Summary
Describimos aquí un ensayo de matanza in vivo basado en citometría de flujo que permite el examen de inmunodominancia en las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a un antígeno tumoral modelo. Proporcionamos ejemplos de cómo este ensayo elegante se puede emplear para estudios mecaniísticos y para pruebas de eficacia de fármacos.
Abstract
Los ensayos de citotoxicidad con base en el éster de carboxyfluorescein succinimidil (CFSE) permiten la cuantificación sensible y precisa de las respuestas de linfocitos T de CD8+ citolíticos (CTL) obtenidas contra péptidos derivados de tumores y patógenos. Ofrecen varias ventajas sobre los ensayos de matanza tradicionales. En primer lugar, permiten el seguimiento de la citotoxicidad por CTL mediada dentro de los órganos linfoides secundarios arquitectónicamente intactos, típicamente en el bazo. En segundo lugar, permiten estudios mecaniísticos durante las fases de cebado, efector y recuperación de las respuestas CTL. En tercer lugar, proporcionan plataformas útiles para las pruebas de eficacia de vacunas/fármacos en un entorno verdaderamente in vivo. Aquí, proporcionamos un protocolo optimizado para el examen de las respuestas CTL concomitantes contra más de un epitopo péptido de un antígeno tumoral modelo (AG), a saber, el virus Simia 40 (SV40)-codificado grande t AG (t AG). Al igual que la mayoría de las otras proteínas del tumor clínicamente relevantes, T AG alberga muchos péptidos potencialmente inmunogénicos. Sin embargo, sólo cuatro de estos péptidos inducen respuestas CTL detectables en ratones C57BL/6. Estas respuestas se organizan sistemáticamente en un orden jerárquico basado en su magnitud, que forma la base para TCD8 "inmunodominancia" en este potente sistema. En consecuencia, la mayor parte de la respuesta TCD8 específica de t AG se centra en un único epítopo inmunodominante, mientras que los otros tres epítopos se reconocen y responden sólo débilmente. La inmunodominación compromete la amplitud de las respuestas antitumorales TCD8 y es, como tal, considerado por muchos como un impedimento para la vacunación exitosa contra el cáncer. Por lo tanto, es importante entender los factores celulares y moleculares y los mecanismos que dictan o dan forma a la inmunodominación TCD8 . El protocolo que Describimos aquí está adaptado a la investigación de este fenómeno en el modelo de inmunización de T AG, pero se puede modificar y extender fácilmente a estudios similares en otros modelos de tumores. Proporcionamos ejemplos de cómo el impacto de las intervenciones inmunoterapéuticas experimentales se puede medir utilizando ensayos de citotoxicidad in vivo.
Introduction
Las células t CD8+ convencionales (tCD8) juegan partes importantes en la vigilancia inmune contra el cáncer. Funcionan principalmente en la capacidad de los linfocitos T citolíticos (CTLs) que reconocen antígenos péptidos específicos o asociados al tumor (AGS) que se muestran dentro de la hendidura cerrada de las moléculas de clase I del complejo de histocompatibilidad principal (MHC). Los CTLs completamente armados utilizan su arsenal citotóxico para destruir las células malignas. El anticancerígeno TCD8 puede detectarse en la circulación o incluso en las masas primarias y metastásicas de muchos pacientes con cáncer y animales portadores de tumores. Sin embargo, a menudo son anérgicas o exhaustas y no logran erradicar el cáncer. Por lo tanto, muchas modalidades de inmunoterapia están diseñadas para aumentar las frecuencias TCD8 anticancerígenas y para restaurar y potenciar sus funciones.
Las proteínas tumorales albergan muchos péptidos, algunos de los cuales pueden ser inmunogénicos y potencialmente inmunoprotectores. Sin embargo, las respuestas TCD8 cuantificables se provocan con magnitudes variables contra pocos péptidos solamente. Esto crea una "jerarquía de inmunodominancia" entre TCD8 clones1. En consecuencia, inmunodominante (ID) TCD8 ocupan rangos jerárquicos prominentes, que es comúnmente juzgado por su abundancia. Por el contrario, las células TCD8 cuyo receptor de linfocitos t (TCR) es específico para epitopos SUBDOMINANTES (SD) ocurren en frecuencias más bajas. Nosotros y otros hemos identificado algunos de los factores que dictan o dan forma a la inmunodominación en las respuestas TCD8 . Estos incluyen, entre otros, el modo de presentación de AG a TCD8 ingenuos (es decir, presentación directa, presentación cruzada, travestismo)2,3,4, el tipo de células presentadoras de AG (APCs) participandoen la activación5TCD8 , la abundancia y estabilidad de la proteína AGS6,7 y la eficiencia y cinética de su degradación por proteasomas7,8, el selectividad relativa del transportador asociado con el procesamiento de AG (TAP) para los péptidos9, la afinidad de los péptidos liberados para las moléculas de MHC I9,10, la presencia, las frecuencias precursoras y la diversidad de TCR de cognar tCD8 en las agrupaciones de células t11,12,13, competencia cruzada entre las células t para el acceso a los APCs14,15, y la capacidad fratricida de tCD8 clones16. Además, la inmunodominación TCD8 está sometida a mecanismos inmunoreguladores mediadas por varios tipos de células supresoras, como las células t (nTreg) reguladorasque ocurren de forma natural, la molécula Co-inhibitoria de la superficie celular programada muerte-1 (PD-1)16, y ciertas enzimas intracelulares como indoleamina 2, 3-dioxigenasa (ido)18 y el objetivo de mamífero de rapamicina (mTOR)19. Es importante tener en cuenta, sin embargo, que los factores anteriores no siempre tienen en cuenta completamente la inmunodominación.
Aparte de la biología básica de la inmunodominación TCD8 , el examen de este fenómeno intrigante tiene importantes implicaciones en la inmunología del cáncer y la inmunoterapia. En primer lugar, un estado de identificación no confiere necesariamente a un clon dado de TCD8 la capacidad de prevenir el inicio del tumor o la progresión20. Si y cómo los ID y SD TCD8 contribuyen a la inmunidad antitumoral pueden depender del tipo y el grado de malignidad y el sistema experimental empleado. En segundo lugar, se cree que ID TCD8 clones pueden ser "demasiado visibles" para el sistema inmunológico y por lo tanto más propensos a los mecanismos de tolerancia central y/o periférica16,21. En tercer lugar, los tumores heterogénicos pueden contener células neoplásicas que evitan la detección por muchos, si no la mayoría, CTLs mostrando sólo un espectro estrecho de péptidos: MHC complejos. Bajo estas circunstancias, TCD8 respuestas de amplitud insuficiente son propensos a permitirse tales células tumorales una ventaja de supervivencia, potenciando así su crecimiento de la salida22. Es por las razones anteriores que muchos ver inmunodominación como un obstáculo a la vacunación exitosa a base de TCD8y terapias contra el cáncer.
La inoculación de ratones C57BL/6 con virus simio 40 (SV40)-células transformadas que expresan gran tumor AG (T AG) proporciona un potente sistema preclínico para estudiar el inmunopredominio de TCD8 . Este modelo ofrece varios beneficios. En primer lugar, los epítopos peptídicos de esta oncoproteína clínicamente relevante están bien caracterizados en esta cepa de ratón23 (tabla 1). En segundo lugar, los epítopos de T AG, que se denominan sitios I, II/III, IV y V, desencadenan respuestas TCD8 que se organizan sistemáticamente en el siguiente orden jerárquico: sitio iv > > sitio I ≥ sitio II/III > ≫ sitio V. en consecuencia, el sitio IV-específico TCD8 Monte la respuesta más robusta a T AG. Por el contrario, los sitios I y II/III son subdominantes, y los TCD8 específicos del sitio V son menos abundantes y por lo general sólo son detectables en ausencia de capacidad de respuesta a otros epítopos23,24. En tercer lugar, la línea celular del tumor T AG+ utilizada en el protocolo aquí descrito, es decir, C57SV células de fibrosarcoma, y las utilizadas en nuestras investigaciones anteriores16,17,18,19 ,25,26, se transforman con fragmentos subgenómicos SV4025. Por lo tanto, son incapaces de ensamblar y liberar SV40 viriones que potencialmente podrían infectar APCs del host. Además, las células C57SV carecen de moléculas coestimuladores clásicas como CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) y ligando del CD137 (4-1BBL)16. Los atributos anteriores hacen que estas líneas sean ideales para el examen de la activación in vivo de TCD8 mediante cebado cruzado. La cebado cruzado es una vía importante para inducir respuestas TCD8 , especialmente aquellas lanzadas contra células tumorales de origen no hematopoyético que fallan directamente en las células T ingenuas25.
Las frecuencias y/o funciones antitumorales TCD8 pueden controlarse mediante la tinción de MHC I tetrámero, la tinción intracelular para citoquinas efectoras (p. ej., el interferón [IFN]-γ) o las moléculas líticas (p. ej., perforación), los ensayos de inmunosolla ligada a enzimas (ELISPOT) y ex ensayos de citotoxicidad vivo. Desde su creación en los 199027,28, carboxyfluorescein succinimidil Ester (CFSE)-basado en ensayos de matanza in vivo han permitido la evaluación de las respuestas citotóxicas mediadas por antiviral CTLs29,30 , 31, antitumorales CTLs16,32, natural killer (NK) células33, glicolipid reactivo natural invariante T (iNKT) células34, y pre existente y de Novo específico del donante aloanticuerpos26. Por lo tanto, sus aplicaciones pueden ser de interés para un amplio número de lectores, incluyendo pero no limitado a los investigadores que trabajan en las áreas de Inmunología tumoral e inmunoterapia, inmunidad antipatógeno, y el diseño de la vacuna preventiva y terapéutica.
Para evaluar la citotoxicidad mediada por células en escenarios típicos, dos poblaciones de splenocitos ingenuos que exhiben un AG irrelevante o un AG (s) cognado están etiquetados con dos dosis diferentes de CFSE, mezcladas en igual número e inyectadas en ingenua (control) o asesino ratones que albergan células. A continuación, la citometría de flujo examina la presencia/ausencia de cada población objetivo.
Hemos optimizado y empleado ensayos de matanza in vivo en nuestros estudios sobre inmunodominancia en las respuestas antiviral y antitumoral T CD812,16,17. Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la evaluación simultánea de las respuestas de ID y SD TCD8 a los epítopos de t AG, que pueden adoptarse fácilmente para investigaciones similares en otros sistemas experimentales. También proporcionamos resultados representativos que demuestran que el agotamiento de células nTreg y el bloqueo PD-1 pueden mejorar selectivamente la citotoxicidad inducida por ID TCD8-y SD tCD8, respectivamente. Al final, discutiremos múltiples ventajas de los ensayos de matanza in vivo, así como algunas de sus limitaciones inherentes.
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Protocol
Los experimentos descritos aquí siguen protocolos de uso de animales aprobados por entidades institucionales y se adhieren a las directrices nacionales establecidas.
1. inoculación de ratones C57BL/6 con T AG-expresando células tumorales
- Cultivar la línea celular de fibrosarcoma SV40 transformada C57SV (o una línea celular de T AG+ adherente similar) en el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/l D-glucosa y l-glutamina (1x) y complementado con piruvato sódico de 1 mm y 10% inactivados por calor suero bovino fetal (FBS) en matraces tratados con cultivo de tejidos a 37 ° c en atmósfera humidificada que contengan 10% de CO2.
- Una vez que las células se vuelven completamente confluentes o ligeramente sobreconfluidas, retire suavemente y deseche el medio y enjuague la monocapa con suero estéril amortiguado por fosfato (PBS) precalentado.
Nota: la expresión T AG máxima se logra cuando las células T AG+ alcanzan el 100% de confluencia. - Dentro de un gabinete biológico de seguridad, añadir tripsin-EDTA pre-calentado (0,25%) para cubrir la monocapa a temperatura ambiente hasta que las células se desalojan en parches. Toque los lados del matraz (s) de cultivo varias veces para liberar las células adherentes restantes.
Nota: si es necesario y para agilizar el proceso de tripsinización, transfiera el (los) matraz (s) a una incubadora de 37 ° c. Las células desalojadas adoptarán rápidamente una forma redondeada bajo un microscopio de luz. Este paso debe durar aproximadamente 5 minutos. - Añadir 5 mL de grumos medio y disociado DMEM para preparar una suspensión de una sola célula pipeteando el contenido de cada matraz hacia arriba y hacia abajo.
- Transfiera la suspensión de la célula a través de un colador de células con poros de 70 μm en un tubo.
- Gire hacia abajo el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Deseche el sobrenadante. Resuspend células granuladas en 10 mL de PBS estéril frío.
- Repita los pasos 1,6 y 1,7 dos veces.
- Cuente las células con un hemociómetro. Prepare una suspensión uniforme que contenga 4 x 107 células/ml PBS estéril.
- Inyectar 500 μL de la suspensión anterior intraperitonealmente (i.p.) en cada adulto (6-12-semana-edad) macho o hembra C57BL/6 ratón.
2. regímenes de tratamiento
-
Régimen de tratamiento para examinar la contribución de las células nTreg a TCD8 inmunodominancia
- Cuatro días antes de la preparación in vivo de ratones C57BL/6 con células C57SV (paso 1,10), inyectar cada animal una vez i.p. con 0,5 mg de una baja endotoxina, anticuerpo monoclonal anti-CD25 sin azida (mAb) (Clone PC-61.5.3), que agota las células nTreg, o con una rata IgG1 isotipo control (p. ej., clonar KLH/G1-2-2, clonar HRPN o clonar TNP6A7).
-
Régimen de tratamiento para probar la significancia in vivo de PD-1-PD-L1 (2) interacciones en el modelado de inmunodominancia TCD8
Nota: la participación de PD-1 por PD-L1 a menudo, pero no siempre, medita la co-inhibición y/o agotamiento de TCD8específico de AG. Por lo tanto, el tratamiento con anti-PD-1 se puede realizar en paralelo con la administración de mAbs anti-PD-L1 y anti-PD-L2 para revelar la interacción intercelular exacta involucrada en un fenómeno biológico.
3. preparación de los Splenocitos objetivo
- Eutanasia ratones ingenuos C57BL/6 de sexo igualado (6-12 semanas de edad) que servirán como donantes de esplocito por dislocación cervical.
- Coloque cada ratón con el abdomen hacia arriba dentro de un gabinete biológico de seguridad. Pulverizar la piel con un 70% (v/v) EtOH. Usando fórceps y tijeras estériles, levante la piel y haga una pequeña incisión ventral en la línea media. Luego, corta la piel de forma cruzada para exponer el peritoneo.
- Usando fórceps, levanta el peritoneo de forma similar a una carpa sin arrebatar ninguno de los órganos internos. Corta el peritoneo abierto para exponer la cavidad peritoneal y retira suavemente el bazo.
- Colocar el bazo (s) dentro de una amoladora de tejido Dounce de 15 mL que contiene 5 mL de PBS estéril. Aplicar presión manual usando el émbolo de vidrio de la amoladora hasta que el tejido esplémico se disipa en una suspensión de células rojas homogéneas.
Nota: dependiendo del número de animales receptores por grupo experimental, pueden necesitarse varios bazos de ratón de donante para la preparación de células diana. Hasta 3 bazos se pueden homogeneizar juntos dentro de una amoladora de 15 ml. - Transfiera el homogeneiado a un tubo de 15 mL. Gire hacia abajo el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Deseche el sobrenadante. Resuspend células granuladas en 4 mL de tampón de lising de cloruro de amonio-potasio (ACK) durante 4 min para eliminar los eritrocitos.
Nota: este es un paso sensible al tiempo. La sobreexposición de los esplocitos al tampón de lising ACK aumentará su fragilidad y los hará susceptibles a la muerte celular no específica. - Para cada tubo, añadir 8 mL de Medio RPMI 1640 conteniendo 10% de FBS inactivados por calor, L-alanyl-L-glutamina, 0,1 mM medios esenciales mínimos (MEM) aminoácidos no esenciales, 1 mM piruvato sódico, 10 mM HEPES, y 1x penicilina/estreptomicina, que en adelante será conoce como medio RPMI completo (tabla de materiales).
- Transfiera el contenido a través de poros de 70 μm de un colador celular a un nuevo tubo de 15 mL.
- Gire hacia abajo el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 ° c.
- Deseche el sobrenadante. Resuspend células granuladas en 12 mL de RPMI completo.
- Divida la suspensión de esplococitos en 3 porciones iguales (4 mL cada una) en 3 tubos separados.
4. recubrimiento de los Splenocitos objetivo con péptidos irrelevantes y cognados
- Etiquetar los tubos de acuerdo con los péptidos que se utilizarán para el pulso de los esplocitos Diana. Los esplocitos de control se pulsarán con un péptido irrelevante, y cada población de esplocitos objetivo cognados se pulsará con un péptido sintético correspondiente al epítopo inmunodominante derivado de T AG (sitio IV) o un epítopo Subdominante de T AG (sitio I o sitio II/III) (cuadro 1).
Nota: la elección de péptidos irrelevantes depende de la conexión experimental y de la cepa del ratón utilizada en cada investigación. Los autores a menudo utilizan gB498-505 (un epitopo de péptido inmunodominante de h-2Kb-restringido de virus del herpes simple [VHS]-1) y/o GP33-41 (un epitopo de péptido inmunodominante de h-2Dbrestringido de linfocíticos virus de la coriomeningitis ([LCMV]) en ratones C57BL/6 (tabla 1). Estos péptidos son opciones óptimas porque: (i) se derivan de patógenos no encontrados anteriormente en el modelo de ratón descrito aquí; (II) similares a los péptidos derivados de T AG, gB498-505 y GP33-41 están restringidos y se unen a las moléculas H-2b . En los ensayos de muerte in vivo de tres picos, cada uno de los dos picos que corresponden a las células diana pueden representar esplocitos pulsados con un péptido inmunodominante o Subdominante. La elección de cada conjunto de péptidos varía de acuerdo con los objetivos de cada experimento. Vea la figura 1 y la figura 2 como ejemplos de dicha variación. Para el resto de este protocolo, los sitios I y IV derivados de T AG representarán péptidos subdominantes e inmunodominantes, respectivamente. - Pulse el contenido de cada tubo etiquetado con 1 μM del péptido respectivo durante 1 h a 37 ° c y 5% CO2.
- Utilice un colador de celda separado (con poros de 70 μm) para cada tubo para eliminar grumos y desechos Si es necesario.
- Gire hacia abajo el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 ° c. Deseche el sobrenadante.
- Resuspend las células granuladas en 12 mL de PBS frío estéril y repita el paso 4,4 una vez más.
Nota: es importante eliminar tanto FBS como sea posible porque FBS puede enlazar CFSE en el siguiente paso.
5. etiquetado de los esplocitos objetivo con CFSE
- Resuspendio los esplocitos pulsados con péptidos en 4 mL de PBS estéril.
- Añadir CFSE a 0,025 μM, 0,25 μM y 2 μM en los tubos que contengan esplocitos de péptidos, sitios I y del sitio IV, respectivamente.
Nota: para lograr un etiquetado CFSE uniforme, sostenga cada tubo en un ángulo de 45 ° antes de añadir el CFSE al lado ligeramente por encima de la suspensión de la célula seguida inmediatamente por un suave vórtex. Esto asegurará la aparición de histogramas lisos al final. Las variaciones de las intensidades de CFSE no son infrecuentes en lotes y dependientes de la edad. Por lo tanto, uno puede necesitar experimentar con dosis diferenciales de CFSE antes de decidir sobre las concentraciones óptimas que se utilizarán.
PRECAUCIÓN: el CFSE es tóxico a concentraciones superiores a 5 μM. - Colocar los tubos dentro de una incubadora de 37 ° c durante 15 min e invertirlos una vez cada 5 min.
- Agregue 3 mL de FBS inactivados por calor a cada tubo para detener la reacción de CFSE. Recarga el contenido con PBS estéril.
- Gire hacia abajo el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 ° c. Deseche el sobrenadante.
- Resuspend células granuladas en 12 mL de PBS estéril y repita el paso 5,5.
6. examen del etiquetado CFSE adecuado/igual de las poblaciones de Esesplocitos objetivo
- Resuspend células granuladas en 3 mL de PBS.
- Vórtice los tubos suavemente. Transferir 10 μL, cada uno, debajaCFSE, CFSEintermedio (int), y CFSE suspensiones de célulasaltas en un 5 ml de fondo redondo de poliestireno activado por fluorescencia (facs) tubo que contiene 200 μL de PBS.
- Interrogue las células utilizando un CITOMETRO de flujo equipado con un láser de 488 nm. Dibuje una compuerta de linfocitos basada en las propiedades de dispersión hacia adelante (FSC) y dispersión lateral (SSC) de las células antes de adquirir 5000 eventos que caen dentro de la puerta de linfocitos en el canal FL-1.
- Dentro de la población "padre" CFSE+ , dibuje puertas de histograma adicionales para identificar las subpoblaciones CFSELow, CFSEinty CFSEHigh .
- Confirme los números de evento iguales o casi iguales dentro de las tres puertas. Si es necesario, ajuste los números de celda en los tubos de "fuente" (paso 6,1) antes de mezclar e inyectar los esplocitos objetivo en ratones ingenuos y imprimados en la sección 7.
7. inyección de células diana etiquetadas por CFSE en los destinatarios ingenuos y con cebado de T-AG
- Vórtice suavemente los tubos de origen. Transfiera las tres suspensiones de células con etiqueta CFSE en proporciones iguales en un tubo nuevo.
- Recarga el contenido con PBS estéril.
- Gire hacia abajo el tubo a 400 x g durante 5 min a 4 ° c. Resuspend las células granuladas con PBS estéril.
- Cuente las células en azul tripan por un hemociómetro para asegurar la viabilidad celular de al menos el 95%.
- Ajustar el volumen para inyectar 1 x 107 células de objetivo mixto/200 ΜL de PBS por vía intravenosa (i.v.), a través de la vena de cola, en cada ratón C57BL/6 receptor.
Nota: Almacene las células en hielo entre las inyecciones. Mezcle suavemente las células diana antes de cada inyección. Anote el tiempo exacto de inyección para cada ratón, que determinará cuándo el animal tendrá que ser eutanzado. Es importante mantener la duración de la citotoxicidad in vivo consistente entre todos los animales en el mismo experimento.
8. adquisición de datos
- Dos o cuatro horas después de la inyección de células diana etiquetadas con CFSE, eutanasia a los ratones receptores por dislocación cervical.
Nota: la duración de la citotoxicidad in vivo puede variar dependiendo del sistema experimental empleado, la inmunogenicidad de los Ags objetivo, la abundancia anticipada de TCD8 específico del antígeno peptídico en el bazo, y la robustez de su función lítica entre otros factores. - Retire y procese cada bazo por separado como en los pasos 3.2 − 3.9.
- Desechar el sobrenadante y resuspender las células peladas en 3 mL de PBS.
Nota: tenga cuidado adicional para manejar el tejido esplémico y preparaciones celulares a 4 ° c o en hielo antes de análisis citofluométricos. Esto es para prevenir la continuación de la citotoxicidad ex vivo. - Transfiera aproximadamente 1 x 107 células de cada bazo procesado a un tubo FACS limpio.
- Interrogue las células inmediatamente utilizando un CITOMETRO de flujo equipado con un láser de 488 nm. Dibuje una puerta de linfocito basada en las propiedades FSC y SSC de las células.
- Identifique los esplocitos del receptor CFSE y las celdas de destino transferidas. Dibuje puertas adicionales que acomode distintas poblaciones de células diana de CFSELow, CFSEinty CFSE.
- Adquiera un total de 2000 eventosbajos CFSE en el canal FL-1.
9. Análisis de datos
- Calcule la lisis específica de cada población de células objetivo cognado utilizando la siguiente fórmula:
% Citotoxicidad específica =
donde x = CFSEint/ número de evento alto en t AG-el ratón Primed, y = CFSE número de eventobajo en t AG-el ratón Primed, a = CFSEint/ número de evento alto en el ratón ingenuo, y b = CFSEbajo el evento número en el ratón ingenuo.
Nota: en los ensayos de citotoxicidad de tres picos en los que se evalúa la lisis específica de más de una población objetivo cognada, no es apropiado utilizar frecuencias celulares Diana. Esto es simplemente porque la frecuencia de una población de células diana cognada está influenciada no sólo por el porcentaje de los controles irrelevantes, sino también por el de los otros esplocitos objetivo cognado. Por lo tanto, los números de evento dentro de cada puerta deben usarse en la fórmula anterior para calcular con precisión la lisis de cada población de células diana cognada (ya sea CFSEint o CFSEHigh cells) contra controles debajo CFSE.
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Representative Results
El objetivo del experimento cuyos resultados se muestran en la figura 1 fue determinar si la presencia y las funciones de las células nTreg forman o alteran la jerarquía de inmunodominancia de tCD8específico de t AG. C57BL/6 ratones fueron inyectados i.p. con PBS o con 0,5 mg de un anti-CD25 mAb (Clone PC-61.5.3 [PC61]) cuatro días antes de que recibieran 2 x 107 C57SV células tumorales i.p. En experimentos separados, se usó un control de isotipo IgG1 de rata en lugar de PBS. El agotamiento exitoso de células de nTreg por PC61 fue confirmado por la citometría de flujo17.
Nueve días después de la inoculación de células C57SV, un momento en el que las respuestas TCD8 específicas de t AG alcanzan su máximo23, cada animal recibió una inyección intravenosa de una suspensión celular que contenía 3 poblaciones distintas de células diana etiquetadas con CFSE. Las células objetivo de control eran los esplocitos ingenuos singeneicos pulsados concomitantemente con dos péptidos irrelevantes (GP33-41 y GB498-505) y etiquetados con una dosis baja de CFSE (0,02 μm). Para preparar las células diana, los esplocitos ingenuos singénicos fueron pulsados con el péptido del sitio derivado de T AG o el péptido del sitio IV (tabla 1), y posteriormente etiquetados con CFSE a 0,2 μm y 2 μm, respectivamente. Las células objetivo de control y cognado fueron lavadas y mezcladas en números iguales (con una relación de 1:1:1) antes de ser inyectadas en ratones ingenuos (control) y C57BL/6 cebados por T AG. Dos horas después de la inyección de la célula diana, los ratones fueron sacrificados por su bazo en el que la presencia/ausencia de células diana etiquetadas por CFSE fue determinada por la citometría de flujo. Las células objetivo se distinguieron en función de sus intensidades de tinción CFSE diferenciales.
Como era de esperar, los picos casi iguales correspondientes a las celdas de objetivo de control y cognado eran detectables en ratones ingenuos (figura 1, panel izquierdo). En contraste, el sitio IV-mostrando las células diana estaban casi completamente ausentes en ratones cebados con T AG, independientemente de su tratamiento previo con PC61 o PBS (figura 1). Curiosamente, nTreg agotamiento de la célula por PC61 aumentada in vivo de lisis mediada por CTL de las células diana de sitio I-pulsado17. Estos resultados nos llevaron a concluir que las células nTreg inhiben selectivamente la citotoxicidad específica del sitio I. Por lo tanto, los agentes inactivados y que agotan las células de nTreg pueden mejorar la función efector citolítica de las CTLs reconociendo ciertos epitopos derivados del tumor.
El conjunto anterior proporciona un ejemplo de cómo se pueden emplear los ensayos de citotoxicidad in vivo para probar simultáneamente la función lítica de los clones ID y SD CTL en el mismo animal.
Figura 1: análisis citofluorimétrico representativo de la citotoxicidad por TCD8mediada contra epitopos derivados de t AG en presencia o ausencia de células nTreg. Los esplocitos objetivo pulsados con péptidos de control, el sitio I o el sitio IV, que fueron etiquetados diferencialmente con CFSE, fueron rastreados por citometría de flujo en el bazo de un ratón ingenuo (panel izquierdo), un ratón cebado con inyección de PBS (panel central) y un PC61 (NTI-CD25)- ratón inyectado (nTreg-agotado) T AG-cebado (panel derecho). El porcentaje de muertes específicas de las celdas de destino se calculó mediante la fórmula descrita en el protocolo y se muestran los números representativos. Esta cifra se adopta, con permiso, de Haeryfar et al.17. Copyright 2005. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
En una investigación más reciente, preguntamos si el bloqueo de PD-1 afecta a la ' amplitud ' de la respuesta TCD8 a t AG16 (figura 2). Esta fue una pregunta clínicamente relevante a la luz de los beneficios terapéuticos observados de los "inhibidores de punto de control" basados en PD-1 en varias neoplasias malignas. Aunque se cree que estos inhibidores trabajan principalmente por revertir el agotamiento de las células T, tuvimos curiosidad por saber si interferir con las interacciones PD-1-PD-L1 también puede ensanchar (o estrechar) las respuestas TCD8 contra el cáncer. En nuestro modelo de reconocimiento de T AG, los experimentos de tinción intracelular de citoquinas (ICS) revelaron que el tratamiento con anti-PD-1 o anti-PD-L-1 expande selectivamente el IFN-γ produciendo TCD8 reconociendo los sitios I y II/III16. A continuación, ampliamos nuestro estudio para examinar la función de efector citolítico in vivo de estos CTLs SD. C57BL/6 ratones fueron inyectados i.p. con 100 μg de un anti-PD-1 mAb (clon RMP1-14) o un control de isotipo de rata IgG2a (clon 2A3) dos horas antes de C57SV inoculación celular. Los ratones recibieron dos dosis adicionales de anti-PD-1 o isotipo tres y seis días después de la inyección de células tumorales. En el día 9 post-cebado, se dieron cohortes de ratones ingenuos y imprimados, a través de venas de cola laterales, una mezcla celular que contenía el mismo número de CFSEbajo (dosis de etiquetado cfse: 0,025 μm), CFSEint (dosis de etiquetado CFSE: 0,25 μm) y CFSEHI (CFSE dosis de etiquetado: 2 μM) los esplocitos ingenuos singeneicos pulsados con gB498-505, sitio II/III y sitio I, respectivamente. Cuatro horas más tarde, los animales fueron eutanizados, y las células diana etiquetadas con CFSE fueron monitorizadas citofluorimétricamente en su bazo. Se ilustran los trazados representativos de FACS (figura 2A) y los datos de 3 animales por cohorte (figura 2B). Mientras que el bloqueo PD-1 no afectó la respuesta ID TCD8 contra el sitio IV16, las respuestas SD específicas de los sitios I y II/III fueron fortaleciadas. Por lo tanto, concluimos que interferir con las interacciones PD-1-PD-L1 puede inducir ' epitopo propagación ' en las respuestas TCD8 contra el cáncer.
La anterior configuracion representa ensayos de matanza in vivo que permiten la cuantificación de citotoxicidad por dos clones SD CTL en el mismo animal.
Figura 2: citotoxicidad in vivo de tCD8 en los ratones tratados con anti-PD-1. (A) los diagramas de histograma representativos demuestran picos de CFSE correspondientes a los splenocitos objetivo pulsados con un péptido irrelevante (CFSELow), el sitio II/III (CFSEint) y el sitio I (CFSEHigh) en los ratones cebados de T AG que recibido un isotipo (panel izquierdo) o un mAb de bloqueo PD-1 (panel derecho). (B) el porcentaje de muertes específicas de cada población de células diana se calculó utilizando CFSE+ números de evento en ratones cebados con T AG (n = 3 por grupo) y destinatarios ingenuos (no mostrados) y la fórmula descrita en el protocolo. Las barras de error representan errores estándar de la media (SEM), y * * denota una diferencia estadística con p < 0,01 por las pruebas tde Student no emparejadas. Esta cifra se adopta, con permiso, de Memarnejadian et al.16. Copyright 2017. La Asociación Americana de inmunólogos, Inc. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fuente de antígeno proteico | Epitopo peptídico | Designación | Secuencia | MHC I restricción |
| SV401 Large T AG2 | T AG206-215 | Sitio I | SAINNYAQKL | H-2Db |
| SV40 Large T AG | T AG223-231 | Sitio II/III | CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 Large T AG | T AG404-411 | Sitio IV | VVYDFLKC | H-2Kb |
| SV40 Large T AG | T AG489-497 | Site V | QGINNLDNL | H-2Db |
| HSV-13 glicoproteína B | gB498-505* | gB498-505 | SSIEFARL | H-2Kb |
| LCMV4 glicoproteína | GP33-41* | GP33-41 | KAVYNFATC | H-2Db |
| 1 Virus Simian 40 | ||||
| 2 El antígeno tumoral grande | ||||
| 3 Virus del herpes simple tipo 1 | ||||
| 4 El virus de la coriomeningitis linfocítica | ||||
| * utilizado como un péptido irrelevante | ||||
Tabla 1. Los péptidos introducidos en este protocolo
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Discussion
Los ensayos de citotoxicidad in vivo basados en CFSE ofrecen varias ventajas sobre los ensayos de matanza tradicionales, como el cromo radioactivo (51CR) y los ensayos de liberación colorimétrico de lactato deshidrogenasa (LDH). Primero, permiten el monitoreo de la función CTL dentro de un órgano linfoide secundario arquitectónicamente intacto.
En segundo lugar, el asesinato específico de células Diana en ensayos de citotoxicidad in vivo refleja el número absoluto de TCD8específico de AG, que suele ser, pero no siempre, una función de las frecuencias tCD8 presentes en el bazo. Esto contrasta con los ensayos de liberación de 51CR/LDH en los que se emplea un número constante de células como fuente de efector TCD8. Por consiguiente, los ensayos de liberación de 51CR/LDH no estiman de forma fiable el número total de TCD8 específicos de AG que pueden estar disponibles para el huésped para eliminar las células tumorales o para combatir las infecciones. Esto es importante ya que en muchos casos y condiciones, el tamaño y la celularidad de los órganos linfoides secundarios/tejidos que acomodan TCD8 específicos de AG se alteran. Por ejemplo, se puede prever un escenario hipotético en el que una infección viral eleva el número total de TCD8 específico para el péptido X, mientras que también la expansión de varios otros clones tCD8 albergando otras especificidades. Como un resultado, la frecuencia de TCD8 específico de X entre total esplénica tCD8 no puede aumentar, en cuyo caso un ensayo de liberación de 51CR/LDH no será útil. Como otro ejemplo, recientemente demostramos que ciertos superantígenos bacterianos expanden la memoria TCD8 específica para NP147-155, un epitopo de péptido inmunodominante de virus de la gripe A en ratones BALB/c, que correlacionó bien con el aumento lisis in vivo de las células diana147-155de NP-pulsadas31. Dado que la exposición a los superantígenos provoca la proliferación de células T no específicamente, habría sido muy poco probable que demostrara una sustancial citotoxicidad por NP147-155específica utilizando 51ensayos de liberación de CR/LDH.
En tercer lugar, las células diana pulsadas con péptidos que se unen a la misma molécula de MHC clase I pueden etiquetarse con diferentes dosis de CFSE, mezcladas y utilizadas en ensayos de citotoxicidad in vivo. El análisis concomitante de funciones CTL hacia tales péptidos no es una opción en 51ensayos de liberación de CR/LDH.
En cuarto, los ensayos de citotoxicidad in vivo permiten realizar estudios mecanicistas durante las fases de cebado, efector y recuperación de las respuestas CTL. Por ejemplo, la inoculación de células tumorales o la vacunación antitumoral pueden realizarse en ratones alterados genéticamente para la evaluación de la inducción de CTL. Por otra parte, los esplocitos de los ratones knock-in y Knock-out del gen pueden ser utilizados como células diana durante la fase efectora. Por último, se pueden administrar varios agentes (p. ej., inhibidores farmacológicos y candidatos a fármacos) antes del cebado, durante la fase de efector o ambos. Por lo tanto, los ensayos de citotoxicidad in vivo proporcionan una potente plataforma para pruebas de eficacia de fármacos/vacunas en un entorno verdaderamente in vivo. En este cuerpo de trabajo, hemos proporcionado ejemplos de intervenciones inmunológicas que impulsan las respuestas CTL in vivo (figura 1 y figura 2).
Al igual que otros ensayos de matanza usados habitualmente, los ensayos de citotoxicidad in vivo no proporcionan ninguna información directa sobre la capacidad de los CTLs para reciclar de un objetivo a otro antes de que se agoten. Además, hemos probado varios tipos de células tumorales como posibles celdas Diana en los ensayos de citotoxicidad in vivo, aunque hasta ahora no haya resultado. Esto es simplemente porque las células tumorales no alcanzan el bazo por lo menos en números detectables después de que se inyectan i.v. Por lo tanto, depender de los esplocitos del ratón como células diana puede considerarse una limitación inherente de los ensayos de citotoxicidad in vivo. Es digno de mención, sin embargo, que los esplocitos objetivo transferidos adoptivamente se pueden encontrar fácilmente en varios otros órganos (además del bazo), por ejemplo en el hígado. Por lo tanto, la función CTL específica de AG se puede evaluar en varios órganos o tejidos.
Hemos optimizado los ensayos de citotoxicidad in vivo para el examen de la inmunodominación en las respuestas tCD8 específicas de t AG16,17. Hay numerosas herramientas y reactivos disponibles para estudiar estas respuestas en los contextos de inmunidad antitumoral y terapia. La línea celular de fibrosarcoma utilizada en el protocolo descrito aquí (es decir, células C57SV) no da lugar a tumores en ratones inmunocompetentes. Por lo tanto, es una herramienta útil en la investigación de la vacunación antitumoral. La transformación neoplástica impulsada por la T AG en tejidos selectos ha generado varios modelos valiosos de cáncer autóctono. Por ejemplo, los ratones SV11 que desarrollan papilomas del plexo coroideo dentro de sus ventrículos cerebrales35 no albergan tCD8 endógeno específicos de la AG, porque estas células se seleccionan contra y se eliminan en el timo. Sin embargo, la transferencia de C57BL/6 de los esplocitos a ratones con radiación subletalmente, SV11 de tumor conduce a un control extendido de los tumores, que se informa asociado con el cebado in vivo del sitio IV específico TCD836,37 . En el adenocarcinoma transgénico de la próstata del ratón (TRAMP) modelo38, la respuesta específica del sitio IV se aleja con la progresión de la neoplasia maligna. Sin embargo, las células TCD8 específicas del sitio inmunorecessive de lo contrario escapan de la selección negativa en el timo y también evitan los mecanismos de tolerancia periférica21. Esto proporciona amplias oportunidades para intervenciones terapéuticas experimentales que giran en torno a las funciones TCD8 específicas del sitio V. Los ensayos de citotoxicidad in vivo deben ser informativos para estudiar y revertir potencialmente la tolerancia inmunológica en varios sistemas modelo, incluido el modelo de reconocimiento de T AG.
La inmunodominación es una característica consistente de las respuestas TCD8 generadas no sólo contra el tumor AGS, sino también hacia epitopos derivados de patógenos. De hecho, hemos utilizado previamente ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar la inmunodominación en la antiinfluenza TCD8 respuestas12. Por lo tanto, el ensayo optimizado descrito en este protocolo puede modificarse y utilizarse en una amplia gama de aplicaciones inmunológicas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los institutos canadienses de investigación sanitaria (CIHR), las subvenciones MOP-130465 y PJT-156295 a SMMH. JC está parcialmente respaldada por una beca de posgrado de la Reina Isabel II en ciencia y tecnología del Ministerio de formación, colegios y universidades de Ontario. CEM fue un beneficiario de una beca de posgrado de Alexander Graham Bell Canada (doctorado) de Ciencias naturales y el Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Thermo Fisher Scientific | 25200-056 | |
| ACK Lysing Buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) | Bio X Cell | BE0012 | |
| Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) | Bio X Cell | BE0146 | |
| CFSE | Thermo Fisher Scientific | C34554 | |
| DMEM (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent Bioproducts | 080-150 | Heat-inactivate prior to use |
| GlutaMAX (100X) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | 10 mM final concentration |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Stock is 100X |
| Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) | SouthernBiotech | 0116-01 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone HRPN) | Bio X Cell | BE0088 | Isotype control |
| Rat IgG1 (clone TNP6A7) | Bio X Cell | BP0290 | Isotype control |
| Rat IgG2a (clone 2A3) | Bio X Cell | BP0089 | Isotype control |
| RPMI 1640 (1X) | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | 1 mM final concentration |
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