Klasse 1 histone deacetylases (Hdac) som RpdA har fått betydning som potensielle mål å behandle fungal infeksjoner. Her presenterer vi en protokoll for den spesifikke berikelse av TAP-Tagged RpdA kombinert med en HDCA aktivitet analysen som gjør at in vitro effekt testing av Histone deacetylase hemmere.
Klasse 1 histone deacetylases (Hdac) som RpdA har fått betydning som potensielle mål for behandling av soppinfeksjoner og for Genova gruvedrift av fungal sekundære metabolitter. Hemmer screening, men krever renset enzym aktiviteter. Siden klasse 1 deacetylases utøve sin funksjon som multiprotein komplekser, de er vanligvis ikke aktive når uttrykt som enkelt polypeptider i bakterier. Derfor endogene komplekser må isoleres, som, når konvensjonelle teknikker som ion utveksling og størrelse eksklusjon kromatografi brukes, er arbeidskrevende og tidkrevende. Tandem affinitet rensing har blitt utviklet som et verktøy for å berike multiprotein komplekser fra celler og dermed viste seg å være ideell for isolering av endogene enzymer. Her gir vi en detaljert protokoll for ett-trinns berikelse av aktive RpdA komplekser via den første rensing trinn av C-uhelbredelig TAP-Tagged RpdA fra Aspergillus nidulans. Den renset komplekser kan deretter brukes for påfølgende inhibitor screening bruke en deacetylase analysen. Proteinet berikelse sammen med enzymatisk aktivitet analysen kan gjennomføres innen to dager.
Histone deacetylases (Hdac) er Zn2 +-avhengige hydrolytisk enzymer som kan fjerne acetyl grupper fra lysin rester av histoner og andre proteiner. Basert på sekvens likheten er Hdac gruppert i flere klasser1. Nylig ble fungal klasse 1 HDCA RpdA, en ortholog av Baker gjær (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, vist å være avgjørende for opportunistiske fungal patogen Aspergillus fumigatus2. Derfor har RpdA fått betydning som et potensielt mål å behandle fungal infeksjoner2. Vurdering av deacetylase aktivitet in vitro er viktig for karakterisering av enzymatisk egenskaper og gjør det mulig å bestemme effekten av romanen stoffer for hemmer utvikling. Selv om rekombinant uttrykk for en Codon-optimalisert versjon av humant HDAC1 i Escherichia coli er rapportert nylig3, forsøk på å uttrykke full lengde RpdA i denne verten mislyktes4. Videre, siden fungal klasse 1 Hdac som RpdA og HosA utøve sin funksjon som multiprotein komplekser, er det gunstig å bruke innfødte endogene komplekser for enzymatisk inhibitor studier. Men på grunn av hemme faktorer og tilstedeværelsen av ulike Hdac i fungal lysater, katalysator målt i hele protein ekstrakter er relativt lav og kan ikke tildeles individuelle enzymer. Videre tidligere studier i trådformede soppen a. nidulans identifiserte en klasse 2 Hdca, HdaA, som dominerende deacetylase i kromatografiske fraksjoner av fungal ekstrakter. Således, mangfoldig tradisjonell kromatografiske rensing skritt er behøvde å separat ingen-HdaA aktivitet fra fungal belastninger4. Innføringen av den tandem affinitet rensing (TAP) strategi i A. nidulans5 har betydelig lettet berikelse av spesifikke deacetylase aktiviteter. Den opprinnelige TAP-taggen består av to protein A-domener og et calmodulin bindende peptid (CBP) atskilt av en tobakk etch virus protease (TEV) kløft sted6. Dette gjør det mulig for innfødt rensing og eluering av merkede proteiner inkludert deres samspill partnere7. Når du bruker de beriket proteiner for aktivitet analyser, den milde eluering under native forhold av protease kløft er en viktig funksjon i TAP tag rensing. En GFP-Tagged protein, for eksempel, kan bli beriket av immobilisert antistoffer også, men kan ikke eluert under native forhold.
Her gir vi en detaljert protokoll for ett-trinns berikelse av aktive RpdA komplekser via den første rensing trinn av C-uhelbredelig TAP-Tagged RpdA fra a. nidulans (IgG SEPARASJON og TEV kløft) for påfølgende inhibitor screening bruke en Histone deacetylase analysen. Som viste seg å være tilstrekkelig, var affinitet berikelse begrenset til bare én rensing trinn også fordi enzymatisk aktivitet ble betydelig redusert etter to-trinns TAP rensing sammenlignet med IgG rensing alene.
Likevel, den innførte protokollen bør i tillegg være aktuelt for berikelse av andre merkede enzymer involvert i kromatin regulering som acetyltransferases, methyltransferases, og demethylases. Ved å tilføye den andre rensing trinnet av TAP-protokollen, proteiner co-renset med den merkede agn kan betraktes som komplekse partnere av (romanen) enzymatisk komplekser.
Denne protokollen beskriver et enkelt-trinns berikelse av en TAP-Tagged klasse 1 HDCA fra trådformede soppen a. nidulans for vurderingen av in vitro deacetylase aktivitet. The TAP tag ble opprinnelig introdusert i Baker gjær for identifisering av protein-protein interaksjon partnere av merket protein6. Deretter ble taggen Codon-optimalisert for bruk i A. nidulans5. Her gir vi en rett frem trinn-for-trinn protokoll for anvendelse av den første affinitet rensing trinn av TAP strategi for ett-trinns berikelse av klassen 1 HDCA RpdA. Den andre affinitet rensing trinn klart øker nivået av rensing, noe som er spesielt viktig for identifisering av agn-samspill proteiner. Likevel, bare det første trinnet anbefales for påfølgende aktivitet testing, siden mangelen på betydelig forurensning etter første skritt ble bekreftet av en kontroll eksperiment ved hjelp av en vill-type belastning. Videre er eluert aktivitet betydelig høyere etter ett-trinns berikelse i forhold til det av full TAP. I tillegg til RpdA2, ble denne protokollen også med hell brukt for rensing A. nidulans komplekser av andre klasse 1 hdca HosA21.
På grunn av våre observasjoner at fungal klasse 1 Hdac bygge opp stabile komplekser4, har vi lyktes å endre protokollen ved Bayram et al. 201212 som representerer grunnlaget for denne metoden. Likevel, noen viktige skritt må nevnes. Utarbeidelse av svært konsentrerte protein ekstrakter for å sikre nær fysiologiske forhold er avgjørende for kompleks stabilitet. Derfor er det viktig å tenke på gitte anbefalinger om biomasse/utvinning buffer forholdet. I denne forbindelse er det også viktig å bruke godt bakken fine Mycelial pulver for å sikre riktig ekstraksjon. Her er bruken av en slipemaskin klart fordelaktig. Som nevnt i protokollen delen, er det verdt å prøve TEV-kløft trinn for 1-2 h ved romtemperatur for å fremskynde rensing. Dette ble testet for RpdA uten å observere noen skadelige effekter på stabilitet (upublisert observasjon, Bauer I, 2018). I tillegg er utskifting av NP40 (brukt i den opprinnelige protokollen) med TX-100 kanskje ikke egnet for andre protein komplekser. Når du bruker denne metoden for rensing av andre TAP-Tagged proteiner, bør man også referere til Bayram protokollen, som inneholder en rekke verdifulle hint som kan være nyttig for en tilstrekkelig rensing av andre protein komplekser12.
I tillegg til her beskrevet TAP-metoden, andre affinitet koder og teknikker er ofte brukt for ett-trinns berikelse av protein av trådformede sopp, inkludert hans-og GFP-Tags. Men som klasse 1 Hdac generelt er funksjonell som høy molekylvekt komplekser, innfødte eluering forhold er en forutsetning for berikelse av katalytisk aktive Hdac. Viktigere er mange andre affinitet renselser utføres under ugunstige forhold. For eksempel, berikelse av Hdac via GFP-Trap, som er basert på antigen-antistoff interaksjon, er ikke egnet på grunn av Sure eluering forhold forstyrrer protein-protein interaksjon av HDCA komplekser bundet til harpiks. Videre, forsøk på å rense hans-Tagged RpdA av metall chelate affinitet kromatografi22, resulterte i et betydelig tap av katalysator under rensing prosedyren selv om imidazole i stedet for lav-pH-forhold ble brukt for eluering ( upubliserte data, Bauer, I, 2010).
En begrensning av den beskrevne enzymatisk analysen protokollen er bruken av det radioaktive underlaget. Imidlertid har analysene på et fluorescerende grunnlag blitt utviklet i tillegg23,24 og er kommersielt tilgjengelige. Disse analysene er utført i godt plater og dermed er egnet også for høy gjennomstrømming screening av HDCA-hemmere. I så fall ville en oppskalere av de presenterte prosedyren være nødvendig.
Potensielle kommende anvendelser av denne protokollen inkluderer berikelse av spesifikke sub-komplekser av klasse 1 Hdac å vurdere deres spesifikke fysiologiske roller og/eller forskjeller i deres mottakelighet for HDCA-hemmere. Ved etablering av den beskrevne metoden for andre enzymer, er det sterkt anbefalt å utføre en negativ kontroll eksperiment med en umerkede belastning. Dette sikrer spesifisitet av målte enzym aktiviteter og ville avdekke forurensning av uspesifikt bundet enzymer.
Rensing og aktivitet analysen beskrevet her kan utføres innen to dager og beriket enzymer er stabile i minst flere måneder, når de oppbevares i alikvoter ved-80 ° c. Som konklusjon, denne protokollen gir en relativt enkel og kostnadseffektiv måte å oppnå klasse 1 HDCA komplekser for aktivitet måling og bestemmelse av hemmer effekt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Petra Merschak, avdeling for molekylærbiologi (Biocenter, Medical University of Innsbruck), for hennes hjelp og støtte angående dette manuskriptet. I tillegg vil vi gjerne takke anmeldere for sine verdifulle kommentarer.
Dette arbeidet ble finansiert av den østerrikske Science Fund (P24803 til SG og P21087 til GB) og ved intramural finansiering (MUI Start, ST201405031 til IB).
10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
Acetic acid | Roth | 7332 | |
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
Cell strainer | Greiner | 542040 | |
Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
Glycerol | Roth | 3783 | |
HCl | Roth | 4625 | |
IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
KOH | Merck | 5033 | |
Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
NaCl | Roth | 3957 | |
NaOH | Roth | 6771 | |
Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
Tris (free base) | Serva | 37190 | |
Tris-HCl | Roth | 9090 | |
Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |