RpdA की तरह कक्षा 1 हिटोन deacetylases (HDACs) संभावित लक्ष्य के रूप में फंगल संक्रमण के इलाज के महत्व को प्राप्त किया है । यहां हम नल के विशिष्ट संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल-टैग की गईं एक hdac गतिविधि परख कि हिस्टोन deacetylase अवरोधकों की विट्रो प्रभावकारिता परीक्षण में अनुमति देता है के साथ संयुक्त rpda ।
RpdA की तरह वर्ग 1 हिटोन डिएसिटाइलसिस (HDACs) फंगल संक्रमण के उपचार के लिए और कवक माध्यमिक चयापचयों के जीनोम खनन के लिए संभावित लक्ष्य के रूप में महत्व प्राप्त किया है । निरोधक स्क्रीनिंग, तथापि, शुद्ध एंजाइम गतिविधियों की आवश्यकता है । के बाद से कक्षा 1 deacetylases बहु प्रोटीन परिसरों के रूप में अपने कार्य डालती है, वे आम तौर पर सक्रिय नहीं है जब बैक्टीरिया में एक पॉलीपेप्टाइड के रूप में व्यक्त किया । इसलिए, अंतर्जात परिसरों को अलग किया जाना चाहिए, जो, जब आयन विनिमय और आकार अपवर्जन क्रोमेटोग्राफी की तरह पारंपरिक तकनीकों लागू कर रहे हैं, श्रमसाध्य और समय लगता है । अग्रानुक्रम संबंध शुद्धि को कोशिकाओं से बहुप्रोटीन परिसरों को समृद्ध करने के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित किया गया है और इस प्रकार अंतर्जात एंजाइमों के अलगाव के लिए आदर्श हो गया है । यहां हम सी के पहले शुद्धीकरण कदम के माध्यम से सक्रिय RpdA परिसरों की एक कदम संवर्धन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान- Termingillus nidulansसे टैग की गईं rpda । शुद्ध परिसरों तो बाद में अवरोध करनेवाला एक deacetylase परख आवेदन स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एंजाइमी गतिविधि परख के साथ एक साथ प्रोटीन संवर्धन दो दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है ।
हिस्टोवन deacetylases (hdacs) zn2 +-निर्भर hydrolytic एंजाइमों histone और अंय प्रोटीन के lysine अवशेषों से ऐसीटिल समूहों को हटाने में सक्षम हैं । अनुक्रम समानता के आधार पर, HDACs कई वर्गों1में वर्गीकृत कर रहे हैं । हाल ही में, कवक वर्ग 1 HDAC RpdA, बेकर के एक ortholog खमीर (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, को अवसरवादी कवक रोगज़नक़ के लिए आवश्यक होना दिखाया गया है धूमकुहर2। इसलिए, RpdA एक संभावित लक्ष्य के लिए फंगल संक्रमण2इलाज के रूप में महत्व प्राप्त किया है । विट्रो में deacetylase गतिविधि का मूल्यांकन एंजाइमी गुणों के लक्षण वर्णन के लिए महत्वपूर्ण है और अवरोधक विकास के लिए उपन्यास पदार्थों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि एक codon-अनुकूलित संस्करण की Escherichia कोलाई में मानव HDAC1 के पुनः संयोजक अभिव्यक्ति हाल ही में3रिपोर्ट किया गया है, इस होस्ट में पूर्ण लंबाई rpda एक्सप्रेस का प्रयास विफल4। इसके अलावा, के बाद से कवक वर्ग 1 hdacs जैसे rpda और hosa multiprotein परिसरों के रूप में अपने कार्य डालती है, यह एंजाइमी अवरोध करनेवाला अध्ययन के लिए देशी अंतर्जात परिसरों का उपयोग करने के लिए अनुकूल है । हालांकि, बाधा कारकों और फंगल lysates में विभिंन HDACs की उपस्थिति के कारण, उत्प्रेरक पूरे प्रोटीन निष्कर्षों में मापा गतिविधि अपेक्षाकृत कम है और व्यक्तिगत एंजाइमों को नहीं सौंपा जा सकता है । इसके अलावा, तंतुमय कवक ए nidulans में पिछले अध्ययन एक वर्ग 2 hdac, hdaa, कवक के अर्क के वर्णलेखी भागों में प्रमुख deacetylase के रूप में पहचान की. इस प्रकार, कई पारंपरिक क्रोमेटोग्राफिक शुद्धि कदम कवक उपभेदों से गैर HdaA गतिविधि अलग करने के लिए आवश्यक हैं4. ए nidulans5 में टैंपरेरी एफ़िनिटी प्यूरीफिकेशन (टीएपी) कार्यनीति की शुरूआत से विशिष्ट डिएसिटिलेज गतिविधियों के संवर्धन में काफी ढील दी गई है । मूल नल टैग दो प्रोटीन एक डोमेन से बना है और एक calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड (cbp) एक तंबाकू खोदना वायरस प्रोटीज (tev) दरार साइट द्वारा अलग6। इस देशी शुद्धि और उनके संपर्क भागीदारों7सहित टैग प्रोटीन के क्षालन के लिए अनुमति देता है । जब गतिविधि के लिए समृद्ध प्रोटीन का उपयोग assays हैं, प्रोटीज दरार द्वारा देशी शर्तों के तहत हल्के क्षालन नल टैग शुद्धि की एक महत्वपूर्ण विशेषता है । एक GFP टैग प्रोटीन, उदाहरण के लिए, immobilized एंटीबॉडी के रूप में अच्छी तरह से समृद्ध किया जा सकता है, तथापि, मूल परिस्थितियों में नहीं किया जा सकता है ।
यहां हम एक के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध कराने के सक्रिय RpdA परिसरों के पहले शुद्धि कदम के माध्यम से सी के लिए एक . nidulans (igg जुदाई और tev दरार से टैग rpda) बाद में अवरोध करनेवाला स्क्रीनिंग के लिए एक आवेदन हिस्टक डिएसिटाइललेस परख । के रूप में पर्याप्त साबित हो, समानता संवर्धन सिर्फ एक शुद्धि कदम के लिए भी सीमित है क्योंकि एंजाइमी गतिविधि दो कदम नल शुद्धि के बाद जब अकेले igg शुद्धि की तुलना में काफी कम हो गया था ।
फिर भी, शुरू की प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से अन्य टैग की गई एंजाइमों के संवर्धन के लिए लागू होना चाहिए वर्णक नियमन जैसे एसीटाइलट्रांस्लेसिस, methyltransferases, और demethylases में शामिल. ठोकर प्रोटोकॉल के दूसरे शुद्धि कदम appending द्वारा, प्रोटीन सह टैग के साथ शुद्ध-(उपंयास) एंजाइमी परिसरों के जटिल भागीदारों के रूप में माना जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल में तंतुमय कवक ए nidulans से इन विट्रो deacetylase गतिविधि के मूल्यांकन के लिए एक नल टैग वर्ग 1 hdac के एक एकल कदम संवर्धन का वर्णन है । ठोकर टैग मूलतः प्रोटीन की पहचान के लिए है बेकर खमीर में शुरू किया गया था टैग प्रोटीन के प्रोटीन बातचीत भागीदारों6। बाद में, टैग codon- एक. nidulans5 में इसके उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया था । यहाँ हम वर्ग 1 HDAC RpdA के एक कदम संवर्धन के लिए ठोकर रणनीति के पहले आत्मीयता शुद्धि कदम के आवेदन के लिए एक सीधे आगे कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । दूसरा एफ़िनिटी शुद्धि चरण स्पष्ट रूप से शुद्धि के स्तर को बढ़ाता है, जो चारा-अन्योन्यक्रिया प्रोटीन की पहचान के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । फिर भी, बस पहला कदम बाद गतिविधि परीक्षण के लिए सिफारिश की है, पहले कदम के बाद महत्वपूर्ण संदूषण की कमी के बाद से एक नियंत्रण प्रयोग एक जंगली प्रकार तनाव का उपयोग करके की पुष्टि की थी । इसके अलावा, जब पूर्ण नल की तुलना में एक कदम संवर्धन के बाद eluted गतिविधि काफी अधिक है । RpdA2के अलावा, इस प्रोटोकॉल भी सफलतापूर्वक एक द्वितीय श्रेणी 1 Hdac hosa21के nidulans परिसरों शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
हमारी टिप्पणियों के कारण है कि कवक वर्ग 1 HDACs ऊपर स्थिर परिसरों4का निर्माण, हम bayram एट अल. २०१२12 कि इस पद्धति के आधार का प्रतिनिधित्व करता है द्वारा प्रोटोकॉल को संशोधित करने में सफल रहा है । इसके बावजूद कुछ महत्वपूर्ण कदमों का उल्लेख करना होगा । अत्यधिक केंद्रित प्रोटीन निष्कर्षों की तैयारी निकट-शारीरिक स्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए जटिल स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, बायोमास/निष्कर्षण बफर अनुपात के संबंध में दी गई सिफारिशों को ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है । इस संबंध में, यह भी उचित निष्कर्षण सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से जमीन ठीक mycelial पाउडर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां पिसाई मशीन का प्रयोग स्पष्ट रूप से लाभप्रद है । के रूप में प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया है, यह करने के लिए 1-2 घंटे के लिए TEV-दरार कदम की कोशिश के लिए कमरे के तापमान में आदेश को शुद्धि गति के लायक है । इस RpdA के लिए स्थिरता पर कोई हानिकारक प्रभाव (अप्रकाशित अवलोकन, Bauer मैं, २०१८) देख बिना परीक्षण किया गया था । इसके अलावा, NP40 के प्रतिस्थापन (मूल प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया) TX-१०० के साथ अंय प्रोटीन परिसरों के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है । अन्य नल के शुद्धिकरण के लिए इस विधि का उपयोग करते समय-टैग प्रोटीन, एक भी Bayram प्रोटोकॉल है, जो मूल्यवान संकेत है कि अन्य प्रोटीन परिसरों के एक पर्याप्त शुद्धि के लिए उपयोगी हो सकता है की एक संख्या शामिल का उल्लेख करना चाहिए12.
यहां के अलावा नल विधि, अंय संबंध टैग और तकनीक का वर्णन सामांयतः तंतुमय कवक के प्रोटीन के एक कदम संवर्धन के लिए उपयोग किया जाता है, उसके सहित और gfp-टैग । हालांकि, के रूप में कक्षा 1 hdacs आम तौर पर उच्च आणविक वजन परिसरों के रूप में कार्यात्मक हैं, देशी क्षालन शर्तों उत्प्रेरक सक्रिय hdacs के संवर्धन के लिए एक शर्त है । महत्वपूर्ण बात, कई अंय संबंध शुद्ध प्रतिकूल परिस्थितियों में प्रदर्शन कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, gfp-ट्रैप, जो antigen-एंटीबॉडी बातचीत पर आधारित है के माध्यम से hdacs के संवर्धन, प्रोटीन hdacs रेजिन के लिए बाध्य परिसरों के प्रोटीन बातचीत के साथ हस्तक्षेप अम्लीय क्षालन शर्तों के कारण उपयुक्त नहीं है । इसके अलावा, धातु कीलेट संबंध क्रोमैटोग्राफी22द्वारा अपने-टैग rpda शुद्ध करने के प्रयास, शोधन प्रक्रिया के दौरान उत्प्रेरक गतिविधि की एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप हालांकि imidazole बजाय कम पीएच शर्तों के क्षालन के लिए इस्तेमाल किया गया था ( अप्रकाशित डेटा, Bauer, मैं, २०१०) ।
वर्णित एंजाइमी परख प्रोटोकॉल की एक सीमा रेडियोधर्मी सब्सट्रेट का उपयोग है । तथापि, एक फ्लोरोसेंट आधार पर assays हैं, के रूप में अच्छी तरह से23,24 विकसित किया गया है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । इन assays है अच्छी तरह से प्लेटों में प्रदर्शन किया है और इस प्रकार HDAC inhibitors की उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए भी उपयुक्त हैं । उस मामले में, प्रस्तुत प्रक्रिया के एक upscale की आवश्यकता होगी ।
इस प्रोटोकॉल के संभावित आगामी अनुप्रयोगों में कक्षा 1 HDACs के विशिष्ट उप-परिसरों का संवर्धन शामिल है ताकि उनकी विशिष्ट शारीरिक भूमिकाओं और/या HDACS अवरोधकों को उनकी संवेदनशीलता में अंतर का आकलन किया जा सके । जब अन्य एंजाइमों के लिए वर्णित विधि की स्थापना, यह दृढ़ता से एक अनटैग तनाव के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग करने के लिए सिफारिश की है । यह मापा एंजाइम गतिविधियों की विशिष्टता सुनिश्चित करता है और unspecifically रूप से बाध्य एंजाइमों द्वारा संदूषण प्रकट होता है ।
शुद्धि और गतिविधि परख यहां वर्णित दो दिनों के भीतर प्रदर्शन किया जा सकता है और समृद्ध एंजाइमों कम से कई महीनों के लिए स्थिर रहे हैं, जब aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत । अंत में, इस प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत सरल और लागत प्रभावी तरीका गतिविधि माप और अवरोध करनेवाला प्रभावकारिता के निर्धारण के लिए कक्षा 1 HDAC परिसरों को प्राप्त करने के लिए प्रदान करता है ।
The authors have nothing to disclose.
हम पेट्रा Merschak, आणविक जीवविज्ञान के विभाजन (Biocenter, Innsbruck के मेडिकल विश्वविद्यालय), उसकी मदद और इस पांडुलिपि के बारे में समर्थन के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इसके अतिरिक्त, हम समीक्षकों को उनके मूल्यवान टिप्पणियों के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
यह काम ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (P24803 एसजी और P21087 करने के लिए जीबी) और अंदर धन द्वारा वित्त पोषित किया गया था (MUI शुरू, आईबी के लिए ST201405031) ।
10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
Acetic acid | Roth | 7332 | |
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
Cell strainer | Greiner | 542040 | |
Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
Glycerol | Roth | 3783 | |
HCl | Roth | 4625 | |
IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
KOH | Merck | 5033 | |
Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
NaCl | Roth | 3957 | |
NaOH | Roth | 6771 | |
Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
Tris (free base) | Serva | 37190 | |
Tris-HCl | Roth | 9090 | |
Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |