Summary
Rpda gibi sınıf 1 histon uyku (hdacs), mantar enfeksiyonları tedavi etmek için potansiyel hedefler olarak önem kazanmıştır. Burada, histon deasetilaz inhibitörlerinin in vitro etkinliğini test etmesini sağlayan bir HDAC aktivite tahlil Ile birlikte tap-Tagged rpda ' nın spesifik zenginleştirme için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Rpda gibi sınıf 1 histon uyku (hdacs), mantar enfeksiyonların tedavisinde ve mantar ikincil metabolitlerin genom madenciliği için potansiyel hedefler olarak önem kazanmıştır. Ancak inhibitör taraması, arıtılmış enzim faaliyetleri gerektirir. Sınıf 1 uyku MultiProtein kompleksleri olarak işlevlerini uygulamak beri, bakteriler tek polipeptitler olarak ifade edildiğinde genellikle aktif değildir. Bu nedenle, endojen kompleksleri, iyon değişimi ve boyut dışlama Kromatografi gibi konvansiyonel teknikler uygulandığında, zahmetli ve zaman alıcı, izole edilmesi gerekir. Tandem benzeşimi arıtma hücrelerden MultiProtein kompleksleri zenginleştirmek için bir araç olarak geliştirilmiştir ve böylece endojen enzimlerin yalıtım için ideal olarak ortaya çıktı. Burada, Aspergillus nidulansdan C-TERMINALLY tap-Tagged rpda ilk arıtma adım aracılığıyla aktif rpda kompleksleri tek adımlı zenginleştirme için ayrıntılı bir protokol sağlar. Arıtılmış kompleksleri daha sonra bir deasetilaz tahlil uygulayarak sonraki inhibitör tarama için kullanılabilir. Enzimatik aktivite tahlil ile birlikte protein zenginleştirme iki gün içinde tamamlanabilir.
Introduction
Histon uyku (hdacs), Histonlar ve diğer proteinlerin lizin kalıntılarından asetil gruplarını kaldırabilen Zn2 +bağımlı hidrolitik enzimlerdir. Dizi benzerlik dayanarak, HDACs birkaç sınıflar1gruplandırılır. Son zamanlarda, mantar Sınıf 1 HDAC rpda, fırıncı Maya (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p bir ortoloğundan, fırsatçı mantar patojen Aspergillus fumigatus2için gerekli olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, rpda mantar enfeksiyonları tedavi etmek için potansiyel bir hedef olarak önem kazanmıştır2. İn vitro deasetilaz aktivitesinin değerlendirilmesi, enzimatik özelliklerin karakterize edilmesi için önemlidir ve yeni maddelerin inhibitör gelişimi için etkinliğini belirlemesine olanak sağlar. Escherichia coli insan HDAC1 bir Codon-optimize sürümü rekombinant ifade son zamanlarda bildirilmiştir rağmen3, bu ana bilgisayarda tam uzunlukta rpda ifade girişimleri4başarısız oldu. Ayrıca, rpda ve hosa gibi mantar sınıfı 1 hdacs, MultiProtein kompleksleri olarak fonksiyonlarını kullanmaları nedeniyle, enzimatik inhibitör çalışmaları için yerli endojen kompleksler kullanmak için uygundur. Ancak, mantar Lysates içinde farklı hdacs varlığı inhibe faktörler ve varlığını nedeniyle, katalitik aktivite tüm protein özler ölçülen nispeten düşüktür ve bireysel enzimler için atanamaz. Dahası, filasentous mantar a. nidulans önceki çalışmalar bir sınıf 2 HDAC, hdaa, mantar özler kromatografik kesirler içinde baskın deasetilaz olarak belirledi. Böylece, hdaa olmayan aktivitesini mantar suşları4' ten ayırmak için birden fazla konvansiyonel kromatografik arıtma basamakları gereklidir. A. nidulans5 ' te tandem benzeşme arıtma (TAP) stratejisinin tanıtımı, spesifik deasetilaz faaliyetlerinin zenginleştirilmesini önemli ölçüde hafifletmiştir. Orijinal TAP etiketi, bir tütün Etch virüsü proteaz (TEV) bölünme sitesi6ile ayrılmış Iki protein a etki alanı ve bir calmodulin bağlayıcı peptid (CBP) oluşur. Bu, etkileşim ortakları da dahil olmak üzere etiketli proteinlerin yerli arıtma ve elüsyonu sağlar7. Aktivite açısından zenginleştirilmiş proteinleri kullanırken, proteaz bölünmesi ile yerel koşullarda hafif bir elüsyon TAP etiketi arıtma önemli bir özelliğidir. Bir Gfp etiketli protein, örneğin, immobilize antikorlar tarafından da zenginleştirilebilir, ancak, yerel koşullarda elüe edilemez.
Burada C-Terminally TAP-Tagged RpdA dan a. nidulans (IgG ayrımı ve TEV Cleavage) ilk arıtma adım aracılığıyla aktif rpda kompleksler tek adımlı zenginleştirme için ayrıntılı bir protokol sağlamak sonraki inhibitör tarama için bir uygulama histon deasetilaz tahlil. Yeterli olduğu kanıtlanmıştır gibi, benzerliği zenginleştirme sadece bir arıtma adımı ile sınırlı olduğu için enzimatik aktivite önemli ölçüde iki adımlı TAP arıtma sonra IgG arıtma tek başına karşılaştırıldığında azaltıldı.
Yine de, tanıtıldı protokol gibi asetiltransferases, metiltransferases ve demethylases gibi kromatin Yönetmeliğinde yer alan diğer etiketli enzimlerin zenginleştirme için geçerli olmalıdır. TAP protokolünün ikinci arıtma adımını ekleyerek, etiketli yemler ile birlikte arıtılmış proteinler (roman) enzimatik kompleksleri karmaşık ortakları olarak kabul edilebilir.
Protocol
1. A. nidulans ekimi
- İnoculum hazırlığı
Not: inkübasyon dışında tüm adımlar bir laminar akış dolabı altında yapılmalıdır.- Gliserol stoktan (-80 °C) glikoz/Xylose minimal Orta (GXMM; litre başına: 10,0 g glikoz, 0,5 g Xylose, 10 mL 1 M di-amonyum tartrat çözeltisi, 20 mL 50 × tuz solüsyonu [litre başına (örn. TİB 32.12) dokunun: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2Po4, 1 ml chloroform], 1 MB 1.000 × Hutner 'ın iz elemanları8) dahil olmak üzere 1,5% (w/v) agar ve gerekli takviyeleri tarafından açıklandığı gibi Todd et al. 20079. 37 °C ' de 2 – 3 gün boyunca inküye yapın.
Not: TIB 32.1 içeren bir Rpda:: tap Fusion bir Xylose-indüklenebilir Promoter tarafından kontrol, xylp(p)10. Bu ksiloz yukarıdaki tarifi dahil olmasıdır. Xylp(p) kontrolü altında olmayan yapıları ifade eden büyüyen suşları zaman ksiloz atlayın. - Sterilizasyon 1,5 ml santrifüjle tüp 1,5 ml steril konidial süspansiyon çözeltisi (CSS; 0,9% (w/v) NaCl,% 0,01 (v/v) polisorbat 80) hazırlayın.
- CSS 'de tek kullanımlık aşı döngü ıslak, adım 1.1.1 plaka gelen konidiyum kapalı kazımak ve adım 1.1.2 tüp askıya.
- Transfer 150 μL her bir conidial süspansiyon 10 25 cm2 hücre kültürü şişeler ile havalandırma kapağı gxmm agar içeren takviyeleri ve 200 μL CSS dahil.
- Konidial süspansiyonu, steril bir aşı döngüsünü kullanarak flsorın içine yayın ve 37 °c ' de 2 – 3 gün boyunca flsoraları kuluçat.
- Conidia hasat için, Flask başına CSS 10 mL kullanın. Bir Flask içine çözüm dökün, sıkıca sağlanan vida kapağı ile Flask kapatın ve şiddetle Flask sallamak.
- Mantar yüzeyini ıslattıktan sonra, kalan konidiyum 'yı steril aşı döngüsü ile tamamen kazımak.
- 40 μm hücreli süzgeçler aracılığıyla konidiyum Pass steril bir 50 ml santrifüj tüp üzerine yerleştirilir ve bir tüp beş şişeler süspansiyon toplamak.
- Tüp Santrifüjü 1.000 × g 10 dk.
- Süpernatant decant ve tüp başına CSS 10 ml Pelet pelletini.
- Bir tüpte her iki süspansiyonları toplayın, 40 mL CSS ile boş tüpü durulayın, süspansiyon ekleyin ve adım 1.1.9 açıklandığı gibi santrifüjler.
- Decant süpernatant ve pelletini conidial Pelet içinde 4 ml CSS.
- Conidial süspansiyonun iki seri 1:50 seyreltme hazırlamak ve ortaya çıkan 1:2, 500-seyreltilmiş süspansiyon bir sayma odası ile konidiyum sayısını belirlemek11tanımlanmıştır.
- Gliserol stoktan (-80 °C) glikoz/Xylose minimal Orta (GXMM; litre başına: 10,0 g glikoz, 0,5 g Xylose, 10 mL 1 M di-amonyum tartrat çözeltisi, 20 mL 50 × tuz solüsyonu [litre başına (örn. TİB 32.12) dokunun: 26,0 g KCl, 26,0 g MgSO4 · 7 H2O, 76,0 g KH2Po4, 1 ml chloroform], 1 MB 1.000 × Hutner 'ın iz elemanları8) dahil olmak üzere 1,5% (w/v) agar ve gerekli takviyeleri tarafından açıklandığı gibi Todd et al. 20079. 37 °C ' de 2 – 3 gün boyunca inküye yapın.
- Mycelia 'nın büyümesi ve toplanması
- Bir laminar akış kabine altında çalışırken, 4 – 6 tek litrelik konik flsorlar her biri 5 × 106 conidia/ml yoğunlukta uygun takviyeleri de dahil olmak üzere GXMM 250 ml içerir ve 180 rpm de 37 °c 14 – 16 h için inkük.
- Peynir bezi bir Flask üzerine bir huni içine yerleştirin ve bez aracılığıyla Mycelia filtre. Deiyonize su ile kısaca yıkayın.
- Önce eller ve sonra kağıt havlular arasında peynir bezi sıkışmış Mycelia sıkarak mümkün olduğunca fazla nem çıkarın.
- Kurutulmuş Mycelia 'yı düz levhalar olarak bir vida kapağı ve sıvı nitrojen ile yanıp sönme ile plastik bir bardak olarak aktarın. Bu, aşağıdaki lyophilization süreci için yüksek alan/hacim oranı sağlar.
- Likofilizasyon öncesinde dondurulmuş Mycelia-80 °C ' ye kadar saklayın.
Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. - Bir gecede Mycelia 'ya lyophilize.
- Mycelia 'nın sıcaklığı sabit kaldığı zaman donma-kurutma sürecini durdurun (18 – 24 saat). Temin edilen vida kapakları ile hemen contaları çıkarın.
Not: sıkıca mühürlendiğinde, liyofilize Mycelia RT 'de birkaç hafta boyunca depolanabilir.
2. TAP-Tagged HDAC 'ın tek adımlı zenginleştirme (bayram ve ark. 2012 ' den uyarlanmış)12
- Tamponların ve çözümlerin hazırlanması
Not: 2-mercaptoethanol (EtSH) ve proteaz inhibitörleri doğrudan kullanımından önce arabelleklerine ekleyin. 0,22 μm nitroselüloz membranlarla kromatografi için kullanılan tüm tamponların, kromatografi reçinesinin kirlilikler/kontaminasyonlarının sunulmaması için filtreleyin. Aşağıdaki adımlarda yer alan talimatlar, her arabelleğin 1 L 'ye hazırlanmasına başvurur. Tamponları 4 °C ' de saklayın.- Ekstraksiyon tamponu (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT),% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- 12,35 g Tris-HCl, 2,62 g Tris (ücretsiz baz) ve 13,2 g NaCl, 800 mL deiyonize su ile çözülür ve 10% 10 mL (v/v) TX-100 çözeltisi ekleyin.
- PH 'yi RT 'de kontrol edin ve gerekirse pH 7,5 ile NaOH veya HCl [5 M] ile ayarlayın.
- 0,22 μm nitroselüloz membran ile 1 L 'ye kadar olun ve filtreleyin.
- 100 mL tampon başına (5 mM son konsantrasyon) doğrudan kullanımından önce 35 μL EtSH ekleyin.
- Yıkama tamponu 250 (WB250): 250 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT),% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Hazırlamak WB250 B250 (2.1.1) için açıklandığı gibi ama ile 3,59 g Tris-HCl, ve 2,08 g Tris (ücretsiz baz).
- Yıkama tamponu 150 (WB150): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT),% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Hazırlamak WB150 olarak açıklandığı gibi B250 (2.1.1) ama ile 3,59 g Tris-HCl, 2,08 g Tris (ücretsiz baz), ve 8,77 g NaCl.
- TEV Dengeleme tamponu (TEB): 150 mM NaCl, 40 mM Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mM EDTA,% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- WB150 aynı ama 0,5 mM son konsantrasyon EDTA ekleyin.
- TEV bölünme tampon (TCB): 150 mm NaCl, 40 mm Tris-HCl pH 8,0 (RT), 0,5 mm EDTA, 0,1% (v/v) TX-100,% 10 (v/v) gliserol, 5 mm etsh.
- Adım 2.1.1 yılında Tris-HCl 3,59 g, Tris 2,08 g (ücretsiz baz) ve 8,77 g NaCl ile açıklandığı gibi hazırlayın ve hacmi 1 L 'ye ayarlamadan önce 100 mL gliserol ekleyin.
- 50 × proteaz inhibitörü kokteyli: 1 mL su içinde ve mağaza-20 °C ' de piyasada mevcut olan proteaz inhibitörlerinin 1 tabletini çözülür.
- TBS-T: 50 mm Tris-HCl pH 7,6 (RT),% 0,9 (w/v) NaCl,% 0,1 (v/v) polisorbat 20.
- 2.1.1 adımda açıklandığı şekilde hazırlayın. Kullanım 6,06 g Tris-HCL, 1,40 g Tris (ücretsiz baz), 9 g NaCl, ve 1 ml polisorbat 20.
- 5 × LSB (Laemmli numune tampon): 315 mM Tris-HCl pH 6,8 (RT),% 25 (v/v) EtSH, 50% (v/v) gliserol,% 10 (w/v) SDS,% 0,05 (w/v) bromophenol mavi.
- Ekstraksiyon tamponu (B250): 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH 7,5 (RT),% 0,1 (v/v) TX-100, 5 mM EtSH.
- Protein ekstresinin hazırlanması
- Bir top değirmeninin taşlama kavanozu içine liyofilize Mycelia ve bir taşlama topu 1,5 g ekleyin.
Not: taze Mycelia da kullanılabilir. Bunu yaparken, dondurma önce mümkün olduğunca iyice Mycelia kuru ve taze Mycelia taşlama için sıvı nitrojen taşlama kavanozları precool emin olun. - 30 s için 25 Hz 'de toz için Mycelia grind.
Not: hiçbir taşlama makinesinin mevcut olmadığı durumlarda, bayram ve ark tarafından açıklandığı gibi, bir havan ve pestle kullanarak bir toz Mycelia eziyet . 12' ye kadar. - Miselyum tozu 15 ml santrifüj tüpüne aktarın.
- Tampon ile Mycelia sonraki karıştırma sağlamak için zemin Mycelia dahil Santrifüjü tüp eğim.
- Gram miselyum toz başına 1 × proteaz inhibitörü kokteyl dahil olmak üzere buz-soğuk B250 6 ml ekleyin ve ham özü tam homojenizasyon kadar küçük bir spatula ile karışımı elde edilir. Taze Mycelia kullanırken bayram ve ark. 12 ekstraksiyon tampon oranına doğru biyokütle ulaşmak için.
- Tüp buz üzerinde 5 dakika tutun.
- Tüpü ve bir denge tüpünü Santrifüjüne yerleştirin ve 40.000 × g 'de 4 °c ' de ≥ 20 dakika olarak döndürün. Santrifüjleme sırasında IgG reçine (adım 2,3) dengelemesinden gerçekleştirin.
- Santrifüjden sonra, sds-page analizi için 10 μL süpernatant 'ı çıkarın. Numuneyi 40 μL su ve 12,5 μL 5 × LSB içeren 1,5 mL tüpüne yerleştirin; Şekil 1' de "Ex" olarak adlandırılır.
- Bir serolojik pipet kullanarak süpernatant (temizlenmiş lysate) dikkatle kaldırın ve dengelenmiş IgG boncuklar (adım 2.3) içeren sütun üzerine transfer ve sıkıca sağlanan uç kapağı kullanarak kapatın.
- Bir top değirmeninin taşlama kavanozu içine liyofilize Mycelia ve bir taşlama topu 1,5 g ekleyin.
- IgG reçine equilibration (adım 2.2.7 sırasında gerçekleştirilir)
- 10 mL tek kullanımlık Kromatografi sütun ve pipet 300 μL iyi resuspended IgG reçine (50% Bulamaç) sütuna hazırlayın. B250 ile 10 mL sütun doldurun ve yerçekimi ile arabellek akışı sağlar.
- Eklemek 1 mL B250 dahil 1 × proteaz inhibitörü kokteyl ve üzerinden akış izin. Sütunun alt kısmına takın.
- TAP-Tagged HDAC toplu arıtma
- 2 – 4 h için 4 °C ' de 10 rpm 'de döner karıştırıcı üzerindeki adım 2.2.9 dengelenmiş boncuklar ve temizlenmiş lysate içeren Kromatografi sütununu inküt.
- Toplu bağlama sonra kapağı kaldırın ve akış-Through toplamak için alttaki sütunu açın.
- 2.2.8 adımda açıklandığı gibi SDS-PAGE analizi için bir örnek alın; Şekil 1' de "ft" olarak adlandırılır.
- 10 mL WB250 ile yıkama boncukları. İlk olarak, bir pipetör kullanarak sütun kapağının tuzağa boncuk kaldırmak için tampon 1 ml kullanın ve boncuklar Resuspension izin yerleşmiş reçine üzerine bir floş bu süspansiyon transfer. Sonra üst sütun doldurun, bir yığın kapağı kullanarak kapatın ve bir peristaltik pompa bağlanın. Yaklaşık 1 – 5 mL/dak 'Lik bir akış hızını ayarlayın. reçine kuru çalışmasını önler.
- WB250 ile toplam dört yıkanıyor için adım 2.4.4 üç kez tekrarlayın.
- 2.4.4 adımda açıklandığı gibi 10 mL TEB ile üç kez yıkamak boncuk.
- Alttaki Kromatografi sütununu kapatın, 1 ml TCB 'de pelletini IgG boncuk, ve 20 μl 50 × proteaz inhibitörü kokteyli yanı sıra 10 μL TEV (~ 1 mg/ml stok, S219V mutant varyantı içinde üretilen) ekleyin.
- Sütunu Kapla ve 4 °C ' de 10 rpm 'de bir Rotary karıştırıcı üzerinde inküd edilen HDAC üzerinden bağlı protein kompleksleri elute.
Not: Alternatif olarak, reaksiyon süresini azaltan yüksek sıcaklıkta (16 – 25 °C) TEV özetini gerçekleştirin, ancak protein bozulması riskini arttırmaktadır. - Ertesi gün sütunu açın ve 2 ml santrifüjli tüp içinde yıkantıdaki toplamak. 0,7 mL TCB kullanın kap boncuk kaldırmak ve sütunun duvar durulayın.
- Sütun üzerinde açık 2 mL tüp kendisi bir 50 mL Santrifüjü tüp içinde yerleştirilir önceki adımda yerleştirin.
- Bu montajı, 2 dakika boyunca 300 × g 'de bir masa üstü Santrifüjü ve spin içine aktarın. Bu da TEV 'i atlatmak.
Not: Tandem benzeşimi arıtma gerçekleştirirken, TEV kalmodulin benzeşimi adım için giriş olarak kullanın. Ayrıca, TEV 'i ayırabilir ve HDAC aktivite belirlenmesi için bir parça ve ikinci bölümü TAP arıtma tamamlamak için kullanabilirsiniz. - 50 μL 'yi TEV 'den çıkarın ve SDS-PAGE için 5 × LSB 12,5 μL ekleyin ( rakamlar 1 ve 2' de "te" olarak adlandırılır) ve geri kalanı buz üzerinde tutun.
- Proteaz elüsyonun etkinliğini değerlendirmek için 2 mL% 5 (v/v) asetik asit ekleyin ve RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın. Yine, reçine pelletini ilk ml kullanın.
- Asit biriktirmek ve tekrar 50 μL örnek almak ve 12,5 μL 5 × LSB ( Şekil 1' de "AE" olarak anılacaktır) ekleyin. Asidik çözüme eklendiğinde LSB sarı renkte dönecektir. Asit nötralize etmek için, 1 μL adımlarında 10 M NaOH ekleyin ve renk yeniden mavi değişene kadar iyi karıştırın.
- Asit nötralize etmek için TBS-T ile IgG reçine Re-equilibrate. Reçine, aynı etiketli protein ile yeniden kullanmak için 4 °C ' de TBS-T/% 20 (v/v) etanol içinde saklayın.
- Elüsyon kesirlerinin saklanması
- Aliquot içine yıkantıdaki ~ 100 μL fraksiyonları, birden fazla donma-çözme döngüleri önlemek için.
- Sıvı nitrojen içinde plakaya dondurmak ve tutmak-80 °c.
Not: Bu şekilde saklanan örnekler enzimatik aktivite kaybetmeden aylarca istikrarlı olacaktır.
3. sds-page ve Batı Blot tarafından arıtma Analizi
- SDS-Poliakrilamid jeller veya prekast jeller13kullanmak için standart protokoller kullanın. 5 dakika için 95 °C ' de önceki bölümden denature jel numuneleri, 5 dakika boyunca ≥ 15.000 × g santrifüj ve% 12 jeller üzerine yük. Önerilen yükleme birimleri Şekil 1' in göstergesinde verilir. Electrophorese örnekleri 1 × Tris-Glycine SDS-PAGE çalışan tampon at 180 V sabit 60 için-70 dakika, SDS-PAGE yükleme tampon bromophenol mavi Marker kadar jel dışarı göç başlar.
- Jeller gümüş boyama için standart protokolleri kullanın. Örneğin, Blum ve el protokollerini kullanın . 1987 de MS analizi ile uyumlu14 .
- Batı Blot için standart protokoller kullanın15. Aşağıda temsili sonuçların oluşturulması için, ticari olarak kullanılabilen bir şişme sistemi kullanılmıştır.
- Ticari olarak mevcut anti-kalmodulin bağlayıcı proteini (Anti-CBP) antikor ile 4 °C ' de TBS-T ' d e% 5 (w/v) süt tozu ile prob şişmeleri.
Not: Anti-CBP antikor TEV Cleavage sonra hala mevcut TAP etiketi kısmına karşı yönlendirilir. - Blots algılama ve geliştirme için standart protokolleri kullanın. Örneğin, aşağıdaki temsili sonuçların oluşturulması için tavşan karşıtı IgG-alkalin fosfataz Konjugat ve BCıP/NBT renk geliştirme substrat kullanılmıştır.
4. deacetylase assay kullanarak in vitro [3H] asetat etiketli tavuk retikülosit Histonlar (trojer ve al. 2003 uyarlanmıştır)4
- [3H] asetat etiketli tavuk retikülosit histones hazırlanması için Kölle vd. 199816 protokolüne bakın.
- Test koşulu yer üç 1,5 mL santrifüjler buzun üzerinde ölçümleri için triplicates. Ayrıca yalnızca arabellek arka plan kontrolü için üç Tüp hazırlayın.
- Her tüpün içine 25 μL WB150 koyun ve 25 μL TEV eklemek Adım 2.4.11 ve buz üzerinde tutmak atlatmak.
- Bir tüp kuluçvörü 25 °C ' ye ısıtın.
- Her tüpe 10 μL etiketli histon [1,5 mg/mL] eklenmesi için 15 s aralıklarını (Saati durdur) kullanın.
- Tahlil başlamadan önce, 10 μL kadar almak [3H] asetat etiketli tavuk Histonlar ve durdurma saati başlatın.
- Başlamadan beş saniye sonra, etiketli Histonlar ekleyin, tüpü sıkıca kapatın, Vortex, ve kuluçca yerleştirin.
- 10 μL etiketli Histonlar eklenmesi için 15 s aralıkları kullanın ve önceki adımda açıklandığı gibi devam edin.
- 60 min inkübasyon sonra 50 μL stop çözeltisi ekleyin (1 M HCl/0.4 M asetik asit) her tüp için 15 s aralıklarla; Hemen Girdabı. Asidik çözümün eklendikten sonra, tahlil karışımı kararlı ve RT bir sonraki adıma kadar tutulabilir.
- 800 ekleyin her tüp için etil asetat μL yayımlanan [3H] asetik asit ayıklamak için.
- Tüplerin sıkıca kapanacak ve her tüp için 5 s girdap.
- Tüp bir mikrosantrifüjüne yerleştirin ve 10.000 × g 'de 10 dk. RT 'de döndürün.
- Bu arada, tahlil örneği başına bir scintbrilasyon şişe hazırlayın ve hidrofobik örnekler için 3 mL scintilasyon kokteyli ekleyin.
- Santrifüjden sonra (adım 2,12), üst organik fazın 600 μL 'i hazırlanmış scintilasyon tüplerine dikkatle aktarın ve tüpleri sıkıca kapatın.
- Bir sıvı scintilasyon sayacı HDAC aktivitesine karşılık gelen radyoaktivite ölçmek.
Representative Results
RpdA 'nın sunulan tek adımlı zenginleştirilmesi tipik bir sonucu Şekil 1 ' de gösterilir ("IgG" olarak adlandırılır). Bütünlük uğruna, aynı zamanda12olarak açıklandığı gibi bir kalmodulin reçine ("cam") tarafından ikinci arıtma adımını gösteren akış ve elüsyon fraksiyonları ("CFT" ve "CE") dahil ettik. Gösterilen gümüş lekeli jel (A), tandem arıtma yapılırken daha da artan ilk benzeşme adımının etkinliğini açıkça gösterir. Protein ekstresi ve akış-Through mevcut en belirgin proteinler, ancak, zaten TEV yıkantıdaki (te) tükenmiş. TEV elüsyon fraksiyonları > 100 x özü ve akış ile karşılaştırıldığında konsantre olduğunu fark etmek önemlidir. Yıldız işareti etiketlenmiş RpdA (panel Bkarşılaştırın). CBP (RpdA:: CBP) dahil olmak üzere RpdA hesaplanan MW 82 kDa, ancak, protein yaklaşık 120 kDa çok daha yüksek belirgin moleküler ağırlıkta göç eder. Bu fenomen daha önce gözlemlenmiştir ve C-Terminus4,17' nin belirli özelliklerine atanabilir. İmmünoblot (B) TEV yıkantıdaki ("te") içinde CBP-etiketli tam uzunlukta rpda (rpda:: CBP) karşılık gelen yaklaşık 120 kDa göç güçlü sinyaller gösterir ("t"), calmodulin akış-through ("CFT"), ve yıkantıdaki ("CE") fraksiyonları. Asitte ("AE") biraz daha büyük MW ile ikinci bir sinyal görülebilir. Bu TEV Cleavage tarafından serbest bırakılmadı IgG reçine bağlı TAP-Tagged RpdA oranını temsil eder. Boyut farkı, 16 kDa protein uncleaved RpdA:: TAP bir tekrarlama karşılık gelir. Beklendiği gibi, hiçbir bant Anti-CBP antikor tarafından vahşi tip kontrol fraksiyonları (panel B, "Wild Type") tespit edilebilir.
Özel HDAC inhibitörü trichostatin A (TSA) ile temsili bir deasetilaz aktivite tahlil sonuçları Şekil 2' de görüntülenir. Bu tahlil başlangıçta bitkiler için geliştirilen18 ve ayrıca memelilerden uyku karşı inhibitör tarama için kullanılmıştır19,20. Tahlil için kullanılan Histonlar etiketlenmiş ve16açıklandığı gibi hazırlanmıştır. Artan TSA konsantrasyonunun zenginleştirilmiş RpdA kompleksinin katalitik aktivitesine etkisi ("TE ± TSA") gösterilir. Etkinliğin hassasiyeti, ölçülen BGBM değerlerinin gerçekten RpdA 'dan kaynaklanduğunu ve spesifik olmayan proteaz aktivitesinin neden olmadığını doğrular. Bu önemli bir gözlem olduğunu gösterir gibi TEV, oldukça yüksek konsantrasyonda mevcut olan, HDAC aktivite tahlil ile müdahale etmez. Ölçülen HDAC aktivitesini RpdA 'ya atamak için negatif kontrol ("Co") olarak bir vahşi tip gerinim kullanılmıştır. Beklendiği gibi, sadece marjinal HDAC aktivite (yaklaşık% 5-10 rpda zenginleştirilmiş fraksiyonları) TEV vahşi türü yıkantıdaki tespit edildi. İlginçtir, HDAC aktivite önemli ölçüde sonra ikinci benzeşimi arıtma adım ("CE") TEV eluate karşılaştırıldığında azalır.
Şekil 1. TAP-Tagged RpdA tandem benzeşimi Purification. Gümüş lekeli% 10 SDS-Poliakrilamid jel (a) ve anti-CBP antikor (B) ile incelenen bir Batı leke görüntülenir. Şerit etiketleme ve yüklenmiş birimler aşağıdaki gibidir: "M": 2 μl 1:10 seyreltilmemiş protein Marker (gümüş leke), 3,5 μl önceden hazırlanmış protein Marker (Batı Blot); "Ex": adım 2.2.8 hazırlanmış protein ekstresi örneği (2 μl 1:10 seyreltme, 5 μl); "FT": IgG reçine akışı-örnek adım 2.4.3 yılında hazırlanan (2 μl 1:10 seyreltme, 5 μl); "AE": adım 2.4.14 asit atlatmak (10 μl, 10 μl); "TE": TEV, adım 2.4.12 (10 μl, 10 μl), TEV bölünmesi ile gece boyunca çekilmesini atlatmak; "CFT": calmodulin akışı (20 μL, 20 μL); "CE": calmodulin yıkantıdaki (10 μL, 10 μL). Seçili Marker proteinlerinin boyutu panellerin sol tarafında belirtilir. Parantez içinde verilen birimler sırasıyla gümüş leke ve Batı Blot için örnek yüklemeleri karşılık gelir. Gümüş lekeli jel yıldız RpdA Fusion protein gösterir. İmmünoblot (B), bcıp/NBT renk geliştirme sistemini kullanarak alkali fosfataz ile tespit edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2. Trihostatin A artan konsantrasyonlarda HDAC aktivite tahlil. RpdA inhibisyonunun etkinliği, RPMI-1640 ortamında seyreltilmiş HDAC inhibitörü TSA 'sında 25 μL ("TE") ve 0, 10, 50% 25 μL ve 500 nM ile test edildi. RPMI arka plan etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı ("boş"). İkinci kalmodulin benzeşme adımının ("CE") ve ilk benzeşimi arıtma adımında (negatif kontrol, "Co") sonra bir etiketsiz gerinim sonra son atlatma faaliyetleri görüntülenir. Faaliyetler, TSA olmadan zenginleştirilmiş RpdA yüzdesi olarak gösterilir (100%, "TE"). Hata çubukları üç çoğaltır standart sapmasını gösterir. Bu rakam Bauer et al. 20162' den değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Discussion
Bu protokol, in vitro deasetilaz aktivitesinin değerlendirilmesi için filasentous mantar a. nidulans gelen bir tap-etiketli Sınıf 1 HDAC tek adımlı bir zenginleştirme açıklar. TAP etiketi, etiketli protein6' nın protein-protein etkileşimi ortaklarının tanımlanması için ilk olarak fırıncı Maya 'da tanıtıldı. Daha sonra etiket, A. nidulans5 ' te kullanılmak üzere Codon tarafından optimize edilmiştir. Burada, sınıfın 1 HDAC RpdA 'Sının tek adımlı zenginleştirme için TAP stratejisinin ilk benzeşimi arıtma adımının uygulanması için düz ileriye dönük bir adım adım protokol sağlıyoruz. İkinci benzeşimi arıtma adım açıkça arıtma seviyesini artırır, hangi yem etkileşim proteinlerin tanımlanması için özellikle önemlidir. Yine de, sadece ilk adım sonraki aktivite testi için tavsiye edilir, ilk adım sonra önemli kontaminasyon eksikliği bir vahşi tip gerinim kullanarak bir kontrol deneyi tarafından teyit edildi beri. Ayrıca, tam TAP 'e kıyasla tek adımlı zenginleştirme işleminden sonra eltilmiş aktivite oldukça yüksektir. RpdA2ek olarak, bu protokol de başarıyla Ikinci sınıfın A. nidulans kompleksleri arındırılması IÇIN kullanılan 1 HDAC hosa21.
Mantar sınıfı 1 hdacs 'in istikrarlı kompleksleri4' ü inşa ettiği gözlemlerimiz nedeniyle, bu yöntemin temelini temsil eden bayram ve al. 201212 ' nin protokolünü değiştirmesini başardık. Yine de, bazı kritik adımlar belirtilmelidir. Yakın fizyolojik koşullar sağlamak için son derece konsantre protein ekstraktlarının hazırlanması karmaşık stabilite için önemlidir. Bu nedenle, biyokütle/ekstraksiyon tampon oranı ile ilgili öneriler akılda önemlidir. Bu bağlamda, uygun çıkarma sağlamak için iyi zemin ince miselyum tozlar kullanmak da önemlidir. Burada, bir taşlama makinesinin kullanımı açıkça avantajlıdır. Protokol bölümünde belirtildiği gibi, arıtma hızlandırmak için oda sıcaklığında 1-2 h için TEV-Cleavage adım denemek için değer. Bu kararlılık üzerinde herhangi bir zararlı etkileri gözlemlemeden RpdA için test edildi (yayınlanmamış gözlem, Bauer ı, 2018). Buna ek olarak, TX-100 ile NP40 (orijinal protokolde kullanılan) değiştirilmesi diğer protein kompleksleri için uygun olmayabilir. Diğer TAP-Tagged proteinleri arıtma için bu yöntemi kullanırken, bir de bayram protokolüne başvurmalıdır, hangi diğer protein kompleksler yeterli bir arıtma için yararlı olabilir değerli ipuçları bir dizi içerir12.
Burada açıklanan TAP-yöntemi yanı sıra, diğer benzeşim etiketleri ve teknikleri yaygın filaentous mantar protein tek adımlı zenginleştirme için kullanılır, onun-ve GFP-Etiketler de dahil olmak üzere. Ancak, sınıf 1 HDACs genellikle yüksek molekül ağırlığı kompleksleri olarak işlevsel olduğu için, yerli elüsyon koşulları katalytically aktif HDACs zenginleştirme için bir ön koşuldur. Daha da önemlisi, pek çok diğer yakınlık temizliği olumsuz koşullarda gerçekleştirilir. Örneğin, antijen-antikor etkileşimine dayanan GFP-Trap ile HDACs 'in zenginleştirilmesi, reçineler için bağlı HDAC kompleksleri protein-protein etkileşimi ile müdahale eden asidik elüsyon koşulları nedeniyle uygun değildir. Dahası, girişimleri onun-Tagged rpda metal şelat benzeşimi Kromatografi22tarafından arındırmak için, arıtma prosedürü sırasında katalitik aktivite önemli bir kaybı sonuçlandı düşük pH koşulları yerine imidazol elüsyon için kullanıldı ( yayımlanmamış veriler, Bauer, ı, 2010).
Tanımlanan enzimatik tahlil protokolünün bir sınırlama radyoaktif substrat kullanımı. Bununla birlikte, floresan bazlı olarak da23,24 ve ticari olarak geliştirilmiştir. Bu yazlar iyi plaklarda gerçekleştirilir ve böylece HDAC inhibitörlerinin yüksek verim taraması için de uygundur. Bu durumda, sunulan prosedürün lüks olması gerekir.
Bu protokolün potansiyel yaklaşan uygulamaları, özel fizyolojik rollerini ve/veya HDAC inhibitörlerine olan duyarlılığının farklılıkları değerlendirmek için sınıf 1 HDACs belirli alt kompleksleri zenginleştirme içerir. Diğer enzimler için açıklanan yöntemi oluştururken, etiketlenmemiş bir gerinim ile negatif kontrol deneyi gerçekleştirmek için önerilir. Bu ölçülen enzim faaliyetlerinin özgüllüğü sağlar ve spesifik olmayan bağlı enzimler tarafından kontaminasyonu ortaya koyacaktır.
Burada açıklanan arıtma ve aktivite tahlil iki gün içinde yapılabilir ve zenginleştirilmiş enzimler en az birkaç ay için kararlı, ne zaman plakaya at-80 °c saklanır. Sonuç olarak bu protokol, sınıf 1 HDAC kompleksini aktivite ölçümü ve inhibitör etkinliğinin belirlenmesi için elde etmenin nispeten basit ve uygun maliyetli bir yolu sağlar.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu makale ile ilgili yardım ve destek için, Moleküler Biyoloji bölümü (Biocenter, Innsbruck Tıp Üniversitesi) Petra Merschak 'a teşekkür etmek istiyoruz. Ayrıca, onların değerli yorumlar için yorumcular teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma Avusturya Bilim Fonu (P24803 SG ve P21087 GB) ve intramural finansman (MUI Start, ST201405031 ıB) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
| 2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
| 25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
| 47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
| AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
| Acetic acid | Roth | 7332 | |
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
| Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
| Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
| BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
| Cell strainer | Greiner | 542040 | |
| Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
| EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
| Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
| Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
| Glycerol | Roth | 3783 | |
| HCl | Roth | 4625 | |
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
| Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
| KOH | Merck | 5033 | |
| Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
| Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
| NaCl | Roth | 3957 | |
| NaOH | Roth | 6771 | |
| Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
| Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
| Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
| peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
| Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
| Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
| Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
| ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
| Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
| Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
| Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
| Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
| Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
| Tris (free base) | Serva | 37190 | |
| Tris-HCl | Roth | 9090 | |
| Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
| Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
| TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |
References
- Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338 (1), 17-31 (2004).
- Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7 (6), (2016).
- Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40 (9-10), 1355-1363 (2018).
- Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31 (14), 3971-3981 (2003).
- Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320 (5882), 1504-1506 (2008).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
- Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
- Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66 (11), 4810-4816 (2000).
- Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
- Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15 (4), 323-331 (1998).
- Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21 (2), 345-353 (2010).
- Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L.
- Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (14), 6259-6265 (2014).
- Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49 (20), 6046-6056 (2006).
- Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10 (1), 61-68 (2003).
- Peng, L., Yuan, Z., Seto, E.
