Summary
Klasse 1 histone deacetylases (HDACs), zoals RpdA hebben opgedaan belang als potentiële doelstellingen voor de behandeling van schimmelinfecties. Hier presenteren we een protocol voor de specifieke verrijking van TAP-Tagged RpdA gecombineerd met een HDAC activiteit assay die het mogelijk maakt in vitro effectiviteit testen van histone deacetylase remmers.
Abstract
Klasse 1 histone deacetylases (HDACs) als RpdA hebben opgedaan belang als potentiële doelstellingen voor de behandeling van schimmelinfecties en voor het genoom mijnbouw van schimmel secundaire metabolieten. Remmer screening, echter, vereist gezuiverd enzymactiviteiten. Aangezien klasse 1 deacetylases hun functie als multieiwit complexen uitoefent, zijn zij gewoonlijk niet actief wanneer uitgedrukt als enige poly peptides in bacteriën. Daarom, endogene complexen moeten worden geïsoleerd, die, wanneer conventionele technieken zoals ionenwisseling en grootte uitsluiting chromatografie worden toegepast, is moeizaam en tijdrovend. Tandem affiniteit zuivering is ontwikkeld als een instrument om multieiwit complexen te verrijken uit cellen en dus bleek te zijn ideaal voor de isolatie van endogene enzymen. Hier verstrekken wij een gedetailleerd protocol voor de enige-stap verrijking van actieve RpdA complexen via de eerste reinigingsstap van C-terminaal kraan-geëtiketteerde RpdA van Aspergillus nidulans. De gezuiverde complexen kunnen vervolgens worden gebruikt voor de daaropvolgende remmer screening toepassing van een deacetylase assay. De eiwit verrijking samen met de enzymatische activiteiten analyse kan binnen twee dagen worden voltooid.
Introduction
Histone deacetylases (HDACs) zijn Zn2 +-afhankelijke hydrolytische enzymen geschikt voor het verwijderen van acetyl groepen van lysine residuen van histonen en andere eiwitten. Gebaseerd op de opeenvolgings gelijkenis, zijn HDACs gegroepeerd in verscheidene klassen1. Onlangs is de schimmel klasse 1 HDAC RpdA, een ortholog van bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, bleek essentieel te zijn voor de opportunistische schimmelziekte verwekker Aspergillus gassus2. Daarom, RpdA heeft opgedaan belang als een potentieel doelwit voor de behandeling van schimmelinfecties2. Beoordeling van deacetylase activiteit in vitro is belangrijk voor de karakterisering van enzymatische eigenschappen en maakt het mogelijk om de effectiviteit van nieuwe stoffen voor remmer ontwikkeling te bepalen. Hoewel de recombinante uitdrukking van een codon-geoptimaliseerde versie van menselijke HDAC1 in Escherichia coli onlangs3is gemeld, pogingen om volledige lengte RpdA in deze gastheer uit te drukken ontbrak4. Bovendien, omdat schimmel klasse 1 HDACs zoals RpdA en HosA oefenen hun functie als multieiwit complexen, is het gunstig om native endogene complexen te gebruiken voor enzymatische remmer studies. Echter, als gevolg van remming van factoren en de aanwezigheid van verschillende HDACs in schimmel lysaten, katalytische activiteit gemeten in hele eiwitextracten is relatief laag en kan niet worden toegewezen aan individuele enzymen. Bovendien, eerdere studies in de gloeiende schimmel a. nidulans geïdentificeerd een klasse 2 HDAC, HdaA, als overheersende deacetylase in chromatografie fracties van schimmel extracten. Aldus, zijn de veelvoudige conventionele chromatografie reinigingsstappen nodig om niet-HdaA activiteit van schimmelstammen4te scheiden. De introductie van de tandem affiniteit zuivering (TAP) strategie in A. nidulans5 heeft de verrijking van specifieke deacetylase activiteiten aanzienlijk vergemakkelijkt. De originele Tik tag is samengesteld uit twee eiwitten een domeinen en een calmodulin bindende peptide (CBP) gescheiden door een tabak etch virus protease (TEV) splitsing site6. Dit zorgt voor native reiniging en elutie van gecodeerde eiwitten met inbegrip van hun interactiepartners7. Wanneer het gebruiken van de verrijkte proteïnen voor activiteiten analyses, is milde elutie onder inheemse voorwaarden door protease splitsing een belangrijk kenmerk van de reiniging van de kraan markering. Een GFP-geëtiketteerde proteïne, bijvoorbeeld, kan door gemobiliseerde antilichamen eveneens worden verrijkt, echter, kan niet onder inheemse voorwaarden worden geëlueerd.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de single-stap verrijking van actieve RpdA complexen via de eerste reiniging stap van C-terminaal TAP-Tagged RpdA van a. nidulans (IgG scheiding en TeV splitsing) voor de volgende remmer screening toepassing van een histone deacetylase assay. Zoals bleek te zijn voldoende, affiniteit verrijking werd beperkt tot slechts een zuivering stap ook omdat de enzymatische activiteit aanzienlijk werd verminderd na twee-staps TAP zuivering in vergelijking met IgG zuivering alleen.
Toch moet het ingevoerde protocol ook van toepassing zijn voor de verrijking van andere gelabelde enzymen die betrokken zijn bij Chromatin regulering, zoals acetyltransferases, methyltransferases, en demethylases. Door de tweede reinigingsstap van het TAP protocol toe te voegen, kunnen eiwitten die samen met de gelabelde aas worden gereinigd, beschouwd worden als complexe partners van (nieuwe) enzymatische complexen.
Protocol
1. teelt van A. nidulans
- Entmateriaal voorbereiding
Nota: alle stappen behalve de incubatie zouden onder een laminaire stroom kabinet moeten worden uitgevoerd.- Streak uit TAP spanning (bijv. TIB 32.12) van de glycerol voorraad (-80 °c) op glucose/XYLOSE minimum middel (GXMM; per liter: 10,0 g van glucose, 0,5 g van xylose, 10 ml van 1 M di-ammonium Tartrate oplossing, 20 ml van 50 × zoute oplossing [per liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml chloroform], 1 ml 1.000 × Hutner spoorelementen8) met inbegrip van 1,5% (w/v) agar en de vereiste supplementen zoals beschreven door Todd et al. 20079. Incubeer voor 2 – 3 dagen bij 37 °C.
Opmerking: TIB 32.1 bevat een rpdA:: tap Fusion gecontroleerd door een xylose-afleidbaar promotor, xylP(p)10. Dit is de reden waarom xylose is opgenomen in het bovenstaande recept. Weglaten xylose bij het kweken van stammen uitdrukken van constructen die niet onder xylP(p) controle. - Bereid een steriele 1,5 mL centrifugebuis met 1,5 mL steriele conidial Suspension Solution (CSS; 0,9% (w/v) NaCl, 0,01% (v/v) polysorbaat 80).
- Natte een wegwerp inentings lijn in CSS, schraap van conidiën van de plaat van stap 1.1.1 en schort in de buis van stap 1.1.2 op.
- Overdracht 150 µ L elk van conidial opschorting aan 10 25 cm2 de cultuur kolven van de cel met opening GLB die GXMM agar met inbegrip van supplementen en 200 µ l van CSS bevat.
- Spreid de conidial suspensie in de kolven uit met een steriele inentings lus en broed de kolven bij 37 °C gedurende 2 – 3 dagen uit.
- Gebruik 10 mL CSS per kolf om de conidiën te oogsten. Giet de oplossing in een kolf, sluit de kolf stevig af met de meegeleverde schroefstop en schud de kolf krachtig.
- Na het bevochtigen van de schimmel oppervlak, volledig Schraap de resterende conidiën met een steriele inenting lus.
- Pass conidiën door 40 µm Cell Strainers geplaatst op een steriele 50 mL centrifugebuis en het verzamelen van de schorsing van vijf kolven in een buis.
- Centrifugeer de buis bij 1.000 × g voor 10 min.
- Decanteer de bovendrijvende en hersuspendeer de pellet in 10 mL CSS per tube.
- Verzamel beide schorsingen in een buis, spoel de lege buis met 40 mL van CSS, toe te voegen aan de schorsing, en centrifugeren zoals beschreven in stap 1.1.9.
- Decanteer de bovendrijvende en hersuspendeer de conidial pellet in 4 mL CSS.
- Bereid twee seriële 1:50 verdunningen van de conidial schorsing en bepaal het aantal conidiën in de resulterende 1:2, 500-verdunde schorsing met een tellende kamer zoals beschreven11.
- Streak uit TAP spanning (bijv. TIB 32.12) van de glycerol voorraad (-80 °c) op glucose/XYLOSE minimum middel (GXMM; per liter: 10,0 g van glucose, 0,5 g van xylose, 10 ml van 1 M di-ammonium Tartrate oplossing, 20 ml van 50 × zoute oplossing [per liter: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2po4, 1 ml chloroform], 1 ml 1.000 × Hutner spoorelementen8) met inbegrip van 1,5% (w/v) agar en de vereiste supplementen zoals beschreven door Todd et al. 20079. Incubeer voor 2 – 3 dagen bij 37 °C.
- Groei en oogsten van mycelia
- Tijdens het werken onder een laminaire stromings kast, inoculeren een-liter kegelvormige kolven elk met 250 mL van GXMM met inbegrip van passende supplementen bij een dichtheid van 5 × 106 conidiën/ml en Incubeer bij 180 rpm bij 37 °c voor 14 – 16 h.
- Leg de kaasdoek in een trechter bovenop een kolf en filtreer de mycelia door het doek. Was kort met deioniseerde water.
- Verwijder zo veel mogelijk vocht door het knijpen van de mycelia gevangen in de kaasdoek tussen eerst de handen en vervolgens papieren handdoeken.
- Breng de gedroogde mycelia als platte vellen op een plastic bekertje met een schroefdeksel en flits bevriezen met vloeibare stikstof. Dit zorgt voor een hoge oppervlakte/volumeverhouding voor de volgende lyofilisatie proces.
- Bewaar de bevroren mycelia bij-80 °C voorafgaand aan lyofilisatie.
Opmerking: het protocol kan hier worden onderbroken. - Lyophilize de mycelia 's nachts.
- Stop het Vries-drogende proces wanneer de temperatuur van mycelia constant blijft (18 – 24 h). Verwijder de bekers en sluit onmiddellijk af met de meegeleverde schroef doppen.
Opmerking: bij goed verzegeld, gelyofiliseerde mycelia kan worden opgeslagen voor meerdere weken op RT.
2. single-stap verrijking van TAP-Tagged HDAC (aangepast van Bayram et al. 2012)12
- Voorbereiding van buffers en oplossingen
Nota: Voeg 2-mercaptoethanol (Stéphanie) en protease inhibitors toe aan buffers direct voorafgaand aan gebruik. Filter alle buffers die voor chromatografie door 0,22 µm nitrocellulose membranen worden gebruikt om introductie van onzuiverheden/verontreinigingen aan de chromatografie hars te vermijden. Instructies in de onderstaande stappen verwijzen naar de voorbereiding van 1 L van elke buffer. Store buffers bij 4 °C.- De buffer van de extractie (B250): 250 mM NaCl, 100 mM tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie.
- Los 12,35 g van tris-HCl, 2,62 g van tris (vrije basis) op, en 13,2 g van NaCl in 800 mL van geioniseerd water en voeg 10 mL van een 10% (v/v) TX-100 oplossing toe.
- Controleer de pH bij RT en pas zo nodig aan op pH 7,5 met ofwel NaOH of HCl [5 M].
- Maak tot 1 L en filtreer door een 0,22 µm nitrocellulose membraan.
- Voeg 35 µ L van Stéphanie per 100 mL buffer (5 mM eindconcentratie) direct voorafgaand aan het gebruik.
- Wassen buffer 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie.
- Bereid WB250 voor zoals beschreven voor B250 (2.1.1) maar met 3,59 g van tris-HCl, en 2,08 g van tris (vrije basis).
- Wassen buffer 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie.
- Bereid WB150 voor zoals beschreven voor B250 (2.1.1) maar met 3,59 g van tris-HCl, 2,08 g van tris (vrije basis), en 8,77 g van NaCl.
- TEV evenwicht buffer (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie.
- Zelfde als WB150, maar Voeg EDTA tot 0,5 mM uiteindelijke concentratie.
- TEV splijt buffer (TCB): 150 mM NaCl, 40 mM tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA, 0,1% (v/v) TX-100, 10% (v/v) glycerol, 5 mM Stéphanie.
- Bereid zoals beschreven in stap 2.1.1 met 3,59 g van tris-HCl, 2,08 g van tris (vrije basis), en 8,77 g van NaCl voor en voeg 100 mL van glycerol toe alvorens het volume aan 1 L aan te passen.
- 50 × proteaseremmer cocktail: Los 1 Tablet van een commercieel beschikbare cocktail van proteaseremmers in 1 mL water en op te slaan bij-20 ° c.
- TBS-T: 50 mM tris-HCl pH 7,6 (RT), 0,9% (w/v) NaCl, 0,1% (v/v) Polysorbaat 20.
- Bereid zoals beschreven in stap 2.1.1. Gebruik 6,06 g van tris-HCl, 1,40 g van tris (vrije basis), 9 g van NaCl, en 1 mL van Polysorbaat 20.
- 5 × LSB (Laemmli steekproef buffer): 315 mM tris-HCl pH 6,8 (RT), 25% (v/v) Stéphanie, 50% (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS, 0,05% (w/v) bromophenol blauw.
- De buffer van de extractie (B250): 250 mM NaCl, 100 mM tris-HCl pH 7,5 (RT), 0,1% (v/v) TX-100, 5 mM Stéphanie.
- Bereiding van eiwit extract
- Voeg 1,5 g van gelyofiliseerde mycelia en een slijpen bal in de slijpen pot van een bal molen.
Opmerking: verse mycelia kan ook worden gebruikt. Droog de mycelia zo goed mogelijk voor het invriezen en zorg ervoor dat de slijp potten in vloeibare stikstof voor het slijpen van verse mycelia worden voorgekoeld. - Grind mycelia tot poeder bij 25 Hz voor 30 s.
Opmerking: in gevallen waar geen slijpmachine beschikbaar is, grind mycelia tot een poeder met behulp van een mortel en stamper, zoals beschreven door Bayram et al. 12. - Breng mycelium poeder over naar een 15 mL centrifugebuis.
- Kantel de centrifugebuis met inbegrip van gemalen mycelia om latere mengen van mycelia met buffer mogelijk te maken.
- Voeg 6 mL ijskoude B250 met inbegrip van 1 × proteaseremmer cocktail per gram mycelium poeder en meng met een kleine spatel tot volledige homogenisering van de ruwe extract wordt bereikt. Bij het gebruik van verse mycelia, verwijzen naar Bayram et al. 12 om de juiste biomassa te bereiken voor de extractiebuffer ratio.
- Houd de buis op het ijs voor 5 minuten.
- Plaats de buis en een balans buis in een centrifuge en draai bij 40.000 × g voor ≥ 20 min bij 4 °c. Voer evenwicht van IgG hars (stap 2,3) tijdens de centrifuge.
- Na centrifugeren, verwijder 10 µ L van de bovendrijvende voor SDS-pagina analyse. Plaats het monster in een 1,5 mL buis met 40 µ L water en 12,5 µ L van 5 × LSB; "ex" genoemd in Figuur 1.
- Verwijder zorgvuldig de bovendrijvende (gewist lysate) met behulp van een serologische pipet en de overdracht op de kolom met de geëquilibreerd IgG kralen (stap 2.3) en strak dicht met behulp van de meegeleverde eind dop.
- Voeg 1,5 g van gelyofiliseerde mycelia en een slijpen bal in de slijpen pot van een bal molen.
- Evenwicht van IgG-hars (uitgevoerd tijdens stap 2.2.7)
- Bereid een 10 mL wegwerp Chromatografiekolom en pipet 300 µ L van well-resuspended IgG hars (50% drijfmest) in de kolom. Vul de kolom in op 10 mL met B250 en laat de buffer door de zwaartekracht stromen.
- Voeg 1 mL B250 met inbegrip van 1 × proteaseinhibitor cocktail toe en laat doorstromen. Sluit de onderkant van de kolom.
- Batch reiniging van TAP-Tagged HDAC
- Incubeer de Chromatografiekolom met de geëquilibreerd kralen en de ontruimde lysate van stap 2.2.9 op een roterende mixer bij 10 rpm bij 4 °C voor 2 – 4 h.
- Na de batch bindend, verwijder de dop en open de kolom aan de onderkant van de flow-through te verzamelen.
- Neem een steekproef voor SDS-pagina analyse zoals die in stap 2.2.8 wordt beschreven; aangeduid als "FT" in Figuur 1.
- Was kralen met 10 mL WB250. Gebruik eerst 1 mL buffer om opgesloten kralen uit de kolom dop te verwijderen met behulp van een pipetter en breng deze suspensie in één flush over op het vaste hars zodat de kralen opnieuw kunnen worden geschorst. Dan vul de kolom naar de top, sluiten met behulp van een stack Cap en maak verbinding met een peristaltische pomp. Stel een debiet van ca. 1 – 5 mL/min. voorkomen dat de hars droog loopt.
- Herhaal stap 2.4.4 drie maal voor een totaal van vier wasbeurten met WB250.
- Was de kralen drie maal met 10 mL TEB zoals beschreven in stap 2.4.4.
- Sluit de Chromatografiekolom aan de onderkant, opnieuw op te schorten IgG kralen in 1 mL van TCB, en Voeg 20 µl van 50 × proteaseremmer cocktail evenals 10 µ l van TeV (~ 1 mg/ml voorraad, S219V Mutant variant geproduceerd in-House).
- Cap de kolom en incubeer op een roterende mixer bij 10 rpm bij 4 ° c 's nachts te elueer de eiwitcomplexen gebonden via de gecodeerde HDAC.
Opmerking: als alternatief uit te voeren TEV Digest bij verhoogde temperatuur (16-25 ° c), die de reactietijd vermindert, echter, is het verhogen van het risico van eiwit degradatie. - Op de volgende dag open de kolom en het verzamelen van de eluaat in een 2 mL centrifugebuis. Gebruik 0,7 mL TCB om kralen uit de dop te verwijderen en de wand van de kolom te spoelen.
- Plaats de kolom op de open 2 mL buis van de vorige stap die zelf is geplaatst binnen een 50 mL centrifugebuis.
- Breng deze montage in een tafelblad centrifuge en draai bij 300 × g voor 2 min. Dit is de TEV eluaat.
Opmerking: gebruik bij het uitvoeren van de tandem affiniteit zuivering de TEV eluaat als input voor de calmodulin affiniteit stap. U ook splitsen de TEV eluaat en gebruik een deel voor HDAC activiteit bepaling en het tweede deel aan de TAP zuivering te voltooien. - Verwijder 50 µ L van TEV eluaat en voeg 12,5 µ L van 5 × LSB voor SDS-pagina toe (die als "TE" in cijfers 1 en 2wordt bedoeld) en houd de resterende eluaat op ijs.
- Om de werkzaamheid van protease elutie te beoordelen, voegt u 2 mL 5% (v/v) azijnzuur toe en Incubeer bij RT gedurende 5 min. Nogmaals, gebruik de eerste mL om de hars opnieuw op te schorten.
- Verzamel de zure eluaat en opnieuw nemen 50 µ L monster en voeg 12,5 µ L van 5 × LSB (aangeduid als "AE" in Figuur 1). LSB zal geel worden wanneer toegevoegd aan de zure oplossing. Om het zuur te neutraliseren, voeg 10 M NaOH in stappen van 1 µ L toe en meng goed tot de kleur in blauw opnieuw verandert.
- Re-equilibrate de IgG hars met TBS-T om het zuur te neutraliseren. Bewaar de hars in TBS-T/20% (v/v) ethanol bij 4 °C voor hergebruik met dezelfde gelabelde eiwitten.
- Opslag van elutie fracties
- Hoeveelheid van de eluaat in ~ 100 µ L fracties, om meerdere Freeze-dooi cycli te voorkomen.
- Bevriezen van de hoeveelheid vloeibare stikstof en houd bij-80 °C.
Opmerking: monsters opgeslagen op deze manier zal stabiel zijn voor maanden zonder verlies van enzymatische activiteit.
3. analyse van reiniging door SDS-pagina en het westelijke bevlekken
- Gebruik standaardprotocollen voor het gieten van SDS-Polyacrylamide gels of gebruik precast gels13. Denature gel monsters van de vorige sectie bij 95 ° c voor 5 min, centrifuge op ≥ 15.000 × g voor 5 min, en de belasting op 12% gels. Aanbevolen laad volumes worden gegeven in de legende van Figuur 1. Electrophorese de monsters in 1 × tris-Glycine SDS-pagina Running buffer op 180 V constante voor 60 – 70 min, totdat de bromophenol Blauwe marker van de SDS-pagina laden buffer begint te migreren uit de gel.
- Gebruik standaardprotocollen voor zilver kleuring van de gels. Gebruik bijvoorbeeld het Protocol van Blum et al. 198714 dat is ook compatibel met MS Analysis.
- Gebruik standaardprotocollen voor het westelijke bevlekken15. Voor de generatie van representatieve resultaten hieronder, werd een commercieel beschikbare Bevlekkende systeem gebruikt.
- Sonde vlekken met in de handel verkrijgbare anti-calmodulin bindende proteïne (anti-CBP) antilichaam in 5% (w/v) melkpoeder in TBS-T bij 4 °C 's nachts.
Opmerking: anti-CBP antilichaam is gericht tegen het deel van de TAP-tag nog steeds aanwezig na TEV splitsing. - Gebruik standaardprotocollen voor opsporing en ontwikkeling van blots. Bijvoorbeeld, anti-Rabbit IgG-alkaline fosfatase geconjugeerde en een BVIE/NBT kleurontwikkeling substraat werden gebruikt voor de generatie van representatieve resultaten hieronder.
4. deacetylase assay met behulp van in vitro [3H] acetaat-gelabelde kip reticulocyte histonen (aangepast van Trojer et al. 2003)4
- Refereer naar het Protocol van Kölle et al. 199816 voor de bereiding van [3H] acetaat-gelabelde kip reticulocyte histonen.
- Per test voorwaarde plaats drie 1,5 mL centrifuge buizen op ijs voor metingen in triplo. Ook voor te bereiden drie buizen voor buffer-only achtergrond controle.
- Zet 25 µ L van WB150 in elke buis en voeg 25 µ L van de TEV eluaat van stap 2.4.11 en houden op ijs.
- Verwarm een buis incubator voor op 25 °C.
- Gebruik 15 s intervallen (Stopwatch) voor de toevoeging van 10 µ L van gelabelde histonen [1,5 mg/mL] aan elke buis.
- Voordat u begint met de Assay, nemen 10 µ L van de [3H] acetaat-label kip histonen en start de stopwatch.
- Vijf seconden na de start, voeg de gelabelde histonen, sluit de buis stevig, Vortex, en zet het in de incubator.
- Gebruik 15 s intervallen voor de toevoeging van 10 µ L van gelabelde histonen en ga verder zoals beschreven in de vorige stap.
- Na 60 min incubatie toe te voegen 50 µ L van stop oplossing (1 M HCl/0.4 M azijnzuur) aan elke buis in 15 s intervallen; Vortex onmiddellijk. Na de toevoeging van de zure oplossing, de assay mix is stabiel en kan worden gehouden op RT tot de volgende stap.
- Voeg 800 µ L van ethylacetaat aan elke buis toe om het vrijgegeven [3H] azijnzuur te halen.
- Sluit de tubes en Vortex elke tube voor 5 s.
- Plaats de buis in een micro centrifuge en draai bij 10.000 × g voor 10 min bij RT.
- In de tussentijd, bereiden een fonkeling flacon per assay monster en voeg 3 mL fonkeling cocktail voor hydrofobe monsters.
- Na centrifugeren (stap 2,12), voorzichtig overdracht 600 µ L van de bovenste organische fase naar de geprepareerde fonkeling buizen en sluit de buizen stevig.
- Meet de radioactiviteit die overeenkomt met de HDAC activiteit in een vloeibare fonkeling teller.
Representative Results
Een typisch resultaat van de voorgestelde enkele stap verrijking van RpdA is weergegeven in Figuur 1 (aangeduid als "IgG"). Omwille van de volledigheid, hebben we ook opgenomen flow-through en elutie fracties ("CFT" en "CE") ter illustratie van de tweede zuivering stap door een calmodulin hars ("CaM") zoals beschreven12. De getoonde zilverkleurige gel (A) illustreert duidelijk de werkzaamheid van de eerste affiniteit stap die nog verder wordt verhoogd bij het uitvoeren van de tandem zuivering. De meeste prominente eiwitten aanwezig in het eiwit extract en de flow-through, echter, zijn al uitgeput in de TEV eluaat (TE). Het is belangrijk op te merken dat de TEV elutie fracties zijn > 100 × geconcentreerd in vergelijking met extract en flow-through. De sterretjes Mark Tagged RpdA (vergelijk paneel B). Berekende MW van RpdA met inbegrip van CBP (RpdA:: CBP) is 82 kDa, echter, migreert het eiwit bij een veel hoger duidelijk moleculair gewicht van ong. 120 kDa. Dit fenomeen is eerder waargenomen en kan worden toegewezen aan de specifieke eigenschappen van de C-Terminus4,17. De immunoblot (B) toont sterke signalen migrerend bij ong. 120 kDa overeenkomt met CBP-gelabelde full-length RpdA (RpdA:: CBP) in de TeV eluaat ("te"), de calmodulin flow-through ("CFT"), en eluaat ("CE") fracties. In zure eluaat ("AE") een tweede signaal met een lichtjes grotere MW is zichtbaar. Dit vertegenwoordigt het aandeel van TAP-Tagged RpdA gebonden aan de IgG hars die niet werd vrijgegeven door TEV splitsing. Het verschil in grootte beantwoordt aan 16 kDa van de proteïne een herhaling van uncleaved RpdA:: kraan. Zoals verwacht, zouden geen banden door het anti-CBP antilichamen in de wild-type controle fracties (paneel B, "wild type") kunnen worden ontdekt.
De resultaten van een representatieve deacetylase activiteit assay met de specifieke HDAC remmer trichostatin A (TSA) worden weergegeven in Figuur 2. Deze test werd oorspronkelijk ontwikkeld voor planten18 en is ook gebruikt voor remmer screening tegen zoogdieren deacetylases19,20. De histonen gebruikt voor de assay werden geëtiketteerd en voorbereid als beschreven16. Het effect van de toenemende concentraties van TSA op de katalytische activiteit van het verrijkte RpdA complex ("TE ± TSA") wordt getoond. De gevoeligheid van de activiteit bevestigt dat gemeten CPM-waarden inderdaad te wijten zijn aan RpdA en niet veroorzaakt door niet-specifieke protease activiteit. Dit is een belangrijke observatie aangezien het erop wijst dat TEV, die bij vrij hoge concentratie aanwezig is, zich niet interfereert met de HDAC activiteit assay. Om gemeten HDAC activiteit aan RpdA toe te wijzen, werd een wild-type spanning gebruikt als negatieve controle ("co"). Zoals verwacht werd in de TEV eluaat van het wild type slechts marginale HDAC activiteit (ca. 5-10% van RpdA fracties) gedetecteerd. Interessant, HDAC activiteit is aanzienlijk verminderd na de tweede affiniteit zuivering stap ("CE") in vergelijking met de TEV eluaat.
Figuur 1. Tandem affiniteit purificationof TAP-Tagged RpdA. Een zilver-bevlekt 10% SDS-Polyacrylamide gel (a) en een westelijke vlek die met het anti-CBP antilichaam wordt probed (B) worden getoond. Lane etikettering en geladen volumes zijn als volgt: "M": 2 µl van 1:10 verdunde onbevlekt eiwit teller (Zilveren vlek), 3,5 µl van voorbevlekt eiwit teller (westelijke vlek); "Ex": eiwit extract monster zoals bereid in stap 2.2.8 (2 µl van 1:10 verdunning, 5 µl); "FT": IgG-hars doorstromings monster zoals bereid in stap 2.4.3 (2 µl van 1:10 verdunning, 5 µl); "AE": zure eluaat van stap 2.4.14 (10 µl, 10 µl); "TE": TEV eluaat van overnachting elutie door TEV splijting, stap 2.4.12 (10 µl, 10 µl); "CFT": calmodulin flow-through (20 µ L, 20 µ L); "CE": calmodulin eluaat (10 µ L, 10 µ L). De grootte van geselecteerde markerings proteïnen wordt vermeld aan de linkerkant van de panelen. De volumes die tussen haakjes worden gegeven corresponderen met steekproef ladingen voor Zilveren vlek en westelijke vlek, respectievelijk. Sterretjes in de zilverkleurige gel geven de RpdA Fusion proteïne. De immunoblot (B) werd gedetecteerd met alkalische fosfatase met behulp van de BVIE/NBT kleur ontwikkelingssysteem. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. HDAC activiteit assay onder toenemende concentraties van trichostatin A. Werkzaamheid van RpdA remming werd getest met 25 µ L van affiniteit-gezuiverde recombinant RpdA ("TE") en 25 µ L van 0, 10, 50, en 500 nM van de HDAC remmer TSA verdund in RPMI-1640 medium. RPMI werd gebruikt om de achtergrond activiteit ("blanco") te beoordelen. Activiteiten van de definitieve eluaat na de tweede calmodulin affiniteit stap ("CE") en van een untagged spanning na de eerste stap van de affiniteit reiniging (negatieve controle, "co") worden getoond. Activiteiten worden getoond als procent van de verrijkte RpdA zonder TSA (100%, "TE"). Foutbalken geven de standaarddeviatie van drie replicaties aan. Dit cijfer is gewijzigd van Bauer et al. 20162. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft een enkele stap verrijking van een TAP-Tagged klasse 1 HDAC van de gloeiende schimmel a. nidulans voor de beoordeling van in vitro deacetylase activiteit. De TAP-tag werd oorspronkelijk geïntroduceerd in bakkersgist voor de identificatie van eiwit-eiwitinteractie partners van de gecodeerde proteïne6. Later, werd de markering codon-geoptimaliseerd voor zijn gebruik in A. nidulans5. Hier bieden we een rechttoe rechtaan stap-voor-stap protocol voor de toepassing van de eerste affiniteit zuivering stap van de TAP-strategie voor single-stap verrijking van de klasse 1 HDAC RpdA. De tweede affiniteit reinigingsstap verhoogt duidelijk het niveau van zuivering, wat bijzonder belangrijk is voor de identificatie van aas-werkende proteïnen. Niettemin, slechts wordt de eerste stap geadviseerd voor het verdere activiteit testen, aangezien het gebrek aan significante verontreiniging na de eerste stap door een controle experiment gebruikend een wild-type spanning werd bevestigd. Bovendien, geëlueerd activiteit is aanzienlijk hoger na een enkele stap verrijking in vergelijking met die van de volledige TAP. In aanvulling op RpdA2, werd dit protocol ook met succes gebruikt voor het zuiveren van een. nidulans complexen van de tweede klasse 1 HDAC HosA21.
Door onze waarnemingen dat schimmel klasse 1 HDACs opbouwen van stabiele complexen4, zijn we erin geslaagd om het protocol te wijzigen door Bayram et al. 201212 dat de basis van deze methode vertegenwoordigt. Toch moeten er enkele kritische stappen worden gezet. De bereiding van sterk geconcentreerde eiwitextracten om te zorgen voor bijna-fysiologische omstandigheden is van cruciaal belang voor complexe stabiliteit. Daarom is het belangrijk om rekening te houden met de gegeven aanbevelingen met betrekking tot de biomassa/extractiebuffer ratio. In dit opzicht is het ook van cruciaal belang om goed gemalen fijne mycelium poeders te gebruiken om een goede extractie te garanderen. Hier is het gebruik van een slijpmachine duidelijk voordelig. Zoals vermeld in het protocol sectie, is het de moeite waard om te proberen de TEV-splitsing stap voor 1-2 h bij kamertemperatuur om de reiniging te versnellen. Dit werd getest op RpdA zonder enige schadelijke effecten op de stabiliteit te observeren (ongepubliceerde observatie, Bauer I, 2018). Bovendien zou de vervanging van NP40 (die in het originele protocol wordt gebruikt) met TX-100 niet geschikt voor andere eiwitcomplexen kunnen zijn. Bij het gebruik van deze methode voor de reiniging van andere TAP-Tagged eiwitten, moet men ook verwijzen naar de Bayram-protocol, dat een aantal waardevolle hints die nuttig kunnen zijn voor een voldoende zuivering van andere eiwitcomplexen12bevat.
Naast de hier beschreven kraan-methode, worden andere affiniteits markeringen en technieken vaak gebruikt voor enige-stap verrijking van proteïne van gloeiende schimmels, met inbegrip van zijn-en GFP-markeringen. Nochtans, aangezien klasse 1 HDACs over het algemeen als hoog-moleculair-gewichts complexen functioneel zijn, zijn de inheemse elutie voorwaarden een voorwaarde voor de verrijking van katalytisch actieve HDACs. Belangrijk is dat veel andere affiniteit zuiveringen worden uitgevoerd in ongunstige omstandigheden. Bijvoorbeeld, is de verrijking van HDACs via GFP-val, die op antigeen-antilichaam interactie gebaseerd is, niet geschikt toe te schrijven aan de zure elutie voorwaarden die zich met eiwit-eiwitinteractie van HDAC complexen mengen die aan harsen worden gebonden. Bovendien, pogingen om te zuiveren zijn-Tagged RpdA door metaal chelatie affiniteitchromatografie22, resulteerde in een significant verlies van katalytische activiteit tijdens de zuivering procedure, hoewel imidazool in plaats van lage pH-voorwaarden werd gebruikt voor elutie ( ongepubliceerde gegevens, Bauer, I, 2010).
Een beperking van het beschreven enzymatische assay protocol is het gebruik van het radioactieve substraat. Nochtans, zijn de analyses op een fluorescente basis ontwikkeld eveneens23,24 en zijn commercieel beschikbaar. Deze tests worden uitgevoerd in goed-platen en zijn dus ook geschikt voor high-throughput screening van HDAC remmers. In dat geval zou de voorgestelde procedure moeten worden geschaald.
Potentiële aankomende toepassingen van dit protocol omvatten de verrijking van specifieke subcomplexen van klasse 1 HDACs om hun specifieke fysiologische rollen en/of verschillen in hun gevoeligheid voor HDAC remmers te beoordelen. Bij de vaststelling van de beschreven methode voor andere enzymen, is het sterk aanbevolen om een negatieve controle experiment uit te voeren met een niet-gecodeerde stam. Dit zorgt voor specificiteit van de gemeten enzymactiviteiten en zou onthullen verontreiniging door onspecifiek gebonden enzymen.
De hier beschreven zuiverings-en activiteiten assay kan binnen twee dagen worden uitgevoerd en de verrijkte enzymen zijn gedurende ten minste enkele maanden stabiel, wanneer ze in een hoeveelheid van-80 °C worden opgeslagen. Tot slot, dit protocol biedt een relatief eenvoudige en kosteneffectieve manier om klasse 1 HDAC complexen voor de activiteit meting en bepaling van de werking van de remmer te bereiken.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Petra Merschak, Afdeling Moleculaire biologie (biocenter, medische universiteit van Innsbruck), voor haar hulp en steun in verband met dit manuscript. Daarnaast willen we graag de recensenten bedanken voor hun waardevolle opmerkingen.
Dit werk werd gefinancierd door het Oostenrijkse Fonds van de wetenschap (P24803 aan SG en P21087 aan GB) en door intramurale financiering (MUI begin, ST201405031 aan IB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L.
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E.
