Klass 1 histondeacetylaser (HDACs) som RpdA har vunnit betydelse som potentiella mål för att behandla svamp infektioner. Här presenterar vi ett protokoll för den specifika berikningen av TAP-märkta RpdA kombinerat med en HDAC aktivitets analys som gör in vitro effektivitets test av histondeacetylashämmare.
Klass 1 histondeacetylaser (HDACs) som RpdA har vunnit betydelse som potentiella mål för behandling av svamp infektioner och för genombrytning av svamp sekundära metaboliter. Inhibitor screening kräver dock renade enzym aktiviteter. Eftersom klass 1 deacetylaser utövar sin funktion som multiproteinkomplex, är de vanligt vis inte aktiva när de uttrycks som enstaka polypeptider i bakterier. Därför, endogena komplex måste isoleras, som, när konventionella tekniker som jonbyte och storlek uteslutning kromatografi tillämpas, är mödosam och tids krävande. Tandem affinitet rening har utvecklats som ett verktyg för att berika multiprotein komplex från celler och därmed visade sig vara idealisk för isolering av endogena enzymer. Här ger vi ett detaljerat protokoll för ett steg berikning av aktiva RpdA komplex via den första rening steg C-terminally TAP-märkta RpdA från Aspergillus nidulans. De renade komplexen kan sedan användas för den efterföljande inhibitor screening som tillämpar en deacetylasanalys. Proteinberikningen tillsammans med enzymatisk aktivitets analys kan slutföras inom två dagar.
Histone deacetylaser (HDACs) är Zn2 +-beroende Hydrolytiska enzymer som kan ta bort acetylgrupper från lysinrester av histoneroch andra proteiner. Baserat på sekvensen likhet, är HDACs grupperas i flera klasser1. Nyligen, den svamp klass 1 HDAC RpdA, en ortolog av bagerijäst (Saccharomyces cerevisiae) Rpd3p, visades vara avgörande för opportunistiska svamp patogenen Aspergillus fumigatus2. Därför har RpdA vunnit betydelse som ett potentiellt mål att behandla svamp infektioner2. Bedömning av deacetylasaktivitet in vitro är viktigt för karakterisering av enzymatiska egenskaper och gör det möjligt att bestämma effekten av nya substanser för inhibitor utveckling. Även om rekombinant uttryck för en Codon-optimerad version av mänskliga HDAC1 i Escherichia coli har rapporter ATS nyligen3, försök att uttrycka ful längds rpda i denna värd misslyckades4. Dessutom, eftersom svamp klass 1 HDACs såsom RpdA och HosA utövar sin funktion som multiprotein komplex, det är gynnsamt att använda infödda endogena komplex för enzymatiska inhibitor studier. På grund av hämmande faktorer och förekomst av olika HDACs i svamplysater, är katalytisk aktivitet mätt i hela protein extrakt relativt låg och kan inte hänföras till enskilda enzymer. Dessutom tidigare studier i trådformiga svampen a. nidulans identifierat en klass 2 HDAC, hdaa, som dominerande histondeacetylas i kromatografiska fraktioner av svamp extrakt. Således behövs flera konventionella kromatografiska renings steg för att separera icke-HdaA-aktivitet från svamp stammar4. Introduktionen av tandem-affinitetsrenings strategin (TAP) i A. nidulans5 har avsevärt minskat anrikningen av specifika deacetylasaktiviteter. Den ursprungliga TAP-taggen består av två protein A-domäner och en calmodulinbindande peptid (CBP) som skiljs åt av ett tobaks virus (TEV) klyvning plats6. Detta möjliggör inhemsk rening och eluering av taggade proteiner inklusive deras interaktions partners7. Vid användning av berikade proteiner för aktivitets analyser är den milda elueringen under infödda förhållanden genom proteasklyvning ett viktigt inslag i TAP-taggen rening. Ett GFP-märkt protein, till exempel, kan berikas av immobiliserade anti kroppar samt, dock, kan inte elueras under inhemska förhållanden.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för enstegs berikning av aktiva RpdA-komplex via den första renings steget av C-terminally TAP-märkta RpdA från a. nidulans (IgG separation och TeV klyvning) för efterföljande inhibitor screening tillämpa en av histondeacetylasanalys. Som visat sig vara tillräcklig, affinitet berikning begränsades till bara ett renings steg också eftersom den enzymatiska aktiviteten reducerades signifikant efter två steg rening jämfört med IgG rening ensam.
Icke desto mindre bör det införda protokollet också vara tillämpligt för berikning av andra märkta enzymer som är involverade i kromatin-reglering såsom acetyltransferaser, metyltransferaser och demetylaser. Genom att lägga till det andra renings steget i TAP-protokollet kan proteiner som är samrenas med de taggade beten betraktas som komplexa partners av (roman) enzymatiska komplex.
Detta protokoll beskriver en enda steg berikning av en Tap-märkta klass 1 HDAC från trådformiga svampen a. nidulans för bedömning av in vitro histondeacetylas aktivitet. TAP-taggen infördes ursprungligen i bagerijäst för identifiering av protein-protein interaktion partner av taggade protein6. Därefter var taggen Codon-optimerad för dess användning i A. nidulans5. Här ger vi ett rakt framåt steg-för-steg-protokoll för tillämpning av den första affinitetsrenings steget i TAP-strategin för enstegs berikning av klass 1 HDAC RpdA. Den andra affinitetsrenings steget ökar tydligt renings nivån, vilket är särskilt viktigt för identifieringen av bete-samverkande proteiner. Ändå, bara det första steget rekommenderas för efterföljande verksamhet testning, eftersom avsaknaden av betydande förorening efter det första steget bekräftades av ett kontroll experiment med hjälp av en vild-typ stam. Dessutom är elerad aktivitet betydligt högre efter ett steg berikning jämfört med den fulla kranen. Förutom RpdA2, detta protokoll har också framgångs rikt använts för rening A. nidulans komplex av andra klass 1 HDAC hosa21.
På grund av våra observationer att svamp klass 1 HDACs bygga upp stabila komplex4, har vi lyckats ändra protokollet av Bayram et al. 201212 som representerar grunden för denna metod. Vissa kritiska steg måste dock nämnas. Beredningen av högkoncentrerade protein extrakt för att säkerställa nära fysiologiska förhållanden är avgörande för komplex stabilitet. Därför är det viktigt att tänka på de givna rekommendationerna om förhållandet bio massa/extraktion buffert. I detta avseende, det är också viktigt att använda väl mark fina Mycelial pulver för att säkerställa korrekt extraktion. Här är användningen av en slipmaskin helt klart fördelaktig. Som nämnts i protokollet avsnittet, är det värt att prova TEV-Cleavage steg för 1-2 h vid rums temperatur för att påskynda reningen. Detta testades för RpdA utan att observera några skadliga effekter på stabiliteten (opublicerad observation, Bauer I, 2018). Dessutom, utbyte av NP40 (används i det ursprungliga protokollet) med TX-100 kanske inte lämpar sig för andra protein komplex. När du använder denna metod för rening av andra TAP-märkta proteiner, bör man också hänvisa till Bayram protokollet, som innehåller ett antal värdefulla tips som kan vara till hjälp för en tillräcklig rening av andra protein komplex12.
Förutom den här beskrivna TAP-metoden, andra affinitet Taggar och tekniker används ofta för ett steg berikning av protein av trådformiga svampar, inklusive hans-och GFP-Taggar. Men eftersom klass 1 HDACs i allmänhet är funktionella som hög molekyl vikt komplex, är infödda eluering villkor en förutsättning för berikning av katalytiskt aktiva HDACs. Viktigt, många andra affinitet reningar utförs under ogynnsamma förhållanden. Till exempel är berikning av HDACs via GFP-Trap, som bygger på interaktion mellan antigen och anti kropp, inte lämplig på grund av de sura elutionsförhållanden som stör protein-proteininteraktion hos HDAC-komplex som binds till hartser. Dessutom försök att rena hans-märkta RpdA av metall kelat affinitet kromatografi22, resulterade i en betydande förlust av katalytisk aktivitet under renings förfarandet även Imidazol i stället för låg-pH-tillstånd användes för eluering ( opublicerade data, Bauer, I, 2010).
En begränsning av det beskrivna enzymatiska analys protokollet är användningen av det radioaktiva underlaget. Emellertid, analyser på fluorescerande basis har utvecklats samt23,24 och är kommersiellt tillgängliga. Dessa analyser utförs i brunn-pläterar och är thus passande också för kick-throughput screening av HDAC-inhibitorer. I så fall skulle det krävas ett exklusivt förfarande för det presenterade förfarandet.
Potentiella kommande tillämpningar av detta protokoll inkluderar berikning av specifika sub-komplex av klass 1 HDACs att bedöma deras specifika fysiologiska roller och/eller skillnader i deras känslighet för HDAC-hämmare. Vid upprättandet av den beskrivna metoden för andra enzymer, rekommenderas det starkt att utföra ett negativt kontroll experiment med en otaggad stam. Detta säkerställer specificitet av uppmätt enzym aktivitet och skulle avslöja kontaminering av ospecifikt bundna enzymer.
Rening och aktivitets analys som beskrivs här kan utföras inom två dagar och de berikade enzymerna är stabila i minst flera månader, när de lagras i Ali kvoter vid-80 ° c. Sammanfattnings vis ger detta protokoll ett relativt enkelt och kostnads effektivt sätt att uppnå klass 1 HDAC-komplex för aktivitets mätning och bestämning av inhibitor effekt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Petra Merschak, avdelningen för molekylär biologi (bio Center, Medical University of Innsbruck), för hennes hjälp och stöd för detta manuskript. Dessutom vill vi tacka granskarna för deras värdefulla kommentarer.
Detta arbete finansierades av den österrikiska vetenskaps fonden (P24803 till SG och P21087 till GB) och genom interna finansiering (MUI start, ST201405031 till IB).
10 x SDS-PAGE running buffer | Novex | ||
2-mercaptoethanol (EtSH) | Roth | 4227 | |
25 cm2 cell culture flasks with vent cap | Sarstedt | 833910002 | For spore production |
47 mm vacuum filtration unit | Roth | EYA7.1 | |
AccuFLEX LSC-8000 | HITACHI | – | Scintillation counter |
Acetic acid | Roth | 7332 | |
Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope Tag Antibody | Millipore | 07-482 | Used at 1:1333 dilution |
Anti-Rabbit IgG (whole molecule)–Alkaline Phosphatase (AP) antibody | Sigma-Aldrich | A3687 | |
Ball mill | Retsch | 207450001 | Mixer Mill MM 400 |
BCIP/NBT | Promega | S3771 | Color development substrate for AP |
Cell strainer | Greiner | 542040 | |
Cheese cloth for harvesting mycelia | BioRen | H0028 | Topfentuch |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Roth | 4720 | |
EDTA | Prolabo | 20309.296 | |
Ethyl acetate | Scharlau | Ac0155 | |
Freeze Dryer | LABCONCO | 7400030 | FreeZone Triad |
Glycerol | Roth | 3783 | |
HCl | Roth | 4625 | |
IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | IgG Sepharose 6 Fast Flow |
Inoculation loops | VWR | 612-2498 | |
KOH | Merck | 5033 | |
Laminar flow cabinet | Thermo Scientific | – | Hera Safe KS |
Mixed Cellulose Esters Membrane Filters | Millipore | GSWP04700 | |
NaCl | Roth | 3957 | |
NaOH | Roth | 6771 | |
Neubauer counting chamber improved | Roth | T728 | |
Novex gel system | Thermo Scientific | For SDS-PAGE | |
Novex Tris-glycine SDS running buffer (10X) | Thermo Scientific | LC2675 | Running buffer for SDS-PAGE |
peqGold protein-marker II | VWR | 27-2010P | Protein ladder used for silver stain |
Peristaltic Pump P-1 | GE Healthcare | 18111091 | |
Pipette controller | Brand | 26302 | accu-jet pro |
Poly-Prep chromatography columns | Bio-Rad | 731-1550 | |
ProSieve QuadColor protein marker | Biozym | 193837 | Prestained protein ladder used for western blot |
Protease inhibitor cocktail tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | cOmplete, EDTA-free |
Rotary mixer | ELMI | – | Intelli-Mixer RM-2 S |
Rotiszint eco plus | Roth | 0016 | |
RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
Scintillation vials | Greiner | 619080 | |
Sorvall Lynx 4000 | Thermo Scientific | ||
Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
TIB32.1 | A. nidulans rpdA::TAP strain. Genotype: alcA(p)::rpdA; veA1; argB2; yA2; pIB32::argB; ArgB+; PyrG+ |
||
Trans-Blot Turbo RTA Midi Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 1704271 | |
Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad | 1704150 | |
Trichostatin A (TSA) | Sigma-Aldrich | T8552 | 5 mM stock in DMSO |
Tris (free base) | Serva | 37190 | |
Tris-HCl | Roth | 9090 | |
Polysorbate 20 | Roth | 9127 | Tween 20 |
Polysorbate 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | Tween 80 |
TX-100 | Acros Organics | 215682500 | Triton X-100, Octoxynol-9 detergent |