Здесь мы представляем комбинаторный подход с использованием микроскопии высокого разрешения, вычислительных инструментов и одноклеточной маркировки в живых эмбрионах C. elegans для понимания динамики одной клетки во время нейроразвития.
Канорхабдит элеганы (C. elegans) выделяется как единственный организм, в котором проблема понимания клеточного происхождения всей нервной системы можно наблюдать, с разрешением одной клетки, in vivo. Здесь мы представляем комплексный протокол для обследования нейроразвития эмбрионов C. elegans. Наш протокол сочетает в себе визуализацию, линейный и нейроанатомический отслеживание одиночных клеток в развивающихся эмбрионах. Мы достигаем долгосрочной, четырехмерной (4D) визуализации живых эмбрионов C. elegans с почти изотропным пространственным разрешением с помощью перевернутой селективной микроскопии плоскости (diSPIM). Ядра и нейрональные структуры в эмбрионах нематод изображены и изотрополово слиты, чтобы дать изображения с разрешением 330 нм во всех трех измерениях. Эти поминутные наборы данных с высоким разрешением 4D затем анализируются для корреляции окончательных клеточных лидентий с экспрессией генов и морфологической динамикой на одноклеточных и субклеточных уровнях детализации. Наш протокол структурирован таким образом, чтобы обеспечить модульную реализацию каждого из описанных шагов и усилить исследования по эмбриогенезу, экспрессии генов или нейроразвитии.
C. elegans выделяется как единственный организм, в котором каждая клетка эмбриона может наблюдаться на протяжении всего развития нервной системы. При всей клеточной линииизвестны и инвариант1 , а также с развитием новых инструментов, которые позволяют маркировки и непрерывной визуализации одиночных клеток в эмбрионах, биологи теперь могут начать изучение различных шагов в развитии нематод нервной система со всех сторон – рождение клеток; миграция и дифференциация; невритовое образование, целенаправленный рост и фасцикуляция; синапсовое образование; и настройка функциональных схем. Захват динамики роста нейронов в эмбрионе C. elegans, сочетая заведомые репортеры и флуоресценцию микроскопии, ценен для научного сообщества.
Исследования в области развития в C. elegans часто используют инвариантные карты клеточной линии и клеточной судьбыэтого вида для расширения контекстуального понимания на одноклеточном уровне в нетронутом организме 1. Автолинейный анализ – с использованием StarryNite2,3,4 и AceTree5,6,7,8 программного обеспечения – выгоды от высокой контрастации, высокого разрешения изображения флуоресцентных ядер. Для оптимальной работы StarryNite/AceTree также зависит от предсказуемой ограниченной ориентации изображенных эмбрионов во время развития. Конфокальная микроскопия, сделанная в эмбрионах C. elegans, сжатых между двумя крышками, является стандартным методом автоматической линии микроскопии уже более десяти лет, поскольку она обеспечивает как высокий контрастный/высокий, так и предсказуемый ограниченный ориентация эмбриона7,8. Ранее мы описали строительство и использование нового светлиста на основе двойного вида перевернутый селективный микроскоп освещения плоскости (diSPIM) для живой образец изображения, такие как C. elegans эмбриогенез9,10 , 11 Год , 12 Лет , 13. Светолистная микроскопия, в общем, обеспечивает низкую фототоксичность, высокую скорость и долгосрочную визуализацию живых 3D-образцов14,15. Метод diSPIM, в частности, производит четырехмерные (4D) изображения с почти изотропным пространственным разрешением примерно 330 нм9.
По сравнению с конфокальной микроскопией, diSPIM предлагает более высокую скорость сигнала к шуму и скорости, более изотропное пространственное разрешение, и больше подходит для долгосрочного in vivo изображений16. Поэтому мы работали над адаптацией данных diSPIM для ввода в StarryNite/AceTree и исследовали, будет ли это способствовать расширению линейных анализов. Основным препятствием является то, что diSPIM образцы не могут быть легко ограничены яичной скорлупы сжатия принять ожидаемые ориентации для StarryNite / AceTree. Случайная ориентация клеточных позиций в анализируемом объеме ухудшает точность ауто-линейного анализа.
Поэтому мы использовали CytoSHOW, пользовательский интерфейс, управляемый зрителем, который позволяет пользователям выбирать точную 3D-ориентацию эмбрионов во время предварительной обработки изображений diSPIM, принося данные изображений, которые являются одновременно оптимизированными и контексто-осведомленными для ввода в StarryNite /AceTree. При выборе пользователями изображений эмбрионов, CytoSHOW организует автоматизированный конвейер обработки данных. Обрезанные и фоновые изображения эмбрионов сохраняются в файлах стека TIFF для каждой позиции, временной точки и представления. CytoSHOW затем итеративно вызывает программу SpimFusion совместно зарегистрироваться и совместно deconvolve два предварительно обработанных просмотров, используя Ричардсон-Люси17,18 алгоритм для получения изотропных высокой разрешения объемных изображений. Для StarryNite был оптимизирован набор параметров diSPIM для управления своим поведением во время сегментации изображений и отслеживания ядер на изотропически сброшенных изображениях. Сброшенные изображения и результаты lineaging затем редактируются с помощью AceTree, что позволяет пользователям выявлять и исправлять любые ошибки в авто-линии трассировки, генерируемых StarryNite. AceTree также может представить линию дерева и 3D моделируемых визуализаций гусеничных ядер в эмбрионе. Мы находим, что скорость и точность автоматической линии заметно повышаются с помощью изотропически сброшенных изображений, по сравнению с необработанными изображениями с камеры SPIM. Наш протокол, хотя и оптимизирован для описанного здесь приложения C. elegans, в целом может быть адаптирован для автоматического оформления данных diSPIM, полученных для других видов или образцов. Если это предполагаемое использование протокола, обратите внимание, что дополнительная настройка параметров StarryNite, вероятно, потребуется для новых образцов, как описано3,4.
Успешная реализация этого протокола приводит к изображениям с 4D-изотропным разрешением и позволяет биологам отслеживать линии клеток, одновременно выявляя и анализируя нейроны в развивающемся эмбрионе C. elegans. Более того, объединив несколько алгоритмов пост-обработки – с аппаратным ускорением, который является наиболее трудоемким из них – теперь мы можем анализировать как мелкие субклеточные детали, так и клеточные линии и клеточные судьбы живых эмбрионов практически в режиме реального времени. Этот новый протокол позволяет точные, обоснованные манипуляции и наблюдения поведения клеток во время доказательных исследований дифференциации и морфогенеза in vivo. В этой рукописи мы представляем подробное объяснение усовершенствованных протоколов, разработанных нами для отслеживания линий и клеток при разработке эмбрионов C. elegans, для повышения уровня исследований эмбриогенеза, экспрессии генов или нейроразвития.
C. elegans выделяется как единственный организм с окончательными позициями и связь каждого взрослого нейрона известны27. Однако динамика развития, приводящая к организации рабочих схем и сетей, вкоторыехавших коннектом C. elegans, остается неизвестной. Основываясь на возможностях, возникающих в результате достижений в области световой микроскопии, мы можем теперь фиксировать и анализировать клеточные позиции, морфогенез и нейрогенез на протяжении всего эмбрионального развития C. elegans.
Процедура, которую мы описали и которую мы регулярно используем в лаборатории, дает 4D-изотропные изображения помеченных нейронов и ядер для клеточной линии в эмбрионах C. elegans. Что еще более важно, мы оптимизировали долгосрочные условия визуализации с diSPIM и в сочетании с полуавтоматическими линейными возможностями с изображениями с высоким разрешением для повышения скорости и точности анализа эмбриогенеза C. elegans. Этот интегрированный протокол позволит пользователям визуализировать и идентифицировать клетки и количественно трехмерных объектов, таких как нейритная миграция и фасцикуляция аксона через начало раннего подергивания. Эта процедура может быть легко адаптирована в любой объект с системой ASI diSPIM, и мы рекомендуем эту систему специально для этого протокола. Другие формулировки SPIM, предлагаемые коммерчески, могут отличаться от конфигурации АСИ в образцовых камерах и оптических свойствах. Тем не менее, данные, экспортируемые с других платформ, также могут быть помещены через наш конвейер данных. Таким образом, оценка их стоимости в lineaging, требовательный тест качества изображения и стабильности приборов, является возможным. Несмотря на то, что мы активно используем diSPIM для регулярного изображения других образцов (таких как дрозофилы и эмбрионы зебры), описанный и всеобъемлющий линейный анализ эмбрионов по-прежнему в настоящее время ограничивается нематодными видами. Для больших или толстых образцов мы предпочитаем использовать подходы к сканированию стадии, которые сканируют образцы через стационарный световой лист. Kumar et al. ранее продемонстрировали это улучшенное diSPIM секционирование для получения высококачественных изображений из толстых образцов без дополнительных изменений в diSPIM10.
Критические шаги в протоколе включают монтаж эмбрионов C. elegans на поли-L-лизин покрытием coverslip, сбор данных, и обработки данных. Сбор урожая и монтаж C. elegans эмбрионов на стеклянном крышке может быть сложной задачей для неопытных пользователей, но здесь мы предоставляем подробный протокол ключевых шагов для облегчения обучения. Если долгосрочная визуализация желательна, мы получаем наилучшие результаты по сбору четырехклеточных или более ранних эмбрионов у 8-10 молодых людей28. Обратите внимание, что пожилые люди менее желательны для сбора эмбрионов ранней стадии, потому что они, как правило, содержат старые эмбрионы в матке и неоплодотворенные яйца. Что касается монтажа эмбрионов, такие проблемы, как блокировка в собранном аспираторе (ротпипетная пипетка) или слишком большое отверстие в микрокапиллярной пипетке, могут предотвратить правильное монтаж и ориентацию эмбрионов. Чтобы подготовиться к оптимальной визуализации, мы проводим предварительное тестирование на ранних и поздних предварительно подергивания эмбрионов, чтобы проверить производительность световых листов, камер, целей и автофокусировки. Мы получаем лучшие результаты, когда все эти операции проверены и дают высококачественные изображения во время нашего предварительного тестирования приобретения. Это особенно актуально для создания изображений с изотропным пространственным разрешением, для которых необработанные изображения, полученные из обоих представлений (целей), должны быть высококачественными. После приобретения объемы, приобретенные для каждого представления, обрабатываются для получения изотропных изображений. Важно использовать соответствующую графическую обработку (GPU) карты, как описано в этом протоколе (см. ниже). Это улучшает скорость обработки, с которой генерируются изотропически сброшенные изображения, сокращая время анализа данных. Кроме того, крайне важно, чтобы пользователи запускали последнюю версию CytoSHOW и используют параметры, предоставляемые с нашей загрузки расслоение для StarryNite автоматической линии. Если пользователи заинтересованы в использовании автоматической линии для других образцов (например, зебрафиш, дрозофила и т.д.), то потребуетсядополнительная оптимизация параметров, используемых в StarryNite (см. справки 3,4).
Хотя наш интегрированный протокол обеспечивает изображения и линейные результаты в предварительно подергиваем эмбрионе, пользователи должны знать, что автоматизированное lineaging в послепотливом эмбрионе в настоящее время не представляется возможным? после подергивания эмбриона, слишком быстро, чтобы позволить линии отслеживания. Тем не менее, diSPIM действительно продемонстрировали многообещающую способность захватить нейроразвития событий и отслеживать некоторые позиции клеток в после подергивания этапов эмбриогенеза23,29. Если пользователи заинтересованы в изучении после подергивания эмбриона, diSPIM обеспечивает скорость получения объемных снимков и отслеживать тонкие события нейроразвития, такие как неврит овый рост, в быстро движущихся эмбрионов.
Этот протокол будет основополагающим для завершения клеток за ячейкой Атлас WormGUIDES30, так как он обеспечит комплексный подход с высоким разрешением изотропных изображений для выявления и захвата 3D морфологии помеченных нейронов во время первые 430 минут эмбриогенеза. В его нынешнем виде прототип атласа WormGUIDES обеспечивает ядерное положение клеток в развивающемся эмбрионе и направлен на захват динамики развития подмножества эмбриональных нейронов. Этот протокол будет ключом к интеграции дополнительных развивающихся нейронов в атлас WormGUIDES30.
Наш интегрированный протокол также упростит изучение новых профилей экспрессии генов в эмбрионе C. elegans. В трансгенных C. elegans, многие клетки конкретных промоутеров пространственно и временно контролировать трансгенное выражение. В то время как модели экспрессии большинства генов были широко охарактеризованы у взрослого животного31,32,33,34, почти все еще не охарактеризованы в развивающихся (особенно поздней стадии) эмбриона. C. elegans promoterome был полезным ресурсом для сообщества червей для привода клеточного экспрессии трансгенов, а также определить, является ли генная функция клеточной или неавтономной. Захват изотропных моделей высокого разрешения и динамического выражения генов, а также точное определение выражающих сярлица клеток с помощью линии будут полезны для многих в научном сообществе.
Эмэмегенез включает в себя два взаимосвязанных основных процесса, клеточной дифференциации и морфогенеза тканей. Многое известно о механизмах и молекулах, которые определяют различные типы клеток во время развития C. elegans. Тем не менее, мало что известно о механизмах, важных для миграции клеток, клеточной адгезии и формы клеток в эмбрионе C. elegans. С C. elegans инвариантной линии клеток известны, наш протокол позволяет нам легко различить каталогизировал 3D-микроанатомии эмбриона во время морфогенеза на новых уровнях детализации, например, аксон фасцикуляции, синаптогенеза, и нейронной активности. Ardiel et al. ранее продемонстрировали силу diSPIM для улавливания переходных кальция на уровне одного нейрона в эмбрионах C. elegans 23. Многие другие аспекты физиологии развития созрели для исследования этими методами.
Наконец, этот протокол в значительной степени автоматизирован и систематически сокращает время, необходимое для генерации изображений деконволуции и выполнения клеточной линии через StarryNite и Acetree. Стратегии программного обеспечения, используемые в этом протоколе, могут быть применены ко многим вопросам биологии, далеким от очень специфических областей, в которых мы их продемонстрировали здесь.
Подробная информация о совместимости программного обеспечения и доступе к загрузке
Информация о Micro-Manager и плагинах для визуализации diSPIM доступна в http://dispim.org/software/micro-manager и https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
В настоящее время для конвейера обработки данных требуется операционная система Windows. Мы упаковали единый архивный файл для упрощения установки всех необходимых программ обработки данных и файлов поддержки. Он доступен для скачивания в http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) основан на широко используемой платформе анализа изображений с открытым исходным кодом ImageJ (v1). Java должна быть установлена и обновлена на компьютере для использования CytoSHOW, а обновления CytoSHOW автоматически развертываются через Java Web Start. Многие функции CytoSHOW на основе ImageJ описаны и проиллюстрированы на https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW был настроен для отображения многомерных необработанных данных из ASI diSPIM, а также другого программного обеспечения для визуализации, которое создает выход TIFF. В принципе, другие многовидовые системы визуализации SPIM могут быть подкреплены незначительными модификациями CytoSHOW, позволяющими осуществлять этот протокол на различных системах микроскопов.
SpimFusion был написан в CUDA/C е с помощью Visual Studio 2013 с помощью инструментария CUDA v7.5. Запуск SpimFusion требует специального компьютерного оборудования, NVIDIA графический процессор (GPU) карты с CUDA вычислительной возможности 1.0 или выше и минимум 2 ГБ памяти видеокарты. На момент публикации нашего протокола SpimFusion не публикуется (Мин Го и Шрофф), но доступен в вышеупомянутом архиве пакета программного обеспечения.
Специально построенная командная версия StarryNite требует установки свободно доступного компилятеля MATLAB Runtime, но не требует лицензии на коммерческое программное обеспечение MATLAB. MatLAB Compiler Runtime включен в упомянутый выше архив пакета программного обеспечения. Код для StarryNite, используемый в этом протоколе, по существу не изменился по сравнению с тем, который используется для конфокальных изображений6. Тем не менее, несколько оперативных вопросов в создании входных изображений для обработки StarryNite и обработки результатов StarryNite были рассмотрены здесь методами в CytoSHOW, которые позволяют непрерывной обработки данных трубопровода для слитого изотропного diSPIM объемов. Эти изменения автоматизированы кодом CytoSHOW, который обрабатывает эти пред- и пост-обработки шагов. CytoSHOW также редотирует предварительно оптимизированный шаблон StarryNite, установленный для автоматической настройки алгоритма сегментации на интенсивность флуоресценции ядер в изображении данных. Уникальные параметры, используемые StarryNite на каждом наборе данных diSPIM, затем сохраняются в файле вместе с выходным изображением и линейными данными.
Пользовательская версия AceTree, которая работает с 16-битными изображениями и поддерживает совместимость с визуализацией Java3D, лучше всего подходит для этого протокола. Он также включен в архив пакета программного обеспечения, упомянутый выше.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Джона Мюррея за интегрированный штамм, ujIs113, для генерации линейных штамм BV514; Брэндон Харви (NIBIB) за помощь в тестировании протокола; Джон Дэниелс и Гэри Рондо (Прикладное научное оборудование) за помощь с Micro-Manager и diSPIM инструмент; и Эндрю йорк и Хэнк Иден за их критические отзывы о системе diSPIM. Мы также благодарим Исследовательский центр для меньшинств учреждений программы и Института нейробиологии Хосе дель Кастильо (Университет Пуэрто-Рико) для обеспечения встречи и мозгового штурма платформы. Большая часть этой работы была проведена в Морской биологической лаборатории в Вудс-Хоул в рамках программы Уитмена. Эта работа была поддержана интрамуральных научно-исследовательских программ НИЗ Национальный институт биомедицинской визуализации и биоинженерии и НИЗ грант No. U01-HD075602 и No. R24-OD016474. Марк У. Мойл был поддержан F32-NS098616 и Лейтон Х. Дункан был поддержан разнообразие дополнение к R24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |