Ici, nous présentons une approche combinatoire utilisant la microscopie à haute résolution, les outils de calcul, et l’étiquetage à une seule cellule dans les embryons vivants de C. elegans pour comprendre la dynamique de cellule unique pendant le neurodéveloppement.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) se distingue comme le seul organisme dans lequel le défi de comprendre les origines cellulaires d’un système nerveux entier peut être observé, avec une résolution de cellule unique, in vivo. Ici, nous présentons un protocole intégré pour l’examen du neurodéveloppement chez les embryons de C. elegans . Notre protocole combine l’imagerie, le ligage et le traçage neuroanatomique des cellules individuelles dans les embryons en développement. Nous atteignons l’imagerie à long terme en quatre dimensions (4D) des embryons vivants de C. elegans avec une résolution spatiale presque isotrope grâce à l’utilisation de la microscopie à double vue à plan sélectif inversé (dispim). Les noyaux et les structures neuronales dans les embryons de nématodes sont imagés et fusionné isotropiquement pour produire des images avec une résolution de ~ 330 nm dans les trois dimensions. Ces ensembles de données 4D à haute résolution minute par minute sont ensuite analysés pour corréler les identités de lignée cellulaire définitives avec l’expression génique et la dynamique morphologique à des niveaux de détail à une seule cellule et sous-cellulaire. Notre protocole est structuré pour permettre la mise en œuvre modulaire de chacune des étapes décrites et améliorer les études sur l’embryogenèse, l’expression génique ou le neurodéveloppement.
C. elegans se distingue comme le seul organisme dans lequel chaque cellule de l’embryon peut être observée tout au long du neurodéveloppement. Avec l’ensemble de la lignée cellulaire connue et invariante1, et avec le développement de nouveaux outils qui permettent l’étiquetage et l’imagerie continue des cellules individuelles dans les embryons, les biologistes peuvent maintenant commencer à examiner différentes étapes dans le développement du nématode nerveux système de tous les angles-la naissance des cellules; migration et différenciation; la formation de neurites, l’excroissance ciblée et la fasciculation; formation de Synapse; et le réglage des circuits fonctionnels. La capture de la dynamique de l’excroissance neuronale dans l’embryon de C. elegans , en combinant des reporters exprimés de façon stable et la microscopie à fluorescence, est précieuse pour la communauté scientifique.
Les études de développement chez C. elegans tirent souvent parti de la lignée cellulaire invariante et des cartes de la cellule-destin de cette espèce pour augmenter la compréhension contextuelle au niveau de la cellule unique au sein de l’organisme intact1. Analyse d’auto-linéarité-utilisation de starrynite2,3,4 et acetree5,6,7,8 Software-avantages du contraste élevé, haute résolution images de noyaux fluorescents. Pour fonctionner de façon optimale, StarryNite/AceTree dépend également de l’orientation prévisible des embryons imagés pendant le développement. La microscopie confocale, faite en C. elegans embryons compressés entre deux lamelles, a été la méthode standard de microscopie auto-linéante depuis plus d’une décennie parce qu’elle fournit à la fois un contraste élevé/haute résolution et une contrainte prévisible orientation de l’embryon7,8. Nous avons décrit précédemment la construction et l’utilisation d’un microscope d’illumination à plan sélectif inversé à double vue à base de feuilles légères (dispim) pour l’imagerie d’échantillons vivants tel que C. elegans embryogenèse9,10 , le 11 , le 12 , 13. la microscopie en feuilles légères, en général, fournit une faible phototoxicité, une haute vitesse et une imagerie à long terme des spécimens 3D vivants14,15. La méthode diSPIM, en particulier, produit des images en quatre dimensions (4D) avec une résolution spatiale presque isotrope d’environ 330 nm9.
Comparé à la microscopie confocale, le diSPIM offre un signal-bruit et une vitesse plus élevés, une résolution spatiale plus isotrope, et est plus approprié pour l’imagerie in vivo à long terme16. Nous avons donc travaillé à adapter les données du diSPIM pour l’entrée dans StarryNite/AceTree et nous avons étudié si cela améliorerait les analyses de linéarité. Un obstacle majeur est que les spécimens de diSPIM ne peuvent pas être facilement contraints par la compression de coquille d’oeuf pour adopter les orientations attendues pour StarryNite/AceTree. L’orientation aléatoire des positions des cellules dans le volume analysé dégrade la précision de l’analyse d’auto-linéarité.
Nous avons donc employé CytoSHOW, une interface utilisateur guidée par le spectateur qui permet aux utilisateurs de sélectionner une orientation 3D précise des embryons lors du pré-traitement des images diSPIM, produisant des données d’image à la fois optimisées pour la qualité et prenant en compte le contexte pour l’entrée dans StarryNite /AceTree. Lors de la sélection des embryons imagés par l’utilisateur, CytoSHOW orchestre un pipeline automatisé de traitement des données. Les images d’embryons recadrées et en arrière-plan sont enregistrées dans les fichiers de pile TIFF pour chaque position, point de temps et vue. Cytoshow appelle alors itérativement le programme spimfusion pour co-enregistrer et décongestirer conjointement les deux vues prétraitées, en utilisant l’algorithme Richardson-Lucy17,18 pour produire des images volumétriques à haute résolution isotrope. Un ensemble de paramètres spécifique au diSPIM a été optimisé pour StarryNite pour régir son comportement lors de la segmentation d’image et du suivi des noyaux dans les images fusionnées isotropiquement. Les images fusionnées et les résultats d’alignement sont ensuite modifiés à l’aide d’AceTree, ce qui permet aux utilisateurs d’identifier et de corriger toutes les erreurs dans la trace de la lignée automatique générée par StarryNite. AceTree peut également présenter l’arbre de lignage et les rendus modélisés en 3D des noyaux suivis dans l’embryon. Nous constatons que la vitesse et la précision d’auto-linéarité sont nettement améliorées à l’aide d’images isotropiquement fusionnées, par rapport aux images brutes de l’une ou l’autre des caméras SPIM. Notre protocole, tout en étant optimisé pour l’application C. elegans décrite ici, pourrait être généralement adapté pour l’auto-ligage des données dispim produites pour d’autres espèces ou spécimens. S’il s’agit de l’utilisation prévue du protocole, veuillez noter qu’un réglage supplémentaire des paramètres starrynite sera probablement exigé pour les nouveaux spécimens, comme décrit3,4.
La mise en œuvre réussie de ce protocole aboutit à des images avec une résolution 4D-isotrope et permet aux biologistes de tracer les lignées cellulaires, tout en identifiant et analysant simultanément les neurones dans l’embryon de C. elegans en développement. En outre, en fusionnant plusieurs algorithmes de post-traitement-avec l’accélération matérielle étant le plus chronophage de ces derniers-, nous pouvons maintenant analyser à la fois les détails subcellulaires fins et les lignées cellulaires et les cellules-Fates d’embryons vivants en temps réel. Ce nouveau protocole permet une manipulation précise et éclairée du comportement cellulaire lors d’études de différenciation et de morphogenèse in vivo. Dans ce manuscrit, nous présentons une explication détaillée des protocoles améliorés que nous avons développés pour le lignage et le suivi cellulaire dans le développement des embryons de C. elegans , pour améliorer les études sur l’embryogenèse, l’expression génique ou le neurodéveloppement.
C. elegans se distingue comme le seul organisme avec les positions finales et la connectivité de chaque neurone adulte connu27. Cependant, la dynamique de développement conduisant à l’Organisation des circuits de travail et des réseaux qui composent le C. elegans connectome reste inconnue. Sur la base des occasions qui émergent des progrès en microscopie photonique, nous pouvons maintenant capturer et analyser les positions cellulaires, la morphogenèse et la neurogenèse tout au long du développement embryonnaire de C. elegans .
La procédure que nous avons décrite et que nous utilisons couramment dans le laboratoire donne des images 4D-isotropes de neurones étiquetés et de noyaux pour l’alignement cellulaire chez des embryons de C. elegans . Plus important encore, nous avons optimisé les conditions d’imagerie à long terme avec le diSPIM et les capacités de linéarité semi-automatisée couplées avec des images haute résolution pour améliorer la vitesse et la précision de l’analyse de l’embryogenèse C. elegans . Ce protocole intégré permettra aux utilisateurs de visualiser et d’identifier les cellules et de quantifier les caractéristiques tridimensionnelles telles que la migration des neurites et la fasciculation des axons au début des contractions précoces. Cette procédure peut être facilement adaptée à n’importe quelle installation avec un système ASI diSPIM, et nous recommandons ce système spécifiquement pour ce protocole. D’autres formulations de SPIM offertes commercialement peuvent différer de la configuration ASI dans la chambre d’échantillonnage et les propriétés optiques. Cependant, les données exportées à partir d’autres plateformes peuvent également être mises à travers notre pipeline de données. Par conséquent, l’évaluation de leur valeur dans l’alignement, un test exigeant de la qualité de l’image et la stabilité de l’instrument, est faisable. Même si nous utilisons activement le diSPIM pour faire régulièrement l’image d’autres spécimens (comme les embryons de drosophile et de zébrafish), l’analyse détaillée et exhaustive des embryons est encore actuellement limitée aux espèces de nématodes. Pour les échantillons plus grands ou épais, nous optons pour utiliser des approches de balayage de scène, qui scannent les échantillons à travers une feuille de lumière stationnaire. Kumar et coll. ont déjà démontré cette sectionnement améliorée de diSPIM pour produire des images de haute qualité à partir d’échantillons épais sans modifications supplémentaires au diSPIM10.
Les étapes critiques dans le protocole incluent le montage des embryons C. elegans sur la Coverslip revêtue de poly-L-lysine, l’acquisition de données et le traitement des données. La récolte et le montage des embryons de C. elegans sur la lamelle de verre peuvent être difficiles pour les utilisateurs inexpérimentés, mais ici nous fournissons un protocole détaillé des étapes clés pour faciliter l’apprentissage. Si l’imagerie à long terme est souhaitée, nous obtenons les meilleurs résultats en récoltant des embryons à quatre cellules ou plus tôt à partir de 8-10 jeunes adultes28. Notez que les adultes âgés sont moins souhaitables pour récolter des embryons de stade précoce parce qu’ils ont tendance à contenir des embryons plus âgés dans l’utérus et des oeufs non fertilisés. En ce qui concerne les embryons de montage, des problèmes tels que le blocage dans l’aspirateur assemblé (pipette à bouche) ou un trop grand d’une ouverture dans la pipette microcapillaire peuvent empêcher le montage et l’orientation appropriés des embryons. Pour se préparer à une imagerie optimale, nous effectuons des tests de pré-acquisition sur les embryons précoces et tardifs de pré-contractions pour vérifier la performance des feuilles lumineuses, des caméras, des objectifs et de l’autofocus. Nous obtenons de meilleurs résultats lorsque toutes ces opérations sont testées et donnent des images de haute qualité lors de nos tests de pré-acquisition. Ceci est particulièrement pertinent pour générer des images avec une résolution spatiale isotrope, pour lesquelles les images brutes acquises à partir des deux vues (objectifs) doivent être de haute qualité. Après l’acquisition, les volumes acquis pour chaque vue sont traités pour produire des images isotropes. Il est important d’utiliser une carte d’unité de traitement graphique (GPU) appropriée comme décrit dans ce protocole (voir ci-dessous). Cela améliore la vitesse de traitement à laquelle les images fusionnées isotropiquement sont générées, raccourcissant le temps d’analyse des données. Il est également impératif que les utilisateurs exécutent la dernière version de CytoSHOW et utilisent les paramètres fournis avec notre Bundle de téléchargement pour StarryNite auto-lineaging. Si les utilisateurs sont intéressés à utiliser l’auto-ligage pour d’autres échantillons (par exemple, zebrafish, Drosophila etc.), l’optimisation supplémentaire aux paramètres utilisés dans starrynite sera nécessaire (voir références3,4).
Bien que notre protocole intégré fournisse des images et des résultats d’alignement dans l’embryon pré-twdémangeant, les utilisateurs doivent être conscients que l’alignement automatisé dans l’embryon post-twdémangeaisons n’est actuellement pas réalisable: les positions nucléaires changent de l’ordre des secondes dans le embryonnaire post-contractions, trop rapidement pour permettre le suivi de la lignée. Cependant, le dispim a en effet démontré une capacité prometteuse de capturer des événements neurodéveloppementaux et de suivre certaines positions cellulaires dans les stades post-contractions de l’embryogenèse23,29. Si les utilisateurs sont intéressés à examiner l’embryon post-twdémangeant, le diSPIM fournit la vitesse pour obtenir des instantanés volumétriques et suivre des événements neurodéveloppementaux fins, tels que l’excroissance de neurites, dans les embryons en mouvement rapide.
Ce protocole sera fondamental pour l’achèvement de la cellule par cellule de l’Atlas30de wormguides, car il fournira une approche intégrée avec des images isotropes à haute résolution pour identifier et capturer les morphologies 3D des neurones étiquetés pendant 430 premières minutes d’embryogenèse. En l’État, le prototype de l’Atlas WormGUIDES fournit des positions nucléaires de cellules dans l’embryon en développement et vise à capturer la dynamique du développement d’un sous-ensemble de neurones embryonnaires. Ce protocole sera une clé pour l’intégration de neurones en développement supplémentaires dans l’Atlas de WormGUIDES30.
Notre protocole intégré simplifiera également l’exploration de nouveaux profils d’expression génique dans l’embryon de C. elegans . Chez les C. eleganstransgéniques, de nombreux promoteurs spécifiques à la cellule contrôlent spatialement et temporequement l’expression transgénique. Alors que les patrons d’expression de la plupart des gènes ont été largement caractérisés dans l’animal adulte31,32,33,34, presque tous n’ont pas encore été caractérisés dans les pays en développement (en particulier embryonnaire tardif). Le C. elegans promoterome a été une ressource utile pour la communauté de ver pour conduire l’expression transgénique spécifique à une cellule, ainsi que de déterminer si la fonction génique est cellulaire-autonome ou non-autonome. Capturer des schémas isotropes de haute résolution et d’expression dynamique des gènes, et identifier précisément les cellules exprimant par le biais d’un ligage sera utile à beaucoup dans la communauté scientifique.
L’embryogenèse comprend deux processus majeurs entrelacés, la différenciation cellulaire et la morphogenèse tissulaire. On sait beaucoup sur les mécanismes et les molécules qui définissent des types distincts de cellules pendant le développement de C. elegans. Cependant, on sait peu de chose sur les mécanismes importants pour la migration cellulaire, l’adhérence des cellules et la forme cellulaire dans l’embryon de C. elegans . Avec la lignée de cellules invariantes C. elegans connue, notre protocole nous permet de discerner facilement la microanatomie 3D cataloguée de l’embryon au cours de la morphogenèse à de nouveaux niveaux de détail: p. ex. fascicule d’axones, synaptogenèse et activité neuronale. Ardiel et coll. ont déjà démontré la puissance du diSPIM pour capturer les transitoires calciques au niveau d’un seul neurones dans les embryons de C. elegans 23. De nombreux autres aspects de la physiologie du développement sont mûrs pour l’enquête par ces méthodes.
Enfin, ce protocole est largement automatisé et réduit systématiquement le temps nécessaire pour générer des images de déconvolution et effectuer des lignées cellulaires via StarryNite et Acetree. Les stratégies logicielles utilisées dans ce protocole peuvent être appliquées à de nombreuses questions de biologie loin des domaines très spécifiques dans lesquels nous les avons démontrés ici.
Détails sur la compatibilité logicielle et l’accès au téléchargement
Des informations sur le micro-gestionnaire et les plugins pour l’imagerie diSPIM sont disponibles sur http://dispim.org/software/micro-manager et https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
Le pipeline de traitement des données nécessite actuellement un système d’exploitation Windows. Nous avons regroupé un seul fichier d’archive pour simplifier l’installation de tous les programmes de traitement de données et fichiers de support requis. Il est disponible au téléchargement à http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) est basé sur la plate-forme d’analyse d’image Open source largement utilisée et ImageJ (v1). Java doit être installé et mis à jour sur l’ordinateur pour utiliser CytoSHOW, et les mises à jour de CytoSHOW sont déployées automatiquement via Java Web Start. De nombreuses fonctions de CytoSHOW basées sur ImageJ sont décrites et illustrées à https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW a été personnalisé pour afficher des données brutes multidimensionnelles à partir de l’ASI diSPIM, ainsi que d’autres logiciels d’imagerie qui crée la sortie TIFF. En principe, d’autres systèmes d’imagerie SPIM à vues multiples pourraient être soutenus par des modifications mineures de CytoSHOW pour permettre que ce protocole soit réalisé sur différents systèmes de microscope.
SpimFusion a été écrit en CUDA/C++ à l’aide de Visual Studio 2013 avec CUDA Toolkit v 7.5. L’exécution de SpimFusion nécessite un matériel informatique spécifique: une carte graphique NVIDIA (GPU) avec une capacité de calcul CUDA 1,0 ou supérieure et un minimum de 2 Go de mémoire de carte graphique. Au moment de la publication de notre protocole, SpimFusion n’est pas publié (min Guo et Hari Shroff) mais disponible dans les Archives du bundle de logiciels mentionnées ci-dessus.
Une version spécialement conçue pilotée par la ligne de commande de StarryNite exige que le runtime MATLAB compiler librement disponible soit installé, mais ne nécessite pas une licence pour le logiciel commercial MATLAB. Le MATLAB compiler Runtime est inclus dans l’archive de Bundle de logiciels mentionnée ci-dessus. Le code de StarryNite utilisé dans ce protocole est essentiellement inchangé par rapport à celui utilisé pour les images confocales6. Cependant, plusieurs questions opérationnelles dans la création d’images d’entrée pour le traitement de StarryNite et la gestion des résultats de StarryNite ont été abordées ici par des méthodes dans CytoSHOW qui permettent un pipeline de traitement de données continu pour le diSPIM isotrope fusionné Volumes. Ces modifications sont automatisées par le code CytoSHOW qui gère ces étapes de pré-et post-traitement. CytoSHOW modifie également un ensemble de paramètres StarryNite de modèle spécifique au diSPIM pré-optimisé pour ajuster automatiquement l’algorithme de segmentation à l’intensité de fluorescence des noyaux dans les données imagées. Les paramètres uniques utilisés par StarryNite sur chaque ensemble de données diSPIM sont ensuite enregistrés dans un fichier avec l’image de sortie et les données de linéarité.
Une version personnalisée d’AceTree qui fonctionne avec des images 16 bits et maintient la compatibilité avec le rendu Java3D est le mieux adapté à ce protocole. Il est également inclus dans les Archives de Bundle de logiciels mentionnées ci-dessus.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions John Murray pour la souche intégrée, ujIs113, pour générer la souche de ligage BV514; Brandon Harvey (NIBIB) pour l’aider à tester le protocole; Jon Daniels et Gary Rondeau (Applied Scientific Instrumentation) pour l’aide au micro-Manager et à l’instrument diSPIM; et Andrew York et Hank Eden pour leurs commentaires critiques sur le système diSPIM. Nous remercions également le programme du centre de recherche pour les institutions minoritaires et l’Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) pour avoir fourni une plate-forme de réunion et de remue-méninges. Une grande partie de ce travail a été menée au laboratoire de biologie marine de Woods Hole à travers le programme Whitman. Ce travail a été appuyé par les programmes de recherche intra-muros de l’Institut national d’imagerie biomédicale et de bioingénierie de la NIH et par la subvention du NIH no. U01-HD075602 et no. OD016474. Mark W. Moyle a été soutenu par NS098616 et Leighton H. Duncan a été appuyé par un supplément de diversité à OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |