Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Skræddersy in vivo cytotoksiske assays til at studere immun dominans i tumor specifikke CD8+ T- celle respons

Published: May 6, 2019 doi: 10.3791/59531
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Western University, 2Department of Medicine, Division of Clinical Immunology and Allergy, Western University, 3Department of Surgery, Division of General Surgery, Western University, 4Lawson Health Research Institute

Summary

Vi beskriver her en flow cytometri-baseret in vivo drab assay, der muliggør undersøgelse af immun dominans i cytotoksiske T-lymfocyt (CTL) svar til en model tumor antigen. Vi giver eksempler på, hvordan denne elegante analyse kan anvendes til Mekanistiske undersøgelser og til Drug effektivitet test.

Abstract

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-baseret in vivo cytotoksicitetsassays muliggør følsom og nøjagtig kvantitation af CD8 + cytolytisk T- lymfocyt (CTL) svar fremkaldt mod tumor-og patogen afledte peptider. De tilbyder flere fordele i forhold til traditionelle drab assays. For det første tillader de overvågning af CTL-medieret cytotoksicitet inden for arkitektonisk intakte sekundære lymfoide organer, typisk i milten. For det andet giver de mulighed for Mekanistiske undersøgelser under priming, effektor og tilbagekaldelse faser af CTL svar. For det tredje, de giver nyttige platforme for vaccine/Drug effektivitet test i en virkelig in vivo indstilling. Her giver vi en optimeret protokol til undersøgelse af samtidige CTL svar mod mere end én peptid epitop af en model tumor antigen (AG), nemlig Simian virus 40 (SV40)-kodet store T AG (t AG). Ligesom de fleste andre klinisk relevante tumor proteiner, er T AG havne mange potentielt immunogeniske peptider. Men, kun fire sådanne peptider inducerer detekterbare CTL svar i C57BL/6 mus. Disse svar er konsekvent arrangeret i en hierarkisk rækkefølge baseret på deres størrelsesorden, som danner grundlag for TCD8 "immunodominans" i dette kraftfulde system. Derfor er hovedparten af t AG-specifikke tCD8 respons fokuseret mod en enkelt immun dominant epitop, mens de andre tre epitoper er anerkendt og reageret på kun svagt. Immun dominans kompromitterer bredden af antitumor TCD8 svar og er, som sådan, anses af mange som en hindring for en vellykket vaccination mod kræft. Derfor er det vigtigt at forstå de cellulære og molekylære faktorer og mekanismer, der dikterer eller former TCD8 immunodominans. Den protokol, vi beskriver her, er skræddersyet til undersøgelsen af dette fænomen i T AG immuniserings modellen, men kan let modificeres og udvides til lignende undersøgelser i andre tumormodeller. Vi giver eksempler på, hvordan virkningen af eksperimentelle immunotherapeutiske interventioner kan måles ved hjælp af in vivo cytotoksicitetsassays.

Introduction

Konventionelle CD8+ t- celler (tCD8) spiller vigtige dele i anticancer immun overvågning. De fungerer primært i kapacitet af cytolytiske T-lymfocytter (CTL'er), der genkender tumor-specifikke eller-associerede peptid antigener (AGS) vises inden for den lukkede kløft af store histocompatibility Complex (MHC) klasse I molekyler. Fuldt bevæbnede CTL'er udnytter deres cytotoksiske arsenal til at ødelægge maligne celler. Anticancer TCD8 kan påvises i cirkulation eller endda inde primær og metastatisk masser af mange kræftpatienter og tumor-bærende dyr. Men de er ofte anerge eller udmattede og undlader at udrydde kræft. Derfor, mange immunotherapeutiske modaliteter er designet til at øge anticancer TCD8 frekvenser og til at genoprette og øge deres funktioner.

Tumor proteiner havnen mange peptider, hvoraf nogle kan være immunogen og potentielt immunoprotective. Men, kvantificerbare TCD8 svar er fremkaldt med varierende størrelser mod kun få peptider. Dette skaber et "immun dominans hierarki" blandt TCD8 kloner1. Derfor, immun dominant (ID) TCD8 besætte fremtrædende hierarkiske rækker, som er almindeligt bedømt af deres overflod. I modsætning, TCD8 celler, hvis t celle receptor (TCR) er specifik for subdominant (SD) epitoper forekomme i lavere frekvenser. Vi og andre har identificeret nogle af de faktorer, der dikterer eller form immun dominans i TCD8 svar. Disse omfatter blandt andet den måde, AG præsentation til naive TCD8 (dvs. direkte præsentation, Cross-præsentation, cross-dressing)2,3,4, typen af AG-præsentation celler (APCS) deltagelse i TCD8 aktivering5, overflod og stabilitet af protein AGS6,7 og virkningsgraden og kinetikken af deres nedbrydning af proteasomer7,8, relativ selektivitet af transporter forbundet med AG forarbejdning (TAP) for peptider9, affinitet af befriet peptider for MHC I molekyler9,10, tilstedeværelsen, prækursorer frekvenser og TCR mangfoldighed af kognate tCD8 i t-cellepuljer 11,12,13, kryds konkurrence mellem t-celler for adgang til APCS14,15, og den broder drab kapacitet af tCD8 kloner16. Desuden underkastes TCD8 immunodominans immunforsvar, som medieres af flere suppressor celletyper såsom naturligt forekommende regulatoriske t (ntreg) celler17, celleoverfladen Co-hæmmende molekyle programmeret Death-1 (PD-1)16, og visse intracellulære enzymer såsom indoleamin 2, 3-dioxygenase (Ido)18 og det mammale mål for Rapamycin (MTOR)19. Det er dog vigtigt at bemærke, at ovennævnte faktorer ikke altid fuldt ud tager højde for immun dominans.

Bortset fra den grundlæggende biologi TCD8 immun dominans, undersøgelsen af dette spændende fænomen har vigtige konsekvenser i kræft immunologi og immunterapi. For det første giver en ID-status ikke nødvendigvis en given TCD8 klon evnen til at forhindre tumor initiering eller progression20. Hvorvidt og hvordan ID og SD TCD8 bidrage til antitumor immunitet kan afhænge af typen og omfanget af malignitet og det anvendte forsøgssystem. For det andet, det menes, at id TCD8 kloner kan være "for synlige" til immunsystemet og dermed mere tilbøjelige til centrale og/eller perifere tolerance mekanismer16,21. Tredje, heterogene tumorer kan indeholde neoplastiske celler, der undgår påvisning af mange, hvis ikke de fleste, CTL'er ved at vise kun et snævert spektrum af peptid: MHC komplekser. Under disse omstændigheder, TCD8 svar af utilstrækkelig bredde har sandsynligvis råd til sådanne tumorceller en overlevelse fordel, hvilket forstærker deres udvækst22. Det er af ovennævnte grunde, at mange ser immun dominans som en forhindring for en vellykket TCD8-baseret vaccination og terapier mod kræft.

Inokulation af C57BL/6 mus med Simian virus 40 (SV40)-transformerede celler, der udtrykker stor tumor AG (T AG) giver et stærkt præklinisk system til at studere TCD8 immun dominans. Denne model giver flere fordele. Første, peptid epitoper af denne klinisk relevante oncoprotein er godt karakteriseret i denne mus stamme23 (tabel 1). For det andet, T AG epitopes, som kaldes sites I, II/III, IV, og V, udløser TCD8 svar, der er konsekvent arrangeret i følgende hierarkisk rækkefølge: site IV > > websted i ≥ site II/iii > ≫ sted V. i overensstemmelse hermed, site IV-specifikke TCD8 Monter den mest robuste respons på T AG. I modsætning hertil er sites i og II/III subdominerende, og site V-specifikke TCD8 er mindst rigelige og normalt kun detekterbare i mangel af reaktionsevne til andre epitoper23,24. For det tredje, den T AG+ tumor cellelinje anvendes i protokollen beskrevet heri, nemlig C57SV fibrosarkom celler, og dem, der anvendes i vores tidligere undersøgelser16,17,18,19 ,25,26, omdannes med subgenomic SV40 fragmenter25. Derfor, de er i stand til at samle og frigive SV40 virions, der potentielt kunne inficere Host Apc'er. Desuden, C57SV celler er blottet for klassiske costimulatory molekyler såsom CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), og CD137 ligand (4-1BBL)16. Ovenstående attributter gør disse linjer ideelle til undersøgelse af in vivo TCD8 aktivering via Cross-priming. Cross-priming er en stor vej i inducere TCD8 reaktioner, især dem, der er lanceret mod tumorceller af ikke-hæmatopoietisk oprindelse, der undlader at direkte Prime naive T-celler25.

Antitumor TCD8 frekvenser og/eller funktioner kan overvåges af MHC i tetramer farvning, intracellulær farvning for effektor cytokiner (f. eks. interferon [IFN]-γ) eller lytiske molekyler (f. eks. perforin), enzym-linked immunospot (elispot) analyser og ex vivo-cytotoksicitetassays. Siden starten i 1990 ' erne27,28, carboxyfluorescein succinimidyl ester (cfse)-baseret in vivo drab analyser har aktiveret evaluering af cytotoksiske reaktioner medieret af antivirale CTLS29,30 , 31, antitumor CTLS16,32, naturlige dræber (NK) celler33, Glycolipid-reaktiv invariant naturlige Killer T (iNKT) celler34, og allerede eksisterende og de Novo donor-specifikke alloantistoffer26. Derfor kan deres applikationer være af interesse for en bred læserskare, herunder men ikke begrænset til efterforskere, der arbejder inden for tumor immunologi og immunterapi, anti-patogen immunitet, og forebyggende og terapeutisk vaccine design.

For at vurdere cellemedieret cytotoksicitet i typiske scenarier, to populationer af naive splenocytter, der viser enten en irrelevant AG eller en kognate AG (s) er mærket med to forskellige doser af cfse, blandet i lige antal og injiceres i naive (kontrol) eller Killer celle-harboring mus. Tilstedeværelsen/fraværet af hver målpopulation undersøges derefter ved flow cytometri.

Vi har optimeret og beskæftiget in vivo drab analyser i vores undersøgelser om immun dominans i både antiviral og antitumor TCD8 svar12,16,17. Her giver vi en detaljeret protokol for den samtidige vurdering af ID og SD TCD8 svar til T AG epitopes, som let kan vedtages for lignende undersøgelser i andre eksperimentelle systemer. Vi giver også repræsentative resultater viser, at nTreg cellenedbrydning og PD-1 blokade kan selektivt forbedre ID TCD8-og SD TCD8-induceret cytotoksicitet, hhv. I slutningen, vil vi diskutere flere fordele ved in vivo drab analyser samt nogle af deres iboende begrænsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De her beskrevne eksperimenter følger protokoller for anvendelse af dyr, der er godkendt af institutionelle enheder, og overholder etablerede nationale retningslinjer.

1. inokulation af C57BL/6 mus med T AG-udtrykker tumor celler

  1. Dyrk den SV40-transformerede fibrosarkom-cellelinje C57SV (eller en lignende T AG+ vedhæng ende cellelinje) i dulbeccos modificerede eagle's medium (DMEM) med 4,5 g/L D-glucose og L-glutamin (1x) og suppleret med 1 mm natriumpyruvat og 10% varme inaktiverede føtal kvægserum (FBS) i vævskultur behandlede kolber ved 37 °C i befurede atmosfærer indeholdende 10% CO2.
  2. Når cellerne er blevet fuldt konflydende eller svagt overbevisende, skal du forsigtigt fjerne og kassere mediet og skylle monollaget med en steril fosfatbuffer (PBS), der er foropvarmet.
    Bemærk: Maximal T AG-udtryk opnås, når T AG+ celler når 100% konfluency.
  3. I et biologisk sikkerhedskabinet tilsættes forvarmede trypsin-EDTA (0,25%) til at dække enkeltlags ved stuetemperatur, indtil cellerne er opløst i plastre. Tryk på siderne af dyrknings kolben (e) flere gange for at frigive de resterende vedsiddende celler.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, og for at fremskynde trypsinserings processen, overføres kolben (erne) til en 37 °C-inkubator. Uindleverede celler vil hurtigt indtage en afrundet form under et let mikroskop. Dette trin bør vare ca. 5 min.
  4. Der tilsættes 5 mL DMEM-medium og dissocieres klumper for at forberede en enkelt cellesuspension ved at afpipette indholdet af hver kolbe op og ned.
  5. Overfør cellesuspensionen gennem en celle filter med 70-μm porer i et rør.
  6. Drej røret på 400 x g i 5 min ved 4 °c.
  7. Kassér supernatanten. Pelleterede celler gensuspenderes i 10 mL steril kold PBS.
  8. Gentag trin 1,6 og 1,7 to gange.
  9. Tæl celler ved hjælp af en hemocytometer. Der tilberedes en ensartet suspension, der indeholder 4 x 107 celler/ml steril PBS.
  10. Injicer 500 μl af ovenstående suspension intraperitonealt (IP) ind i hver voksen (6-12-uge-gammel) mand eller kvinde C57BL/6 mus.

2. behandlingsregimer

  1. Behandling regime til at undersøge bidraget af nTreg celler til TCD8 immunodominans
    1. Fire dage før in vivo-priming af C57BL/6-mus med C57SV celler (trin 1,10) indsprøjtes hvert dyr én gang med 0,5 mg af et lavendotoksin, Azid-frit anti-CD25 monoklonalt antistof (mAb) (Clone PC-61.5.3), som udtømmer nTreg-celler eller med en rotte-isotype kontrol (f. eks klon KLH/G1-2-2, klon HRPN, eller klon TNP6A7).
  2. Behandling regime til at teste in vivo signifikans af PD-1-PD-L1 (2) interaktioner i Shaping TCD8 immunodominans
    Bemærk: PD-1 's engagement ved PD-L1 ofte, men ikke altid, medierer Co-hæmning og/eller konsumption af AG-specifikke TCD8. Derfor kan behandling med anti-PD-1 udføres parallelt med administration af anti-PD-L1 og anti-PD-L2 mAbs for at afsløre den eksakte intercellulære interaktion, der er involveret i et biologisk fænomen.

3. forberedelse af Target Splenocytter

  1. Euthanize sex-matchede naive C57BL/6 mus (6-12 ugers alderen), der vil tjene som splenocyte donorer ved cervikal dislocation.
  2. Anbring hver mus med maven opad inde i et biologisk sikkerhedskabinet. Sprøjt huden med 70% (v/v) EtOH. Brug sterile pincet og saks, løft huden og lav en lille ventrale midterlinje indsnit. Skær derefter huden på en kryds lignende måde for at afsløre peritoneum.
  3. Brug pincet, trække bughinden i en telt-lignende måde uden at snuppe nogen af de indre organer. Skær bughinden åben for at eksponere peritonealhulrummet og forsigtigt fjerne milten.
  4. Milten (erne) anbringes i en 15 mL Dounce-vævkværn indeholdende 5 mL steril PBS. Anvend det manuelle tryk ved hjælp af kværnens glas stempel, indtil det spleniske væv spredes til en rød homogen cellesuspension.
    Bemærk: afhængigt af antallet af modtager dyr pr. forsøgsgruppe kan der være behov for flere donor muse spleter til målcellens forberedelse. Op til 3 milt kan homogeniseres sammen i en 15 ml slibemaskine.
  5. Homogenatet overføres til et 15 mL rør. Drej røret på 400 x g i 5 min ved 4 °c.
  6. Kassér supernatanten. Pelleterede celler gensuspenderes i 4 mL ammoniumchlorid-kalium (ACK) lyserende buffer i 4 minutter for at eliminere Erytrocytterne.
    Bemærk: Dette er et tidsfølsomt trin. Overeksponering af splenocytter til ACK lyserende buffer vil øge deres skrøbelighed og gøre dem modtagelige for ikke-specifikke celledød.
  7. Til hvert rør tilsættes 8 mL RPMI 1640 medium, der indeholder 10% varme inaktiverede FBS, L-alanyl-L-glutamin, 0,1 mM minimum essentielle medier (MEM) ikke-essentielle aminosyrer, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM HEPES og 1x penicillin/streptomycin, som herefter vil blive kaldes komplet RPMI-medium (materiale oversigt).
  8. Overfør indholdet gennem 70 μm porer af en celle si til et nyt 15 ml rør.
  9. Drej røret på 400 x g i 5 min ved 4 °c.
  10. Kassér supernatanten. Pelleterede celler gensuspenderes i 12 mL komplet RPMI.
  11. Den splenocytiske suspension opdeles i 3 lige store portioner (4 mL hver) i 3 separate rør.

4. belægning Target Splenocytter med irrelevante og cognate peptider

  1. Mærk rørene i henhold til de peptider, der vil blive brugt til at puls mål splenocytes. Kontrol splenocytter vil blive pulseret med et irrelevant peptid, og hver population af kognate mål splenocytter vil blive pulseret med et syntetisk peptid svarende til den t AG-afledte immunodominerende epitop (sted IV) eller en subdominant t AG epitop (sted I eller sted II/III) (tabel 1).
    Bemærk: valget af irrelevante peptider afhænger af det eksperimentelle set-up og den musestamme, der anvendes i hver undersøgelse. Forfatterne bruger ofte GB498-505 (en h-2kb-begrænset immun dominant peptidepitope af herpes simplex virus [HSV]-1) og/eller GP33-41 (en h-2Db-begrænset immun dominant peptid epitop af lymfocytisk choriomeningitis virus ([LCMV]) i C57BL/6 mus (tabel 1). Disse peptider er optimale valg, fordi: (i) de er afledt af patogener, der ikke tidligere er stødt på i musemodellen, der er beskrevet her; (II) svarende til T AG-afledte peptider, gB498-505 og GP33-41 er begrænset af og binder til H-2b molekyler. I ' tre-peak ' in vivo-dræbende analyser kan hver af de to toppe, der svarer til de kognate målceller, repræsentere splenocytter pulseret med et immundominerende eller subdominant peptid. Valget af hvert peptidsæt varierer i henhold til målene for hvert eksperiment. Se figur 1 og figur 2 som eksempler på en sådan variation. I resten af denne protokol vil de T AG-afledte lokaliteter i og IV repræsentere henholdsvis subdominerende og immunodominerende peptider.
  2. Puls indholdet af hvert mærkede rør med 1 μM af det respektive peptid i 1 time ved 37 °C og 5% CO2.
  3. Brug en separat celle filter (med 70-μm porer) for hvert rør til at fjerne klumper og snavs, hvis det er nødvendigt.
  4. Drej røret på 400 x g i 5 min ved 4 °c. Kassér supernatanten.
  5. Pelleterede celler gensuspenderes i 12 mL steril kold PBS, og trin 4,4 gentages igen.
    Bemærk: det er vigtigt at fjerne så meget FBS som muligt, fordi FBS kan binde CFSE i næste trin.

5. mærkning mål splenocytes med CFSE

  1. Resuspension af peptid-pulsed splenocytter i 4 mL steril PBS.
  2. Tilsæt CFSE ved 0,025 μM, 0,25 μM og 2 μM i rørene, der indeholder irrelevante peptid-, site I-, og site IV-pulseret splenocytes, hhv.
    Bemærk: for at opnå en ensartet CFSE-mærkning skal du holde hvert rør i en 45 ° vinkel, før du tilføjer CFSE til siden lidt over cellesuspensionen, umiddelbart efterfulgt af blid vortexing. Dette vil sikre udseendet af glatte histogrammer i slutningen. Batch-til-batch-og aldersafhængige variationer i CFSE-intensiteter er ikke ualmindelige. Derfor kan det være nødvendigt at eksperimentere med differentierede CFSE doser, før der træffes beslutning om optimale koncentrationer, der skal anvendes.
    Forsigtig: CFSE er giftig ved koncentrationer, der er højere end 5 μM.
  3. Anbring rørene inde i en 37 °C-inkubator i 15 minutter, og vend dem en gang hver 5 min.
  4. Der tilsættes 3 mL varme inaktiverede FBS til hvert rør for at standse CFSE-reaktionen. Top op indholdet med steril PBS.
  5. Drej røret på 400 x g i 5 min ved 4 °c. Kassér supernatanten.
  6. Pelleterede celler gensuspenderes i 12 mL steril PBS, og Gentag trin 5,5.

6. undersøgelse af tilstrækkelig/lige CFSE mærkning af Target Splenocyte populationer

  1. Pelleterede celler gensuspenderes i 3 mL PBS.
  2. Vortex rørene forsigtigt. Overfør 10 μL til hver af CFSE'Slave, cfseintermediære (int)og cfsehøjcelle suspensioner til en 5 ml rund bunden polystyren fluorescens-aktiveret celle sorterings slange (facs), der indeholder 200 μl PBS.
  3. Interrogat celler ved hjælp af et flow flowcytometer udstyret med en 488 nm laser. Tegn en lymfocyt port baseret på fremad scatter (FSC) og side scatter (SSC) egenskaber af cellerne, før de erhverver 5000 hændelser, der falder inden for lymfocyt porten i FL-1 kanalen.
  4. Inden for den ' overordnede ' CFSE+- population skal du tegne yderligere histogram porte for at identificere cfseLow, CFSEintog cfseHigh subpopulationer.
  5. Bekræft lige eller nær-lige hændelses numre inden for de tre porte. Hvis det er nødvendigt, justeres celle numrene i "kilde rørene" (trin 6,1), før de blandes og indsprøjtes splenocytter i naive og primede mus i afsnit 7.

7. injektion af CFSE-mærkede målceller i naive og T-AG-primede modtagere

  1. Vortex forsigtigt kilde rørene. Overfør de tre CFSE-mærkede celle suspensioner i lige store forhold til et nyt rør.
  2. Top op indholdet med steril PBS.
  3. Drej røret på 400 x g i 5 min ved 4 °c. Opslæbt pelleterede celler med steril PBS.
  4. Tæl celler i trypan blå af en hemocytometer for at sikre cellulære levedygtighed på mindst 95%.
  5. Juster lydstyrken for at injicere 1 x 107 blandede målceller/200 μl PBS intravenøst (i.v.), via hale vene, i hver modtager C57BL/6 mus.
    Bemærk: Opbevar cellerne på is mellem injektionerne. Bland forsigtigt målcellerne før hver injektion. Optag det nøjagtige tidspunkt for injektion for hver mus, som vil afgøre, hvornår dyret skal euthanized. Det er vigtigt at holde varigheden af in vivo-cytotoksicitet konsistent blandt alle dyr i samme forsøg.

8. data indsamling

  1. To eller fire timer efter injektion af cfse-mærkede målceller, aflive recipient musene ved cervikal dislokation.
    Bemærk: varigheden af in vivo-cytotoksicitet kan variere afhængigt af det anvendte forsøgssystem, immunogeniciteten af Target AGS, den forventede overflod af peptidantigen-specifik TCD8 i milten og robustheden af deres lytiske funktion blandt andre faktorer.
  2. Fjern og Behandl hver milten separat som i trin 3.2 − 3.9.
  3. Supernatanten kasseres, og de pelleterede celler gensuspenderes i 3 mL PBS.
    Bemærk: Vær ekstra forsigtig med at håndtere spleniske væv og celle præparater ved 4 °C eller på is før cytofluorimetriske analyser. Dette er for at forhindre fortsat cytotoksicitet ex vivo.
  4. Overfør ca. 1 x 107 celler fra hver forarbejdet milt til et rent FACS-rør.
  5. Interrogat celler med det samme ved hjælp af et flow flowcytometer udstyret med en 488-nm-laser. Tegn en lymfocyt port baseret på FSC og SSC egenskaber af cellerne.
  6. Identificer CFSE- modtagers splenocytes og cfse+ overførte målceller. Tegn yderligere porte, der imødekommende adskiller CFSElav, cfseint, og cfsehøj målcelle populationer.
  7. Få i alt 2000 CFSE-lave hændelser i fl-1-kanalen.

9. data analyse

  1. Beregn den specifikke lysis af hver kognate målcelle population ved hjælp af følgende formel:
    % Specifik cytotoksicitet =Equation
    hvor x = cfseint/High Event-nummer i t AG-primet mus, y = cfselav hændelsesnummer i t AG-primet mus, a = cfseint/High Event nummer i naiv mus, og b = cfseLow Event nummer i en naiv mus.
    Bemærk: i ' tre-peak ' cytotoksicitetassays, hvor den specifikke lysis af mere end en kognat målpopulation evalueres, er det ikke hensigtsmæssigt at anvende målcelle frekvenser. Det skyldes ganske enkelt, at hyppigheden af en målcelle population, der er i kognere, ikke blot påvirkes af procentdelen af de irrelevante Kontroller, men også af det andet kognate-mål splenocytter. Derfor bør hændelses numre inden for hver port anvendes i ovenstående formel til nøjagtigt at beregne lysis af hver enkelt kognere målcelle population (enten CFSEint eller cfsehøje celler) mod cfselav kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med forsøget, hvis resultater er afbildet i figur 1 , var at fastslå, om nTreg-cellernes tilstedeværelse og funktioner udgør eller ændrer immun dominans hierarkiet for t AG-specifikke tCD8. C57BL/6-musene blev injiceret med PBS eller med 0,5 mg anti-CD25 mAb (klon-PC-61.5.3 [PC61]) fire dage før de fik 2 x 107 C57SV tumorceller IP I separate eksperimenter, en rotte IgG1 isotype kontrol blev anvendt i stedet for PBS. Vellykket nTreg cellenedbrydning af PC61 blev bekræftet af flow cytometri17.

Ni dage efter C57SV celle inokulering, et tidspunkt hvor T AG-specifikke TCD8 responser nåede deres maksimum23, fik hvert dyr en intravenøs injektion af en cellesuspension indeholdende 3 forskellige populationer af cfse-mærkede målceller. Kontrol målcellerne var syngeneoniske naive splenocytter, som samtidig blev pulseret med to irrelevante peptider (GP33-41 og GB498-505) og mærket med en lav dosis Cfse (0,02 μM). For at forberede sammenligne lige målceller blev murinsynogene naive splenocytter pulseret med enten T AG-afledt sted I peptid eller site IV peptid (tabel 1), og efterfølgende mærket med cfse ved 0,2 μm og 2 μm. Kontrol og kognate målceller blev vasket og blandet i lige store antal (på et 1:1:1 ratio), før de blev injiceret i naive (kontrol) og T AG-primet C57BL/6 mus. To timer efter injektion af målcellen blev mus ofret for deres milt, hvor tilstedeværelsen/fraværet af CFSE-mærkede målceller blev bestemt af flowcytometri. Målcellerne blev skelnet baseret på deres differentierede CFSE-farvnings intensiteter.

Som forventet kunne der påvises nær lige toppe svarende til kontrol-og kognate målceller hos naive mus (figur 1, venstre panel). I modsætning hertil var site IV-visning af målceller næsten helt fraværende i T AG-primede mus uanset deres tidligere behandling med PC61 eller PBS (figur 1). Interessant, nTreg cellenedbrydning af PC61 forstærket in vivo CTL-medieret lysis af stedet i-pulserende målceller17. Disse resultater fik os til at konk, at nTreg celler selektivt hæmmer site I-specifik cytotoksicitet. Derfor kan nTreg celle nedbrydende/inaktiverings midler forstærke den cytolytiske effektor funktion af CTL'er, der genkender visse tumor afledte epitoper.

Ovenstående set-up giver et eksempel på, hvordan in vivo cytotoksiske analyser kan anvendes til samtidig test den lytiske funktion af ID og SD CTL kloner i samme dyr.

Figure 1
Figur 1: repræsentativ cytofluorimetrisk analyse af TCD8-medieret cytotoksicitet mod t AG-afledte epitoper ved tilstedeværelse eller fravær af nTreg-celler. Mål splenocytter pulseret med kontrol peptider, site I eller site IV, som var differentieret mærket med CFSE, blev sporet af flow cytometri i milten af en naiv mus (venstre panel), en PBS-injiceret T AG-primet mus (midterste panel), og en PC61 (NTI-CD25)- injiceret (nTreg-depleteret) T AG-primet mus (højre panel). Procent specifik aflivning af målceller blev beregnet ved hjælp af den formel, der er beskrevet i protokollen, og repræsentative tal vises. Dette tal er vedtaget med tilladelse fra Haeryfar et al.17. Copyright 2005. Den amerikanske sammenslutning af immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

I en nyere undersøgelse spurgte vi, om blokering af PD-1 påvirker» bredden «af TCD8 svar på t AG16 (figur 2). Dette var et klinisk relevant spørgsmål i lyset af de observerede terapeutiske fordele ved PD-1-baserede "check point-hæmmere" i flere maligniteter. Selv om sådanne inhibitorer menes at arbejde primært ved at vende T celle udmattelse, vi var nysgerrige efter at vide, om interferere med PD-1-PD-L1 interaktioner kan desuden udvide (eller smalle) anticancer TCD8 svar. I vores T AG anerkendelse model, intracellulære cytokin farvning (ICS) eksperimenter afslørede, at behandling med enten anti-PD-1 eller anti-PD-L-1 selektivt udvider IFN-γ-producerende TCD8 genkende sites I og II/III16. Vi har derefter udvidet vores undersøgelse for at undersøge in vivo cytolytiske Effector funktion af disse SD CTLs. C57BL/6 mus blev injiceret IP med 100 μg anti-PD-1 mAb (klon RMP1-14) eller en rotte IgG2a isotype kontrol (klon 2A3) to timer før C57SV celle inokulering. Mus fik to ekstra doser af anti-PD-1 eller isotype tre og seks dage efter tumor celle injektion. På dag 9 efter priming, kohorter af naive og primede mus blev givet, via laterale hale vener, en celle blanding indeholder lige mange CFSElav (cfse mærkning dosis: 0,025 μm), cfseint (cfse mærkning dosis: 0,25 ΜM), og cfseHi (cfse dosis: 2 μM) murinsynogene naive splenocytter pulseret med GB498-505, stedet II/III, og stedet i, hhv. Fire timer senere, dyr blev euthanized, og CFSE-mærkede målceller blev sporet cytofluorimetrisk i deres milten. Repræsentative FACS-parceller (figur 2a) og data fra 3 dyr pr. kohorte (figur 2b) er illustreret. Mens PD-1 blokade ikke påvirkede ID TCD8 svar mod stedet IV16, blev sites I-og II/III-specifikke SD-svar oplivede. Vi konkluderede således, at interferere med PD-1-PD-L1 interaktioner kan fremkalde ' epitope sprede ' i anticancer TCD8 svar.

Ovennævnte set-up repræsenterer in vivo drab analyser, der muliggør kvantitation af cytotoksicitet fremkaldt af to SD CTL kloner i samme dyr.

Figure 2
Figur 2: in vivo cytotoksicitet af T AG-specifik TCD8 i anti-PD-1-behandlede mus. A) repræsentative histogram områder viser cfse-toppe svarende til mål splenocytter pulseret med et irrelevant PEPTID (cfseLow), sted II/III (cfseint) og sted i (cfseHigh) i T AG-primede mus, der har fået en isotype (venstre panel) eller en PD-1-blokerende mAb (højre panel). (B) procent specifik aflivning af hver enkelt kognate målcelle population blev beregnet ved hjælp af cfse+ hændelses numre i T AG-primede mus (n = 3 pr. gruppe) og naive modtagere (ikke vist) og den formel, der er beskrevet i protokollen. Fejllinjer repræsenterer standardfejl i middelværdien (SEM), og * * angiver en statistisk forskel med p < 0,01 ved ikke-parret Students t-tests. Dette tal er vedtaget med tilladelse fra Memarnejadian et al.16. Copyright 2017. Den amerikanske sammenslutning af immunologer, Inc. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protein antigen kilde Peptid Epitope Udpegning Sekvens MHC I-begrænsning
SV401 stor T AG2 T AG206-215 Websted I NYKØBING, Arhus, fordi du indsendte en ændring. H-2Db
SV40 Large T AG T AG223-231 Side II/III Den nye H-2Db
SV40 Large T AG T AG404-411 Websted IV ANDRE priser H-2Kb
SV40 Large T AG T AG489-497 Websted V QGINNLDNL H-2Db
HSV-13 glycoprotein B Dk498-505* Dk498-505 "Meget mere" H-2Kb
LCMV4 glycoprotein Praktiserende læger33-41* Praktiserende læger33-41 Søren k H-2Db
1 af Simian virus 40
2 af Stor tumor antigen
3 af Herpes simplex virus type 1
4 af Lymfocytisk Choriomeningitis virus
* anvendes som et irrelevant peptid

Tabel 1. Peptider introduceret i denne protokol

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cfse-baserede in vivo cytotoksicitetsassays tilbyder flere fordele i forhold til traditionelle drab analyser såsom radioaktivt chrom (51CR) frigivelse og kolorimetriske lactat dehydrogenase (LDH) frigivelse analyser. For det første tillader de overvågning af CTL funktion inden for et arkitektonisk intakt sekundært lymfoid organ.

For det andet afspejler den specifikke aflivning af målcellerne i in vivo-cytotoksicitetsassays det absolutte antal AG-specifikke TCD8, som normalt, men ikke altid, er en funktion af tCD8 frekvenser til stede i milten. Dette er i modsætning til 51CR/LDH Release analyser, hvor et konstant antal celler er ansat som en kilde til effektor TCD8. Derfor, 51CR/LDH Release analyser undlader at pålideligt anslå det samlede antal AG-specifikke TCD8 , der kan være til rådighed for værten til at eliminere tumorceller eller til at bekæmpe infektioner. Dette er vigtigt, da i mange tilfælde og betingelser, størrelse og cellularitet af sekundære lymfoide organer/væv, der passer AG-specifikke TCD8 er ændret. For eksempel kan man forestille sig et hypotetisk scenario, hvor en viral infektion hæver det totale antal tCD8 specifikke for peptid X mens også udvide flere andre TCD8 kloner husly andre særlige forhold. Som et resultat, hyppigheden af X-specifik tCD8 blandt samlede milt tCD8 kan ikke stige, i hvilket tilfælde en 51CR/LDH Release assay vil ikke være nyttigt. Som et andet eksempel, vi for nylig vist, at visse bakterielle super antigener udvide hukommelsen TCD8 specifik for NP147-155, en immun dominant peptid epitop af influenza A vira i Balb/c mus, som korreleret godt med øget in vivo lysis af NP147-155-pulserede målceller31. Da eksponering for Super antigener provokerer T-celleproliferation ikke-specifikt, ville det have været meget usandsynligt at påvise betydelig NP147-155-specifik cytotoksicitet ved hjælp af 51CR/LDH Release assays.

For det tredje kan målceller pulseres med peptider, der binder til det samme MHC klasse I-molekyle, mærkes med forskellige doser af CFSE, blandes og anvendes i in vivo cytotoksicitetsassays. Den samtidige analyse af CTL funktioner i retning af sådanne peptider er ikke en mulighed i 51CR/LDH Release assays.

For det fjerde giver in vivo-cytotoksiske analyser mulighed for Mekanistiske undersøgelser i forbindelse med priming, effektor-og tilbagekaldelses faser af CTL-responserne. For eksempel kan tumor celle inokulation eller antitumor vaccination udføres i genetisk ændrede mus til vurdering af CTL induktion. Desuden kan splenocytter fra genknock-in og knock-out mus anvendes som målceller i effektor fasen. Endelig kan forskellige agenser (f. eks. farmakologiske hæmmere og lægemiddelkandidater) administreres før priming, under effektor fasen eller begge dele. Derfor, in vivo cytotoksicitet analyser give en kraftfuld platform for Drug/vaccine effektivitet test i en virkelig in vivo indstilling. I dette arbejde har vi givet eksempler på immunologiske interventioner, der øger in vivo-CTL-responser (figur 1 og figur 2).

Ligesom andre rutinemæssigt anvendte drab analyser, in vivo cytotoksiske analyser giver ikke nogen direkte oplysninger om ctl's evne til at genbruge fra et mål til et andet, før de bliver opbrugt. Derudover har vi testet flere tumor celletyper som potentielle målceller i in vivo cytotoksicitetsassays, omend til ingen nytte hidtil. Dette er simpelthen fordi tumorceller ikke når milten i det mindste i detekterbare tal efter de injiceres i.v. Derfor, baseret på mus splenocytes som målceller kan betragtes som en iboende begrænsning af in vivo cytotoksicitet assays. Det er bemærkelsesværdigt, dog, at adoptivt overført mål splenocytter let kan findes i flere andre organer (ud over milten), for eksempel i leveren. Derfor kan den AG-specifikke CTL-funktion vurderes i flere organer eller væv.

Vi har optimeret in vivo cytotoksicitetsassays til undersøgelse af immun dominans i t AG-specifikke tCD8 responser16,17. Talrige værktøjer og reagenser er tilgængelige for at studere disse reaktioner i sammenhænge af antitumor immunitet og terapi. Den fibrosarkom cellelinje, der anvendes i den protokol, der er beskrevet her (dvs. C57SV celler), giver ikke anledning til tumorer hos immunkompetente mus. Derfor er det et nyttigt redskab til at undersøge antitumor vaccination. T AG-drevet neoplastisk omdannelse i udvalgte væv har genereret flere værdifulde modeller af autoktont kræft. For eksempel, SV11 mus, der udvikler chorioideus plexus papillomer inde i deres hjerneventrikler35 ikke havn endogene t AG-specifikke tCD8 fordi disse celler er valgt mod og slettet i thymus. Men overførsel af C57BL/6 splenocytter til sublethelt bestrålede, tumor bærende SV11 mus fører til udvidet kontrol af tumorer, som efter sigende er forbundet med in vivo priming af site IV-specifik TCD836,37 . I den transgene adenokarcinom i muse prostata (Tramp) model38, den site IV-specifikke respons svinder ind væk med progression af malignitet. Men det ellers immunorecessivt sted V-specifikke TCD8 celler undslippe negativ selektion i thymus og også undgå perifere tolerance mekanismer21. Dette giver rigelige muligheder for eksperimentelle terapeutiske interventioner kredser omkring site V-specifikke TCD8 funktioner. In vivo cytotoksiske analyser bør vise sig at være informative med hensyn til studier og potentielt vende immunologisk tolerance i forskellige modelsystemer, herunder i T AG-anerkendelses modellen.

Immunodominans er et konsistent træk ved TCD8 reaktioner genereret ikke kun mod tumor AGS, men også mod patogen-afledte epitoper. Faktisk har vi tidligere anvendt in vivo cytotoksiske analyser til at studere immun dominans i Anti-influenza TCD8 svar12. Derfor kan den optimerede analyse, der er beskrevet i denne protokol, ændres og anvendes i en bred vifte af immunologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR) bevilger MOP-130465 og PJT-156295 til SMMH. JC er delvist understøttet af en dronning Elizabeth II Graduate Scholarship i videnskab og teknologi fra Ontario Ministeriet for uddannelse, gymnasier og universiteter. CEM var modtager af en Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (doktor) fra naturvidenskab og ingeniør forskning Council of Canada (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yewdell, J. W., Bennink, J. R. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).
  2. Chen, W., et al. Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination. The Journal of Immunology. 173 (8), 5021-5027 (2004).
  3. Otahal, P., et al. Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope. The Journal of Immunology. 175 (2), 700-712 (2005).
  4. Lauron, E. J., et al. Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition. PLoS Pathogens. 14 (2), e1006883 (2018).
  5. Crowe, S. R., et al. Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections. The Journal of Experimental Medicine. 198 (3), 399-410 (2003).
  6. Probst, H. C., et al. Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression. The Journal of Immunology. 171 (10), 5415-5422 (2003).
  7. Gileadi, U., et al. Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein. The Journal of Immunology. 163 (11), 6045-6052 (1999).
  8. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. The Journal of Immunology. 191 (1), 52-59 (2013).
  9. Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL. The Journal of Immunology. 158 (4), 1507-1515 (1997).
  10. Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1471-1483 (1994).
  11. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. The Journal of Immunology. 181 (3), 2124-2133 (2008).
  12. Haeryfar, S. M., et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies. The Journal of Immunology. 181 (1), 649-659 (2008).
  13. Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase. Immunological Investigations. 37 (7), 714-725 (2008).
  14. Kedl, R. M., et al. T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells. The Journal of Experimental Medicine. 192 (8), 1105-1113 (2000).
  15. Kastenmuller, W., et al. Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. The Journal of Experimental Medicine. 204 (9), 2187-2198 (2007).
  16. Memarnejadian, A., et al. PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination. The Journal of Immunology. 199 (9), 3348-3359 (2017).
  17. Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities. The Journal of Immunology. 174 (6), 3344-3351 (2005).
  18. Rytelewski, M., et al. Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase. PLoS One. 9 (2), e90439 (2014).
  19. Maleki Vareki, S., et al. Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin. American Journal of Transplantation. 12 (1), 233-239 (2012).
  20. Irvine, K., Bennink, J. Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses. Expert Review of Clinical Immunology. 2 (1), 135-147 (2006).
  21. Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes. Journal of Immunotherapy. 24 (3), 237-241 (2001).
  22. Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. Immunodominance and tumor escape. Seminars in Cancer Biology. 12 (1), 25-31 (2002).
  23. Mylin, L. M., et al. Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes. Journal of Virology. 74 (15), 6922-6934 (2000).
  24. Fu, T. M., et al. An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope. Journal of Virology. 72 (2), 1469-1481 (1998).
  25. Chen, W., et al. Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon. European Journal of Immunology. 34 (1), 194-199 (2004).
  26. Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo. Transplantation. 100 (5), 1041-1051 (2016).
  27. Aichele, P., et al. Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology. Immunity. 6 (5), 519-529 (1997).
  28. Oehen, S., Brduscha-Riem, K. Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division. The Journal of Immunology. 161 (10), 5338-5346 (1998).
  29. Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1. The Journal of Immunology. 168 (2), 834-838 (2002).
  30. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. The Journal of Immunology. 171 (1), 27-31 (2003).
  31. Meilleur, C. E., et al. Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. , Epub ahead of print (2018).
  32. Goldszmid, R. S., et al. Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma. The Journal of Immunology. 171 (11), 5940-5947 (2003).
  33. Oberg, L., et al. Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways. European Journal of Immunology. 34 (6), 1646-1653 (2004).
  34. Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency. The Journal of Immunology. 185 (5), 2721-2729 (2010).
  35. Brinster, R. L., et al. Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors. Cell. 37 (2), 367-379 (1984).
  36. Tatum, A. M., et al. CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors. The Journal of Immunology. 181 (6), 4406-4417 (2008).
  37. Schell, T. D., Tevethia, S. S. Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen. The Journal of Immunology. 167 (12), 6947-6956 (2001).
  38. Greenberg, N. M., et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3439-3443 (1995).

Tags

Immunologi og infektion CD8+ T celler cytotoksicitet kræft immun dominans tumor-afledte peptider store t-antigen regulatoriske t-celler PD-1 kontrolpunkts-hæmmere Drug effekt test flow cytometri
Skræddersy in vivo cytotoksiske assays til at studere immun dominans i tumor specifikke CD8<sup>+ T-</sup> celle respons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, … More

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter