Hier stellen wir einen kombinatorischen Ansatz vor, bei dem hochauflösende Mikroskopie, Rechenwerkzeuge und Einzellen-Beschriftungen in lebenden C. eleganischen Embryonen verwendet werden, um die Einzelzellendynamik während der Neuroentwicklung zu verstehen.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) sticht als einziger Organismus hervor, in dem die Herausforderung, die zellulären Ursprünge eines gesamten Nervensystems zu verstehen, mit einer einzigen Zellauflösung in vivo beobachtet werden kann. Hier stellen wir ein integriertes Protokoll zur Untersuchung der Neuroentwicklung in C. eleganischen Embryonen vor. Unser Protokoll kombiniert die Bildgebung, die Linienführung und die neuroanatomische Verfolgung einzelner Zellen bei der Entwicklung von Embryonen. Durch den Einsatz der Dual-View-Invertitionslinge-Illuminationsmikroskopie (DiSPIM) erreichen wir eine langfristige, vierdimensionale (4D) Bildgebung lebender C . eleganischer Embryonen mit nahezu isotropher räumlicher Auflösung. Nuklei und neuronale Strukturen in den Nematoden Embryonen werden abgebildet und isotropical verschmolzen, um Bilder mit einer Auflösung von ~ 330 nm in allen drei Dimensionen zu erzeugen. Diese minutenlangen hochauflösenden 4D-Datensätze werden dann analysiert, um definitive zelllineare Identitäten mit Genexpression und morphologischer Dynamik auf einzelligen und subzellulären Detailebenen zu korrelieren. Unser Protokoll ist so strukturiert, dass es eine modulare Umsetzung der einzelnen beschriebenen Schritte ermöglicht und Studien zu Embryogenese, Genexpression oder Neuroentwicklung verbessert werden kann.
C. elegans sticht als einziger Organismus hervor, in dem jede Zelle im Embryo während der gesamten Neuroentwicklung beobachtet werden kann. Mit der gesamten Zelllinie bekannt und invariant1, und mit der Entwicklung neuer Werkzeuge, die die Kennzeichnung und kontinuierliche Abbildung von einzelnen Zellen in Embryonen ermöglichen, können Biologen nun beginnen, verschiedene Schritte in der Entwicklung der Nematoden nervös zu untersuchen System aus allen Blickwinkeln-Zellgeburt; Migration und Differenzierung; NeuritBildung, gezieltes Auswachsen und Faschisierung; Synapsbildung; Und Abstimmung von Funktionskreisen. Die Erfassung der neuronalen Auswuchsdynamik im C. eleganischen Embryo durch die Kombination von stabil ausgedrückten Reportern und Fluoreszenzmikroskopie ist für die wissenschaftliche Gemeinschaft wertvoll.
Die Entwicklungsstudien in C. elegans nutzen oft die invarianten Zellabstammung und die Karten des Zellschicks dieser Art, um das kontextbezogene Verständnis auf der Einzeller-Ebene imintakten Organismus zu erweitern. Die Auto-Line-Age-Analyse-mit der Software StarryNite2,3, 4 und AceTree5,6, 7, 8-profitiertvon hohem Kontrast,hoher Auflösung Bilder von fluoreszierenden Kernen. Um optimal zu arbeiten, hängt StarryNite/AceTree auch von einer vorhersehbaren eingeschränkten Orientierung der abgebildeten Embryonen während der Entwicklung ab. Die konfokale Mikroskopie, die in C. eleganischem Embryonen, die zwischen zwei Coverslips komprimiert werden, durchgeführt wird, ist seit mehr als einem Jahrzehnt die Standardmethode der Autolinesmikroskopie, weil sie sowohl eine hohe kontrast-/hohe Auflösung als auch eine vorhersehbare Beschränkung bietet. Ausrichtung des Embryos7,8. Wir haben zuvor den Bau und die Verwendung eines neuartigen Lichtbogen-Basis, das selektive Flächenbeleuchtungsmikroskop (diSPIM) für die Live-Probenbildgebungwie C. elegans embryogenesis 9, 10 verwendet . , 11 , 12 , 13. Die Lichtbogenmikroskopie bietet in der Regel eine geringe Phototoxizität, hohe Geschwindigkeit und eine langfristige Abbildung von lebenden 3D-Exemplaren14,15. Die DiSPIM-Methode erzeugt insbesondere vierdimensionale (4D) Bilder mit einer nahezu isotropen Raumauflösung von etwa 330 nm9.
Im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie bietet diSPIM eine höhere Signal-zu-Rausch-und-geschwindigkeit, eine isotropere Raumauflösung und eignet sich besser für die langfristige Bildgebung16 . Deshalb haben wir daran gearbeitet, die diSPIM-Daten für die Eingabe in StarryNite/AceTree anzupassen und zu untersuchen, ob dies die Linienanalysen verbessern würde. Eine große Hürde ist, dass DiSPIM-Exemplare nicht einfach durch Auberginen-Kompression eingeschränkt werden können, um erwartete Orientierungen für StarryNiteTree zu übernehmen. Die zufällige Ausrichtung der Zellpositionen in dem analysierten Volumen mindert die Genauigkeit der Auto-Line-Analyse.
Wir haben daher CytoSHOW, eine von den Seiten geführte Benutzeroberfläche, eingesetzt, die es Nutzern ermöglicht, bei der Vorverarbeitung von DiSPIM-Bildern eine präzise 3D-Ausrichtung von Embryonen auszuwählen, die sowohl qualitätsoptimierte als auch kontextbewusste Bilddaten für den Einstieg in StarryNite liefert. /AceTree. Bei der Nutzerauswahl von abgebildeten Embryonen inszeniert CytoSHOW eine automatisierte Datenverarbeitungs-Pipeline. Eingeschreifte und rückensubtrahierte Embryo-Bilder werden in TIFF-Stapeldateien für jede Position, jeden Zeitpunkt und jede Ansicht gespeichert. CytoSHOW ruft dann iterativ das Programm SpimFusion auf, die beiden vorverarbeiteten Ansichten gemeinsam zu registrieren und gemeinsam zu dekonvolvieren, indem er den Richardson-Lucy 17,18Algorithmus verwendet, um isotrope hochauflösende volumetrische Bilder zu liefern. Für StarryNite wurde ein diSPIM-spezifischer Parametersatz optimiert, um sein Verhalten während der Bildsegmentierung und der Nukleus-Tracking in isotropical verschmolzenen Bildern zu steuern. Geschmolzene Bilder und Liniengebnisse werden dann mit AceTree bearbeitet, was es dem Benutzer ermöglicht, Fehler in der von StarryNite generierten Auto-Linie zu erkennen und zu beheben. AceTree kann auch Line-Baum-und 3D-modellierte Renderings von geprägten Kernen im Embryo präsentieren. Wir stellen fest, dass die Geschwindigkeit und Genauigkeit der automatischen Linie durch isotropical verschmolzene Bilder deutlich verbessert wird, im Vergleich zu Rohbildern der beiden SPIM-Kameras. Unser Protokoll, das für die hier beschriebene C . elegans-Anwendung optimiert wurde, könnte in der Regel für die automatische Abfertigung von DiSPIM-Daten, die für andere Arten oder Proben produziert werden, angepasst werden. Wenn es sich um die beabsichtigte Verwendung des Protokolls handelt, beachten Sie bitte, dass für neue Exemplare eine zusätzliche Abstimmung der StarryNite-Parameter erforderlich ist, wie beschrieben3,4.
Die erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls führt zu Bildern mit 4D-isotropen Auflösung und ermöglicht Biologen, Zelllinien zu verfolgen und gleichzeitig Neuronen im sich entwickelnden C. eleganischen Embryo zu identifizieren und zu analysieren. Darüber hinaus können wir durch die Verschmelzung mehrerer nachverarbeiteter Algorithmen-wobei die Hardwarebeschleunigung die zeitaufwändigste dieser Algorithmen ist-nun sowohl feine subzelluläre Details als auch die Zelllinien und Zellverschlüsse lebender Embryonen in einer im Wesentlichen realen Zeit analysieren. Dieses neue Protokoll ermöglicht eine präzise, informierte Manipulation und Beobachtung des Zellverhaltens während der probativen Studien der Differenzierung und Morphogenese in vivo. In diesem Manuskript stellen wir eine detaillierte Erklärung der verbesserten Protokolle vor, die wir für die Linienführung und die Zellverfolgung in der Entwicklung von C. eleganischem Embryonen entwickelt haben, um Studien zur Embryogenese, Genexpression oder Neuroentwicklung zu verbessern.
C. elegans sticht als der einzige Organismus mit den letzten Positionen und der Konnektivität jedes erwachsenenNeuronsbekannt 27. Die Entwicklungsdynamik, die zur Organisation der Arbeitskreise und Netzwerke führt, aus denen sich die C. elegans connectome zusammensetzt, ist jedoch unbekannt. Basierend auf den Chancen, die sich aus den Fortschritten in der Lichtmikroskopie ergeben, können wir nun Zellpositionen, Morphogenese und Neurogenese in der gesamten Embryonalentwicklung von C. elegans erfassen und analysieren.
Die Prozedur, die wir beschrieben haben und die wir routinemäßig im Labor verwenden, liefert 4D-isotrope Bilder von beschrifteten Neuronen und Kernen für die Zelllineare in C. eleganischem Embryonen. Noch wichtiger ist, dass wir mit den DiSPIM und den gekoppelten semi-automatischen Linienbildungsfunktionen langfristige Bildgebungsbedingungen optimiert haben, um die Geschwindigkeit und Präzision der Analyse von C. elegans Embryogenese zu verbessern. Dieses integrierte Protokoll wird es den Nutzern ermöglichen, Zellen zu visualisieren und zu identifizieren und dreidimensionale Merkmale wie Neuriten-Migration und Axonfaschisierung durch den Beginn des frühen Twitching zu quantitieren. Dieses Verfahren lässt sich mit einem ASI-DiSPIM-System problemlos in jede Anlage integrieren, und wir empfehlen dieses System speziell für dieses Protokoll. Andere SPIM-Formulierungen, die kommerziell angeboten werden, können sich von der ASI-Konfiguration in der Probenkammer und den optischen Eigenschaften unterscheiden. Daten, die von anderen Plattformen exportiert werden, können aber auch über unsere Datenpipeline übertragen werden. Daher ist eine Bewertung ihres Wertes in der Linienführung, einem anspruchsvollen Test der Bildqualität und der Stabilität des Instruments, machbar. Auch wenn wir die DiSPIM aktiv nutzen, um regelmäßig andere Exemplare (wie Drosophila und Zebrafisch-Embryonen) abzubilden, ist die beschriebene und umfassende lineätische Analyse von Embryonen derzeit noch auf die Nematoden-Arten beschränkt. Bei größeren oder dicken Proben entscheiden wir uns für die Verwendung von Bühnenscannern, die die Proben durch ein stationäres Lichtblech scannen. Kumar et al. haben zuvor diese verbesserte DiSPIM-Sparung demonstriert, um qualitativ hochwertige Bilder aus dicken Proben ohne zusätzliche Änderungen an der DiSPIM10zu erzeugen.
Zu den kritischen Schritten innerhalb des Protokolls gehören die Montage von C. elegans Embryonen an der poly-Lysin-lysin-beschichteten Coverslip, Datenerfassung und Datenverarbeitung. Die Ernte und Montage von C. eleganischem Embryonen an den Glaskappe kann für unerfahrene Anwender eine Herausforderung sein, aber hier stellen wir ein detailliertes Protokoll der wichtigsten Schritte zur Verfügung, um das Lernen zu erleichtern. Wenn eine langfristige Bildgebung gewünscht ist, erhalten wir die besten Ergebnisse bei der Ernte von Vierzellen oder früheren Embryonenvon 8-10 jungen Erwachsenen 28. Es ist zu beachten, dass ältere Erwachsene weniger wünschenswert sind, Embryonen im Frühstadium zu ernten, da sie dazu neigen, ältere Embryonen in der Gebärmutter und unbefruchtete Eizellen zu enthalten. Bei der Montage von Embryonen können Probleme wie die Blockade des montierten Aspirators (Mundpipette) oder eine zu große Öffnung in der Mikrokapillarpipette eine korrekte Montage und Orientierung der Embryonen verhindern. Um sich auf eine optimale Bildgebung vorzubereiten, führen wir Vorbeschaffungstests an frühen und späten Pre-twittifenden Embryonen durch, um die Leistung der Lichtblätter, Kameras, Ziele und Autofokus zu überprüfen. Wir erzielen beste Ergebnisse, wenn alle diese Operationen getestet werden und liefern qualitativ hochwertige Bilder während unserer Vorbeschaffungstests. Dies ist vor allem für die Erzeugung von Bildern mit isotropher Raumauflösung von Bedeutung, für die Rohbilder, die aus beiden Blickwinkeln (Ziele) aufgenommen wurden, von hoher Qualität sein müssen. Nach der Akquisition werden die für jede Ansicht erworbenen Volumina zu isotropen Bildern verarbeitet. Es ist wichtig, eine entsprechende Grafikverarbeitungseinheit (GPU) zu verwenden, wie in diesem Protokoll beschrieben (siehe unten). Dadurch wird die Verarbeitungsgeschwindigkeit verbessert, mit der die isotropical verschmolzenen Bilder erzeugt werden, was die Zeit für Datenanalysen verkürzt. Es ist auch zwingend erforderlich, dass die Benutzer die neueste Version von CytoSHOW verwenden und die mit unserem Download-Bundle für StarryNite Auto-Linaging zur Verfügung gestellten Parameter verwenden. Wenn Nutzer daran interessiert sind, die automatische Linie für andere Proben (z.B. Zebrafische, Drosophila etc.) zu verwenden, ist eine zusätzliche Optimierung der in StarryNite verwendeten Parameter erforderlich (siehe Referenzen3,4).
Obwohl unser integriertes Protokoll Bilder und Linienresultate im Pre-twitching-Embryo liefert, sollten sich die Nutzer darüber im Klaren sein, dass eine automatisierte Linienführung im Post-twittiching-Embryo derzeit nicht machbar ist: Die nuklearen Positionen ändern sich in der Reihenfolge der Sekunden in der Nachzwitschern Embryo, zu schnell, um Abstammung zu ermöglichen. In der Tat hat die DiSPIM in der Tateinevielversprechende Fähigkeit gezeigt, neuroentwicklungsbedingte Ereignisse zu erfassen und einige Zellpositionen in den nachtwitternden Stadien der Embryogenese 23,29zu verfolgen. Wenn Nutzer daran interessiert sind, den nachtwitternden Embryo zu untersuchen, bietet das diSPIM die Geschwindigkeit an, um volumetrische Schnappschüsse zu erhalten und feine neuroentwicklungsbedingte Ereignisse, wie Neuriten-Auswuchs, in schnell bewegten Embryonen zu verfolgen.
Dieses Protokoll wird für die Zell-by-Zell-Fertigstellung des WormGUIDES Atlas 30 grundlegend sein,da es einen integrierten Ansatz mit hochauflösenden isotropen Bildern bieten wird, um 3D-Morphologien von beschrifteten Neuronen zu identifizieren und zu erfassen. Die ersten 430 Minuten der Embryogenese. Der Prototyp WormGUIDES Atlas liefert derzeit nukleare Positionen von Zellen im sich entwickelnden Embryo und zielt darauf ab, die Entwicklungsdynamik einer Teilmenge von embryonalen Neuronen zu erfassen. Dieses Protokoll wird ein Schlüssel für die Integration von zusätzlichen sich entwickelnden Neuronen in den WormGUIDES Atlas30 sein.
Unser integriertes Protokoll wird auch die Erforschung neuer Genexpressionsprofile im C. eleganischen Embryo vereinfachen. In transgenen C. elegans steuernviele zellspezifische Promoter räumlich und zeitlich die Transgenexpression. Während die Expressionsmuster der meisten Gene beim erwachsenenTier 31,32, 33,34ausgiebig charakterisiert wurden, müssen in der Entwicklung fast alle noch charakterisiert werden (insbesondere Spätstadium) Embryo. Das Promoterom C. elegans war eine nützliche Ressource für die Wurmgemeinschaft, um die zellspezifische Transgene-Expression zu fördern und festzustellen, ob die G-Funktion zellautonom oder nicht autonom ist. Die Erfassung isotropes hochauflösender und dynamischer Expressionsmuster von Genen und die präzise Identifizierung von Expressionsgegenständen über Linaging wird für viele in der wissenschaftlichen Gemeinschaft wertvoll sein.
Die Embryogenese besteht aus zwei miteinander verknüpften Hauptprozessen, der zellulären Differenzierung und der Gewebemorphogenese. Über die Mechanismen und Moleküle, die bei der Entwicklung von C. elegansverschiedene Zelltypen definieren, ist viel bekannt. Über die Mechanismen, die für die Zellmigration, die Zellhaftung und die Zellform im C. eleganischem Embryo wichtig sind, ist jedoch wenig bekannt. Mit der invarianten Zelllinie C . elegans können wir mit unserem Protokoll die katalogisierte 3D-Mikroanatomie des Embryos während der Morphogenese auf neuen Detailebenen erkennen: z.B. Axonfaschisierung, Synaptogenese und neuronale Aktivität. Ardiel et al. haben zuvor die Macht des DiSPIM demonstriert, Kalziumvergängiger auf der Ebene eines einzelnen Neurons in C. elegans Embryonen23 zu erfassen. Viele andere Aspekte der Entwicklungsphysiologie sind mit diesen Methoden reif für die Untersuchung.
Schließlich ist dieses Protokoll weitgehend automatisiert und reduziert systematisch die Zeit, die es braucht, um Dekonvolution-Bilder zu erzeugen und Zell-Linienführung über StarryNite und Acetree durchzuführen. Die in diesem Protokoll verwendeten Softwarestrategien können auf viele Fragen der Biologie angewendet werden, die weit von den ganz spezifischen Bereichen entfernt sind, in denen wir sie hier demonstriert haben.
Details zur Software-Kompatibilität und zum Download-Zugang
Informationen zu Micro-Manager und Plugins für die DiSPIM-Bildgebung gibt es bei http://dispim.org/software/micro-manager und https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
Die Datenverarbeitungs-Pipeline benötigt derzeit ein Windows-Betriebssystem. Wir haben eine einzelne Archivdatei gebündelt, um die Installation aller erforderlichen Datenverarbeitungsprogramme und Support-Dateien zu vereinfachen. Sie steht zum Download auf http://dispimlineage.wormguides.org zur Verfügung.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) basiert auf der weit verbreiteten und Open-Source-Bildanalyseplattform ImageJ (v1). Java muss auf dem Computer installiert und auf dem neuesten Stand sein, um CytoSHOW zu verwenden, und Updates zu CytoSHOW werden automatisch über Java Web Start eingesetzt. Viele ImageJ-basierte Funktionen von CytoSHOW sind wie beschrieben und auf https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html illustriert. CytoSHOW wurde angepasst, um mehrdimensionale Rohdaten des ASI diSPIM sowie anderer Bildbearbeitungssoftware anzuzeigen, die TIFF-Ausgabe erzeugt. Im Prinzip könnten andere SPIM-Bildgebungssysteme mit mehreren Ansichten durch kleinere Modifikationen von CytoSHOW unterstützt werden, um dieses Protokoll auf verschiedenen Mikroskopsystemen durchführen zu können.
SpimFusion wurde in CUDA/C + + mit Visual Studio 2013 mit CUDA Toolkit v7.5 geschrieben. Das Laufen von SpimFusion erfordert eine spezielle Computer-Hardware: Eine NVIDIA-Grafikverarbeitungseinheit (GPU) mit CUDA-Komputationsfähigkeit 1,0 oder höher und mindestens 2 GB Grafikkarten-Speicher. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung unseres Protokolls ist SpimFusion unveröffentlicht (Min Guo und Hari Shroff), aber im oben genannten Software-Bündel-Archiv verfügbar.
Eine speziell gebaute Kommandozeilenversion von StarryNite verlangt, dass der frei verfügbare MATLAB Compiler Runtime installiert ist, aber keine Lizenz für kommerzielle MATLAB-Software benötigt. Der MATLAB Compiler Runtime ist im oben genannten Software-Bundle-Archiv enthalten. Der Code für StarryNite, wie er in diesem Protokoll verwendet wird, ist im Wesentlichen unverändert als der für konfokaleBilder 6. Allerdings wurden hier mehrere operative Fragen bei der Erstellung von Eingangsbildern für die StarryNite-Verarbeitung und dem Umgang mit StarryNit-Ergebnissen mit Methoden in CytoSHOW befasst, die eine kontinuierliche Datenverarbeitungs-Pipeline für verschmolzene isotrope diSPIM ermöglichen. Volumes. Diese Änderungen werden durch den CytoSHOW-Code automatisiert, der diese Vor-und Nachbearbeitungsschritte bearbeitet. CytoSHOW editiert auch eine voroptimierte diSPIM-spezifische Vorlage StarryNite Parameter gesetzt, um automatisch den Segmentierungsalgorithmus auf die Fluoreszenz-Intensität von Kernen in den abgebauten Daten zu stimmen. Die einzigartigen Parameter, die StarryNite auf jedem DiSPIM-Datensatz verwendet, werden dann zusammen mit dem Ausgabebild und den Liniendaten in einer Datei gespeichert.
Eine benutzerdefinierte Version von AceTree, die mit 16-Bit-Bildern arbeitet und die Kompatibilität mit dem Joom3D-Rendering beibehält, ist für dieses Protokoll am besten geeignet. Es ist auch in dem oben genannten Software-Paketarchiv enthalten.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken John Murray für die integrierte Sorte, ujIs113, für die Erzeugung von Linienstrakt BV514; Brandon Harvey (NIBIB) für die Hilfe beim Testen des Protokolls; Jon Daniels und Gary Rondeau (Angewandte wissenschaftliche Instrumente) für die Unterstützung von Micro-Manager und DiSPIM-Instrument; Und Andrew York und Hank Eden für ihr kritisches Feedback zum DiSPIM-System. Wir danken auch dem Forschungszentrum für Minderheitseinrichtungen und dem Instituto de Neurobiología Jose del Castillo (Universidad de Puerto Rico) für die Bereitstellung einer Tagungs-und Brainstorming-Plattform. Ein großer Teil dieser Arbeit wurde im Rahmen des Whitman Programms am Marine Biological Laboratory in Woods Hole durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die intramuralen Forschungsprogramme des NIH-Nationalen Instituts für Biomedizinische Bildgebung und Bioengineering und durch das NIH-Stipendium Nr. U01-HD075602 und Nr. R24-OD016474. Mark W. Moyle wurde von F32-NS098616 und Leighton H. Duncan unterstützt von einem Diversity Supplement to R24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |