כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.
אלנבאבדיוטיס (ג. אלגיה) בולטת כאורגניזם היחיד שבו האתגר של הבנת המקורות הסלולריים של מערכת העצבים כולה ניתן לצפות, עם רזולוציית תא בודדת, בvivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול משולב לבדיקת ההתפתחות העצבית בעוברי המשך. הפרוטוקול שלנו משלב דימות, לשון ומעקב נוירואנטומי של תאים בודדים בפיתוח עוברים. אנו משיגים הדמיה לטווח ארוך, 4-מימדי (4D ) של החיים העוברים עם הרזולוציה המרחבית הכמעט איזוטרופית באמצעות שימוש באמצעות תצוגה כפולה הפוך מיקרוסקופית תאורה סלקטיבית (dispim). גרעינים ומבנים עצביים בעוברי נמטודות הם התמונה התמזגו איזוטרובאלי כדי להניב תמונות עם רזולוציה של ~ 330 ננומטר בכל שלושת הממדים. אלה של דקה אחר דקה ברזולוציה גבוהה 4D הנתונים מנותח לאחר מכן לתיאום זהויות מוחלטות היוחסין של התא עם ביטוי גנים ודינמיקה מורפולוגית בתוך תא יחיד ורמות subcellular של פירוט. הפרוטוקול שלנו מובנה כדי לאפשר יישום מודולרי של כל אחד מהשלבים המתוארים ולשפר את המחקרים על embryogenesis, ביטוי גנטי, או התפתחות עצבית.
ג. אלגיה בולטת כאורגניזם היחיד שבו כל תא בעובר ניתן לצפות במהלך התפתחות עצבית. עם כל התא-שושלת היוחסין ידוע וקבוע1, עם פיתוח של כלים חדשים המאפשרים תיוג והדמיה רציפה של תאים בודדים בעוברים, ביולוגים יכולים כעת להתחיל בחינת צעדים שונים בפיתוח של העצבים נמטודות מערכת מכל הזוויות-לידה תאים; הגירה ובידול; היווצרות neurite, ממוקד הצמיחה והפסטולציות; היווצרות סינפסה; וכוונון של מעגלים פונקציונליים. לכידת הדינמיקה העצבית במהלך העובר C. אלגיה , על ידי שילוב של כתבים מבוטא באופן בלתי נשכח ומיקרוסקופ קרינה, הוא בעל ערך לקהילה המדעית.
מחקרים התפתחותיים ב- C. אלגיה ממנף לעתים קרובות את השושלת הקבועה ומפות התאים של המין הזה כדי להגדיל את ההבנה ההקשרית ברמת התא הבודד בתוך האורגניזם השלם1. ניתוח הזדקנות אוטומטי-שימוש ב-starrynite2,3,4 ו-5,6,7,8 תוכנות-יתרונות מניגודיות גבוהה, רזולוציה גבוהה תמונות של גרעיני פלורסנט. כדי לעבוד בצורה אופטימלית, הסטרינייט/מרחרי תלוי גם בכיוון מוגבל צפוי של עוברי התמונה במהלך הפיתוח. מיקרוסקופיה קונפוקלית, מתבצעת ב -C. אלגיה עוברים שנדחסו בין שני שמיכות, היתה שיטת מיקרוסקופ אוטומטי סטנדרטי לינארי במשך יותר מעשור, כי הוא מספק הן חדות גבוהה/רזולוציה גבוהה ומוגבל צפוי התמצאות של העובר7,8. בעבר תיארנו את הבנייה והשימוש של הרומן המבוסס על גיליון האור מבוסס-תצוגה כפולה הפוכה מיקרוסקופ תאורה סלקטיבי (dispim) עבור הדמיה לדוגמה חיה כגון C. אלגיה embryogenesis9,10 , מיכל בן 11 , מיכל בן 12 , 13. מיקרוסקופ האור, באופן כללי, מספק פוטורעילות נמוכה, מהירות גבוהה והדמיה ארוכת טווח של יצורים חיים תלת-ממדיים14,15. השיטה diSPIM, במיוחד, מייצרת 4-מימדי (4D) תמונות עם רזולוציה כמעט איזוטרופי מרחבית של כ 330 ננומטר9.
בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית, diSPIM מציעה אות לרעש גבוה יותר ומהירות, יותר רזולוציה איזוטרופית מרחבית, והוא מתאים יותר לטווח ארוך vivo הדמיה 16. לפיכך, עבדנו כדי להתאים את נתוני diSPIM עבור קלט לתוך StarryNite/מרחרי וחקרו אם זה ישפר את ניתוחי הששון. משוכה גדולה היא כי לא ניתן להיות מוגבל בקלות של דגימות של diSPIM על ידי דחיסת קליפת ביצה כדי לאמץ את הכיוונים הצפויים עבור StarryNite/מרחרי. כיוון אקראי של תנוחות תאים באמצעי האחסון המנותח מבזה את הדיוק של ניתוח לינשון אוטומטי.
לפיכך, העסקנו ציטוהצג, ממשק משתמש מונחה מציג המאפשר למשתמשים לבחור כיוון תלת-ממד מדויק של העוברים במהלך עיבוד טרום של תמונות diSPIM, מניב נתונים תמונה כי הוא גם איכות אופטימיזציה ההקשר מודע הקשר לקלט לתוך StarryNite . אני מבין על-ידי בחירת המשתמש של עוברי התמונות, בתזמולן מופיעים צינורות לעיבוד נתונים אוטומטיים. תמונות העובר שנחתכו ומופחתים על רקע נשמרות בתוך קבצי מחסנית TIFF עבור כל מיקום, נקודת זמן ותצוגה. ציטוהצג לאחר מכן שיחות לאחר מכן התוכנית spimfusion כדי שיתוף לרשום ובמשותף לפרק את שתי התצוגות טרום מעובד, באמצעות ריצ’רדסון-לוסי17,18 אלגוריתם לתשואה איזוטרופי ברזולוציה גבוהה נפח תמונות. ערכת פרמטרים ספציפית ל-diSPIM ממוטבת עבור StarryNite כדי למשול בהתנהגותו במהלך פילוח תמונה ומעקב אחר הגרעין בתמונות התמזגו באופן איזוטרואלי. תמונות התמזגו ותוצאות הזדקנות מתקבלות לאחר מכן באמצעות מרחרי, מה שמאפשר למשתמשים לזהות ולתקן שגיאות בעקבות השושלת האוטומטית שנוצרה על ידי StarryNite. מרחרי יכול גם להציג עץ השושלת ואת 3D עיבודים המודל של גרעינים מסומנים העובר. אנו מוצאים כי באופן אוטומטי מהירות ודיוק משופרת במידה ניכרת באמצעות תמונות התמזגו איזוטרובאלי, כאשר לעומת תמונות raw ממצלמת SPIM. הפרוטוקול שלנו, בעוד אופטימיזציה ליישום C. אלגיה המתואר כאן, יכול להיות מותאם בדרך כלל עבור הזדקנות אוטומטית של נתוני dispim המיוצרים עבור מינים אחרים או דגימות. אם זהו השימוש המיועד בפרוטוקול, הינכם מתבקשים לשים לב כי כוונון נוסף של פרמטרי הסטארריניט יהיה נדרש עבור דגימות חדשות, כמתואר3,4.
יישום מוצלח של פרוטוקול זה מביא תמונות עם רזולוציה 4D-isotropic ומאפשר לביולוגים לעקוב אחר שאריות התא, ובמקביל לזהות ולנתח נוירונים בהתפתחות העובר C. אלגיה . יתר על כן, על ידי מיזוג מספר אלגוריתמים לאחר עיבוד-עם האצת חומרה להיות הזמן הארוך ביותר של אלה-אנחנו יכולים עכשיו לנתח הן הפרטים הקטנים בסדר הסלולר ואת התאים לפני הצינוק ואת הגורלות התאים של עוברים חיים בזמן אמת למעשה. פרוטוקול חדש זה מאפשר מניפולציה מדויקת, מושכלת והתבוננות של התנהגות התא במהלך מחקרים המוקד של בידול ומורפולגנזה ב vivo. בכתב יד זה, אנו מציגים הסבר מפורט על הפרוטוקולים המשופרים שפיתחנו לאיתור הזדקנות ומעקב תאים בפיתוח העוברים של C. אלגיה , כדי לשפר את המחקרים של embryogenesis, ביטוי גנטי או התפתחות עצבית.
ג. אלגיה בולטת כאורגניזם היחיד עם התפקידים הסופיים והקישוריות של כל תא מבוגר הידוע27. עם זאת, הדינמיקה ההתפתחותית המובילה לארגון מעגלי העבודה והרשתות היוצרת את המערכת מאפשרת להישאר בלתי ידוע. מבוסס על הזדמנויות המתעוררים מתוך התקדמות במיקרוסקופ אור, אנחנו יכולים כעת ללכוד ולנתח את עמדות התא, מורפוגנזה, ו נוירוגנזה ברחבי C. אלגיה התפתחות עובריים.
הנוהל שתיארנו ושאנו שימוש באופן שגרתי במעבדה התשואות 4D-isotropic תמונות של נוירונים וגרעינים שכותרתו עבור הזדקנות התא ב- C. אלגיה עוברים. חשוב מכך, יש לנו אופטימיזציה לטווח ארוך הדמיה התנאים עם diSPIM ומצמידים למחצה אוטומטי יכולות לינארי עם תמונות ברזולוציה גבוהה כדי לשפר את המהירות והדיוק של ניתוח C. אלגיה embryogenesis. פרוטוקול משולב זה יאפשר למשתמשים להמחיש ולזהות תאים ולכמת תכונות תלת ממדיות כגון הגירה neurite ו-אקסון באמצעות תחילתה של העווית המוקדמת. הליך זה יכול להיות מותאם בקלות לתוך כל מתקן עם מערכת הספק אסי diSPIM, ואנו ממליצים על מערכת זו במיוחד עבור פרוטוקול זה. ניסוחים SPIM אחרים המוצעים באופן מסחרי עשויים להיות שונים מתצורת ASI בתכונות החדר והאופטי לדוגמה. עם זאת, נתונים המיוצאים מפלטפורמות אחרות ניתן גם לשים דרך צינור הנתונים שלנו. לכן, הערכת הערך שלהם בהזדקנות, מבחן תובעני של איכות התמונה ויציבות הכלי, הוא אפשרי. למרות שאנו משתמשים באופן פעיל ב-dispim כדי לדמות בקביעות דגימות אחרות (כגון דרוזופילה ועוברי דגים), ניתוח העוברים לפני הזמן המתואר והמקיף של העוברי עדיין מוגבל למינים מסוג נמטודות. לדגימות גדולות או עבות, אנו בוחרים להשתמש בגישות לסריקת במה, הסורקים את הדגימות דרך גיליון אור נייח. קומאר ואח ‘ הפגינו בעבר את הפרטים המשופרים הללו כדי להניב תמונות באיכות גבוהה מדגימות עבות ללא שינויים נוספים ב-diSPIM10.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים את העוברים הבאים של C. אלגיה באמצעות שמיכות הציפוי פולי ליזין, רכישת נתונים ועיבוד נתונים. קציר והרכבה C. אלגיה עוברים על שמיכות זכוכית יכול להיות מאתגר למשתמשים לא מנוסים, אבל כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט של שלבי מפתח כדי להקל על הלמידה. אם הדמיה ארוכת טווח רצוי, אנו משיגים תוצאות הטוב ביותר קצירת ארבעה תאים או עוברים מוקדם מ 8-10 צעירים מבוגרים28. שימו לב כי המבוגרים הוותיקים פחות רצוי לקצור עוברי הבמה המוקדמים, משום שהם נוטים להכיל עוברים ישנים יותר ברחם ובביצים לא מופרות. לגבי העוברים, בעיות כגון סתימה בתוך מייבש הבית (פיפטה הפה) או גדול מדי של פתיחה בתוך הפיפטה מיקרוקפילר עשוי למנוע הרכבה נכונה וכיוון העוברים. כדי להתכונן לדימות אופטימלי, אנו מבצעים טרום רכישה בדיקות על עוברים מוקדם ומאוחר מתעוות לבדוק את הביצועים של יריעות אור, מצלמות, מטרות, פוקוס אוטומטי. אנו משיגים את התוצאות הטובות ביותר כאשר כל הפעולות הללו נבדקות ומפיקות תמונות באיכות גבוהה במהלך בדיקות טרום הרכישה שלנו. דבר זה רלוונטי במיוחד ליצירת תמונות עם פתרון מרחבי איזוטרופי, שעבורם תמונות raw שנרכשו משתי התצוגות (מטרות) חייבות להיות באיכות גבוהה. לאחר הרכישה, אמצעי האחסון שנרכשו עבור כל תצוגה מעובדים כדי להניב תמונות איזוטרופיות. חשוב להשתמש בכרטיס של יחידת עיבוד גרפית (GPU) מתאימה כמתואר בפרוטוקול זה (ראה להלן). פעולה זו משפרת את מהירות העיבוד שבה נוצרות התמונות האיזוטרומיות, קיצור הזמן לניתוחי נתונים. זה גם הכרחי כי משתמשים מריצים את הגירסה העדכנית ביותר של ציטוהצג והם משתמשים בפרמטרים שסופקו עם צרור ההורדה שלנו עבור הזדקנות אוטומטית StarryNite. אם משתמשים מעוניינים להשתמש באופן אוטומטי לבחירה עבור דגימות אחרות (למשל, zebrafish, דרוזופילה ילה וכו ‘) אז אופטימיזציה נוספת לפרמטרים המשמשים starrynite יידרש (ראה הפניות3,4).
למרות שהפרוטוקול המשולב שלנו מספק תמונות ותוצאות הזדקנות בעובר מראש, משתמשים צריכים להיות מודעים לכך ששינוי אוטומטי בעובר לאחר העווית אינו אפשרי כרגע: שינויים בתנוחות גרעיניות בסדר השניות ב עובר לאחר העווית, מהר מדי. כדי לאפשר מעקב אחר השושלת עם זאת, הדגים אכן הפגינו יכולת מבטיחה ללכוד אירועים נוירוהתפתחותיים ולעקוב אחר מיקומי תאים בשלבים שלאחר העווית של embryogenesis23,29. אם משתמשים מעוניינים לבחון את העובר לאחר העווית, הפונקציה מספקת את המהירות להשגת תמונות נפחי ולעקוב אחר אירועים נוירוטיביים משובחים, כגון neurite outgrowth, בעוברים במהירות.
פרוטוקול זה יהיה היסוד עבור השלמת תא אחר התא של המדריך לתולעים האטלס30, כפי שהוא יספק גישה משולבת עם ברזולוציה גבוהה איזוטרופי תמונות לזהות וללכוד 3d מורפולוגיות של נוירונים התווית במהלך את 430 הדקות הראשונות של הembryogenesis. כפי שהוא עומד, אב טיפוס האטלס מדריכים מספק עמדות גרעיניות של תאים בעובר המתפתח ומטרתו ללכוד את הדינמיקה ההתפתחותית של תת-ערכה של נוירונים עובריים. פרוטוקול זה יהיה מפתח עבור שילוב של הנוירונים המפתחים נוספים לתוך מדריכי התולעת אטלס30.
הפרוטוקול המשולב שלנו גם יפשט את הביקור בפרופילים חדשים של ביטוי גנים בעובר הג. באופן טרנסגניים, הרבה מיזמים ספציפיים לתאים ולשלוט באופן זמני בביטוי הטרנסגנטי. בעוד דפוסי הביטוי של רוב הגנים התאפיין בהרחבה בחיה למבוגרים31,32,33,34, כמעט כולם עדיין להיות מאופיין בפיתוח (במיוחד העובר בשלב מאוחר). מקדם ה -C. אלגיה מהווה משאב שימושי לקהילת התולעים כדי לכונן ביטוי העברה ספציפי לתאים, כמו גם לקבוע אם פונקציית גן היא אוטונומית או לא אוטונומית. לכידת איזוטרופי דפוסי ביטויים דינמיים ודינאמיים של גנים, ומזהה בדיוק לבטא תאים באמצעות הזדקנות יהיה ערך לרבים בקהילה המדעית.
Embryogenesis כולל שני תהליכים עיקריים שזורים, בידול סלולרי רקמה מורפוגנזה. הרבה ידוע על המנגנונים והמולקולות המגדירים סוגי תאים ברורים במהלך התפתחות הג. עם זאת, מעט ידוע על המנגנונים החשובים להעברת תאים, הדבקה בתאים וצורת תא בעובר C. אלגיה . עם כללי השושלת של ה- C. אלגיה הידועה, הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו להבחין בקלות את 3d-מיקרואנטומיה מקוטלגים של העובר במהלך מורפולגנזה ברמות חדשות של פירוט: למשל, האקסון, synaptogenesis, ופעילות עצבית. ארדיאל ואח ‘ הפגינו בעבר את הכוח של ה-diSPIM ללכוד מעבר סידן ברמה של נוירונים בודדים ב -C. אלגיה עוברים23. היבטים רבים אחרים של הפיזיולוגיה ההתפתחותיים בשלים לחקירה על ידי שיטות אלה.
לבסוף, פרוטוקול זה הוא אוטומטי ברובו באופן שיטתי מפחית את הזמן שלוקח כדי ליצור תמונות לפירוק ולבצע הזדקנות תא באמצעות StarryNite ו מרחרי. את אסטרטגיות התוכנה המשמשות בפרוטוקול זה ניתן להחיל על שאלות רבות של ביולוגיה הרחק מתוך השדות הספציפיים מאוד שבו הדגמנו אותם כאן.
פרטים על תאימות תוכנה וגישת הורדה
מידע על מיקרו-מנהל ותוספים עבור הדמיה של diSPIM זמינים ב http://dispim.org/software/micro-manager ו-https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
צינור עיבוד הנתונים מחייב כעת מערכת הפעלה של Windows. יש לנו ארוזות קובץ ארכיון יחיד כדי לפשט את ההתקנה של כל הדרושים עיבוד נתונים תוכניות ותמיכה קבצים. הוא זמין להורדה ב http://dispimlineage.wormguides.org.
ציטוהצג (http://run.cytoshow.org/) מבוסס על פלטפורמת ניתוח תמונת קוד פתוחה בשימוש נרחב, ImageJ (v1). על java להיות מותקן ומעודכן במחשב לשימוש ב-ציטוהצג, ועדכונים ל-ציטוהצג נפרסים באופן אוטומטי באמצעות הפעלת אתר Java. פונקציות מבוססות ImageJ רבות של ציטוהצג הן כמתואר ומומחשות ב-https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. ציטוהצג הותאם אישית כדי להציג נתונים גולמיים רב ממדיים מ-ASI diSPIM, כמו גם תוכנות דימות אחרות היוצרות פלט TIFF. בעיקרון, מערכות מרובות תצוגה SPIM הדמיה יכול להיות נתמך על ידי שינויים משניים של ציטוהצג כדי לאפשר פרוטוקול זה להתבצע על מערכות מיקרוסקופ שונים.
SpimFusion נכתב ב CUDA/C++ באמצעות Visual Studio 2013 עם ערכת הכלים של CUDA v 7.5. הפעלת SpimFusion דורש חומרה מחשב ספציפי: יחידת עיבוד גרפיקה של NVIDIA (GPU) כרטיס עם היכולת לחישוב CUDA 1.0 או יותר ומינימום של זיכרון כרטיס גרפי 2 GB. בזמן הפרסום של הפרוטוקול שלנו, SpimFusion הוא לא פורסם (מין גואו ו הארי Shroff) אבל זמין בארכיון צרור התוכנה שהוזכרו לעיל.
גירסה מונחית של שורת פקודה מוכללת של StarryNite מחייבת שהתקנת MATLAB קומפיילר זמן הפנוי הזמינה באופן חופשי, אך אינה דורשת רשיון עבור תוכנת MATLAB מסחרית. זמן הריצה של קומפיילר MATLAB נכלל בארכיון חבילת התוכנה שהוזכר לעיל. הקוד עבור סטארריניט כפי שנעשה בשימוש בפרוטוקול זה הוא ביסודו של דבר ללא שינוי ששימש עבור תמונות מיקוד6. עם זאת, כמה עניינים מבצעיים ביצירת תמונות קלט עבור העיבוד StarryNite והטיפול של התוצאות StarryNite טופלו כאן על ידי שיטות ב ציטוהצג המאפשרים צינור עיבוד נתונים רציפה עבור מחובר איזוטרופי diSPIM אמצעי אחסון. שינויים אלה אוטומטיים באמצעות קוד ציטוהצג המטפל בצעדים אלה לפני ולאחר עיבוד. בנוסף, ציטוהצג עורך את הפרמטר המותאם לפני הגדרת מיטוב של תבנית מותאמת להגדרה באופן אוטומטי כדי לכוונן את האלגוריתם של הפילוח לעוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בנתוני התמונה. הפרמטרים הייחודיים המשמשים את סטארריניט בכל ערכת נתונים של diSPIM נשמרים לאחר מכן בקובץ יחד עם תמונת הפלט ונתוני השידור.
גירסה מותאמת אישית של מרחרי הפועלת עם תמונות של 16 סיביות ושומרת על תאימות עם Java3D רינדור מתאימה ביותר לפרוטוקול זה. הוא נכלל גם בארכיון צרור התוכנה שהוזכר לעיל.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לג מאריי על זן משולב, ujIs113, כדי לייצר זן הזדקנות BV514; ברנדון הארווי (NIBIB) לקבלת עזרה בבדיקת הפרוטוקול; ג’ון דניאלס וגרי רונדו (מיכשור מדעי יישומי) לסיוע בכלי מיקרו-מנהל ומכשיר diSPIM; ואנדרו יורק והאנק עדן על המשוב הקריטי שלהם על מערכת ה-diSPIM. כמו כן, אנו מודים למרכז המחקר לתכנית מוסדות המיעוט ולמכון לנוירוביולוגים חוסה דל קסטיליו (אוניברסינדה דה פוארטו ריקו) למתן מפגש ומערכת סיעור מוחות. הרבה מהעבודה הזאת נערכה במעבדה הביולוגית הימית ביער הול באמצעות תוכנית ויטמן. עבודה זו נתמכת על ידי תוכניות מחקר הפנים של המכון הלאומי NIH של הדמיה ביו-רפואית וביוהנדסה ועל ידי NIH מענק לא. U01-HD075602 ו-No. R24-OD016474. מארק W. Moyle נתמך על ידי F32-NS098616 ו לייטון ה. דאנקן נתמך על ידי תוספת גיוון ל R24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |