Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصةCD8 + T الاستجابات الخلية

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59531
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy, Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

ونحن هنا وصف تدفق الخلوية التي تستند في الجسم الحيوي قتل الفحص الذي يتيح النظر في المناعية في الاستجابات اللمفاوية T السامة للخلايا (CTL) لنموذج مستضد الورم. ونحن نقدم أمثله علي كيفيه استخدام هذا الفحص الأنيق للدراسات الميكانيكية ولاختبار فعاليه المخدرات.

Abstract

كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في اختبارات الخلايا الحيوية تمكين الحساسية ودقه الكمية منCD8 + لحل T اللمفاويات (CTL) الاستجابات التي اثارتها ضد الببتيدات المشتقة من الورم والممرض. هم يقدمون عده فوائد علي تقليديه قتل اختبارات. أولا ، انها تسمح برصد السمية الخلوية بوساطة CTL داخل الاجهزه اللمفاوية الثانوية سليمه معماريا ، وعاده في الطحال. ثانيا ، انها تسمح للدراسات الميكانيكية خلال المراحل فتيله ، المستجيب والاستدعاء من الاستجابات CTL. ثالثا ، انها توفر منصات مفيده لاختبار فعاليه اللقاح/المخدرات في بيئة الجسم الخارجي حقا. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لفحص الاستجابات CTL المصاحبة ضد أكثر من واحد من مرضبه الببتيد من نموذج مستضد الورم (Ag) ، وهي الفيروس simian 40 (SV40)-ترميز كبير T Ag (T Ag). مثل معظم البروتينات السرطانية ذات الصلة سريريا, T Ag الموانئ العديد من الببتيدات المناعية المحتملة. ومع ذلك ، فقط أربعه الببتيدات هذه للحث علي الاستجابات CTL للكشف في C57BL/6 الفئران. يتم ترتيب هذه الاستجابات باستمرار في ترتيب هرمي استنادا إلى حجمها ، والذي يشكل الأساس ل TCD8 "المناعية" في هذا النظام القوي. ووفقا لذلك ، يتركز الجزء الأكبر من الاستجابة tCD8 الخاصة t Ag ضد واحده السمية المناعية في حين يتم التعرف علي الثلاثة الأخرى المربه والرد علي ضعيف فقط. المناعي يهدد اتساع الاستجابات المضادة للورم TCD8 وهو ، علي هذا النحو ، يعتبره الكثيرون عائقا امام نجاح التطعيم ضد السرطان. ولذلك ، فمن المهم ان نفهم العوامل الخلوية والجزيئية واليات التي تملي أو تشكل TCD8 امودومنيانسي. البروتوكول الذي وصفناه هنا مصمم خصيصا لتحقيق هذه الظاهرة في نموذج التمنيع T Ag ، ولكن يمكن تعديله بسهوله وتوسيعه ليشمل دراسات مماثله في نماذج الأورام الأخرى. ونحن نقدم أمثله عن كيفيه قياس تاثير التدخلات العلاجية المناعية التجريبية باستخدام في اختبارات الخلوية الحيوية.

Introduction

التقليديةCD8 + t الخلايا (tCD8) تلعب أجزاء هامه في مراقبه المناعة المضادة للسرطان. انها تعمل في المقام الأول في قدره الخلايا اللمفاوية T لحل (ctls) التي تعترف الأورام الببتيد المرتبطة أو المقترنة (الحثالة) المعروضة داخل الشق المغلقة من مجمع التوافق النسيجي الرئيسي (mhc) الفئة الاولي الجزيئات. CTLs المسلحة بالبالكامل استخدام ترسانتها السامة للخلايا لتدمير الخلايا الخبيثة. يمكن الكشف عن السرطان TCD8 في الدورة الدموية أو حتى داخل الجماهير الابتدائية والمنتشرة من العديد من مرضي السرطان والحيوانية الحاملة للورم. ومع ذلك ، فانها غالبا ما تكون أنجيك أو استنفدت وتفشل في القضاء علي السرطان. ولذلك ، تم تصميم العديد من طرائق العلاج المناعي لزيادة المضادة للسرطان TCD8 الترددات واستعاده وتعزيز وظائفها.

البروتينات السرطانية الميناء العديد من الببتيدات ، وبعضها يمكن ان تكون مناعية ويحتمل ان تكون مناعية. ومع ذلك ، يتم استخلاصها الاستجاباتCD8 T قابله للقياس الكمي مع احجام متفاوتة ضد الببتيدات قليله فقط. هذا يخلق "التسلسل الهرمي المناعي" بين TCD8 استنساخ1. وفقا لذلك ، المناعية (ID) TCD8 تحتل الرتب الهرمية البارزة ، والتي يتم الحكم عاده من قبل وفره بهم. وعلي النقيض من ذلك ، فان خلايا TCD8 التي تكون مستقبلات الخلايا التائية (TCR) الخاصة بها محدده للفوقية المهيمنة (SD) التي تحدث في ترددات اقل. وقد حددنا نحن وغيرنا بعض العوامل التي تملي أو تشكل المناعة في استجابات TCD8 . وتشمل هذه ، من بين أمور أخرى ، طريقه تقديم ag إلى السذاجة TCD8 (اي ، العرض المباشر ، عبر العرض ، عبر خلع الملابس)2،3،4، ونوع من الخلايا تقديم ag (apcs) المشاركة في التنشيط TCD8 5، وفره واستقرار البروتين الحثالة6،7 وكفاءه وحركيه تدهورها من قبل بروتياسميس7،8، و الانتقائية النسبية للناقل المرتبطة تجهيز Ag (الحنفية) ل الببتيدات9، وتقارب الببتيدات المحررة لجزيئات mhc I9،10، وجود ، والترددات السلائف وتنوع TCR مشابه tCD8 in t الخلية تجمعات11،12،13، عبر المنافسة بين الخلايا t للوصول إلى apcs14،15، وقدره الاشقاء من tCD8 استنساخ16. الاضافه إلى ذلك ، يتم إخضاع TCD8 المناعي إلى أليات المناعية بوساطة عده أنواع الخلايا المثبطة مثل التي تحدث بشكل طبيعي t (nTreg) الخلايا17، والخلية سطح مشترك المثبطة المبرمجة الموت-1 (PD-1)16، وبعض الانزيمات داخل الخلايا مثل indoleamine 2 ، 3-ديوكسيجيناسي (IDO)18 والهدف الثدييات من راباميسين (mtor)19. ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان العوامل المذكورة أعلاه لا تمثل دائما بشكل كامل للمناعة.

وبصرف النظر عن البيولوجيا الاساسيه لل TCD8 المناعي ، فان فحص هذه الظاهرة المثيرة للاهتمام له اثار هامه في علم المناعة السرطانية والعلاج المناعي. أولا ، لا تمنح حاله المعرف بالضرورة القدرة علي منع بدء الورم أو التقدم فيه بالقياس إلى TCD8 . سواء وكيف ID و SD TCD8 المساهمة في المناعة انتيورم قد تكون معتمده علي نوع ومدي الأورام الخبيثة والنظام التجريبي المستخدمة. الثانية, ويعتقد ان معرف رCD8 استنساخ قد تكون ' مرئية جدا ' للجهاز المناعي التالي أكثر عرضه لليات التسامح المركزية و/أو المحيطي16,21. ثالثا ، قد تحتوي الأورام الميتوزي علي خلايا الأورام السرطانية التي تتجنب الكشف من قبل العديد ، ان لم يكن معظم ، CTLs من خلال عرض طيف ضيق من الببتيد: المجمعات MHC. في ظل هذه الظروف, TCD8 الردود من اتساع غير كافيه من المرجح ان تحمل مثل هذه الخلايا السرطانية ميزه البقاء علي قيد الحياة, التالي تحفيز نموها22. وللاسباب المذكورة أعلاه ان العديد من رؤية المناعية كعقبه لنجاح التلقيح القائم عليCD8T والعلاجات ضد السرطان.

تلقيح الفئران C57BL/6 مع الفيروس simian 40 (SV40)-الخلايا المتحولة التي تعبر عن الورم الكبير ag (t ag) يوفر نظام سريري قوي لدراسة TCD8 المناعي. هذا النموذج يقدم العديد من الفوائد. أولا ، وتتميز بشكل جيد في هذا الضغط الفار الببتيد من هذا البروتين oncoproteinه ذات الصلة سريريا ( الجدول1). الثانية ، T Ag المربية ، والتي تسمي المواقع الأول والثاني/الثالث والرابع والخامس ، والزناد TCD8 الردود التي يتم ترتيبها باستمرار في ترتيب التسلسل الهرمي التالي: الموقع الرابع > > موقع I ≥ الموقع الثاني/الثالث > > الموقع خامسا. جبل الاستجابة الأكثر قوه ل T Ag. وعلي النقيض من ذلك ، فان الموقعين الأول والثاني/الثالث مهيمنان ، والمواقع V الخاصة بالCD8 الخاصة هي اقل وفره وعاده ما تكون قابله للكشف فقط في غياب الاستجابة لغيرها من المرتوب23،24. ثالثا ، TAg + خط الخلايا السرطانية المستخدمة في البروتوكول الموصوف هنا ، وهي الخلايا الليفية C57SV ، وتلك المستخدمة في التحقيقات السابقة لدينا16،17،18،19 ,25,26, حولت مع [سوبجنومي] SV40 شظايا25. ولذلك ، فهي غير قادره علي تجميع والإفراج عن SV40 virions التي يحتمل ان تصيب APCs المضيف. الاضافه إلى ذلك ، C57SV الخلايا خاليه من جزيئات الكلاسيكية كوستيمولاتوري مثل CD80 (b7-1) ، CD86 (b7-2) ، و CD137 يجند (4-1bbl)16. السمات المذكورة أعلاه جعل هذه الخطوط مثاليه للفحص في الجسم الCD8 T تنشيط عبر فتيله. عبر فتيله هو المسار الرئيسي في حمل TCD8 الاستجابات ، وخاصه تلك التي أطلقت ضد الخلايا السرطانية من أصل غير الدم التي تفشل في الخلايا الاوليه الساذجة مباشره25.

ويمكن رصد الترددات المضادة للورم TCD8 و/أو وظائف من قبل mhc I تترامير تلطيخ ، تلطيخ داخل الخلايا للتوكسينات المستجيب (علي سبيل المثال ، مضادات التداخل [ifn]-γ) أو جزيئات الليتيك (علي سبيل المثال ، تثقيب) ، والانزيمات المرتبطة المناعية (elispot) والسابقين اختبارات الخلوية الفيفو. منذ بدايتها في 1990s27,28, كاربوكسيفلوريسسين الناجحة استر (cfse)-مقرها في الجسم الحيوي قتل اختبارات مكنت تقييم الاستجابات السامة للخلايا بوساطة ctls المضادة للفيروسات29,30 , 31، المضادة للورم ctls16،32، الطبيعية القاتلة (ناغورني كاراباخ) الخلايا33، glycolipid-الثابتة التفاعلية القاتل الطبيعي T (inkt) الخلايا34، والموجودة مسبقا والخاصة بالمانحين محدده الأجسام المضادة26. ولذلك ، فان تطبيقاتها يمكن ان تكون ذات فائده لقراء واسعه ، بما في ذلك ولكن لا تقتصر علي المحققين العاملين في مجالات المناعة الأورام والعلاج المناعي ، والمناعة المضادة للمرض ، وتصميم اللقاح الوقائي والعلاجي.

لتقييم الخلايا الخلوية بوساطة في السيناريوهات النموذجية ، يتم تسميه اثنين من السكان من الخلايا الطحال الساذجة التي تعرض اما Ag غير ذي صله أو Ag (s) المدرك مع جرعتين مختلفتين من CFSE ، مختلطة في اعداد متساوية وحقنها في ساذج (السيطرة) أو القاتل الفئران التي تاوي الخلايا. بعد ذلك يتم فحص وجود/غياب كل السكان المستهدفين عن طريق قياس التدفق الخلوي.

لدينا الأمثل والعاملين في الجسم الحيوي قتل الاختبارات في دراساتنا علي المناعية في كل من المضادة للفيروسات ومضادات الأورام TCD8 الاستجابات12,16,17. هنا ، ونحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتقييم في وقت واحد من الهوية و SD TCD8 الردود علي الملحقات t Ag ، والتي يمكن اعتمادها بسهوله لتحقيقات مماثله في النظم التجريبية الأخرى. كما نقدم نتائج تمثيليه تبين ان استنزاف الخلايا nTreg و PD-1 الحصار يمكن ان تعزز بشكل انتقائي ID TCD8-و SD tCD8المستحثة للخلايا ، علي التوالي. وفي النهاية ، سنناقش المزايا المتعددة لاختبارات القتل المجرية فضلا عن بعض القيود المتاصله فيها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتتبع التجارب الموصوفة هنا بروتوكولات استخدام الماشية التي وافقت عليها الكيانات المؤسسية والتزمت بالمبادئ التوجيهية الوطنية الراسخة.

1. تلقيح الفئران C57BL/6 مع T Ag-التعبير عن الخلايا السرطانية

  1. تنمو SV40 الخلايا الليفية المتحولة خط C57SV (أو مماثله TAg + خط الخلية ملتصقة) في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (dmem) مع 4.5 g/l D-الجلوكوز و l-الجلوتامين (1x) وتستكمل مع بيروفات الصوديوم 1 مم و 10 ٪ الحرارة المعطلة مصل الأبقار الجنينية في قوارير الانسجه المعالجة الثقافة في 37 درجه مئوية في الغلاف الجوي المرطب الذي يحتوي علي 10 ٪ CO2.
  2. بمجرد ان تصبح الخلايا متموج بشكل كامل أو أوفيركونفلوينت قليلا ، وأزاله بلطف والتخلص من المتوسطة وشطف أحاديه الطبقة مع الفوسفات المعقمة قبل تسخينها-المالحة المخزنة مؤقتا (تلفزيوني).
    ملاحظه: يتم تحقيق التعبير T Ag القصوى عندما t ag + الخلايا تصل إلى 100 ٪ كونفلوينسي.
  3. داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ، أضافه ما قبل الحرارة تريبسين-أدتا (0.25 ٪) لتغطيه أحاديه الطبقة في درجه حرارة الغرفة حتى يتم فك الخلايا في بقع. اضغط علي جانبي قارورة (ق) الثقافة عده مرات للإفراج عن الخلايا الملتصقة المتبقية.
    ملاحظه: إذا لزم الأمر وتسريع عمليه التريسينزيشن ، نقل قارورة (ق) إلى 37 درجه مئوية حاضنه. ستعتمد الخلايا التي تم طردها بسرعة شكلا مدورا تحت المجهر الضوئي. يجب ان تستمر هذه الخطوة حوالي 5 دقائق.
  4. أضافه 5 مل من DMEM المتوسطة وانفصال كتل لاعداد تعليق خليه واحده عن طريق الأنابيب المحتوي من كل قارورة صعودا وهبوطا.
  5. نقل تعليق الخلية من خلال مصفاه الخلية مع المسام 70 μm في أنبوب.
  6. تدور أسفل الأنبوب في 400 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
  7. تجاهل الخارقة. أعاده التعليق الخلايا المغلفة في 10 مل من تلفزيونيه الباردة المعقمة.
  8. كرر الخطوات 1.6 و 1.7 مرتين.
  9. عد الخلايا باستخدام مقياس الكريات الدموية. اعداد تعليق موحد يحتوي علي 4 × 107 خلايا/مل العقيمة تلفزيوني.
  10. حقن 500 μL من التعليق أعلاه داخل الصفاق (i.p.) في كل الكبار (6-12-العمر الأسبوع) ذكر أو انثي C57BL/6 الماوس.

2. نظم العلاج

  1. نظام العلاج لدراسة مساهمه خلايا nTreg إلى TCD8 المناعي
    1. قبل أربعه أيام في فتيله المجرية من C57BL/6 الفئران مع خلايا C57SV (الخطوة 1.10) ، حقن كل الحيوانية مره واحده i.p. مع 0.5 ملغ من منخفضه اندوتوكسين ، المضادة لCD25 الأضداد الاحاديه النواة (ماب) (استنساخ PC-61.5.3) ، الذي يستنزف خلايا nTreg ، أو مع الفئران IgG1 النمط السيطرة (علي سبيل المثال ، استنساخ KLH/G1-2-2 ، استنساخ HRPN ، أو استنساخ TNP6A7).
  2. نظام العلاج لاختبار الاهميه المجرية من PD-1-PD-L1 (2) التفاعلات في تشكيل TCD8 المناعية
    ملاحظه: الاشتباك من PD-1 بواسطة PD-L1 في كثير من الأحيان ، ولكن ليس دائما ، يتوسط التثبيط المشترك و/أو استنفادCD8T الخاصة. ولذلك ، يمكن اجراء العلاج مع مكافحه PD-1 بالتوازي مع أداره المضادة-PD-L1 والمضادة-PD-L2 mAbs للكشف عن التفاعل بين الخلوية الدقيق التي تنطوي عليها ظاهره بيولوجية.

3. اعداد خلايا الطحال المستهدفة

  1. موت ببطء الجنس المتطابقة C57BL/6 الفئران (6-12 أسابيع من العمر) التي من شانها ان تكون بمثابه المتبرعين الطحال عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. وضع كل الماوس مع البطن في مواجهه داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. رش الجلد مع 70 ٪ (v/v) EtOH. باستخدام ملقط معقمه ومقص ، ورفع الجلد وجعل شق منتصف الطريق البطني الصغيرة. ثم ، قطع الجلد بطريقه تشبه الصليب لفضح الصفاق.
  3. باستخدام ملقط ، وسحب ما يصل الصفاق في الأزياء مثل خيمه دون انتزاع اي من الأعضاء الداخلية. يقطع الصفاق المفتوح للكشف عن التجويف الصفاقي ويزيل الطحال برفق.
  4. ضع الطحال (ق) داخل مطحنه الانسجه Dounce 15 مل تحتوي علي 5 مل من المعقمة. تطبيق الضغط اليدوي باستخدام المكبس الزجاج طاحونة حتى الانسجه الطحال تبدد في تعليق الخلية الحمراء متجانسة.
    ملاحظه: اعتمادا علي عدد الكائنات المتلقية لكل مجموعه تجريبية ، قد تكون هناك حاجه إلى العديد من طحال الماوس المانحة لاعداد الخلية الهدف. يمكن ان تكون متجانسة حتى 3 طحال معا داخل طاحونة 15 مل.
  5. نقل متجانسة إلى أنبوب 15 مل. تدور أسفل الأنبوب في 400 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
  6. تجاهل الخارقة. أعاده التعليق الخلايا المغلفة في 4 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) ليسينج العازلة لمده 4 دقائق للقضاء علي كريات الحمراء.
    ملاحظه: هذه خطوه حساسة للوقت. تعريض الطحال الفوقية إلى ACK ليسينج العازلة سيزيد من هشاشة وجعلها عرضه للموت خليه غير محدده.
  7. إلى كل أنبوب ، أضافه 8 مل من RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي علي 10 ٪ من الحرارة المعطلة ، L-الانيل-L-الجلوتامين ، 0.1 mM الحد الأدنى من وسائل الاعلام الاساسيه (م) الأحماض الامينيه غير الاساسيه ، 1 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 10 ملم HEPES ، و 1x البنسلين يشار إلى المتوسطة RPMI كامله (جدول المواد).
  8. نقل المحتوي من خلال 70 μm المسام من مصفاه الخلية إلى أنبوب 15 مل جديده.
  9. تدور أسفل الأنبوب في 400 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
  10. تجاهل الخارقة. أعاده التعليق الخلايا المغلفة في 12 مل من RPMI كامله.
  11. تقسيم تعليق الخلايا الطحال إلى 3 أجزاء متساوية (4 مل لكل منهما) في 3 أنابيب منفصلة.

4. طلاء الهدف الخلايا الطحال مع الببتيدات غير ذات صله والcognate

  1. تسميه الأنابيب وفقا للببتيدات التي سيتم استخدامها لنبض الخلايا الطحال الهدف. وسوف تكون نابضه السيطرة الخلايا الطحال مع الببتيد غير ذات صله ، سيتم نبض كل السكان من الخلايا الطحال المستهدفة مع الببتيد الاصطناعية المقابلة لل T Ag-المستمدة المناعية المسكرة (الموقع الرابع) أو المهيمن تي Ag الفوقية (موقع I أو موقع II/III) (الجدول 1).
    ملاحظه: يعتمد اختيار الببتيدات غير ذات الصلة علي الاعداد التجريبي وسلاله الماوس المستخدمة في كل تحقيق. المؤلفين في كثير من الأحيان استخدام gB498-505 (ا-2k ب-المقيدة المناعية الببتيد السمية من فيروس الهربس البسيط [hsv]-1) و/أو GP33-41 (ا-2kب-تقييد المناعية الببتيد السمية اللمفاوية فيروس لمفاواني ([الجدول 1) في الفئران C57BL/6. هذه الببتيدات هي الخيارات المثلي لان: (ط) انها مشتقه من مسببات الامراض التي لم يسبق لها ان واجهت في نموذج الماوس الموصوفة هنا; ' 2 ' مماثله للببتيدات المشتقة من T Ag ، يتم تقييد gB498-505 و GP33-41 بواسطة جزيئات H-2b وربطها بها. في ' ثلاثه الذروة ' في اختبارات القتل المجرية, كل من القمم اثنين التي تتوافق مع الخلايا المستهدفة المتشابهة قد تمثل الكريات الطحال نابض مع الببتيد المناعية أو شبه المهيمن. يختلف اختيار كل مجموعه الببتيد وفقا لأهداف كل تجربه. انظر الشكل 1 والشكل 2 كامثله علي هذا الاختلاف. النسبة لما تبقي من هذا البروتوكول ، ستمثل المواقع المشتقة من T Ag الأول والرابع الببتيدات المهيمنة والمناعية ، علي التوالي.
  2. نبض محتوي كل أنبوب المسمي مع 1 μM من الببتيد المعنية ل 1 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  3. استخدام مصفاه خليه منفصلة (مع المسام 70-μm) لكل أنبوب لأزاله كتل والحطام إذا لزم الأمر.
  4. تدور أسفل الأنبوب في 400 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. تجاهل الخارقة.
  5. أعاده التعليق الخلايا المغلفة في 12 مل من المعقمة الباردة تلفزيوني وكرر الخطوة 4.4 مره أخرى.
    ملاحظه: من المهم أزاله أكبر قدر ممكن من المنفذ لأنه يمكن لهذا المنفذ ربط CFSE في الخطوة التالية.

5. وضع العلامات الهدف الخلايا الطحال مع CFSE

  1. أعاده التعليق الببتيد-نبضي الطحال في 4 مل من العقيمة تلفزيوني.
  2. أضافه CFSE في 0.025 μM ، 0.25 μM ، و 2 μM في الأنابيب التي تحتوي علي الببتيد غير ذي صله-، موقع I-، والموقع IV-نبض الطحال ، علي التوالي.
    ملاحظه: لتحقيق وضع العلامات CFSE موحده ، عقد كل أنبوب في زاوية 45 درجه قبل أضافه CFSE إلى الجانب قليلا فوق تعليق الخلية تليها علي الفور بواسطة vortexing لطيف. وهذا سوف يضمن ظهور الرسوم البيانية علي نحو سلس في نهاية المطاف. الاختلافات بين الدفعات والفئات المعتمدة علي العمر في كثافة CFSE ليست غير شائعه. ولذلك ، قد يحتاج المرء إلى تجربه جرعات CFSE التفاضلية قبل اتخاذ قرار بشان التركيزات المثلي لاستخدامها.
    تحذير: CFSE هو سام في التركيزات التي هي اعلي من 5 μM.
  3. وضع الأنابيب داخل حاضنه 37 درجه مئوية لمده 15 دقيقه وعكسها مره واحده كل 5 دقائق.
  4. أضافه 3 مل من الحرارة المعطلة لكل أنبوب لوقف رد فعل CFSE. اعلي المحتوي مع العقيمة تلفزيوني.
  5. تدور أسفل الأنبوب في 400 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. تجاهل الخارقة.
  6. أعاده التعليق الخلايا المغلفة في 12 مل من العقيمة تلفزيوني وكرر الخطوة 5.5.

6. فحص كافيه/المساواة CFSE وضع العلامات المستهدفة السكان الخلايا الطحال

  1. أعاده التعليق الخلايا المغلفة في 3 مل من تلفزيوني.
  2. دوامه الأنابيب بلطف. نقل 10 μL ، لكل من CFSEمنخفضه، cfse المتوسطة(int)، و cfse المعلقات الخلية العالية في 5 مل جولة أسفل القاع البوليسترين المنشط الخلية الفرز (facs) أنبوب التي تحتوي علي 200 μl من تلفزيوني.
  3. استجوب الخلايا باستخدام مقياس التدفق الخلوي مجهزه بالليزر 488 nm. رسم بوابه الخلايا اللمفاوية استنادا إلى التشتت إلى الامام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) خصائص للخلايا قبل الحصول علي 5000 الاحداث التي تقع داخل بوابه اللمفاوية في قناه FL-1.
  4. ضمن "الأصل" CFSE + السكان ، رسم بوابات المدرج التكراري اضافيه لتحديد CFSEمنخفضه، cfseINT، و cfseعاليه السكان الفرعيين.
  5. تاكيد أرقام الاحداث المتساوية أو شبه المتساوية داخل البوابات الثلاثة. إذا لزم الأمر ، ضبط أرقام الخلايا في أنابيب ' المصدر ' (الخطوة 6.1) قبل خلط وحقن الخلايا الطحال الهدف في الفئران ساذجه وتستعد في القسم 7.

7. حقن الخلايا المستهدفة CFSE الموسومة في المتلقيين ساذجه و T-Ag-تستعد

  1. دوامه بلطف أنابيب المصدر. انقل تعليقات الخلية الثلاثة المسمية CFSE بنسب متساوية إلى أنبوب جديد.
  2. اعلي المحتوي مع العقيمة تلفزيوني.
  3. تدور أسفل الأنبوب في 400 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. أعاده التعليق الخلايا المغلفة مع العقيمة تلفزيوني.
  4. عد الخلايا في التريكان الأزرق بواسطة مقياس الكريات الدموية لضمان السلامة الخلوية علي الأقل 95 ٪.
  5. ضبط مستوي الصوت من أجل حقن 1 × 107 الخلايا المستهدفة مختلطة/200 ΜL تلفزيوني عن طريق الوريد (وريدي) ، عبر الوريد الذيل ، في كل المتلقي C57BL/6 الماوس.
    ملاحظه: تخزين الخلايا علي الجليد في بين الحقن. اخلط الخلايا المستهدفة برفق قبل كل حقنه. تسجيل الوقت بالبالضبط من الحقن لكل الماوس ، والتي سوف تحدد متى الحيوانية سوف تحتاج إلى ان تكون رحيم. من المهم الحفاظ علي مده الخلوية في الجسم الخلوي متسقة بين جميع الكائنات في نفس التجربة.

8. الحصول علي البيانات

  1. بعد ساعتين أو أربع ساعات من حقن الخلايا المستهدفة CFSE ، موت ببطء الفئران المتلقية بخلع عنق الرحم.
    ملاحظه: يمكن ان تختلف مده في الجسم الخلوي الخلوية اعتمادا علي النظام التجريبي المستخدمة ، والاستمناع الهدف الحثالة ، وفره المتوقع من الببتيدCD8 T المحددة في الطحال ، ومتانة وظيفتها التحللي من بين عوامل أخرى.
  2. أزاله ومعالجه كل الطحال بشكل منفصل كما في الخطوات 3.2 − 3.9.
  3. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا التي تغلف في 3 مل من تلفزيوني.
    ملاحظه: اتخاذ المزيد من العناية للتعامل مع الانسجه الطحال والاستعدادات الخلية في 4 درجه مئوية أو علي الجليد قبل التحاليل الخلوية. هذا هو لمنع استمرار الخلوية السابقة الجسم الخلوي.
  4. نقل ما يقرب من 1 × 107 خلايا من كل الطحال معالجتها في أنبوب facs نظيفه.
  5. استجوب الخلايا علي الفور باستخدام مقياس التدفق الخلوي مجهز بالليزر 488-nm. رسم بوابه الخلايا اللمفاوية علي أساس الخصائص FSC و SSC للخلايا.
  6. تحديد CFSE- المستلم الطحال و cfse + الخلايا المستهدفة المنقولة. رسم بوابات اضافيه تستوعب CFSEمنخفضه، cfseint، والسكان الخلية الهدفعاليه cfse.
  7. الحصول علي إجمالي 2000 الاحداث المنخفضة cfse في قناه FL-1.

9. تحليل البيانات

  1. حساب تحلل محدده من كل الخلايا المستهدفة المتشابهة باستخدام الصيغة التالية:
    % السمية الخلوية المحددة =Equation
    حيث x = cfseint/ارتفاع عدد الحدث في t ag-تستعد الماوس ، y = cfse رقم الحدثمنخفض في t ag-تستعد الماوس ، a = cfseint/ارتفاع عدد الحدث في الماوس ساذجه ، و b = الحدثمنخفض cfse عدد في الماوس ساذجه.
    ملاحظه: في "ثلاثه الذروة" اختبارات السمية الخلوية التي يتم تقييم التحلل محدده من أكثر من السكان المستهدفين واحد ، فانه ليس من المناسب استخدام ترددات الخلايا المستهدفة. هذا ببساطه لان تردد الخلايا المستهدفة المتشابهة يتاثر ليس فقط من خلال النسبة المئوية من الضوابط غير ذات صله ولكن أيضا من قبل الأخرى المتشابهة الهدف الخلايا الطحال. لذلك ، يجب استخدام أرقام الاحداث داخل كل بوابه في الصيغة المذكورة أعلاه لحساب بدقه تحلل كل الخلايا المستهدفة المتشابهة (اما CFSEint أو خليهعاليه cfse) ضد التحكم cfseمنخفضه .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وكان الهدف من التجربة التي صورت نتائجها في الشكل 1 لتحديد ما إذا كان وجود ووظائف خلايا nTreg شكل أو تغيير التسلسل الهرمي المناعي لل t Ag الخاصة tCD8. C57BL/6 تم حقن الفئران i.p. مع تلفزيوني أو مع 0.5 ملغ من المضادة لCD25 ماب (استنساخ PC-61.5.3 [PC61]) قبل أربعه أيام تلقوا 2 × 107 C57SV الخلايا السرطانية i.p. في تجارب منفصلة ، تم استخدام الفئران IgG1 نمط أسوي تحكم النمط بدلا من تلفزيوني. تم تاكيد استنفاد خليه nTreg الناجحة بواسطة PC61 بواسطة التدفق الخلوي17.

تسعه أيام بعد C57SV خليه تلقيح, [تيم بوينت] في اي [ت] [غ-ويد] [ت]CD8 استجابات بلغت هم قصوى23, كل حيوانيه يستلم حقنه وريديه من خليه تعليق يحتوي 3 مجموعه متميزة من [كفس-كشس] هدف خلايا. وكانت الخلايا المستهدفة السيطرة علي الطحال السذاجة الساذجة في التزامن نابض مع اثنين من الببتيدات غير ذات صله (GP33-41 و gB498-505) ووصفت مع جرعه منخفضه من Cfse (0.02 μM). لاعداد الخلايا المستهدفة المتشابهة ، تم نبض الطحال الساذجة السذاجة مع اما الموقع المشتقة T Ag I الببتيد أو الموقع الرابع الببتيد (الجدول 1) ، وبعد ذلك المسمية مع cfse في 0.2 μm و 2 μm ، علي التوالي. تم غسل الخلايا المستهدفة والتحكم فيها ومزجها باعداد متساوية (بنسبه 1:1:1) قبل ان يتم حقنها في الفئران الساذجة (التحكم) و T Ag-الفاره C57BL/6. بعد ساعتين من حقن الخلايا المستهدفة ، تم التضحية بالفئران لطحالهم حيث تم تحديد وجود/غياب الخلايا المستهدفة CFSE بواسطة قياس التدفق الخلوي. تم تمييز الخلايا المستهدفة استنادا إلى شدتها التفاضلية لتلطيخ CFSE.

وكما هو متوقع ، كانت القمم شبه المتساوية المناظرة للسيطرة والخلايا المستهدفة المتشابهة قابله للاكتشاف في الفئران الساذجة (الشكل 1، اللوحة اليسرى). وعلي النقيض من ذلك ، كان الموقع IV-عرض الخلايا المستهدفة غائبه تماما تقريبا في الفئران T Ag-تستعد بغض الاعتبار عن العلاج السابق لها مع PC61 أو تلفزيوني (الشكل 1). ومن المثير للاهتمام, nTreg استنزاف الخلية بواسطة PC61 المعززة في الجسم التحلل بوساطة CTL من الموقع I-نبض الخلايا المستهدفة17. وقد دفعتنا هذه النتائج إلى استنتاج ان خلايا nTreg تمنع بشكل انتقائي الموقع الخاص بي للخلايا الخلوية. ولذلك ، فان ntreg الخلايا المستنفدة/التي تعمل علي تنشيط العوامل قد تعزز وظيفة المستجيب لحل من ctls الاعتراف ببعض المواد الوراثية المشتقة من الورم.

ويوفر الاعداد المذكور أعلاه مثالا علي كيفيه استخدام الاختبارات الخلوية الخلوية للاختبار في نفس الوقت للدالة الخلوية للهوية والنسخ المستنسخة SD CTL في الحيوانية ذاتها.

Figure 1
الشكل 1: تحليل السمية الخلوية التمثيلي للخلاياCD8التي تتوسط فيها الخلايا التائية ضد التسمم المشتق من t Ag في وجود أو عدم وجود خليه nTreg. خلايا الطحال المستهدفة النبضي مع الببتيدات التحكم ، الموقع I أو الموقع IV ، التي تم تصنيفها بشكل مختلف مع CFSE ، تم تعقبها من قبل تدفق الخلوية في الطحال من الماوس ساذجه (لوحه اليسار) ، وهو الماوس الذي تم حقنه بواسطة PC61 (اللوحة الوسطي) ، والCD25 (nti)- حقن (nTreg-المنضب) T Ag-تستعد الماوس (اللوحة اليمني). تم حساب النسبة المئوية للقتل المحدد للخلايا المستهدفة باستخدام الصيغة الموصوفة في البروتوكول ، ويتم عرض الأرقام التمثيلية. وقد اعتمد هذا الرقم باذن من هاريفار وآخرون17. حقوق الطبع والنشر 2005. الرابطة الامريكيه لعلماء المناعة ، وشركه يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

في تحقيق أحدث ، سالنا ما إذا كان حجب PD-1 يؤثر علي "اتساع" استجابه TCD8 إلى t Ag16 (الشكل2). كان هذا سؤالا سريريا ذات الصلة في ضوء الفوائد العلاجية الملحوظة لمثبطات نقاط التفتيش المستندة إلى PD-1 في العديد من الأورام الخبيثة. علي الرغم من ان هذه المثبطات ويعتقد ان العمل في المقام الأول من خلال عكس T استنفاد الخلية, كنا الغريب ان نعرف ما إذا كان التداخل مع PD-1-PD-L1 التفاعلات قد يوسع بالاضافه إلى ذلك (أو ضيق) المضادة للسرطان TCD8 الردود. في نموذج الاعتراف T Ag لدينا ، وكشفت التجارب داخل الخلايا تلطيخ (ICS) ان العلاج مع اما المضادة-PD-1 أو المضادة لل PD-L-1 يوسع بشكل انتقائي IFN-γ-إنتاج TCD8 الاعتراف المواقع الأول والثاني/الثالث16. ثم قمنا بتوسيع دراستنا لدراسة في الجسم الخارجي وظيفة المستجيب لحل من هذه SD ctls. C57BL/6 تم حقن الفئران i.p. مع 100 ميكروغرام من المضادة-PD-1 ماب (استنساخ RMP1) أو الفئران IgG2a السيطرة علي النمط (استنساخ 2a3) قبل ساعتين من C57SV خليه التلقيح. تلقت الفئران جرعتين إضافيتين من المضادة لل PD-1 أو النمط الوراثي بعد ثلاثه وسته أيام من حقن الخلايا السرطانية. في يوم 9 بعد فتيله ، أعطيت أفواج من الفئران ساذجه وتستعد ، عن طريق الاورده الذيل الجانبي ، خليط الخلية التي تحتوي علي اعداد متساوية من CFSEمنخفضه (cfse وضع العلامات الجرعة: 0.025 μm) ، cfseint (cfse وصف الجرعة: 0.25 ΜM) ، و cfseمرحبا (cfse وضع العلامات الجرعة: 2 μM) الخلايا الطحال ساذجه السذاجة النبضي مع gB498-505، الموقع الثاني/الثالث ، والموقع الأول ، علي التوالي. بعد أربع ساعات ، كانت الرحيم الحيوانية ، والخلايا المستهدفة CFSE المسمية كانت تتبع سيتوفلوميفي الطحال. وتوضح المخططات التمثيلية لهذه المجموعة (الشكل 2 ا) وبيانات 3 من الماشية لكل فوج (الشكل2 ب). في حين ان الحصار PD-1 لم يؤثر علي معرف TCD8 استجابه ضد الموقع IV16، تم تنشيط المواقع الاولي والثانية/الثالثة الخاصة SD الاستجابات. التالي خلصنا إلى ان التدخل في التفاعلات PD-1-PD-L1 قد يحفز ' مرضبه الانتشار ' في المضادة للسرطان TCD8 الردود.

ويمثل الاعداد أعلاه في الجسم الحيوي قتل الاختبارات التي تمكن كميه من السمية الخلوية التي اثارتها اثنين من المستنسخين SD CTL في نفس الحيوانية.

Figure 2
الشكل 2: في الجسم الخلوي للخلايا t Ag الخاصة TCD8 في مكافحه PD-1-الفئران المعالجة. (ا) المخططات البيانية التمثيلية تظهر قمم cfse المقابلة للخلايا الطحال المستهدفة النبضي مع الببتيد غير ذي صله (cfseمنخفضه) ، الموقع الثاني/الثالث (cfseint) ، والموقع الأول (Cfseعاليه) في T Ag-تستعد الفئران التي تلقي النمط (اللوحة اليسرى) أو ماب-1-حجب (اللوحة اليمني). (ب) تم حساب النسبة المئوية للقتل المحدد لكل خليه من مجموعات الخلايا المستهدفة باستخدام أرقام الحدث cfse + في الفئران التي تستعد لل T Ag (n = 3 لكل مجموعه) والمستلمين الساذجين (غير الظاهرين) والصيغة الموصوفة في البروتوكول. تمثل أشرطه الخطا الأخطاء القياسية لمتوسط (SEM) و * * تشير إلى اختلاف إحصائي مع p < 0.01 بواسطة الاختبارات tالخاصة بالطالب الكترون. وقد اعتمد هذا الرقم باذن من Memarنجران et al.16. حقوق الطبع والنشر 2017. الرابطة الامريكيه لعلماء المناعة ، وشركه يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

مصدر البروتين Antigen الببتيد المربي تعيين تسلسل MHC I تقييد
SV401 كبير T Ag2 T Ag206-215 الموقع الأول القديس حسين حاء-2Db
SV40 كبير T Ag T Ag223-231 الموقع الثاني/الثالث في الآن حاء-2Db
SV40 كبير T Ag T Ag404-411 الموقع الرابع VVYDFLKC H-2Kb
SV40 كبير T Ag T Ag489-497 الموقع الخامس QGINNLDNL حاء-2Db
HSV-13 بروتين سكري B gB498-505* 498-505 جيجا بايت SSIEFARL H-2Kb
البروتين السكري الرابع GP33-41* GP33-41 كافينفاتك حاء-2Db
1 سيميان فيروس 40
2 مستضد الورم الكبير
3 فيروس الهربس البسيط نوع 1
4 اللمفاوية لمفاواني فيروس
* تستخدم الببتيد غير ذات صله

الجدول 1 الببتيدات المقدمة في هذا البروتوكول

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المستندة إلى CFSE في اختبارات الخلوية الحيوية تقدم العديد من المزايا علي اختبارات القتل التقليدية مثل الكروم المشعة (51Cr) الإفراج والقياس اللوني لاكتات نازعه (ldh) الإفراج عن الاختبارات. أولا ، انها تسمح برصد وظيفة CTL داخل الجهاز اللمفاوي الثانوي سليمه معماريا.

ثانيا ، ان القتل المحدد للخلايا المستهدفة في اختبارات الخلايا الخلوية يعكس العددالمطلق لCD8 t الخاصة ب Ag ، والتي عاده ما تكون ، ولكن ليس دائما ، داله لترددات tCD8 الموجودة في الطحال. هذا علي النقيض من 51CR/ldh الإصدار الاختبارات التي يتم استخدام عدد ثابت من الخلايا كمصدر لCD8T. التالي ، 51الإصدار CR/ldh اختبارات تفشل في تقدير موثوق العدد الإجمالي لCD8 T الخاصة Ag التي قد تكون متاحه للمضيف للقضاء علي الخلايا السرطانية أو لمكافحه العدوى. وهذا مهم لأنه في كثير من الحالات والظروف ، يتم تغيير حجم والاغشيه من الاجهزه اللمفاوية الثانوية/الانسجه التي تستوعب Ag الخاصةCD8 T. علي سبيل المثال ، يمكن تصور سيناريو افتراضي فيه العدوى الفيروسية يرفع العدد الإجمالي لل TCD8 محدده ل الببتيد X بينما أيضا توسيع متعددة أخرى tCD8 المستنسخين إيواء خصوصيات أخرى. ونتيجة لذلك ، فان ترددCD8 t الخاصة بين مجموع الطحال tCD8 قد لا تزيد ، وفي هذه الحالة 51Cr/ldh الإفراج فحص لن يكون مفيدا. كمثال آخر ، ونحن أظهرت مؤخرا ان بعض مستضدات بكتيرية توسيع الذاكرة TCD8 محدده ل NP147-155، وهو مرضدي الببتيد المناعية من فيروسات الإنفلونزا A في balb/c الفئران ، والتي ترتبط بشكل جيد مع زيادة في الجسم التحلل من NP147-155-نبض الخلايا المستهدفة31. وبما ان التعرض للمستضدات الخارقة يثير تكاثر الخلايا التائية غير المحددة، فانه من غير المحتمل جدا ان تثبت السمية الخلوية الخاصة بال147-155 NP باستخدام 51Cr/ldh.

ثالثا ، نبض الخلايا المستهدفة مع الببتيدات التي ترتبط بنفس الفئة MHC انا جزيء يمكن ان توصف بجرعات مختلفه من CFSE ، مختلطة والمستخدمة في اختبارات الخلوية في الجسم الخارجي. التحليل المصاحب لوظائف CTL نحو الببتيدات هذه ليس خيارا في 51CR/ldh اختبارات الإصدار.

رابعا ، في اختبارات الخلوية المجرية تسمح للدراسات الميكانيكية خلال فتيله ، المستجيب ومراحل الاستدعاء من الاستجابات CTL. علي سبيل المثال ، يمكن اجراء تلقيح الخلايا السرطانية أو التطعيم ضد الأورام في الفئران المعدلة وراثيا لتقييم الحث CTL. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام الطحال من الجينات تدق في والفئران ضرب التدريجي كما الخلايا المستهدفة خلال مرحله المستجيب. أخيرا, وكلاء مختلفه (مثل, مثبطات الدوائية والمرشحين المخدرات) يمكن ان تدار قبل فتيله, خلال مرحله المستجيب, أو كليهما. ولذلك ، في اختبارات الخلوية الجسم الخلوي توفر منصة قويه للاختبار فعاليه المخدرات/لقاح في وضع الجسم الفعلي في الواقع. وفي هذه المجموعة من الاعمال ، قدمنا أمثله علي التدخلات المناعية التي تعزز استجابات CTL المجرية (الشكل 1 والشكل 2).

مثل غيرها من الاختبارات التي تستخدم بشكل روتيني قتل ، في اختبارات الجسم الخلوي لا توفر اي معلومات مباشره فيما يتعلق بقدره CTLs لأعاده التدوير من هدف إلى آخر قبل ان تصبح استنفدت. الاضافه إلى ذلك ، قمنا باختبار العديد من أنواع الخلايا السرطانية كخلايا مستهدفه محتمله في الاختبارات الخلوية للخلايا الحيوية ، وان لم تكن مجديه حتى الآن. هذا هو ببساطه لان الخلايا السرطانية لا تصل إلى الطحال علي الأقل في أرقام يمكن كشفها بعد ان يتم حقن وريدي ولذلك ، يمكن اعتبار الاعتماد علي الخلايا الطحال الماوس كما الخلية المستهدفة قيدا متاصلا في اختبارات الخلوية الجسم الحيوي. ومن الجدير بالذكر ، ومع ذلك ، ان الخلايا الطحال الهدف المنقولة بطريقه متبنيه يمكن العثور عليها بسهوله في العديد من الاجهزه الأخرى (بالاضافه إلى الطحال) ، علي سبيل المثال في الكبد. ولذلك ، يمكن تقييم الدالة CTL الخاصة Ag في أجهزه متعددة أو الانسجه.

لدينا الأمثل في الجسم الحيوي اختبارات الخلوية لفحص المناعية في t Ag الخاصةCD8 الردود16،17. تتوفر العديد من الاداات والكاشفات لدراسة هذه الاستجابات في سياقات المناعة ضد الورم والعلاج. خط الخلايا الليفية المستخدمة في البروتوكول الموصوف هنا (اي ، خلايا C57SV) لا يؤدي إلى أورام في الفئران المناعية. ولذلك ، فانه هو أداه مفيده في التحقيق التطعيم ضد الأورام. وقد ولدت التحول النيوبلاستيك الذي يحركه T Ag في الانسجه المختارة عده نماذج قيمه من سرطان الأصلي. علي سبيل المثال ، SV11 الفئران التي تتطور الأورام الضفيرة المشيميه داخل البطينين الدماغ35 لا الميناء الذاتية t Ag الخاصة tCD8 لان يتم تحديد هذه الخلايا ضد وحذفها في الغدة الصعتريه. ومع ذلك ، نقل C57BL/6 الطحال في سوبليثالي المشع ، والفئران الحاملة للورم SV11 يؤدي إلى توسيع السيطرة علي الأورام ، والتي يقال انها مرتبطة في فتيله الجسم من الموقع IV محدده TCD836،37 . في السرطانات اللحمية المحورة وراثيا من البروستاتا الماوس (متشرد) نموذج38, الموقع IV-استجابه محدده تتضاءل بعيدا مع تطور الورم الخبيث. ومع ذلك ، فان الخلايا الإيمونوريسيسيفيه الخاصة بالموقع الخامس الخاصة بالCD8 الهروب من الاختيار السلبي في الغدة الصعتريه وأيضا تجنب أليات التسامح المحيطي21. وهذا يوفر فرصا وافره للتدخلات العلاجية التجريبية التي تدور حول الموقع V-محدده TCD8 وظائف. في الجسم الخلوي اختبارات التسمم الخلوي يجب ان تكون مفيده في دراسة وربما عكس التسامح المناعي في أنظمه النموذج المختلفة ، بما في ذلك في نموذج الاعتراف T Ag.

المناعي هو سمه ثابته من الردودCD8 T ولدت ليس فقط ضد الأورام ولكن أيضا نحو المولدات المسببة للمرض. في الواقع ، لقد استخدمنا سابقا في اختبارات الخلوية الجسم الخلوي لدراسة المناعية في مكافحه الإنفلونزا TCD8 الاستجابات12. ولذلك ، يمكن تعديل المقايسة المحسنة الموصوفة في هذا البروتوكول واستخدامها في مجموعه واسعه من التطبيقات المناعية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) منح ممسحة-130465 و PJT-156295 إلى SMMH. ويدعم المعهد جزئيا منحه الملكة اليزابيث الثانية للدراسات العليا في العلوم والتكنولوجيا من وزاره التدريب والكليات والجامعات في اونتاريو. وكان جيم حاصلا علي منحه الدراسات العليا من العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) من الكسندر غراهام بيل كندا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yewdell, J. W., Bennink, J. R. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).
  2. Chen, W., et al. Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination. The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).
  3. Otahal, P., et al. Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope. The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).
  4. Lauron, E. J., et al. Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).
  5. Crowe, S. R., et al. Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections. The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).
  6. Probst, H. C., et al. Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression. The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).
  7. Gileadi, U., et al. Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein. The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).
  8. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).
  9. Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL. The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).
  10. Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).
  11. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  12. Haeryfar, S. M., et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies. The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).
  13. Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase. Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).
  14. Kedl, R. M., et al. T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells. The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).
  15. Kastenmuller, W., et al. Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).
  16. Memarnejadian, A., et al. PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination. The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).
  17. Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities. The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).
  18. Rytelewski, M., et al. Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase. PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).
  19. Maleki Vareki, S., et al. Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin. American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).
  20. Irvine, K., Bennink, J. Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses. Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).
  21. Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes. Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).
  22. Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. Immunodominance and tumor escape. Seminars in Cancer Biology. 12 (1), 25-31 (2002).
  23. Mylin, L. M., et al. Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes. Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).
  24. Fu, T. M., et al. An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope. Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).
  25. Chen, W., et al. Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon. European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).
  26. Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo. Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).
  27. Aichele, P., et al. Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology. Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).
  28. Oehen, S., Brduscha-Riem, K. Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division. The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).
  29. Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1. The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).
  30. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).
  31. Meilleur, C. E., et al. Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. , Epub ahead of print (2018).
  32. Goldszmid, R. S., et al. Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma. The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).
  33. Oberg, L., et al. Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways. European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).
  34. Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency. The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).
  35. Brinster, R. L., et al. Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors. Cell. 37 (2), 367-379 (1984).
  36. Tatum, A. M., et al. CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors. The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).
  37. Schell, T. D., Tevethia, S. S. Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen. The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).
  38. Greenberg, N. M., et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 147 ، الخلايا CD8 + t ، السمية الخلوية ، السرطان ، المناعة ، الببتيدات المشتقة من الورم ، مستضد t الكبير ، الخلايا التنظيمية ، PD-1 ، مثبطات نقاط التفتيش ، اختبار فعاليه المخدرات ، قياس التدفق
الخياطة في فيفو الاختبارات الخلوية لدراسة المناعي في الأورام الخاصة<sup>CD8 +</sup> T الاستجابات الخلية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, … More

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter