Summary
클래스 1 히스톤 디 아 세 틸 아 제 (hdacs) 같은 rpda는 곰 팡이 감염을 치료 하는 잠재적인 대상으로 중요성을 얻고 있다. 여기에서 우리는 히스톤 데 아 세 틸 제 억제제의 시험관 내 효능 테스트를 허용 하는 hdac 활성 분석을 결합 한 탭 태그 rpda의 특정 농축을 위한 프로토콜을 제시 합니다.
Abstract
Rpda와 같은 클래스 1 히스톤 디 아 세 틸 아 제 (hdacs)는 곰 팡이 감염의 치료 및 곰 팡이 이차 대사 산물의 게놈 채굴을 위한 잠재적 인 표적으로 서 중요성을 얻고 있습니다. 그러나 억제제 스크리닝은 정제 된 효소 활동을 필요로 한다. 클래스 1 디 아 세 틸 아 제는 다중 단백질 복합체로 서의 기능을 발휘 하기 때문에, 박테리아에서 단일 폴 리 펩타이드로 서 발현 될 때 일반적으로 활성화 되지 않는다. 따라서, 내 인 성 복합체는 분리 될 필요가 있으며,이는 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 종래의 기술이 적용 될 때, 번거롭고 시간이 많이 소요 된다. 탠덤 친화성 정제는 세포 로부터 다중 단백질 복합체를 풍부 하 게 하는 도구로 개발 되었으며, 따라서 내 인 성 효소의 단로에 이상적 이라고 밝혀졌다. 여기서 우리는 아 스퍼 질러 스 nidulans의 C-말기 탭 태그 rpda의 첫 번째 정제 단계를 통해 활성 rpda 복합체의 단일 단계 농축을 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 정제 된 복합체는 이어서 디 아 세 틸 제 분석을 적용 한 후속 억제제 스크리닝에 사용 될 수 있다. 효소 활성 분석 법과 함께 단백질 농축은 2 일 이내에 완료 될 수 있다.
Introduction
Histone 디 아 세 틸 아 제 (HDACs)는 히 돌 및 기타 단백질의 리 신 잔기에서 아 세 틸 그룹을 제거할 수 있는 Zn2 +의존성 가수분해 효소입니다. 시퀀스 유사성에 따라 HDACs는 여러 클래스1로 그룹화 됩니다. 최근, 진 균 클래스 1 HDAC RpdA는 빵집의 효 모 (사 카로 마 세레 비시) Rpd3p의 기립 성 이며, 기회 없는 곰 팡이 병원 균의 아 스퍼 질러 스의 후 미그나 투 스2에 필수적인 것으로 나타났다. 따라서, RpdA는 곰 팡이 감염을 치료 하는 잠재적 인 표적으로 서 중요성을 얻고 있다2. 시험관 내에서의 de아 세 틸 제 활성의 평가는 효소 특성의 특성화에 중요 하며 억제제 개발을 위한 신규 한 물질의 효능을 결정할 수 있게 한다. 대장균 에서 인간 HDAC1의 코 돈 최적화 된 버전의 재조합 발현이 최근 보고 되었지만,이숙주에서 전체 길이 rpda를 발현 하는 시도가 실패4. 또한 RpdA 및 HosA와 같은 균 류 클래스 1 HDACs는 다중 단백질 복합체로 서의 기능을 발휘 하기 때문에 효소 억제제 연구를 위한 천연 내 인 성 복합체를 사용 하는 것이 유리 합니다. 그러나, 억제 요인 및 곰 팡이 용 해물에 다른 HDACs의 존재로 인해, 전체 단백질 추출 물에서 측정 된 촉매 활성은 상대적으로 낮고 개별 효소에 할당 될 수 없습니다. 더욱이, 사상 균 곰 팡이에서의 이전 연구 는 , hdaa 클래스 2 hdac, 곰 팡이 추출 물의 크로마토그래피 분 획으로 우세한 데 아 세 틸 제를 동정 하였다. 따라서, 다 수의 통상적인 크로마토그래피 정제 단계는 곰 팡이 균 주4에서 비 hdaa 활성을 분리 하기 위해 필요 하다. A. nidulans5 에서 탠덤 친화도 정화 (TAP) 전략의 도입은 특정 디 아 세 틸 제 활동의 농축을 크게 완화 시켰습니다. 원래의 탭 태그는 2 개의 단백질 A 도메인과 cal모듈화 결합 펩타이드 (CBP)가 담배 식 각 바이러스에 의해 분리 된 단백질 분해 효소 (TEV) 절단 부위 (6)로 구성 된다. 이것은 그들의 상호 작용 파트너7를 포함 하 여 태그 된 단백질의 기본 정화 그리고 용 출을 허용 합니다. 활성 분석을 위해 농축 된 단백질을 사용 하는 경우, 프로 테아 제 절단에의 한 천연 조건 하에서의 온화한 용 출은 탭 태그 정제의 중요 한 특징 이다. GFP 태그 단백질은, 예를 들면, 고 정화 항 체에 의해 강화 될 수 있습니다, 그러나, 본래 조건 하에서 용 출 될 수 없습니다.
여기서 우리는 a의 첫 번째 정제 단계를 거쳐 활성 RpdA 복합체의 단일 단계 농축을 위한 상세한 프로토콜을 제공 한다. 이후 억제제 스크리닝을 위한 (IgG 분리 및 tev 절단) 하이 스톤 디 아 세 틸 제 분석. 충분 한 것으로 입증 된 것 처럼, 친화성 강화는 IgG 정제 단독에 비하여 2 단계 탭 정제 후에 효소 활성이 현저히 감소 했기 때문에 단지 하나의 정제 단계로 제한 되었다.
그럼에도 불구 하 고, 도입 된 프로토콜은 아 세 틸 트랜스퍼 제, 메 틸 트랜스퍼 제, 및 탈 메 틸 제와 같은 크로마 틴 조절에 관여 하는 다른 태그 된 효소의 농축에도 적용 될 수 있어야 합니다. 탭 프로토콜의 제 2 정제 단계를 추가 함으로써, 태그 된 미끼와 함께 단백질 공동 정제는 (소설) 효소 복합체의 복잡 한 파트너로 간주 될 수 있다.
Protocol
1. 니 둘 란 스의 재배
- 접종 물 준비
주: 인큐베이션과는 별개로 모든 단계는 층 류 캐비닛에서 수행 해야 합니다.- 연속 탭 스트레인 (예를 들어 tib 32.1)에서 글리세롤 스톡 (-80 ° c)에서 포도 당/자일 로스 최소 배지 (gxmm; 당 리터 10.0의 포도 당 0.5 g의 혈당, 10ml(1m의 디 암모늄 타르트 레이트 50 용액 20ml × 염 26.0 용액 20ml KCl, 26.0 g · 7h2o, 76.0의 클로로포 름 1 ml), 1.5%의 한 천을 포함 하는 1000 × 허 트 너의 미 량 원소8) 및 토 드 외. 20079에 기술 된 바와 같이 필요한 보조 제. 37 ° c에서 2 ~ 3 일 동안 배양 합니다.
참고: TIB 32.1에는 Rpda가 포함 되어 있습니다:: 탭 융합은 자일 로스-유도성 프로모터, xylp(p.10)에 의해 제어 된다. 이것이 자일 로스가 위의 레시피에 포함 된 이유입니다. Xylp(p) 컨트롤 아래에 있지 않은 구조를 표현 하는 균 주를 재배 할 때 자일 로스를 생략 하십시오. - 멸 균 된 침 엽 다이얼 서 스 펜 션 솔루션 (80 polysorbate의 0.9%) 염화 나트륨, 0.01% (v/v)를 1.5 가진 멸 균 1.5 ml 원심 분리기 튜브를 준비 합니다.
- CSS에서 일회용 접종 루프를 적시고 1.1.1 단계에서 플레이트에서 침 엽 직경을 긁어 내 고 1.1.2 단계에서 튜브를 일시 중단 합니다.
- 전송 150 µ L는 10 25의 보충 및 200 µ L 을 포함 하 여 GXMM 한 천을 포함 하는 벤 트 캡이 들어 있는 침 엽 다이얼 서 스 펜 션의 각각의 구 수로 각이 있습니다.
- 멸 균 접종 루프를 사용 하 여 플라스 크 내 침 엽 다이얼 현 탁 액을 확산 하 고 2 ~ 3 일 동안 37 ° c에서 플라스 크를 배양 합니다.
- 침 엽 직경을 수확 하려면 플라스 크 당 10 mL의 CSS를 사용 하십시오. 용액을 플라스 크에 붓고, 제공 된 스크류 캡으로 플라스 크를 단단히 닫고 플라스 크를 세게 흔들어 줍니다.
- 곰 팡이 표면을 습윤 한 후, 멸 균 접종 루프로 남아 있는 침 엽 dia를 완전히 긁어 냅니다.
- 40 µm 세포 스 트레이너를 통해 침 엽 디 아를 통과 시켜 50 mL 원심 분리기 튜브에 넣고 하나의 튜브에서 5 플라스 크의 현 탁 액을 수집 합니다.
- 10 분 동안 1000 × g 에서 튜브를 원심 분리기.
- 상층 액을 decant 하 고 튜브 당 CSS의 10ml로 펠 렛을 소생 시킵니다.
- 1.1.9 단계에서 설명한 바와 같이, 하나의 튜브에서 두 현 탁 액을 모두 모으고, 빈 튜브를 CSS의 40 mL로 헹 구 고, 현 탁 액에 추가 하 고, 원심 분리기를 사용 하십시오.
- 상 청 액을 decant 하 고, CSS의 4 mL에 침 엽 다이얼 펠 렛을 소생.
- 침 엽 다이얼 서 스 펜 션의 시리얼 1:50 희석 액을 2 개 준비 하 고, 그 결과를도11과 같이 카운팅 챔버로 생성 된 1:2, 500 희석 현 탁 액의 침 엽 수를 결정 한다.
- 연속 탭 스트레인 (예를 들어 tib 32.1)에서 글리세롤 스톡 (-80 ° c)에서 포도 당/자일 로스 최소 배지 (gxmm; 당 리터 10.0의 포도 당 0.5 g의 혈당, 10ml(1m의 디 암모늄 타르트 레이트 50 용액 20ml × 염 26.0 용액 20ml KCl, 26.0 g · 7h2o, 76.0의 클로로포 름 1 ml), 1.5%의 한 천을 포함 하는 1000 × 허 트 너의 미 량 원소8) 및 토 드 외. 20079에 기술 된 바와 같이 필요한 보조 제. 37 ° c에서 2 ~ 3 일 동안 배양 합니다.
- 균 사체의 성장과 수확
- 층 류 캐비닛 하에서 작업 하는 동안, 각각 5×106 침 엽 dia/mL의 밀도에서 적절 한 보충제를 포함 하 여 250 mL의 1 리터 원추형 플라스 크를 함유 하는 접종 하 고 14~16h의 37 ° c에서 180 rpm으로 배양 한다.
- 치즈 천을 플라스 크 위에 있는 깔때기에 넣고 천을 통해 균 사체를 걸러냅니다. 탈 이온 수로 간단히 씻으십시오.
- 첫 번째 손과 종이 타월 사이에 치즈 천에 갇힌 균 사체를 압착 하 여 최대한 많은 수 분을 제거 하십시오.
- 스크류 뚜껑이 있는 플라스틱 비 커에 건조 된 균 사체를 평평한 시트로 옮겨 액체 질소로 플래시를 고정 합니다. 이는 다음 동결 건조 과정에 대 한 높은 면적/부피 비를 보장 한다.
- 냉동 균 사체을 동결 건조 전에-80 ° c에서 보관 하십시오.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 밤새 균 사체을 동결 건조 한다.
- 균 사체 온도가 일정 하 게 유지 되 면 동결 건조 과정을 중지 합니다 (18 ~ 24 시간). 비 커를 제거 하 고 제공 된 스크류 캡으로 즉시 밀봉 하십시오.
참고: 단단히 밀봉 할 때, 동결 건조 균 사체 RT에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.
2. 탭 태그 HDAC의 단일 단계 보강 (Bayram 외 2012)12
- 버퍼 및 솔루션 준비
참고: 사용 하기 바로 전에 버퍼에 진단을 (EtSH) 및 프로 테아 제 억제제를 추가 하십시오. 0.22 µm 니트로 멤브레인을 통해 크로마토그래피에 사용 되는 모든 버퍼를 필터링 하 여 크로마토그래피 수 지에 불순물/오염을 도입 하지 않도록 합니다. 아래 단계의 지침은 각 버퍼의 1 L 준비를 참조 하십시오. 4 ° c에서 버퍼를 저장 합니다.- 추출 완충 액 (B250): 250 염화 나트륨, 100 mM 트리-HCl pH 7.5, 5Mmetsh의 0.1% (v/v 100)
- 12.35 g의 트리 스-HCl을 2.62의 트리 스 (무료 베이스) 및 탈 이온 수의 800 mL의 염화 나트륨 13.2 g을 넣고 10Ml(v/v) TX-100 용액 10ml를 첨가 한다.
- RT에서 pH를 확인 하 고 필요에 따라 NaOH 또는 HCl을 사용 하 여 pH 7.5으로 조정 하십시오.
- 최대 1l를 구성 하 고 0.22 µm 니트로 멤브레인을 통해 필터링 할 수 있습니다.
- 35 µ L의 EtSH를 사용 하기 바로 전에 100 mL의 완충 액 (5mm 최종 농도)에 추가 하십시오.
- 세척 완충 250 (WB250): 250 mM 염화 나트륨, 40 mM 트리-HCl pH 8.0, 5Mmetsh의 0.1 (v/v)
- B250에 대해 설명 된 바와 같이 WB250를 준비 하 되, 3.59 g의 트리-HCl과 2.08 g의 트리 (프리 베이스)를 사용 합니다.
- 세척 완충 150 (WB150): 150 mM 염화 나트륨, 40 mM 트리-HCl pH 8.0, 5Mmetsh의 0.1 (v/v)
- B250에 대해 설명 된 바와 같이 WB150를 준비 하 되, 3.59 g의 트리 트리-HCl을 2.08의 트리 트리 (유리 염기) 및 8.77 g의 염화 나트륨으로 제조 하였다.
- TEV 평형 완충 액 (TEV): 150 염화 나트륨, 40 mM 트리 스-HCl의 pH 8.0, 0.5 m-0.1, 5mm EtSH.
- WB150와 동일 하지만 EDTA를 0.5 최종 농도로 추가 합니다.
- Tev 절단 버퍼 (TCB): 150 mm 염화 염, 40 mm 인 트리 스-HCl의 pH 0.1 0.5 8.0, 5mm~10% (v/v) 글리세롤, 5mm etsh.
- 2.1.1 단계에서 설명 된 대로 준비 하 고 3.59 g의 트리 스-HCl을 2.08 g의 트리 (유리 염기) 및 염화 나트륨 8.77 g을 사용 하 여 부피를 1l로 조절 하기 전에 글리세롤의 100 mL을 첨가 한다.
- 50 × 프로 테아 제 억제제 칵테일: 시판 되는 프로 테아 제 억제제의 1 정을 1 mL의 물에 녹여-20°c에서 보관 한다.
- 50의 경우 트리 트리-HCl pH 7.6, 0.9%의 염화 나트륨, 0.1% (v) polysorbate
- 2.1.1 단계에서 설명한 대로 준비 합니다. 6.06 g의 트리 트리-HCl 1.40 g, 염화 나트륨 polysorbate, 1Ml의 1 mL를 사용 합니다.
- 5 × LSB (Laemmli 샘플 버퍼): 315 mM 트리 스-HCl pH 6.8, 105v(v/v) 글리세롤, 0.05% (v) 브로 모 페 놀 블루 .이 하에는 510(50 v/v)
- 추출 완충 액 (B250): 250 염화 나트륨, 100 mM 트리-HCl pH 7.5, 5Mmetsh의 0.1% (v/v 100)
- 단백질 추출 물의 제조
- 볼 밀의 분쇄 용기에 동결 건조 균 사체 분쇄 공을 1.5 g 추가 하십시오.
참고: 신선한 균 사체도 사용할 수 있습니다. 그렇게 할 때, 동결 전에 가능한 한 완전히 균 사체 건조 하 고 신선한 균 사체을 분쇄 하기 위한 액체 질소의 분쇄 항아리를 미리 냉각 해야 합니다. - 30 초 동안 25hz에서 균 사체 분말로 갈아 냅니다.
참고: 연 삭 기를 사용할 수 없는 경우에는 Bayram et al 에 설명 된 바와 같이 박격포와 유 봉 (균 사체)을 사용 하 여 분말로 갈아 냅니다. 12. - 균 사체 분말을 15 mL 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
- 그라운드 균 사체를 포함 한 원심 분리기 튜브를 기울여 버퍼와 균 사체의 후속 혼합을 허용 합니다.
- 균 사체 파우더 그램 당 1 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함 한 아이스 콜드 B250 6 mL를 첨가 하 고, 조 추출 물의 완전 한 균질 화를 달성할 때까지 작은 주걱으로 블렌딩 한다. 신선한 균 사체를 사용 하는 경우, Bayram et al 을 참조 하십시오. 12 . 추출 버퍼 비율에 적합 한 바이오 매스를 달성 한다.
- 튜브를 얼음에 5 분간 보관 하십시오.
- 튜브와 평형 튜브를 원심 분리기에 놓고 4만 × g 에서 4 ° c에서 20 분 이상 회전 합니다. 상기 원심 분리 시 IgG 수 지 (단계 2.3)의 평형을 수행 한다.
- 원심 분리 후, 상 청 액의 10 µ L을 제거 하 여 SDS-PAGE 분석을 한다. 40 µ의 물과 12.5 µ L의 5 × LSB를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 샘플을 놓습니다. 그림 1에서 "Ex" 라고 합니다.
- 세 혈 학 피 펫을 이용 하 여 상층 액 (제거 된 파쇄 물)을 조심 스럽게 제거한 후, 제공 된 말단 캡을 이용 하 여 긴밀 하 게 밀착 된 IgG 비드 (단계 2.3)를 포함 하는 칼럼 상에 전사 한다.
- 볼 밀의 분쇄 용기에 동결 건조 균 사체 분쇄 공을 1.5 g 추가 하십시오.
- IgG 수 지의 평형 화 (단계 2.2.7 중에 수행 됨)
- 열에 재현 탁 IgG 수 지 (50% 슬러리)의 10 mL 일회용 크로마토그래피 컬럼 및 pipet 300 µ L을 준비 한다. B250를 사용 하 여 열을 10ml로 채우고 버퍼가 중력을 통과 하도록 합니다.
- 1 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함 한 B250 1 mL를 첨가 하 고 흐르는 것을 보자. 기둥의 하단을 연결 합니다.
- 탭 태그 HDAC의 배치 정제
- 회전 믹서에서 2.2.9 단계부터 2 ~ 4 시간 동안 4°c에서 10rpm으로 평형 화 비드 및 제거 된 파쇄 물이 포함 된 크로마토그래피 컬럼을 배양 합니다.
- 배치 바인딩 후, 캡을 제거 하 고 아래쪽의 열을 열어 플로우 스루를 수집 합니다.
- 2.2.8 단계에서 설명한 대로 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플을 가져가 라. 그림 1에서 "FT" 라고 합니다.
- WB250 10ml의 구슬 세척. 먼저, 1 mL의 완충 액을 사용 하 여 칼럼 캡에서 트랩 된 비드를 제거 하 고이 현 탁 액을 침전 된 수 지에 한 플러시로 옮겨 구슬의 소생을 허용 합니다. 그런 다음 기둥을 상단에 채우고 스택 캡을 사용 하 여 닫은 후 연동 펌프에 연결 합니다. 유량을 약 1 ~ 5ml/min으로 조절 합니다. 수 지가 건조 하 게 작동 하지 않도록 합니다.
- 2.4.4 단계를 3 번 반복 하 여 총 4 회 세척을 WB250.
- 2.4.4 단계에서 설명한 바와 같이 10ml의 TEB로 비드를 세 번 씻으십시오.
- 하단에 있는 크로마토그래피 칼럼을 닫고, TCB 1 mL의 IgG 비드를 분해 하 고 50 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 20 µ, tev(~1~1mg/ml 스톡 S219V 돌연변이 변이체를 생성 하는 10 µ l)를 첨가 한다.
- 칼럼에 캡을 하 고 4 ° c에서 10 rpm으로 회전 혼합기에서 배양 하 여 태그 드 HDAC를 통해 결합 된 단백질 복합체를 용 출 시킨다.
참고: 또한 온도 (16~25°c)에서 TEV 다이제스트를 수행 하 여 반응 시간을 단축 시킬 수 있지만 단백질 분해의 위험을 높이는 것입니다. - 다음날 열을 열고 2 mL 원심 분리기 튜브에 용 출 액를 수집 합니다. 0.7 mL의 TCB를 사용 하 여 뚜껑에서 구슬을 제거 하 고 기둥의 벽을 헹 굽 니다.
- 그 자체가 50 mL 원심 분리기 튜브 내에 배치 되는 이전 단계에서 열린 2 mL 튜브에 컬럼을 놓습니다.
- 이 조립품을 테이블 상단 원심 분리기로 전송 하 고 2 분 동안 300 × g 에서 회전 시킵니다. 이것은 TEV 용 출 액.
주: 탠덤 선호도 정제를 수행할 때 cal모듈화 선호도 단계에 대 한 입력으로 TEV 용 출 액를 사용 합니다. 또한 TEV 용 출 액를 분할 하 고 HDAC 활동 결정을 위해 한 부분을 사용 하 고 두 번째 부분은 탭 정제를 완료 할 수 있습니다. - TEV 용 출 액에서 50 µ L을 제거 하 고 SDS 페이지 ( 그림 1 및 2에서 ' TE ' 라고 함)의 12.5 µ l을 추가 하 고 나머지 용 출 액을 얼음에 보관 하십시오.
- 프로 테아 제 용 출의 효능을 평가 하기 위해, 5%의 아세트산을 2 mL를 넣고 5 분간 RT에서 배양 한다. 다시, 첫 번째 mL을 사용 하 여 수 지를 소생 시킵니다.
- 산 용 출 액를 수집 하 고 다시 50 µ L 샘플을가지고 5 × LSB의 12.5 µ L을 추가 ( 그림 1에서 "AE" 라고 함). 산 성 용액에 첨가 하면 LSB 황색으로 바뀝니다. 산을 중화 시키기 위해 1 µ L의 단계에서 10 M NaOH를 추가 하 고 색상이 다시 파란색으로 바뀔 때까지 잘 섞어 줍니다.
- IgG 수 지를 TBS-T로 평형을 다시 하 여 산을 중화 시킵니다. 수 지를 4°c에서 TBS-T20v(v/v) 에탄올에 보관 하 여 동일한 태그 단백질로 재사용 하십시오.
- 용 출 분 획의 저장
- 용 출 액는 ~ 100 µ L 분 획으로 여러 동결-해 동 주기를 피하기 위해.
- 액체 질소의 분 취를 동결 하 고-80 ° c에서 유지 하십시오.
참고:이 방법으로 저장 된 샘플은 효소 활동을 잃지 않고 수개월 동안 안정적입니다.
3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에의 한 정제의 분석
- 표준 프로토콜을 사용 하 여 SDS 폴 리 아크릴 아 미드 겔을 주조 하거나 프리 캐스트 겔을 사용 합니다. 이전 섹션에서 5 분 동안 95 ° c에서 겔 샘플을 변성 하 고, ≥ 15000 × g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 12% 젤에 적재 합니다. 권장 되는 로드 볼륨은 그림 1의 범례에 나와 있습니다. 샘플을 1 × 트리 스-글리신의 SDS-PAGE 실행 버퍼에서 60 ~ 70 분간 일정 하 게 하 고, SDS-PAGE 로딩 버퍼의 브로 모 페 놀의 블루 마커가 겔 밖으로 마이그레이션하기 시작할 때까지 전 180.
- 젤의은 염색에는 표준 프로토콜을 사용 합니다. 예를 들어, Blum et al 프로토콜을 사용 합니다. 198714 는 MS 분석과도 호환 됩니다.
- 웨스턴 블로 팅15에 표준 프로토콜을 사용 합니다. 대표적인 결과의 생성을 위해, 시판 되는 블 롯 시스템을 사용 하였다.
- 시판 되는 항-cal모듈화 결합 단백질 (안티 CBP) 항 체를 포함 하는 프로브 블 롯은 4°c에서 하룻밤 동안 5%의 우유 분말로 밀크 파우더를 사용 한다.
참고: 안티-CBP 항 체는 TEV 절단 후 여전히 존재 하는 탭 태그의 부분에 대 한 지시. - Blots의 검색 및 개발에 표준 프로토콜을 사용 합니다. 예를 들어, 항-토끼 IgG-알칼리 성 인산 가수분해 효소 결합체 및 BCIP/NBT 색 개발 기질은 아래의 대표적인 결과의 생성을 위해 사용 되었다.
4. 시험관 내에서 사용 하는 데 아세틸 제 분석 [3 시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 망상 히 돌 (트 로 지에 적응 2003)4
- [3시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 망상 히 돌의 제조를 위해 kölle 외. 199816 의 프로토콜을 참조 하십시오.
- 분석 조건 당 3 개의 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 얼음에 넣고 삼중으로 측정 합니다. 또한 버퍼 전용 배경 제어를 위해 세 개의 튜브를 준비 합니다.
- 각 튜브에 WB150 25 µ L을 넣고 단계 2.4.11에서 TEV 용 출 액의 25 µ L을 추가 하 고 얼음을 유지 합니다.
- 튜브 인큐베이터를 25°c로 예 열 합니다.
- 각 튜브에 라벨링 된 하이 스톤 [1.5 밀리 리터]의 10 µ L을 추가 하기 위해 15 초 간격 (스톱 워치)을 사용 하십시오.
- 분석을 시작 하기 전에 [3시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 히 돌의 10 µ l을 차지 하 고 스톱 워치를 시작 합니다.
- 시작 후 5 초 후에 레이블이 붙은 histones를 추가 하 고 튜브를 단단히 닫고 소용돌이를 인큐베이터에 넣습니다.
- 레이블이 지정 된 히스톤의 10 µ l을 추가 하기 위해 15 초 간격을 사용 하 고 이전 단계에서 설명한 대로 진행 합니다.
- 60 분 인큐베이션 후에 각 튜브에 15 초 간격으로 50 µ L의 스톱 용액 (1m HCl/0.4m 아세트산)을 첨가 한다. 소용돌이가 즉시. 산 성 용액의 첨가 후, 어 세이 믹스는 안정 하 고 다음 단계까지 RT에서 유지 될 수 있다.
- 각 튜브에 800 µ L의 에틸 아세테이트를 첨가 하 여 방출 된 [3시간] 아세트산을 추출 한다.
- 5 초 동안 튜브와 소용돌이 각 튜브를 단단히 닫습니다.
- 튜브를 마이크로 원심 분리기에 넣고 RT에서 10 분 동안 1만 × g 로 돌립니다.
- 그 동안에, 분석 샘플 당 하나의 섬광 유리병을 준비 하 고 소수 성 샘플에 대 한 3 mL의 섬광 칵테일을 추가 합니다.
- 원심 분리 후 (단계 2.12), 상부 유기 물의 600 µ L을 준비한 섬광 관에 조심 스럽게 전달 하 고 튜브를 단단히 닫습니다.
- 액체 섬광 카운터에서 HDAC 활성에 상응 하는 방사능을 측정 한다.
Representative Results
RpdA의 제시 된 단일 단계 농축의 전형적인 결과는 도 1 에 나타나 있다 (' IgG ' 라 함). 완전성을 위해서, 우리는 또한도12에 기술 된 바와 같이 cal모듈화 수 지 (CaM)에의 한 제 2 정제 단계를 설명 하는 흐름 스루 및 용 출 분 획 (' cft ' 및 ' CE ')을 포함 시켰다. 표시 된 실버 스 테 인 젤 (A)은 탠덤 정제를 수행 하였을 때 더욱 증가 되는 제 1 친화성 단계의 효능을 명확 하 게 나타낸다. 단백질 추출 물에 존재 하는 가장 두드러진 단백질 및 흐름-스루, 그러나, 이미 TEV 용 출 액 (TE)에서 고갈 된다. TEV 용 출 분 획은 추출 물 및 흐름 통과에 비해 100 × 농축 > 것을 주목 하는 것이 중요 하다. 별표 태그는 RpdA (비교 패널 B)에 표시 됩니다. 상기 CBP를 포함 하는 RpdA의 산출 된 MW는 82 kDa 이지만, 단백질은 약 120 kDa의 훨씬 더 높은 겉보기 분자량에서 마이그레이션합니다. 이러한 현상은 이전에 관찰 되었으며 C-말단4,17의 특정 성질에 할당 될 수 있다. 면역 세포 (B)는 tev 용 출 액에 해당 하는 cbp 태그 풀 길이 RpdA (RPDA: cbp)에 상응 하는 약 120 kDa에서 이동 하는 강력한 신호를 표시 하 고, 칼 모듈 린 흐름 스루 (' cft ') 및 용 출 액 분 획을 나타낸다. 산 용 출 액 ("AE")에서 약간 큰 MW의 두 번째 신호가 보입니다. 이는 TEV 절단에 의해 방출 되지 않은 IgG 수 지에 결합 된 탭 태그 RpdA의 비율을 나타낸다. 크기의 차이는 단백질의 16 kDa에 해당 합니다. 절단 되지 않은 RpdA의 반복:: 누릅니다. 예상 대로, 야생 형 제어 분 획에서 항-CBP 항 체에 의해 어떤 밴드가 검출 될 수 없다 (패널 B, ' 와일드 타입 ').
특정 HDAC 억제제 인 트리 코 스타 틴 A (TSA)를 사용한 대표적인 디 아 세 틸 제 활성 분석의 결과를 도 2에 표시 하였다. 이 분석은 본래 식물 (18 )을 위해 개발 되었으며 또한 포유류 디 아 세 틸 아 제19,20에 대 한 억제제 스크리닝에 사용 되어 왔다. 상기 검정에 사용 되는 히 돌을 표지 하 고, 상기 기재 된16과 같이 제조 하였다. 농축 된 RpdA 복합체 ("TE ± TSA")의 촉매 활성에 대 한 TSA의 농도가 증가 하는 효과를 나타내 었 다. 활동의 민감도는 측정 된 cpm 값이 실제로 RpdA에 기인 하 고 비 특이 적 프로 테아 제 활성에의 한 것이 아니라는 것을 확인 합니다. 이것은 다소 높은 농도로 존재 하는 TEV가 HDAC 활성 분석을 방해 하지 않음을 나타내는 중요 한 관찰입니다. 측정 된 HDAC 활성을 RpdA에 할당 하기 위해 야생 형 스트레인을 음성 대조 군 ("Co")으로 사용 하였다. 예상 대로 야생 유형의 TEV 용 출 액에서 한계 HDAC 활성 (RpdA 농축 분 획의 약 5-10%)만 검출 되었습니다. 흥미롭게도, TEV 용 출 액에 비하여 HDAC 활성은 두 번째 친화성 정제 단계 (' CE ') 후 현저히 감소 한다.
그림 1입니다. 탠덤 선호도 청교도 탭 태그 RpdA의. 실버 스 테 인 10%의 SDS 폴 리 아크릴 아 미드 겔 (a) 및 항-CBP 항 체 (B)를 사용한 웨스턴 블 롯 프로 베드가 표시 된다. 차선 라벨링 및 로드 볼륨은 다음과 같습니다: "M" 1:10 희석 된 미 염색 단백질 마커 (은 얼룩), 3.5 µl의 프리 스 테 인 단백질 마커 (웨스턴 블 롯); "Ex": 2.2.8 단계에서 제조 된 단백질 추출 시료 (2 µl의 1:10 희석, 5 µl); 「 FT 」: IgG 수 지는 단계 2.4.3에서 제조 된 플로 스루 시료 ( µ1:10 희석 액, 5 µl); 「 AE 」: 2.4.14 용 출 액의 산 성 ( 10µl, 10 µl); 「 TE 」: tev 용 출 액에의 한 용 출의 TEV의 절단, 스텝 2.4.12 (10µ l, 10µ l); "CFT": 칼 모듈 렌 흐름을 통해 (20 µ µ L); 용 출 액 10µ, 10µ L)을 제공 합니다. 선택 된 마커 단백질의 크기는 패널의 좌측에 표시 된다. 괄호 안에 지정 된 체적은 각각 은색 얼룩 및 웨스턴 블 럿의 샘플 하 중에 해당 합니다. 실버 스 테 인 젤의 별표는 RpdA 융합 단백질을 나타냅니다. 면역 세포 (B)는 bcip/nbt 색 개발 시스템을 사용 하 여 알칼리 인산 가수분해 효소로 검출 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 트리 코 스타 틴 A의 증가 농도 하에서 HDAC 활성 분석. RpdA 저해의 효능은 RPDA-1640 배지에 희석 된 HDAC 억제제의 µ, 50 및 500 nM의 친화성-정제 된 재조합 RpdA ("TE")와 25µ l로 시험 하였다. RPMI는 백그라운드 활동 ("공백")을 평가 하는 데 사용 되었습니다. 제 2 cal모듈화 친화성 단계 (' CE ') 및 첫 번째 친화성 정제 단계 후의 태그 없는 변형 후의 최종 용 출 액의 활동 (음성 대조 군, ' Co ')이 표시 된다. 활동은 TSA (100%)가 없는 농축 된 RpdA의 비율로 표시 됩니다. 오차 막대는 3 개의 복제의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 바 우 어 외. 20162에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
이 프로토콜은 시험관 내 데 아 세 틸 제 활성의 평가를 위해 탭 태그 클래스 1 HDAC를 사상 균 류 a. nidulans 로부터 단일 단계 보강을 설명 합니다. 탭 태그는 태그 된 단백질6의 단백질-단백질 상호 작용 파트너의 식별을 위해 베이커의 효 모에서 처음 소개 되었습니다. 이어서, 태그는 a. nidulans 에서의 그것의 사용에 대 한 코 돈 최적화 되었다 5. 여기서 우리는 클래스 1 HDAC RpdA의 단일 단계 보강을 위한 탭 전략의 제 1 친화성 정제 단계의 적용을 위한 스트레이트 포워드 단계별 프로토콜을 제공 한다. 두 번째 친화성 정제 단계는 정제의 수준을 명확 하 게 증가 시키며,이는 미끼-상호작용 단백질의 동정에 특히 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, 첫 번째 단계는 후속 활성 테스트를 위해 권장 되며, 이후 첫 번째 단계 이후 상당한 오염의 결여는 야생 형 균 주를 이용한 대조 실험에 의해 확인 되었다. 또한, 용 출 활동은 전체 탭과 비교 했을 때 단일 단계 농축 후 상당히 더 높습니다. RpdA2외에도,이 프로토콜은 또한 제 2 클래스 1 Hdac hosa21의 . 니 둘 란 스 복합체의 정제를 위해 성공적으로 사용 되었다.
때문에 곰 팡이 클래스 1 HDACs는 안정 된 단지를 구축 우리의 관측4, 우리는 bayram 외에 의해 프로토콜을 수정 하는 데 성공 했습니다 . 201212 이 방법의 기초를 나타냅니다. 그럼에도 불구 하 고 몇 가지 중요 한 단계를 언급 해야 합니다. 고도로 농축 된 단백질 추출 물의 제조는 복잡 한 안정성을 위해 매우 중요 한 생리 적 상태를 보장 합니다. 따라서 바이오 매스/추출 완충 액 비율에 관한 주어진 권장 사항을 염두 하는 것이 중요 합니다. 이러한 측면에서, 적절 한 추출을 보장 하기 위해 잘 분쇄 된 미세한 균 사체 분말을 사용 하는 것도 중요 합니다. 여기서, 연 삭 기의 사용은 명백 하 게 유리 하다. 상기 프로토콜 섹션에서 언급 한 바와 같이, 정제 속도를 높이기 위해 실 온에서 1-2 h에 대 한 TEV-절단 단계를 시도 하는 것이 가치가 있다. 이는 안정성에 대 한 해로운 영향을 관찰 하지 않고 RpdA에 대해 테스트 되었습니다 (미 출판 관찰, 바 우 어 I, 2018). 또한 NP40 (원래 프로토콜에서 사용 100)의 교체는 다른 단백질 복합체에 적합 하지 않을 수 있습니다. 다른 탭 태그 단백질의 정제를 위해이 방법을 사용 하는 경우, 또 다른 단백질 복합체의 충분 한 정제에 도움이 될 수 있는 유용한 힌트의 번호를 포함 하는 Bayram 프로토콜을 참조 해야12.
여기에 설명 된 탭 방법 외에도, 다른 선호도 태그 및 기술은 일반적으로 그의-및 GFP 태그를 포함 하 여 사상 균 류의 단백질의 단일 단계 농축에 사용 됩니다. 그러나 1 급 HDACs는 일반적으로 고 분자량 복합체로 서 기능적으로 작용 하므로, 기본 용 리 조건은 촉매 활성 HDACs의 농축을 위한 전제 조건입니다. 중요 한 것은, 다른 많은 친화도는 불리 한 조건 하에서 수행 됩니다. 예를 들어, 항 원 항 체 상호작용을 기반으로 하는 GFP 덫을 통한 HDACs의 농축은 수 지에 결합 된 HDACS 복합체의 단백질 단백질 상호작용을 방해 하는 산 성 용 출 조건 때문에 적합 하지 않습니다. 더욱이, 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (22)에 의해 그의 태그 rpda를 정제 하려는 시도는 낮은 pH 조건을 대신 하 여 이미 다 졸이 용 출을 위해 사용 되었으나 정화 과정 중에 촉매 활성의 현저한 손실을 초래 하였다 ( 게시 되지 않은 데이터, 바 우 어, I, 2010).
설명 된 효소 분석 프로토콜의 한 가지 제한은 방사성 기질을 사용 하는 것 이다. 그러나 형광에의 한 분석 법은23,24 로 개발 되어 시판 되 고 있다. 이러한 분석은 웰 플레이트에서 수행 되므로 HDAC 억제제의 고 처리량 스크리닝에도 적합 합니다. 이 경우, 제시 된 절차의 고급이 필요 합니다.
이 프로토콜의 잠재적으로 다가오는 응용 프로그램은 그들의 특정 생리 적인 역할 및/또는 HDACS 억제제에 그들의 감수 성에 차이 평가 하기 위해 클래스 1 HDACs의 특정 하위 복합체의 농축을 포함 한다. 다른 효소에 대해 설명 된 방법을 확립 할 때 태그 없는 변형을 사용 하 여 네거티브 컨트롤 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 이는 측정 된 효소 활동의 특이성을 보장 하 고 비 특이 적으로 결합 된 효소에의 한 오염을 드러낼 것입니다.
여기에 기재 된 정제 및 활성 분석은 2 일 이내에 수행 될 수 있고 농축 된 효소는-80 ° c에서의 ali쿠오 트에 저장 될 때 적어도 몇 개월 동안 안정 하다. 결론적으로,이 프로토콜은 활성 측정 및 억제제 효능의 결정을 위해 클래스 1 HDAC 복합체를 달성 하는 비교적 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는이 원고에 대 한 그녀의 도움과 지원에 대 한 분자 생물학 (바이오 센터, 인스부르크의과 대학)의 부문 페트라 Merschak에 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 그들의 귀중 한 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 고 싶습니다.
이 사업은 오스트리아 과학 기금 (P24803와 P21087에서 GB)과 교내 자금 조달 (MUI 스타트, ST201405031에서 IB)에 의해 지원 되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
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