना में एक कदम संवर्धन के बाद eluted गतिविधि काफी अधिक है । RpdA2के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी सफलतापूर्वक एक द्वितीय श्रेणी 1 Hdac hosa21के nidulans परिसरों शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

हमारी टिप्पणियों के कारण है कि कवक वर्ग 1 HDACs ऊपर स्थिर परिसरों4का निर्माण, हम bayram एट अल. २०१२12 कि इस पद्धति के आधार का प्रतिनिधित्व करता है द्वारा प्रोटोकॉल को संशोधित करने में सफल रहा है । इसके बावजूद कुछ महत्वपूर्ण कदमों का उल्लेख करना होगा । अत्यधिक केंद्रित प्रोटीन निष्कर्षों की तैयारी निकट-शारीरिक स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए जटिल स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, बायोमास/निष्कर्षण बफर अनुपात के संबंध में दी गई सिफारिशों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है । इस संबंध में, यह भी उचित निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से जमीन ठीक mycelial पाउडर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां पिसाई मशीन का प्रयोग स्पष्ट रूप से लाभप्रद है । के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया है, यह करने के लिए 1-2 घंटे के लिए TEV-दरार कदम की कोशिश के लिए कमरे के तापमान में आदेश को शुद्धि गति के लायक है । इस RpdA के लिए स्थिरता पर कोई हानिकारक प्रभाव (अप्रकाशित अवलोकन, Bauer मैं, २०१८) देख बिना परीक्षण किया गया था । इसके अलावा, NP40 के प्रतिस्थापन (मूल प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया) TX-१०० के साथ अंय प्रोटीन परिसरों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । अन्य नल के शुद्धिकरण के लिए इस विधि का उपयोग करते समय-टैग प्रोटीन, एक भी Bayram प्रोटोकॉल है, जो मूल्यवान संकेत है कि अन्य प्रोटीन परिसरों के एक पर्याप्त शुद्धि के लिए उपयोगी हो सकता है की एक संख्या शामिल का उल्लेख करना चाहिए12.

यहां के अलावा नल विधि, अंय संबंध टैग और तकनीक का वर्णन सामांयतः तंतुमय कवक के प्रोटीन के एक कदम संवर्धन के लिए उपयोग किया जाता है, उसके सहित और gfp-टैग । हालांकि, के रूप में कक्षा 1 hdacs आम तौर पर उच्च आणविक वजन परिसरों के रूप में कार्यात्मक हैं, देशी क्षालन शर्तों उत्प्रेरक सक्रिय hdacs के संवर्धन के लिए एक शर्त है । महत्वपूर्ण बात, कई अंय संबंध शुद्ध प्रतिकूल परिस्थितियों में प्रदर्शन कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, gfp-ट्रैप, जो antigen-एंटीबॉडी बातचीत पर आधारित है के माध्यम से hdacs के संवर्धन, प्रोटीन hdacs रेजिन के लिए बाध्य परिसरों के प्रोटीन बातचीत के साथ हस्तक्षेप अम्लीय क्षालन शर्तों के कारण उपयुक्त नहीं है । इसके अलावा, धातु कीलेट संबंध क्रोमैटोग्राफी22द्वारा अपने-टैग rpda शुद्ध करने के प्रयास, शोधन प्रक्रिया के दौरान उत्प्रेरक गतिविधि की एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप हालांकि imidazole बजाय कम पीएच शर्तों के क्षालन के लिए इस्तेमाल किया गया था ( अप्रकाशित डेटा, Bauer, मैं, २०१०) ।

वर्णित एंजाइमी परख प्रोटोकॉल की एक सीमा रेडियोधर्मी सब्सट्रेट का उपयोग है । तथापि, एक फ्लोरोसेंट आधार पर assays हैं, के रूप में अच्छी तरह से23,24 विकसित किया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । इन assays है अच्छी तरह से प्लेटों में प्रदर्शन किया है और इस प्रकार HDAC inhibitors की उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए भी उपयुक्त हैं । उस मामले में, प्रस्तुत प्रक्रिया के एक upscale की आवश्यकता होगी ।

इस प्रोटोकॉल के संभावित आगामी अनुप्रयोगों में कक्षा 1 HDACs के विशिष्ट उप-परिसरों का संवर्धन शामिल है ताकि उनकी विशिष्ट शारीरिक भूमिकाओं और/या HDACS अवरोधकों को उनकी संवेदनशीलता में अंतर का आकलन किया जा सके । जब अन्य एंजाइमों के लिए वर्णित विधि की स्थापना, यह दृढ़ता से एक अनटैग तनाव के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग करने के लिए सिफारिश की है । यह मापा एंजाइम गतिविधियों की विशिष्टता सुनिश्चित करता है और unspecifically रूप से बाध्य एंजाइमों द्वारा संदूषण प्रकट होता है ।

शुद्धि और गतिविधि परख यहां वर्णित दो दिनों के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और समृद्ध एंजाइमों कम से कई महीनों के लिए स्थिर रहे हैं, जब aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत । अंत में, इस प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी तरीका गतिविधि माप और अवरोध करनेवाला प्रभावकारिता के निर्धारण के लिए कक्षा 1 HDAC परिसरों को प्राप्त करने के लिए प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पेट्रा Merschak, आणविक जीवविज्ञान के विभाजन (Biocenter, Innsbruck के मेडिकल विश्वविद्यालय), उसकी मदद और इस पांडुलिपि के बारे में समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इसके अतिरिक्त, हम समीक्षकों को उनके मूल्यवान टिप्पणियों के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

यह काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (P24803 एसजी और P21087 करने के लिए जीबी) और अंदर धन द्वारा वित्त पोषित किया गया था (MUI शुरू, आईबी के लिए ST201405031) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x SDS-PAGE running buffer Novex
2-mercaptoethanol (EtSH) Roth 4227
25 cm2 cell culture flasks with vent cap Sarstedt 833910002 For spore production
47 mm vacuum filtration unit Roth EYA7.1
AccuFLEX LSC-8000 HITACHI Scintillation counter
Acetic acid Roth 7332
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody Millipore 07-482 Used at 1:1333 dilution
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody Sigma-Aldrich A3687
Ball mill Retsch 207450001 Mixer Mill MM 400
BCIP/NBT Promega S3771 Color development substrate for AP
Cell strainer Greiner 542040
Cheese cloth for harvesting mycelia BioRen H0028 Topfentuch
Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth 4720
EDTA Prolabo 20309.296
Ethyl acetate Scharlau Ac0155
Freeze Dryer LABCONCO 7400030 FreeZone Triad
Glycerol Roth 3783
HCl Roth 4625
IgG resin GE Healthcare 17-0969-01 IgG Sepharose 6 Fast Flow
Inoculation loops VWR 612-2498
KOH Merck 5033
Laminar flow cabinet Thermo Scientific Hera Safe KS
Mixed Cellulose Esters Membrane Filters Millipore GSWP04700
NaCl Roth 3957
NaOH Roth 6771
Neubauer counting chamber improved Roth T728
Novex gel system Thermo Scientific For SDS-PAGE
Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) Thermo Scientific LC2675 Running buffer for SDS-PAGE
peqGold protein-marker II VWR 27-2010P Protein ladder used for silver stain
Peristaltic Pump P-1 GE Healthcare 18111091
Pipette controller Brand 26302 accu-jet pro
Poly-Prep chromatography columns Bio-Rad 731-1550
ProSieve QuadColor protein marker Biozym 193837 Prestained protein ladder used for western blot
Protease inhibitor cocktail tablets Sigma-Aldrich 11873580001 cOmplete, EDTA-free
Rotary mixer ELMI Intelli-Mixer RM-2 S
Rotiszint eco plus Roth 0016
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Scintillation vials Greiner 619080
Sorvall Lynx 4000 Thermo Scientific
Thermomixer comfort Eppendorf
TIB32.1 A. nidulans rpdA::TAP strain.
Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1;
argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 1704271
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad 1704150
Trichostatin A (TSA) Sigma-Aldrich T8552 5 mM stock in DMSO
Tris (free base) Serva 37190
Tris-HCl Roth 9090
Polysorbate 20 Roth 9127 Tween 20
Polysorbate 80 Sigma-Aldrich P1754 Tween 80
TX-100 Acros Organics 215682500 Triton X-100, Octoxynol-9 detergent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338, (1), 17-31 (2004).
  2. Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7, (6), (2016).
  3. Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40, (9-10), 1355-1363 (2018).
  4. Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31, (14), 3971-3981 (2003).
  5. Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320, (5882), 1504-1506 (2008).
  6. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
  9. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2, (4), 811-821 (2007).
  10. Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66, (11), 4810-4816 (2000).
  11. Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  12. Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
  13. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  14. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, (2), 93-99 (1987).
  15. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
  16. Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15, (4), 323-331 (1998).
  17. Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21, (2), 345-353 (2010).
  18. Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11, (6), 857-866 (1988).
  19. Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57, (14), 6259-6265 (2014).
  20. Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49, (20), 6046-6056 (2006).
  21. Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
  22. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, (5536), 598-599 (1975).
  23. Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10, (1), 61-68 (2003).
  24. Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
एंजाइमेटिक गतिविधि परख के लिए Filamentous कवक <em>एस्पर्जिलस nidulans</em> के एक टेप टैग की गई हिवन Deacetylase के एक कदम संवर्धन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bauer, I., Pidroni, A., Bayram, Ö.,Brosch, G., Graessle, S. Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay. J. Vis. Exp. (147), e59527, doi:10.3791/59527 (2019).More

Bauer, I., Pidroni, A., Bayram, Ö., Brosch, G., Graessle, S. Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay. J. Vis. Exp. (147), e59527, doi:10.3791/59527 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter