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Biochemistry

효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 스퍼 질러 스 니 둘 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축

doi: 10.3791/59527 Published: May 1, 2019

Summary

클래스 1 히스톤 디 아 세 틸 아 제 (hdacs) 같은 rpda는 곰 팡이 감염을 치료 하는 잠재적인 대상으로 중요성을 얻고 있다. 여기에서 우리는 히스톤 데 아 세 틸 제 억제제의 시험관 내 효능 테스트를 허용 하는 hdac 활성 분석을 결합 한 탭 태그 rpda의 특정 농축을 위한 프로토콜을 제시 합니다.

Abstract

Rpda와 같은 클래스 1 히스톤 디 아 세 틸 아 제 (hdacs)는 곰 팡이 감염의 치료 및 곰 팡이 이차 대사 산물의 게놈 채굴을 위한 잠재적 인 표적으로 서 중요성을 얻고 있습니다. 그러나 억제제 스크리닝은 정제 된 효소 활동을 필요로 한다. 클래스 1 디 아 세 틸 아 제는 다중 단백질 복합체로 서의 기능을 발휘 하기 때문에, 박테리아에서 단일 폴 리 펩타이드로 서 발현 될 때 일반적으로 활성화 되지 않는다. 따라서, 내 인 성 복합체는 분리 될 필요가 있으며,이는 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피와 같은 종래의 기술이 적용 될 때, 번거롭고 시간이 많이 소요 된다. 탠덤 친화성 정제는 세포 로부터 다중 단백질 복합체를 풍부 하 게 하는 도구로 개발 되었으며, 따라서 내 인 성 효소의 단로에 이상적 이라고 밝혀졌다. 여기서 우리는 아 스퍼 질러 스 nidulans의 C-말기 탭 태그 rpda의 첫 번째 정제 단계를 통해 활성 rpda 복합체의 단일 단계 농축을 위한 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 정제 된 복합체는 이어서 디 아 세 틸 제 분석을 적용 한 후속 억제제 스크리닝에 사용 될 수 있다. 효소 활성 분석 법과 함께 단백질 농축은 2 일 이내에 완료 될 수 있다.

Introduction

Histone 디 아 세 틸 아 제 (HDACs)는 히 돌 및 기타 단백질의 리 신 잔기에서 아 세 틸 그룹을 제거할 수 있는 Zn2 +의존성 가수분해 효소입니다. 시퀀스 유사성에 따라 HDACs는 여러 클래스1로 그룹화 됩니다. 최근, 진 균 클래스 1 HDAC RpdA는 빵집의 효 모 (사 카로 마 세레 비시) Rpd3p의 기립 성 이며, 기회 없는 곰 팡이 병원 균의 아 스퍼 질러 스의 후 미그나 투 스2에 필수적인 것으로 나타났다. 따라서, RpdA는 곰 팡이 감염을 치료 하는 잠재적 인 표적으로 서 중요성을 얻고 있다2. 시험관 내에서의 de아 세 틸 제 활성의 평가는 효소 특성의 특성화에 중요 하며 억제제 개발을 위한 신규 한 물질의 효능을 결정할 수 있게 한다. 대장균 에서 인간 HDAC1의 코 돈 최적화 된 버전의 재조합 발현이 최근 보고 되었지만,이숙주에서 전체 길이 rpda를 발현 하는 시도가 실패4. 또한 RpdA 및 HosA와 같은 균 류 클래스 1 HDACs는 다중 단백질 복합체로 서의 기능을 발휘 하기 때문에 효소 억제제 연구를 위한 천연 내 인 성 복합체를 사용 하는 것이 유리 합니다. 그러나, 억제 요인 및 곰 팡이 용 해물에 다른 HDACs의 존재로 인해, 전체 단백질 추출 물에서 측정 된 촉매 활성은 상대적으로 낮고 개별 효소에 할당 될 수 없습니다. 더욱이, 사상 균 곰 팡이에서의 이전 연구 , hdaa 클래스 2 hdac, 곰 팡이 추출 물의 크로마토그래피 분 획으로 우세한 데 아 세 틸 제를 동정 하였다. 따라서, 다 수의 통상적인 크로마토그래피 정제 단계는 곰 팡이 균 주4에서 비 hdaa 활성을 분리 하기 위해 필요 하다. A. nidulans5 에서 탠덤 친화도 정화 (TAP) 전략의 도입은 특정 디 아 세 틸 제 활동의 농축을 크게 완화 시켰습니다. 원래의 탭 태그는 2 개의 단백질 A 도메인과 cal모듈화 결합 펩타이드 (CBP)가 담배 식 각 바이러스에 의해 분리 된 단백질 분해 효소 (TEV) 절단 부위 (6)로 구성 된다. 이것은 그들의 상호 작용 파트너7를 포함 하 여 태그 된 단백질의 기본 정화 그리고 용 출을 허용 합니다. 활성 분석을 위해 농축 된 단백질을 사용 하는 경우, 프로 테아 제 절단에의 한 천연 조건 하에서의 온화한 용 출은 탭 태그 정제의 중요 한 특징 이다. GFP 태그 단백질은, 예를 들면, 고 정화 항 체에 의해 강화 될 수 있습니다, 그러나, 본래 조건 하에서 용 출 될 수 없습니다.

여기서 우리는 a의 첫 번째 정제 단계를 거쳐 활성 RpdA 복합체의 단일 단계 농축을 위한 상세한 프로토콜을 제공 한다. 이후 억제제 스크리닝을 위한 (IgG 분리 및 tev 절단) 하이 스톤 디 아 세 틸 제 분석. 충분 한 것으로 입증 된 것 처럼, 친화성 강화는 IgG 정제 단독에 비하여 2 단계 탭 정제 후에 효소 활성이 현저히 감소 했기 때문에 단지 하나의 정제 단계로 제한 되었다.

그럼에도 불구 하 고, 도입 된 프로토콜은 아 세 틸 트랜스퍼 제, 메 틸 트랜스퍼 제, 및 탈 메 틸 제와 같은 크로마 틴 조절에 관여 하는 다른 태그 된 효소의 농축에도 적용 될 수 있어야 합니다. 탭 프로토콜의 제 2 정제 단계를 추가 함으로써, 태그 된 미끼와 함께 단백질 공동 정제는 (소설) 효소 복합체의 복잡 한 파트너로 간주 될 수 있다.

Protocol

1. 니 둘 란 스의 재배

  1. 접종 물 준비
    주: 인큐베이션과는 별개로 모든 단계는 층 류 캐비닛에서 수행 해야 합니다.
    1. 연속 탭 스트레인 (예를 들어 tib 32.1)에서 글리세롤 스톡 (-80 ° c)에서 포도 당/자일 로스 최소 배지 (gxmm; 당 리터 10.0의 포도 당 0.5 g의 혈당, 10ml(1m의 디 암모늄 타르트 레이트 50 용액 20ml × 염 26.0 용액 20ml KCl, 26.0 g · 7h2o, 76.0의 클로로포 름 1 ml), 1.5%의 한 천을 포함 하는 1000 × 허 트 너의 미 량 원소8) 및 토 드 외. 20079에 기술 된 바와 같이 필요한 보조 제. 37 ° c에서 2 ~ 3 일 동안 배양 합니다.
      참고: TIB 32.1에는 Rpda가 포함 되어 있습니다:: 탭 융합은 자일 로스-유도성 프로모터, xylp(p.10)에 의해 제어 된다. 이것이 자일 로스가 위의 레시피에 포함 된 이유입니다. Xylp(p) 컨트롤 아래에 있지 않은 구조를 표현 하는 균 주를 재배 할 때 자일 로스를 생략 하십시오.
    2. 멸 균 된 침 엽 다이얼 서 스 펜 션 솔루션 (80 polysorbate의 0.9%) 염화 나트륨, 0.01% (v/v)를 1.5 가진 멸 균 1.5 ml 원심 분리기 튜브를 준비 합니다.
    3. CSS에서 일회용 접종 루프를 적시고 1.1.1 단계에서 플레이트에서 침 엽 직경을 긁어 내 고 1.1.2 단계에서 튜브를 일시 중단 합니다.
    4. 전송 150 µ L는 10 25의 보충 및 200 µ L 을 포함 하 여 GXMM 한 천을 포함 하는 벤 트 캡이 들어 있는 침 엽 다이얼 서 스 펜 션의 각각의 구 수로 각이 있습니다.
    5. 멸 균 접종 루프를 사용 하 여 플라스 크 내 침 엽 다이얼 현 탁 액을 확산 하 고 2 ~ 3 일 동안 37 ° c에서 플라스 크를 배양 합니다.
    6. 침 엽 직경을 수확 하려면 플라스 크 당 10 mL의 CSS를 사용 하십시오. 용액을 플라스 크에 붓고, 제공 된 스크류 캡으로 플라스 크를 단단히 닫고 플라스 크를 세게 흔들어 줍니다.
    7. 곰 팡이 표면을 습윤 한 후, 멸 균 접종 루프로 남아 있는 침 엽 dia를 완전히 긁어 냅니다.
    8. 40 µm 세포 스 트레이너를 통해 침 엽 디 아를 통과 시켜 50 mL 원심 분리기 튜브에 넣고 하나의 튜브에서 5 플라스 크의 현 탁 액을 수집 합니다.
    9. 10 분 동안 1000 × g 에서 튜브를 원심 분리기.
    10. 상층 액을 decant 하 고 튜브 당 CSS의 10ml로 펠 렛을 소생 시킵니다.
    11. 1.1.9 단계에서 설명한 바와 같이, 하나의 튜브에서 두 현 탁 액을 모두 모으고, 빈 튜브를 CSS의 40 mL로 헹 구 고, 현 탁 액에 추가 하 고, 원심 분리기를 사용 하십시오.
    12. 상 청 액을 decant 하 고, CSS의 4 mL에 침 엽 다이얼 펠 렛을 소생.
    13. 침 엽 다이얼 서 스 펜 션의 시리얼 1:50 희석 액을 2 개 준비 하 고, 그 결과를도11과 같이 카운팅 챔버로 생성 된 1:2, 500 희석 현 탁 액의 침 엽 수를 결정 한다.
  2. 균 사체의 성장과 수확
    1. 층 류 캐비닛 하에서 작업 하는 동안, 각각 5×106 침 엽 dia/mL의 밀도에서 적절 한 보충제를 포함 하 여 250 mL의 1 리터 원추형 플라스 크를 함유 하는 접종 하 고 14~16h의 37 ° c에서 180 rpm으로 배양 한다.
    2. 치즈 천을 플라스 크 위에 있는 깔때기에 넣고 천을 통해 균 사체를 걸러냅니다. 탈 이온 수로 간단히 씻으십시오.
    3. 첫 번째 손과 종이 타월 사이에 치즈 천에 갇힌 균 사체를 압착 하 여 최대한 많은 수 분을 제거 하십시오.
    4. 스크류 뚜껑이 있는 플라스틱 비 커에 건조 된 균 사체를 평평한 시트로 옮겨 액체 질소로 플래시를 고정 합니다. 이는 다음 동결 건조 과정에 대 한 높은 면적/부피 비를 보장 한다.
    5. 냉동 균 사체을 동결 건조 전에-80 ° c에서 보관 하십시오.
      참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다.
    6. 밤새 균 사체을 동결 건조 한다.
    7. 균 사체 온도가 일정 하 게 유지 되 면 동결 건조 과정을 중지 합니다 (18 ~ 24 시간). 비 커를 제거 하 고 제공 된 스크류 캡으로 즉시 밀봉 하십시오.
      참고: 단단히 밀봉 할 때, 동결 건조 균 사체 RT에서 몇 주 동안 저장할 수 있습니다.

2. 탭 태그 HDAC의 단일 단계 보강 (Bayram 2012)12

  1. 버퍼 및 솔루션 준비
    참고: 사용 하기 바로 전에 버퍼에 진단을 (EtSH) 및 프로 테아 제 억제제를 추가 하십시오. 0.22 µm 니트로 멤브레인을 통해 크로마토그래피에 사용 되는 모든 버퍼를 필터링 하 여 크로마토그래피 수 지에 불순물/오염을 도입 하지 않도록 합니다. 아래 단계의 지침은 각 버퍼의 1 L 준비를 참조 하십시오. 4 ° c에서 버퍼를 저장 합니다.
    1. 추출 완충 액 (B250): 250 염화 나트륨, 100 mM 트리-HCl pH 7.5, 5Mmetsh의 0.1% (v/v 100)
      1. 12.35 g의 트리 스-HCl을 2.62의 트리 스 (무료 베이스) 및 탈 이온 수의 800 mL의 염화 나트륨 13.2 g을 넣고 10Ml(v/v) TX-100 용액 10ml를 첨가 한다.
      2. RT에서 pH를 확인 하 고 필요에 따라 NaOH 또는 HCl을 사용 하 여 pH 7.5으로 조정 하십시오.
      3. 최대 1l를 구성 하 고 0.22 µm 니트로 멤브레인을 통해 필터링 할 수 있습니다.
      4. 35 µ L의 EtSH를 사용 하기 바로 전에 100 mL의 완충 액 (5mm 최종 농도)에 추가 하십시오.
    2. 세척 완충 250 (WB250): 250 mM 염화 나트륨, 40 mM 트리-HCl pH 8.0, 5Mmetsh의 0.1 (v/v)
      1. B250에 대해 설명 된 바와 같이 WB250를 준비 하 되, 3.59 g의 트리-HCl과 2.08 g의 트리 (프리 베이스)를 사용 합니다.
    3. 세척 완충 150 (WB150): 150 mM 염화 나트륨, 40 mM 트리-HCl pH 8.0, 5Mmetsh의 0.1 (v/v)
      1. B250에 대해 설명 된 바와 같이 WB150를 준비 하 되, 3.59 g의 트리 트리-HCl을 2.08의 트리 트리 (유리 염기) 및 8.77 g의 염화 나트륨으로 제조 하였다.
    4. TEV 평형 완충 액 (TEV): 150 염화 나트륨, 40 mM 트리 스-HCl의 pH 8.0, 0.5 m-0.1, 5mm EtSH.
      1. WB150와 동일 하지만 EDTA를 0.5 최종 농도로 추가 합니다.
    5. Tev 절단 버퍼 (TCB): 150 mm 염화 염, 40 mm 인 트리 스-HCl의 pH 0.1 0.5 8.0, 5mm~10% (v/v) 글리세롤, 5mm etsh.
      1. 2.1.1 단계에서 설명 된 대로 준비 하 고 3.59 g의 트리 스-HCl을 2.08 g의 트리 (유리 염기) 및 염화 나트륨 8.77 g을 사용 하 여 부피를 1l로 조절 하기 전에 글리세롤의 100 mL을 첨가 한다.
    6. 50 × 프로 테아 제 억제제 칵테일: 시판 되는 프로 테아 제 억제제의 1 정을 1 mL의 물에 녹여-20°c에서 보관 한다.
    7. 50의 경우 트리 트리-HCl pH 7.6, 0.9%의 염화 나트륨, 0.1% (v) polysorbate
      1. 2.1.1 단계에서 설명한 대로 준비 합니다. 6.06 g의 트리 트리-HCl 1.40 g, 염화 나트륨 polysorbate, 1Ml의 1 mL를 사용 합니다.
    8. 5 × LSB (Laemmli 샘플 버퍼): 315 mM 트리 스-HCl pH 6.8, 105v(v/v) 글리세롤, 0.05% (v) 브로 모 페 놀 블루 .이 하에는 510(50 v/v)
  2. 단백질 추출 물의 제조
    1. 볼 밀의 분쇄 용기에 동결 건조 균 사체 분쇄 공을 1.5 g 추가 하십시오.
      참고: 신선한 균 사체도 사용할 수 있습니다. 그렇게 할 때, 동결 전에 가능한 한 완전히 균 사체 건조 하 고 신선한 균 사체을 분쇄 하기 위한 액체 질소의 분쇄 항아리를 미리 냉각 해야 합니다.
    2. 30 초 동안 25hz에서 균 사체 분말로 갈아 냅니다.
      참고: 연 삭 기를 사용할 수 없는 경우에는 Bayram et al 에 설명 된 바와 같이 박격포와 유 봉 (균 사체)을 사용 하 여 분말로 갈아 냅니다. 12.
    3. 균 사체 분말을 15 mL 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
    4. 그라운드 균 사체를 포함 한 원심 분리기 튜브를 기울여 버퍼와 균 사체의 후속 혼합을 허용 합니다.
    5. 균 사체 파우더 그램 당 1 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함 한 아이스 콜드 B250 6 mL를 첨가 하 고, 조 추출 물의 완전 한 균질 화를 달성할 때까지 작은 주걱으로 블렌딩 한다. 신선한 균 사체를 사용 하는 경우, Bayram et al 을 참조 하십시오. 12 . 추출 버퍼 비율에 적합 한 바이오 매스를 달성 한다.
    6. 튜브를 얼음에 5 분간 보관 하십시오.
    7. 튜브와 평형 튜브를 원심 분리기에 놓고 4만 × g 에서 4 ° c에서 20 분 이상 회전 합니다. 상기 원심 분리 시 IgG 수 지 (단계 2.3)의 평형을 수행 한다.
    8. 원심 분리 후, 상 청 액의 10 µ L을 제거 하 여 SDS-PAGE 분석을 한다. 40 µ의 물과 12.5 µ L의 5 × LSB를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 샘플을 놓습니다. 그림 1에서 "Ex" 라고 합니다.
    9. 세 혈 학 피 펫을 이용 하 여 상층 액 (제거 된 파쇄 물)을 조심 스럽게 제거한 후, 제공 된 말단 캡을 이용 하 여 긴밀 하 게 밀착 된 IgG 비드 (단계 2.3)를 포함 하는 칼럼 상에 전사 한다.
  3. IgG 수 지의 평형 화 (단계 2.2.7 중에 수행 됨)
    1. 열에 재현 탁 IgG 수 지 (50% 슬러리)의 10 mL 일회용 크로마토그래피 컬럼 및 pipet 300 µ L을 준비 한다. B250를 사용 하 여 열을 10ml로 채우고 버퍼가 중력을 통과 하도록 합니다.
    2. 1 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 포함 한 B250 1 mL를 첨가 하 고 흐르는 것을 보자. 기둥의 하단을 연결 합니다.
  4. 탭 태그 HDAC의 배치 정제
    1. 회전 믹서에서 2.2.9 단계부터 2 ~ 4 시간 동안 4°c에서 10rpm으로 평형 화 비드 및 제거 된 파쇄 물이 포함 된 크로마토그래피 컬럼을 배양 합니다.
    2. 배치 바인딩 후, 캡을 제거 하 고 아래쪽의 열을 열어 플로우 스루를 수집 합니다.
    3. 2.2.8 단계에서 설명한 대로 SDS-PAGE 분석을 위한 샘플을 가져가 라. 그림 1에서 "FT" 라고 합니다.
    4. WB250 10ml의 구슬 세척. 먼저, 1 mL의 완충 액을 사용 하 여 칼럼 캡에서 트랩 된 비드를 제거 하 고이 현 탁 액을 침전 된 수 지에 한 플러시로 옮겨 구슬의 소생을 허용 합니다. 그런 다음 기둥을 상단에 채우고 스택 캡을 사용 하 여 닫은 후 연동 펌프에 연결 합니다. 유량을 약 1 ~ 5ml/min으로 조절 합니다. 수 지가 건조 하 게 작동 하지 않도록 합니다.
    5. 2.4.4 단계를 3 번 반복 하 여 총 4 회 세척을 WB250.
    6. 2.4.4 단계에서 설명한 바와 같이 10ml의 TEB로 비드를 세 번 씻으십시오.
    7. 하단에 있는 크로마토그래피 칼럼을 닫고, TCB 1 mL의 IgG 비드를 분해 하 고 50 × 프로 테아 제 억제제 칵테일을 20 µ, tev(~1~1mg/ml 스톡 S219V 돌연변이 변이체를 생성 하는 10 µ l)를 첨가 한다.
    8. 칼럼에 캡을 하 고 4 ° c에서 10 rpm으로 회전 혼합기에서 배양 하 여 태그 드 HDAC를 통해 결합 된 단백질 복합체를 용 출 시킨다.
      참고: 또한 온도 (16~25°c)에서 TEV 다이제스트를 수행 하 여 반응 시간을 단축 시킬 수 있지만 단백질 분해의 위험을 높이는 것입니다.
    9. 다음날 열을 열고 2 mL 원심 분리기 튜브에 용 출 액를 수집 합니다. 0.7 mL의 TCB를 사용 하 여 뚜껑에서 구슬을 제거 하 고 기둥의 벽을 헹 굽 니다.
    10. 그 자체가 50 mL 원심 분리기 튜브 내에 배치 되는 이전 단계에서 열린 2 mL 튜브에 컬럼을 놓습니다.
    11. 이 조립품을 테이블 상단 원심 분리기로 전송 하 고 2 분 동안 300 × g 에서 회전 시킵니다. 이것은 TEV 용 출 액.
      주: 탠덤 선호도 정제를 수행할 때 cal모듈화 선호도 단계에 대 한 입력으로 TEV 용 출 액를 사용 합니다. 또한 TEV 용 출 액를 분할 하 고 HDAC 활동 결정을 위해 한 부분을 사용 하 고 두 번째 부분은 탭 정제를 완료 할 수 있습니다.
    12. TEV 용 출 액에서 50 µ L을 제거 하 고 SDS 페이지 ( 그림 1 및 2에서 ' TE ' 라고 함)의 12.5 µ l을 추가 하 고 나머지 용 출 액을 얼음에 보관 하십시오.
    13. 프로 테아 제 용 출의 효능을 평가 하기 위해, 5%의 아세트산을 2 mL를 넣고 5 분간 RT에서 배양 한다. 다시, 첫 번째 mL을 사용 하 여 수 지를 소생 시킵니다.
    14. 산 용 출 액를 수집 하 고 다시 50 µ L 샘플을가지고 5 × LSB의 12.5 µ L을 추가 ( 그림 1에서 "AE" 라고 함). 산 성 용액에 첨가 하면 LSB 황색으로 바뀝니다. 산을 중화 시키기 위해 1 µ L의 단계에서 10 M NaOH를 추가 하 고 색상이 다시 파란색으로 바뀔 때까지 잘 섞어 줍니다.
    15. IgG 수 지를 TBS-T로 평형을 다시 하 여 산을 중화 시킵니다. 수 지를 4°c에서 TBS-T20v(v/v) 에탄올에 보관 하 여 동일한 태그 단백질로 재사용 하십시오.
  5. 용 출 분 획의 저장
    1. 용 출 액는 ~ 100 µ L 분 획으로 여러 동결-해 동 주기를 피하기 위해.
    2. 액체 질소의 분 취를 동결 하 고-80 ° c에서 유지 하십시오.
      참고:이 방법으로 저장 된 샘플은 효소 활동을 잃지 않고 수개월 동안 안정적입니다.

3. SDS-PAGE 및 웨스턴 블로 팅에의 한 정제의 분석

  1. 표준 프로토콜을 사용 하 여 SDS 폴 리 아크릴 아 미드 겔을 주조 하거나 프리 캐스트 겔을 사용 합니다. 이전 섹션에서 5 분 동안 95 ° c에서 겔 샘플을 변성 하 고, ≥ 15000 × g 에서 5 분간 원심 분리 하 고 12% 젤에 적재 합니다. 권장 되는 로드 볼륨은 그림 1의 범례에 나와 있습니다. 샘플을 1 × 트리 스-글리신의 SDS-PAGE 실행 버퍼에서 60 ~ 70 분간 일정 하 게 하 고, SDS-PAGE 로딩 버퍼의 브로 모 페 놀의 블루 마커가 겔 밖으로 마이그레이션하기 시작할 때까지 전 180.
  2. 젤의은 염색에는 표준 프로토콜을 사용 합니다. 예를 들어, Blum et al 프로토콜을 사용 합니다. 198714 는 MS 분석과도 호환 됩니다.
  3. 웨스턴 블로 팅15에 표준 프로토콜을 사용 합니다. 대표적인 결과의 생성을 위해, 시판 되는 블 롯 시스템을 사용 하였다.
  4. 시판 되는 항-cal모듈화 결합 단백질 (안티 CBP) 항 체를 포함 하는 프로브 블 롯은 4°c에서 하룻밤 동안 5%의 우유 분말로 밀크 파우더를 사용 한다.
    참고: 안티-CBP 항 체는 TEV 절단 후 여전히 존재 하는 탭 태그의 부분에 대 한 지시.
  5. Blots의 검색 및 개발에 표준 프로토콜을 사용 합니다. 예를 들어, 항-토끼 IgG-알칼리 성 인산 가수분해 효소 결합체 및 BCIP/NBT 색 개발 기질은 아래의 대표적인 결과의 생성을 위해 사용 되었다.

4. 시험관 내에서 사용 하는 데 아틸 제 분석 [3 시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 망상 히 돌 (트 로 지에 적응 2003)4

  1. [3시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 망상 히 돌의 제조를 위해 kölle 외. 199816 의 프로토콜을 참조 하십시오.
  2. 분석 조건 당 3 개의 1.5 mL 원심 분리기 튜브를 얼음에 넣고 삼중으로 측정 합니다. 또한 버퍼 전용 배경 제어를 위해 세 개의 튜브를 준비 합니다.
  3. 각 튜브에 WB150 25 µ L을 넣고 단계 2.4.11에서 TEV 용 출 액의 25 µ L을 추가 하 고 얼음을 유지 합니다.
  4. 튜브 인큐베이터를 25°c로 예 열 합니다.
  5. 각 튜브에 라벨링 된 하이 스톤 [1.5 밀리 리터]의 10 µ L을 추가 하기 위해 15 초 간격 (스톱 워치)을 사용 하십시오.
  6. 분석을 시작 하기 전에 [3시간] 아세테이트 레이블이 붙은 치킨 히 돌의 10 µ l을 차지 하 고 스톱 워치를 시작 합니다.
  7. 시작 후 5 초 후에 레이블이 붙은 histones를 추가 하 고 튜브를 단단히 닫고 소용돌이를 인큐베이터에 넣습니다.
  8. 레이블이 지정 된 히스톤의 10 µ l을 추가 하기 위해 15 초 간격을 사용 하 고 이전 단계에서 설명한 대로 진행 합니다.
  9. 60 분 인큐베이션 후에 각 튜브에 15 초 간격으로 50 µ L의 스톱 용액 (1m HCl/0.4m 아세트산)을 첨가 한다. 소용돌이가 즉시. 산 성 용액의 첨가 후, 어 세이 믹스는 안정 하 고 다음 단계까지 RT에서 유지 될 수 있다.
  10. 각 튜브에 800 µ L의 에틸 아세테이트를 첨가 하 여 방출 된 [3시간] 아세트산을 추출 한다.
  11. 5 초 동안 튜브와 소용돌이 각 튜브를 단단히 닫습니다.
  12. 튜브를 마이크로 원심 분리기에 넣고 RT에서 10 분 동안 1만 × g 로 돌립니다.
  13. 그 동안에, 분석 샘플 당 하나의 섬광 유리병을 준비 하 고 소수 성 샘플에 대 한 3 mL의 섬광 칵테일을 추가 합니다.
  14. 원심 분리 후 (단계 2.12), 상부 유기 물의 600 µ L을 준비한 섬광 관에 조심 스럽게 전달 하 고 튜브를 단단히 닫습니다.
  15. 액체 섬광 카운터에서 HDAC 활성에 상응 하는 방사능을 측정 한다.

Representative Results

RpdA의 제시 된 단일 단계 농축의 전형적인 결과는 도 1 에 나타나 있다 (' IgG ' 라 함). 완전성을 위해서, 우리는 또한도12에 기술 된 바와 같이 cal모듈화 수 지 (CaM)에의 한 제 2 정제 단계를 설명 하는 흐름 스루 및 용 출 분 획 (' cft ' 및 ' CE ')을 포함 시켰다. 표시 된 실버 스 테 인 젤 (A)은 탠덤 정제를 수행 하였을 때 더욱 증가 되는 제 1 친화성 단계의 효능을 명확 하 게 나타낸다. 단백질 추출 물에 존재 하는 가장 두드러진 단백질 및 흐름-스루, 그러나, 이미 TEV 용 출 액 (TE)에서 고갈 된다. TEV 용 출 분 획은 추출 물 및 흐름 통과에 비해 100 × 농축 > 것을 주목 하는 것이 중요 하다. 별표 태그는 RpdA (비교 패널 B)에 표시 됩니다. 상기 CBP를 포함 하는 RpdA의 산출 된 MW는 82 kDa 이지만, 단백질은 약 120 kDa의 훨씬 더 높은 겉보기 분자량에서 마이그레이션합니다. 이러한 현상은 이전에 관찰 되었으며 C-말단4,17의 특정 성질에 할당 될 수 있다. 면역 세포 (B)는 tev 용 출 액에 해당 하는 cbp 태그 풀 길이 RpdA (RPDA: cbp)에 상응 하는 약 120 kDa에서 이동 하는 강력한 신호를 표시 하 고, 칼 모듈 린 흐름 스루 (' cft ') 및 용 출 액 분 획을 나타낸다. 산 용 출 액 ("AE")에서 약간 큰 MW의 두 번째 신호가 보입니다. 이는 TEV 절단에 의해 방출 되지 않은 IgG 수 지에 결합 된 탭 태그 RpdA의 비율을 나타낸다. 크기의 차이는 단백질의 16 kDa에 해당 합니다. 절단 되지 않은 RpdA의 반복:: 누릅니다. 예상 대로, 야생 형 제어 분 획에서 항-CBP 항 체에 의해 어떤 밴드가 검출 될 수 없다 (패널 B, ' 와일드 타입 ').

특정 HDAC 억제제 인 트리 코 스타 틴 A (TSA)를 사용한 대표적인 디 아 세 틸 제 활성 분석의 결과를 도 2에 표시 하였다. 이 분석은 본래 식물 (18 )을 위해 개발 되었으며 또한 포유류 디 아 세 틸 아 제19,20에 대 한 억제제 스크리닝에 사용 되어 왔다. 상기 검정에 사용 되는 히 돌을 표지 하 고, 상기 기재 된16과 같이 제조 하였다. 농축 된 RpdA 복합체 ("TE ± TSA")의 촉매 활성에 대 한 TSA의 농도가 증가 하는 효과를 나타내 었 다. 활동의 민감도는 측정 된 cpm 값이 실제로 RpdA에 기인 하 고 비 특이 적 프로 테아 제 활성에의 한 것이 아니라는 것을 확인 합니다. 이것은 다소 높은 농도로 존재 하는 TEV가 HDAC 활성 분석을 방해 하지 않음을 나타내는 중요 한 관찰입니다. 측정 된 HDAC 활성을 RpdA에 할당 하기 위해 야생 형 스트레인을 음성 대조 군 ("Co")으로 사용 하였다. 예상 대로 야생 유형의 TEV 용 출 액에서 한계 HDAC 활성 (RpdA 농축 분 획의 약 5-10%)만 검출 되었습니다. 흥미롭게도, TEV 용 출 액에 비하여 HDAC 활성은 두 번째 친화성 정제 단계 (' CE ') 후 현저히 감소 한다.

Figure 1
그림 1입니다. 탠덤 선호도 청교도 탭 태그 RpdA의. 실버 스 테 인 10%의 SDS 폴 리 아크릴 아 미드 겔 (a) 및 항-CBP 항 체 (B)를 사용한 웨스턴 블 롯 프로 베드가 표시 된다. 차선 라벨링 및 로드 볼륨은 다음과 같습니다: "M" 1:10 희석 된 미 염색 단백질 마커 (은 얼룩), 3.5 µl의 프리 스 테 인 단백질 마커 (웨스턴 블 롯); "Ex": 2.2.8 단계에서 제조 된 단백질 추출 시료 (2 µl의 1:10 희석, 5 µl); 「 FT 」: IgG 수 지는 단계 2.4.3에서 제조 된 플로 스루 시료 ( µ1:10 희석 액, 5 µl); 「 AE 」: 2.4.14 용 출 액의 산 성 ( 10µl, 10 µl); 「 TE 」: tev 용 출 액에의 한 용 출의 TEV의 절단, 스텝 2.4.12 (10µ l, 10µ l); "CFT": 칼 모듈 렌 흐름을 통해 (20 µ µ L); 용 출 액 10µ, 10µ L)을 제공 합니다. 선택 된 마커 단백질의 크기는 패널의 좌측에 표시 된다. 괄호 안에 지정 된 체적은 각각 은색 얼룩 및 웨스턴 블 럿의 샘플 하 중에 해당 합니다. 실버 스 테 인 젤의 별표는 RpdA 융합 단백질을 나타냅니다. 면역 세포 (B)는 bcip/nbt 색 개발 시스템을 사용 하 여 알칼리 인산 가수분해 효소로 검출 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 트리 코 스타 틴 A의 증가 농도 하에서 HDAC 활성 분석. RpdA 저해의 효능은 RPDA-1640 배지에 희석 된 HDAC 억제제의 µ, 50 및 500 nM의 친화성-정제 된 재조합 RpdA ("TE")와 25µ l로 시험 하였다. RPMI는 백그라운드 활동 ("공백")을 평가 하는 데 사용 되었습니다. 제 2 cal모듈화 친화성 단계 (' CE ') 및 첫 번째 친화성 정제 단계 후의 태그 없는 변형 후의 최종 용 출 액의 활동 (음성 대조 군, ' Co ')이 표시 된다. 활동은 TSA (100%)가 없는 농축 된 RpdA의 비율로 표시 됩니다. 오차 막대는 3 개의 복제의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림은 바 우 어 외. 20162에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜은 시험관 내 데 아 세 틸 제 활성의 평가를 위해 탭 태그 클래스 1 HDAC를 사상 균 류 a. nidulans 로부터 단일 단계 보강을 설명 합니다. 탭 태그는 태그 된 단백질6의 단백질-단백질 상호 작용 파트너의 식별을 위해 베이커의 효 모에서 처음 소개 되었습니다. 이어서, 태그는 a. nidulans 에서의 그것의 사용에 대 한 코 돈 최적화 되었다 5. 여기서 우리는 클래스 1 HDAC RpdA의 단일 단계 보강을 위한 탭 전략의 제 1 친화성 정제 단계의 적용을 위한 스트레이트 포워드 단계별 프로토콜을 제공 한다. 두 번째 친화성 정제 단계는 정제의 수준을 명확 하 게 증가 시키며,이는 미끼-상호작용 단백질의 동정에 특히 중요 하다. 그럼에도 불구 하 고, 첫 번째 단계는 후속 활성 테스트를 위해 권장 되며, 이후 첫 번째 단계 이후 상당한 오염의 결여는 야생 형 균 주를 이용한 대조 실험에 의해 확인 되었다. 또한, 용 출 활동은 전체 탭과 비교 했을 때 단일 단계 농축 후 상당히 더 높습니다. RpdA2외에도,이 프로토콜은 또한 제 2 클래스 1 Hdac hosa21. 니 둘 란 스 복합체의 정제를 위해 성공적으로 사용 되었다.

때문에 곰 팡이 클래스 1 HDACs는 안정 된 단지를 구축 우리의 관측4, 우리는 bayram 외에 의해 프로토콜을 수정 하는 데 성공 했습니다 . 201212 이 방법의 기초를 나타냅니다. 그럼에도 불구 하 고 몇 가지 중요 한 단계를 언급 해야 합니다. 고도로 농축 된 단백질 추출 물의 제조는 복잡 한 안정성을 위해 매우 중요 한 생리 적 상태를 보장 합니다. 따라서 바이오 매스/추출 완충 액 비율에 관한 주어진 권장 사항을 염두 하는 것이 중요 합니다. 이러한 측면에서, 적절 한 추출을 보장 하기 위해 잘 분쇄 된 미세한 균 사체 분말을 사용 하는 것도 중요 합니다. 여기서, 연 삭 기의 사용은 명백 하 게 유리 하다. 상기 프로토콜 섹션에서 언급 한 바와 같이, 정제 속도를 높이기 위해 실 온에서 1-2 h에 대 한 TEV-절단 단계를 시도 하는 것이 가치가 있다. 이는 안정성에 대 한 해로운 영향을 관찰 하지 않고 RpdA에 대해 테스트 되었습니다 (미 출판 관찰, 바 우 어 I, 2018). 또한 NP40 (원래 프로토콜에서 사용 100)의 교체는 다른 단백질 복합체에 적합 하지 않을 수 있습니다. 다른 탭 태그 단백질의 정제를 위해이 방법을 사용 하는 경우, 또 다른 단백질 복합체의 충분 한 정제에 도움이 될 수 있는 유용한 힌트의 번호를 포함 하는 Bayram 프로토콜을 참조 해야12.

여기에 설명 된 탭 방법 외에도, 다른 선호도 태그 및 기술은 일반적으로 그의-및 GFP 태그를 포함 하 여 사상 균 류의 단백질의 단일 단계 농축에 사용 됩니다. 그러나 1 급 HDACs는 일반적으로 고 분자량 복합체로 서 기능적으로 작용 하므로, 기본 용 리 조건은 촉매 활성 HDACs의 농축을 위한 전제 조건입니다. 중요 한 것은, 다른 많은 친화도는 불리 한 조건 하에서 수행 됩니다. 예를 들어, 항 원 항 체 상호작용을 기반으로 하는 GFP 덫을 통한 HDACs의 농축은 수 지에 결합 된 HDACS 복합체의 단백질 단백질 상호작용을 방해 하는 산 성 용 출 조건 때문에 적합 하지 않습니다. 더욱이, 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (22)에 의해 그의 태그 rpda를 정제 하려는 시도는 낮은 pH 조건을 대신 하 여 이미 다 졸이 용 출을 위해 사용 되었으나 정화 과정 중에 촉매 활성의 현저한 손실을 초래 하였다 ( 게시 되지 않은 데이터, 바 우 어, I, 2010).

설명 된 효소 분석 프로토콜의 한 가지 제한은 방사성 기질을 사용 하는 것 이다. 그러나 형광에의 한 분석 법은23,24 로 개발 되어 시판 되 고 있다. 이러한 분석은 웰 플레이트에서 수행 되므로 HDAC 억제제의 고 처리량 스크리닝에도 적합 합니다. 이 경우, 제시 된 절차의 고급이 필요 합니다.

이 프로토콜의 잠재적으로 다가오는 응용 프로그램은 그들의 특정 생리 적인 역할 및/또는 HDACS 억제제에 그들의 감수 성에 차이 평가 하기 위해 클래스 1 HDACs의 특정 하위 복합체의 농축을 포함 한다. 다른 효소에 대해 설명 된 방법을 확립 할 때 태그 없는 변형을 사용 하 여 네거티브 컨트롤 실험을 수행 하는 것이 좋습니다. 이는 측정 된 효소 활동의 특이성을 보장 하 고 비 특이 적으로 결합 된 효소에의 한 오염을 드러낼 것입니다.

여기에 기재 된 정제 및 활성 분석은 2 일 이내에 수행 될 수 있고 농축 된 효소는-80 ° c에서의 ali쿠오 트에 저장 될 때 적어도 몇 개월 동안 안정 하다. 결론적으로,이 프로토콜은 활성 측정 및 억제제 효능의 결정을 위해 클래스 1 HDAC 복합체를 달성 하는 비교적 간단 하 고 비용 효율적인 방법을 제공 합니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

우리는이 원고에 대 한 그녀의 도움과 지원에 대 한 분자 생물학 (바이오 센터, 인스부르크의과 대학)의 부문 페트라 Merschak에 감사 하 고 싶습니다. 또한, 우리는 그들의 귀중 한 의견에 대 한 검토자에 게 감사 하 고 싶습니다.

이 사업은 오스트리아 과학 기금 (P24803와 P21087에서 GB)과 교내 자금 조달 (MUI 스타트, ST201405031에서 IB)에 의해 지원 되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 x SDS-PAGE running buffer Novex
2-mercaptoethanol (EtSH) Roth 4227
25 cm2 cell culture flasks with vent cap Sarstedt 833910002 For spore production
47 mm vacuum filtration unit Roth EYA7.1
AccuFLEX LSC-8000 HITACHI Scintillation counter
Acetic acid Roth 7332
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody Millipore 07-482 Used at 1:1333 dilution
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody Sigma-Aldrich A3687
Ball mill Retsch 207450001 Mixer Mill MM 400
BCIP/NBT Promega S3771 Color development substrate for AP
Cell strainer Greiner 542040
Cheese cloth for harvesting mycelia BioRen H0028 Topfentuch
Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth 4720
EDTA Prolabo 20309.296
Ethyl acetate Scharlau Ac0155
Freeze Dryer LABCONCO 7400030 FreeZone Triad
Glycerol Roth 3783
HCl Roth 4625
IgG resin GE Healthcare 17-0969-01 IgG Sepharose 6 Fast Flow
Inoculation loops VWR 612-2498
KOH Merck 5033
Laminar flow cabinet Thermo Scientific Hera Safe KS
Mixed Cellulose Esters Membrane Filters Millipore GSWP04700
NaCl Roth 3957
NaOH Roth 6771
Neubauer counting chamber improved Roth T728
Novex gel system Thermo Scientific For SDS-PAGE
Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) Thermo Scientific LC2675 Running buffer for SDS-PAGE
peqGold protein-marker II VWR 27-2010P Protein ladder used for silver stain
Peristaltic Pump P-1 GE Healthcare 18111091
Pipette controller Brand 26302 accu-jet pro
Poly-Prep chromatography columns Bio-Rad 731-1550
ProSieve QuadColor protein marker Biozym 193837 Prestained protein ladder used for western blot
Protease inhibitor cocktail tablets Sigma-Aldrich 11873580001 cOmplete, EDTA-free
Rotary mixer ELMI Intelli-Mixer RM-2 S
Rotiszint eco plus Roth 0016
RPMI-1640 Sigma-Aldrich R6504
Scintillation vials Greiner 619080
Sorvall Lynx 4000 Thermo Scientific
Thermomixer comfort Eppendorf
TIB32.1 A. nidulans rpdA::TAP strain.
Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1;
argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit Bio-Rad 1704271
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad 1704150
Trichostatin A (TSA) Sigma-Aldrich T8552 5 mM stock in DMSO
Tris (free base) Serva 37190
Tris-HCl Roth 9090
Polysorbate 20 Roth 9127 Tween 20
Polysorbate 80 Sigma-Aldrich P1754 Tween 80
TX-100 Acros Organics 215682500 Triton X-100, Octoxynol-9 detergent

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References

  1. Gregoretti, I. V., Lee, Y. -M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. Journal of Molecular Biology. 338, (1), 17-31 (2004).
  2. Bauer, I., et al. A Class 1 Histone Deacetylase with Potential as an Antifungal Target. mBio. 7, (6), (2016).
  3. Stefan, A., et al. Purification of active recombinant human histone deacetylase 1 (HDAC1) overexpressed in Escherichia coli. Biotechnology Letters. 40, (9-10), 1355-1363 (2018).
  4. Trojer, P., et al. Histone deacetylases in fungi: novel members, new facts. Nucleic Acids Research. 31, (14), 3971-3981 (2003).
  5. Bayram, Ö, et al. VelB/VeA/LaeA complex coordinates light signal with fungal development and secondary metabolism. Science. 320, (5882), 1504-1506 (2008).
  6. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, (3), 218-229 (2001).
  7. Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, (10), 1030-1032 (1999).
  8. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48, (2001).
  9. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2, (4), 811-821 (2007).
  10. Zadra, I., Abt, B., Parson, W., Haas, H. xylP promoter-based expression system and its use for antisense downregulation of the Penicillium chrysogenum nitrogen regulator NRE. Applied and Environmental Microbiology. 66, (11), 4810-4816 (2000).
  11. Stolz, D. J., et al. Histological Quantification to Determine Lung Fungal Burden in Experimental Aspergillosis. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  12. Bayram, Ö, et al. Identification of protein complexes from filamentous fungi with tandem affinity purification. Methods in Molecular Biology. 944, 191-205 (2012).
  13. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, (5259), 680-685 (1970).
  14. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8, (2), 93-99 (1987).
  15. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
  16. Kölle, D., et al. Biochemical methods for analysis of histone deacetylases. Methods. 15, (4), 323-331 (1998).
  17. Tribus, M., et al. A novel motif in fungal class 1 histone deacetylases is essential for growth and development of Aspergillus. Molecular Biology of the Cell. 21, (2), 345-353 (2010).
  18. Sendra, R., Rodrigo, I., Salvador, M. L., Franco, L. Characterization of pea histone deacetylases. Plant Molecular Biology. 11, (6), 857-866 (1988).
  19. Valente, S., et al. 1,3,4-Oxadiazole-containing histone deacetylase inhibitors: anticancer activities in cancer cells. Journal of Medicinal Chemistry. 57, (14), 6259-6265 (2014).
  20. Mai, A., et al. Synthesis and biological properties of novel, uracil-containing histone deacetylase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 49, (20), 6046-6056 (2006).
  21. Pidroni, A., et al. A Class 1 Histone Deacetylase as Major Regulator of Secondary Metabolite Production in Aspergillus nidulans. Frontiers in Microbiology. 9, 2212 (2018).
  22. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, (5536), 598-599 (1975).
  23. Wegener, D., Wirsching, F., Riester, D., Schwienhorst, A. A fluorogenic histone deacetylase assay well suited for high-throughput activity screening. Chemistry & Biology. 10, (1), 61-68 (2003).
  24. Peng, L., Yuan, Z., Seto, E. Histone deacetylase activity assay. Methods in Molecular Biology. 1288, 95-108 (2015).
효소 활성 분석을 위한 사상 균 류 아 <em>스퍼 질러 스 니 둘</em> 란 스의 탭 태그 Histone de살리실산의 단일 단계 농축
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Bauer, I., Pidroni, A., Bayram, Ö.,Brosch, G., Graessle, S. Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay. J. Vis. Exp. (147), e59527, doi:10.3791/59527 (2019).More

Bauer, I., Pidroni, A., Bayram, Ö., Brosch, G., Graessle, S. Single-Step Enrichment of a TAP-Tagged Histone Deacetylase of the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans for Enzymatic Activity Assay. J. Vis. Exp. (147), e59527, doi:10.3791/59527 (2019).

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