Her præsenterer vi en kombinatorisk tilgang ved hjælp af høj opløsning mikroskopi, beregningsmæssige værktøjer, og enkelt celle mærkning i levende C. elegans embryoner til at forstå enkelt celle dynamik under neurodevelopment.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) skiller sig ud som den eneste organisme, hvor udfordringen med at forstå den cellulære oprindelse af et helt nervesystem kan observeres, med en enkelt celle opløsning, in vivo. Her præsenterer vi en integreret protokol til undersøgelse af Neuro udvikling i C. elegans embryoner. Vores protokol kombinerer billeddannelse, lineaging og Neuro anatomisk sporing af enkeltceller i udvikling af embryoner. Vi opnår langsigtede, fire-dimensionelle (4D) billeddannelse af levende C. elegans embryoner med næsten isotropisk rumlig opløsning gennem brug af Dual-View inverteret selektiv plane belysning mikroskopi (dispim). Nuklei og neuronal strukturer i fyrretræsnematoden embryoner er afbildet og isotropisk smeltet til at give billeder med opløsning af ~ 330 nm i alle tre dimensioner. Disse minut-for-minut høj opløsning 4D datasæt analyseres derefter for at korrelere definitive celle-Lineage identiteter med genekspression og morfologiske dynamik på enkelt celle og subcellulære niveauer af detaljer. Vores protokol er struktureret til at muliggøre modulær gennemførelse af hver af de beskrevne trin og forbedre undersøgelser af embryogenesen, genekspression, eller Neuro udvikling.
C. elegans skiller sig ud som den eneste organisme, hvor hver celle i embryonet kan observeres gennem neurodevelopment. Med hele celle-Lineage kendt og invariant1, og med udviklingen af nye værktøjer, der tillader mærkning og kontinuerlig billeddannelse af enkeltceller i embryoner, kan biologer nu begynde at undersøge forskellige trin i udviklingen af fyrretræsnematoden nervøs system fra alle vinkler-celle fødsel; migration og differentiering; neurit formation, målrettet udvækst og fasciculation; synapse dannelse; og tuning af funktionelle kredsløb. Opfange neuronal udvækst dynamik i C. elegans embryo, ved at kombinere stabilt udtrykte journalister og Fluorescens mikroskopi, er værdifuld for det videnskabelige samfund.
Udviklingsmæssige undersøgelser i C. elegans ofte udnytte invariant celle-Lineage og celle-skæbne kort af denne art til at forøge kontekstuelle forståelse på enkelt celleniveau inden for intakt organisme1. Auto-lineaging analyse-ved hjælp af starrynite2,3,4 og acetree5,6,7,8 software-fordele ved høj kontrast, høj opløsning billeder af fluorescerende kerner. For at arbejde optimalt, StarryNite/AceTree afhænger også af forudsigelig begrænset orientering af indpakkede embryoner under udvikling. Confokal mikroskopi, udført i C. elegans embryoner komprimeret mellem to dæksedler, har været standard Auto-lineaging mikroskopi metode i mere end et årti, fordi det giver både høj kontrast/høj opløsning og en forudsigelig begrænset fostrets orientering7,8. Vi har tidligere beskrevet opførelsen og brugen af en ny lys-Sheet-baseret Dual-View inverteret selektiv plan belysning mikroskop (dispim) for levende prøve billeder såsom C. elegans embryogenese9,10 , 11 af , 12 ud af , 13. lysplade mikroskopi, generelt, giver lav fototoksicitet, høj hastighed, og langsigtet billeddiagnostik af levende 3D prøver14,15. Metoden diSPIM fremstiller specifikt fire-dimensionelle (4D) billeder med næsten isotropisk rumlig opløsning på ca. 330 nm9.
Sammenlignet med confokal mikroskopi, tilbyder diSPIM højere signal-støj og hastighed, mere isotropisk rumlig opløsning, og er mere velegnet til langsigtet in vivo Imaging16. Vi har derfor arbejdet på at tilpasse diSPIM data til input til StarryNite/AceTree og undersøgt, om dette ville forbedre lineaging analyserne. En større forhindring er, at dispim prøver ikke let kan begrænses af ægshell-kompression til at vedtage forventede retningslinjer for starrynite/acetree. Tilfældig orientering af celle positioner i den diskenhed, der analyseres, forringer nøjagtigheden af Auto-lineaging analyse.
Vi har derfor ansat CytoSHOW, en seer-guidet brugergrænseflade, som giver brugerne mulighed for at vælge præcis 3D orientering af embryoner under forbehandling af diSPIM billeder, giver billeddata, der er både kvalitet-optimeret og kontekst-Aware for input til StarryNite /AceTree. Ved brugervalg af indpakkede embryoner, organiserer CytoSHOW en automatiseret databehandling pipeline. Beskårne og baggrund-subtraede embryo billeder gemmes i TIFF stack-filer for hver position, tidspunkt og visning. Cytoshow derefter iterativt kalder programmet spimfusion at co-registrere og i fællesskab deconvolve de to præ-forarbejdede synspunkter, ved hjælp af Richardson-Lucy17,18 algoritme til at give isotropisk høj opløsning volumetriske billeder. En dispim-specifikke sæt af parametre er blevet optimeret til starrynite at styre sin adfærd under billed-segmentering og Nucleus-tracking i isotropisk smeltet billeder. Fusionerede billeder og lineaging resultater redigeres derefter ved hjælp af AceTree, som giver brugerne mulighed for at identificere og rette eventuelle fejl i Auto-Lineage spor genereret af StarryNite. AceTree kan også præsentere Lineage-træ og 3D modelleret gengivelser af sporede kerner i embryonet. Vi finder, at Auto-lineaging hastighed og nøjagtighed er markant forbedret ved hjælp af isotropisk smeltet billeder, sammenlignet med RAW-billeder fra enten spim kamera. Vores protokol, mens optimeret til C. elegans program beskrevet her, kunne generelt tilpasses til Auto-lineaging af dispim data produceret for andre arter eller enheder. Hvis dette er den tilsigtede anvendelse af protokollen, Bemærk venligst, at yderligere tuning af starrynite parametre vil sandsynligvis være påkrævet for nye enheder, som beskrevet3,4.
Vellykket gennemførelse af denne protokol resulterer i billeder med 4D-isotropisk opløsning og gør det muligt for biologer at spore celle lineages, samtidig med at identificere og analysere neuroner i det udviklende C. elegans embryo. Desuden, ved at fusionere flere efter behandling algoritmer-med hardwareacceleration er den mest tidskrævende af disse-vi kan nu analysere både fine under cellulære detaljer og celle-lineages og celle-skæbner af levende embryoner i stort set realtid. Denne nye protokol giver mulighed for præcis, informeret manipulation og observation af celle adfærd under bevis undersøgelser af differentiering og morfogenesis in vivo. I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret forklaring på de forbedrede protokoller, vi har udviklet med henblik på lineaging og celle sporing i udviklingen af C. elegans -embryoner, for at forbedre undersøgelserne af embryogenesen, genekspression eller Neuro udvikling.
C. elegans skiller sig ud som den eneste organisme med de endelige positioner og konnektivitet af hver voksen neuron kendt27. Men den udviklingsmæssige dynamik, der fører til organisering af de arbejds kredsløb og netværk, der udgør C. elegans connectome forbliver ukendt. Baseret på muligheder fra fremskridt i lys mikroskopi, kan vi nu fange og analysere celle positioner, morfogenesis, og neurogenese hele C. elegans embryonale udvikling.
Den procedure, som vi har beskrevet, og som vi rutinemæssigt bruger i laboratoriet, giver 4D-isotropiske billeder af mærkede neuroner og kerner til celle-lineaging i C. elegans -embryoner. Endnu vigtigere er det, at vi har optimeret langsigtede billeddannelses betingelser med diSPIM og koblede semi-automatiserede lineaging-funktioner med billeder i høj opløsning for at forbedre hastigheden og præcisionen ved at analysere C. elegans embryogenese. Denne integrerede protokol vil gøre det muligt for brugerne at visualisere og identificere celler og kvantificere tredimensionale funktioner såsom neurit migration og Axon fasciculation gennem debut af tidlig trækninger. Denne procedure kan let tilpasses til ethvert anlæg med et ASI diSPIM-system, og vi anbefaler dette system specifikt til denne protokol. Andre SPIM-formuleringer, der udbydes kommercielt, kan afvige fra ASI-konfigurationen i prøvekammeret og de optiske egenskaber. Data, der eksporteres fra andre platforme, kan dog også gennemføres via vores datapipeline. Derfor, vurdering af deres værdi i lineaging, en krævende test af billedkvalitet og instrument stabilitet, er muligt. Selvom vi aktivt bruger diSPIM til regelmæssigt at afbilde andre prøver (som f. eks. Drosophila og zebrafiske embryoner), er den beskrevne og omfattende analyse af embryonerne i øjeblikket stadig begrænset til fyrretræsnematoden-arterne. For større eller tykke prøver vælger vi at bruge trin-scanning tilgange, som scanner prøverne gennem en stationær lys ark. Kumar et al. har tidligere demonstreret denne forbedrede diSPIM skæring til at give billeder af høj kvalitet fra tykke prøver uden yderligere ændringer af diSPIM10.
De kritiske trin i protokollen omfatter montering C. elegans embryoner på poly-L-lysin belagt coverslip, dataopsamling, og databehandling. Høst og montering C. elegans embryoner på glasset dækglas kan være udfordrende for uerfarne brugere, men her giver vi en detaljeret protokol af centrale skridt til at lette læring. Hvis langsigtet billeddannelse ønskes, opnår vi de bedste resultater ved høst af fire-cellet eller tidligere embryoner fra 8-10 unge voksne28. Bemærk, at gamle voksne er mindre ønskeligt at høste tidlige stadier embryoner, fordi de har tendens til at indeholde ældre embryoner i livmoderen og ubefrugtede æg. Med hensyn til montering af embryoner kan problemer som blokering i den samlede indsugnings (mund pipette) eller en for stor åbning i mikrokapillar pipetten forhindre korrekt montering og orientering af embryoner. For at forberede den optimale billeddannelse udfører vi test før anskaffelsen på tidlige og sene præ-twitching-embryoner for at kontrollere ydeevnen af lysark, kameraer, mål og autofokus. Vi opnår de bedste resultater, når alle disse operationer er testet og giver billeder af høj kvalitet under vores pre-Acquisition test. Dette er især relevant for generering af billeder med isotropisk rumlig opløsning, hvor RAW-billeder, der er anskaffet fra begge synspunkter (mål), skal være af høj kvalitet. Efter købet behandles de mængder, der er anskaffet for hver visning, for at give isotropiske billeder. Det er vigtigt at bruge et passende GPU-kort (grafikprocessor) som beskrevet i denne protokol (se nedenfor). Dette forbedrer den behandlingshastighed, hvormed de isotropisk sammensmeltede billeder genereres, hvilket forkorter tiden til dataanalyser. Det er også bydende nødvendigt, at brugerne kører den nyeste version af CytoSHOW og bruger de parametre, der leveres med vores download bundle til StarryNite Auto-lineaging. Hvis brugerne er interesseret i at bruge Auto-lineaging til andre prøver (f. eks. zebrafish, Drosophila osv.), vil der være behov for yderligere optimering af de parametre, der anvendes i starrynite (Se referencer3,4).
Selv om vores integrerede protokol giver billeder og lineaging resultater i præ-twitching embryo, bør brugerne være opmærksomme på, at automatiseret lineaging i post-twitching embryo er i øjeblikket ikke muligt: nukleare positioner ændringer på rækkefølgen af sekunder i efter twitching embryo, for hurtigt at tillade Lineage tracking. Men, den dispim har faktisk vist en lovende evne til at indfange neuroudviklingsmæssige hændelser og spore nogle celle positioner i post-twitching stadier af embryo Genesis23,29. Hvis brugerne er interesseret i at undersøge post-twitching embryo, den diSPIM giver den hastighed for at opnå volumetriske Snapshots og spore fine neuroudviklingsmæssige hændelser, såsom neurite outgrowth, i hurtigt bevægende embryoner.
Denne protokol vil være grundlæggende for celle-for-celle færdiggørelse af WormGUIDES Atlas30, da det vil give en integreret tilgang med høj opløsning isotropiske billeder til at identificere og indfange 3D morfologier af mærkede neuroner under de første 430 minutter af embryogenese. Som det ser ud, prototypen WormGUIDES Atlas giver nukleare positioner af celler i det udviklende embryo og har til formål at indfange den udviklingsmæssige dynamik i en delmængde af embryonale neuroner. Denne protokol vil være nøglen til integration af yderligere udviklings neuroner i WormGUIDES Atlas30.
Vores integrerede protokol vil også forenkle udforskning af nye genekspressions profiler i C. elegans embryo. I transgene C. elegans, mange celle-specifikke initiativtagere rumligt og temporalt kontrol transgen udtryk. Mens udtrykket mønstre af de fleste gener er blevet udførligt karakteriseret i det voksne dyr31,32,33,34, næsten alle er endnu ikke karakteriseret i udviklingslandene (især forsinket) embryo. Den C. elegans promoterome har været en nyttig ressource til ormen samfund til at køre celle-specifikke transgen udtryk, samt afgøre, om gen funktion er celle-autonome eller ikke-autonome. At opfange isotropiske, højopløsnings-og dynamiske udtryks mønstre af gener og præcist at identificere celler via lineaging vil være værdifuldt for mange i forskersamfundet.
Embryogenese består af to sammenflettede store processer, cellulær differentiering og vævs morfogenese. En hel del er kendt om de mekanismer og molekyler, der definerer særskilte celletyper under udviklingen af C. elegans. Men, lidt er kendt om de mekanismer, der er vigtige for celle migration, celle vedhæftning, og celle form i C. elegans embryo. Med C. elegans invariant celle Lineage kendt, vores protokol lader os let skelne katalogiseret 3D-mikroanatomi af embryonet under morfogenese på nye niveauer af detaljer: fx Axon fasciculation, synaptogenesis, og neuronal aktivitet. Ardiel et al. har tidligere demonstreret styrken af diSPIM til at indfange calcium transienter på niveau med en enkelt neuroner i C. elegans embryoner23. Mange andre aspekter af udviklings fysiologi er moden til undersøgelse af disse metoder.
Endelig, denne protokol er stort set automatiseret og systematisk reducerer den tid, det tager at generere deconvolution billeder og udføre celle-lineaging via StarryNite og Acetree. De software strategier, der anvendes i denne protokol, kan anvendes på mange spørgsmål om biologi langt fra de meget specifikke områder, hvor vi har demonstreret dem her.
Oplysninger om software kompatibilitet og download-adgang
Oplysninger om Micro-Manager og plugins til diSPIM Imaging er tilgængelige på http://dispim.org/software/micro-manager og https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
Databehandlings pipelinen kræver i øjeblikket et Windows-operativsystem. Vi har bundtet en enkelt arkivfil for at forenkle installationen af alle nødvendige databehandling programmer og støtte filer. Den kan downloades på http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) er baseret på den udbredte og open source billedanalyse platform, ImageJ (v1). Java skal være installeret og opdateret på computeren for at bruge CytoSHOW, og opdateringer til CytoSHOW installeres automatisk via Java Web Start. Mange ImageJ-baserede funktioner i CytoSHOW er som beskrevet og illustreret på https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW er blevet tilpasset til at vise flerdimensionelle rå data fra ASI diSPIM, samt anden billedbehandling software, der skaber TIFF-output. I princippet kan andre MultiView SPIM billedsystemer understøttes af mindre ændringer af CytoSHOW, så denne protokol kan udføres på forskellige mikroskop systemer.
SpimFusion blev skrevet i CUDA/C++ med Visual Studio 2013 med CUDA Toolkit v 7.5. Kørsel af SpimFusion kræver specifik computer hardware: et GPU-kort (NVIDIA Graphics Processor Unit) med CUDA-databehandlingskapacitet 1,0 eller højere og mindst 2 GB grafikkorthukommelse. På tidspunktet for offentliggørelsen af vores protokol, SpimFusion er ikke offentliggjort (min Guo og Hari shroff), men findes i software Bundle Arkiv nævnt ovenfor.
En specialbygget kommandolinje drevet version af StarryNite kræver, at den frit tilgængelige MATLAB compiler Runtime er installeret, men kræver ikke en licens til kommerciel MATLAB-software. MATLAB compiler Runtime er inkluderet i software Bundle arkivet nævnt ovenfor. Koden for StarryNite som anvendt i denne protokol er stort set uændret fra den, der anvendes til confokale billeder6. Men, flere operationelle spørgsmål i skabelsen af input billeder til starrynite behandling og håndtering af starrynite resultater er blevet behandlet her ved metoder i cytoshow, der muliggør en kontinuerlig databehandling pipeline for smeltet isotropisk dispim Diskenheder. Disse ændringer er automatiseret af CytoSHOW kode, der håndterer disse præ-og efter behandling trin. CytoSHOW også redigerer en pre-optimeret diSPIM-specifik skabelon StarryNite parameter indstillet til automatisk at tune segmenterings algoritmen til fluorescens intensitet af kerner i de indpakkede data. De unikke parametre, der anvendes af StarryNite på hvert diSPIM datasæt gemmes derefter i en fil sammen med output-billede og line aging data.
En brugerdefineret version af AceTree, der fungerer med 16-bit-billeder og bevarer kompatibiliteten med Java3D-gengivelse, er bedst egnet til denne protokol. Det er også inkluderet i software Bundle Arkiv nævnt ovenfor.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker John Murray for integreret stamme, ujIs113, til at generere lineaging stamme BV514; Brandon Harvey (NIBIB) for at få hjælp til at teste protokollen; Jon Daniels og Gary Rondeau (Applied Scientific Instrumentation) for hjælp med Micro-Manager og diSPIM instrument; og Andrew York og Hank Eden for deres kritiske feedback på diSPIM systemet. Vi takker også forskningscenteret for mindretals institutioner-programmet og Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) for at levere en møde-og brainstorming-platform. Meget af dette arbejde blev udført på marine biologisk laboratorium i Woods Hole gennem Whitman programmet. Dette arbejde blev støttet af de Intramural forskningsprogrammer af NIH National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering og af NIH Grant No. U01-HD075602 og nej. R24-OD016474. Mark W. Moyle blev støttet af F32-NS098616 og Leighton H. Duncan blev støttet af et mangfoldigheds tillæg til R24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |