Aquí, presentamos un enfoque combinatorio usando microscopía de alta resolución, herramientas computacionales y etiquetado de una sola célula en los embriones vivos de C. elegans para entender la dinámica de una sola célula durante el neurodesarrollo.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) se destaca como el único organismo en el que se puede observar el reto de entender los orígenes celulares de todo un sistema nervioso, con una resolución de célula única, in vivo. Aquí presentamos un protocolo integrado para el examen del neurodesarrollo en embriones C. elegans . Nuestro protocolo combina imágenes, lineaje y rastreo neuroanatómico de células individuales en el desarrollo de embriones. Logramos imágenes a largo plazo, de cuatro dimensiones (4D) de embriones vivos C. elegans con resolución espacial casi isotrópica mediante el uso de microscopía de iluminación de plano selectivo invertido de doble vista (dispim). Los núcleos y las estructuras neuronales de los embriones de nematodos son imágenes e isotrógicamente fusionados para producir imágenes con una resolución de ~ 330 nm en las tres dimensiones. A continuación, se analizan estos conjuntos de datos minuto a minuto de alta resolución 4D para correlacionar las identidades definitivas de linaje celular con la expresión génica y la dinámica morfológica en niveles de detalle de célula única y subcelular. Nuestro protocolo está estructurado para permitir la implementación modular de cada uno de los pasos descritos y mejorar los estudios sobre la embriogénesis, la expresión génica o el neurodesarrollo.
C. elegans se destaca como el único organismo en el que cada célula en el embrión se puede observar a través del neurodesarrollo. Con todo el linaje celular conocido e invariable1, y con el desarrollo de nuevas herramientas que permiten el etiquetado y la imagen continua de células individuales en embriones, los biólogos pueden ahora comenzar a examinar diferentes pasos en el desarrollo de los nematodos nerviosos sistema de todos los ángulos-nacimiento de la célula; migración y diferenciación; formación de neurita, afloramiento y fasciculación dirigidos; formación de sinapsis; y la sintonización de circuitos funcionales. La captura de dinámicas de crecimiento neuronal en el embrión de C. elegans , mediante la combinación de periodistas expresablemente expresados y microscopía de fluorescencia, es valiosa para la comunidad científica.
Los estudios de desarrollo en C. elegans a menudo aprovechan los mapas invariantes de linaje celular y destino celular de esta especie para aumentar la comprensión contextual a nivel de célula única dentro del organismo intacto1. Análisis de lineaje automático-uso del software starrynite2,3,4 y acetree5,6,7,8 -beneficios de alto contraste, alta resolución imágenes de núcleos fluorescentes. Para trabajar de manera óptima, starrynite/acetree también depende de la orientación predecible y restringida de los embriones imágenes durante el desarrollo. La microscopía confocal, realizada en embriones C. elegans comprimidos entre dos cubreobjetos, ha sido el método de microscopía de lineaje automático estándar durante más de una década porque proporciona tanto contraste alto/alta resolución como un predecible orientación del embrión7,8. Anteriormente Describimos la construcción y el uso de un nuevo microscopio de iluminación de plano selectivo invertido de doble visión (dispim) basado en hojas ligeras para imágenes de muestras en vivo como la embriogénesis de C. elegans de9,10 , 11 , 12 , 13. la microscopía de láminas ligeras, en general, proporciona una fototoxicidad baja, alta velocidad y imágenes a largo plazo de especímenes 3D en vivo14,15. El método diSPIM, específicamente, produce imágenes de cuatro dimensiones (4D) con una resolución espacial casi isotrópica de aproximadamente 330 nm9.
En comparación con la microscopía confocal, diSPIM ofrece una mayor señal a ruido y velocidad, una resolución espacial más isotrópica y es más adecuada para imágenes in vivo de largo plazo16. Por lo tanto, trabajamos para adaptar los datos de diSPIM para su entrada en StarryNite/AceTree e investigamos si esto mejoraría los análisis de lineaje. Un obstáculo importante es que los especímenes de diSPIM no pueden ser fácilmente restringidos por la compresión de cáscara de huevo para adoptar las orientaciones esperadas para StarryNite/AceTree. La orientación aleatoria de las posiciones de celda en el volumen que se está analizando degrada la precisión del análisis de lineaje automático.
Por lo tanto, empleamos CytoSHOW, una interfaz de usuario guiada por el espectador que permite a los usuarios seleccionar la orientación 3D precisa de los embriones durante el preprocesamiento de imágenes de diSPIM, produciendo datos de imagen que están optimizados para la calidad y en el contexto para la entrada en StarryNite /AceTree. Tras la selección de los embriones con imagen, CytoSHOW orquesta una canalización automatizada de procesamiento de datos. Las imágenes de embriones recortadas y en segundo plano se guardan en archivos de pila TIFF para cada posición, punto de tiempo y vista. Cytoshow entonces iterativamente llama al programa spimfusion para co-registrarse y deconvolve conjuntamente las dos vistas pre-procesadas, utilizando el algoritmo Richardson-Lucy17,18 para producir imágenes volumétricas isotrópicas de alta resolución. Se ha optimizado un conjunto de parámetros específicos de diSPIM para que StarryNite gobierne su comportamiento durante la segmentación de imágenes y el seguimiento de núcleos en imagen fusionada isotrógicamente. Las imágenes fusionadas y los resultados de lineaging se editan con AceTree, lo que permite a los usuarios identificar y corregir cualquier error en la traza de linaje automático generada por StarryNite. El AceTree también puede presentar representaciones modeladas en árbol de linaje y modelado 3D de núcleos rastreados en el embrión. Encontramos que la velocidad y la precisión de los lineados automáticos se mejoran notablemente utilizando imágenes fusionadas isotrógicamente, en comparación con las imágenes RAW de cualquiera de las cámaras SPIM. Nuestro protocolo, aunque optimizado para la aplicación C. elegans descrita aquí, podría ser adaptado generalmente para el lineamiento automático de los datos de dispim producidos para otras especies o especímenes. Si este es el uso previsto del Protocolo, tenga en cuenta que es probable que el ajuste adicional de los parámetros de starrynite sea necesario para los nuevos especímenes, como se describe en3,4.
La implementación exitosa de este protocolo da como resultado imágenes con resolución 4D-isotrópica y permite a los biólogos rastrear linajes celulares, mientras que simultáneamente identifican y analizan neuronas en el desarrollo de embriones C. elegans . Por otra parte, mediante la fusión de varios algoritmos de post-procesamiento-con la aceleración de hardware es el más lento de estos-ahora podemos analizar tanto los detalles subcelulares finos y los linajes celulares y las células-Fates de embriones vivos en tiempo esencialmente real. Este nuevo protocolo permite la manipulación precisa, informada y la observación del comportamiento de las células durante los estudios probativos de diferenciación y morfogénesis in vivo. En este manuscrito, presentamos una explicación detallada de los protocolos mejorados que hemos desarrollado para el lineaje y el rastreo celular en el desarrollo de embriones C. elegans , para mejorar los estudios de embriogénesis, expresión génica o neurodesarrollo.
C. elegans se destaca como el único organismo con las posiciones finales y la conectividad de cada neurona adulta conocida27. Sin embargo, las dinámicas de desarrollo que conducen a la organización de los circuitos de trabajo y las redes que componen el connectome C. elegans permanecen desconocidas. Basándonos en las oportunidades que surgen de los avances en la microscopía de luz, ahora podemos capturar y analizar las posiciones celulares, la morfogénesis y la neurogénesis a lo largo del desarrollo embrionario de C. elegans .
El procedimiento que hemos descrito y que rutinariamente utilizamos en el laboratorio produce imágenes 4D-isotrópicas de neuronas etiquetadas y núcleos para el lineaje celular en embriones C. elegans . Lo que es más importante, hemos optimizado las condiciones de imagen a largo plazo con el diSPIM y las capacidades de lineado semi-automatizadas acopladas con imágenes de alta resolución para mejorar la velocidad y la precisión del análisis de la embriogénesis C. elegans . Este protocolo integrado permitirá a los usuarios visualizar e identificar las células y cuantificar las características tridimensionales, tales como la migración de la neurita y la fasciculación del axón a través del inicio de las contracciones tempranas. Este procedimiento se puede adaptar fácilmente a cualquier instalación con un sistema ASI diSPIM, y recomendamos este sistema específicamente para este protocolo. Otras formulaciones de SPIM ofrecidas comercialmente pueden diferir de la configuración de ASI en la cámara de muestreo y propiedades ópticas. Sin embargo, los datos exportados desde otras plataformas también se pueden poner a través de nuestra canalización de datos. Por lo tanto, es factible la evaluación de su valor en lineaging, una prueba exigente de calidad de imagen y estabilidad del instrumento. A pesar de que utilizamos activamente el diSPIM para la imagen periódica de otros especímenes (como los embriones de Drosophila y cebra), el análisis de lineaje descrito y exhaustivo de los embriones todavía se limita actualmente a las especies de nematodo. Para muestras más grandes o gruesas, optamos por utilizar enfoques de escaneo de etapa, que escanean las muestras a través de una lámina de luz estacionaria. Kumar et al. han demostrado previamente esta sección mejorada de diSPIM para producir imágenes de alta calidad de muestras gruesas sin modificaciones adicionales al diSPIM10.
Los pasos críticos dentro del protocolo incluyen el montaje de embriones C. elegans en el recubrimiento recubierto de poli-L-lisina, adquisición de datos y procesamiento de datos. La cosecha y el montaje de embriones C. elegans en el recubrimiento de vidrio puede ser difícil para los usuarios inexpertos, pero aquí proporcionamos un protocolo detallado de los pasos clave para facilitar el aprendizaje. Si se desea una toma de imágenes a largo plazo, obtenemos mejores resultados cosechando embriones de cuatro células o anteriores de 8-10 adultos jóvenes28. Tenga en cuenta que los adultos mayores son menos deseables para cosechar embriones de etapa temprana porque tienden a contener embriones más viejos en el útero y óvulos no fertilizados. En lo que respecta a los embriones de montaje, los problemas como el bloqueo en el aspirador montado (Piera bucal) o una abertura demasiado grande en la picada microcapilar pueden impedir el montaje y la orientación adecuados de los embriones. Para prepararse para obtener imágenes óptimas, realizamos pruebas previas a la adquisición en embriones pre-twitching tempranos y tardíos para comprobar el rendimiento de las láminas de luz, las cámaras, los objetivos y el enfoque automático. Obtenemos mejores resultados cuando todas estas operaciones se prueban y producen imágenes de alta calidad durante nuestras pruebas previas a la adquisición. Esto es especialmente relevante para generar imágenes con resolución espacial isotrópica, para las cuales las imágenes RAW adquiridas a partir de ambas vistas (objetivos) deben ser de alta calidad. Después de la adquisición, los volúmenes adquiridos para cada vista se procesan para producir imágenes isotrópicas. Es importante utilizar una tarjeta de unidad de procesamiento de gráficos (GPU) adecuada como se describe en este protocolo (ver más abajo). Esto mejora la velocidad de procesamiento a la que se generan las imágenes fusionadas isotrógicamente, acortando el tiempo a los análisis de datos. También es imperativo que los usuarios están ejecutando la última versión de CytoSHOW y están utilizando los parámetros proporcionados con nuestro paquete de descarga para StarryNite auto-lineaging. Si los usuarios están interesados en utilizar el lineamiento automático para otras muestras (p. ej., zebrafish, Drosophila, etc.), se requerirá una optimización adicional de los parámetros utilizados en starrynite (ver referencias3,4).
Aunque nuestro protocolo integrado proporciona imágenes y resultados de lineaje en el embrión pre-twitching, los usuarios deben ser conscientes de que el lineaje automatizado en el embrión post-twitching no es actualmente factible: las posiciones nucleares cambian en el orden de los segundos en el embrión post-twitching, demasiado rápido para permitir el rastreo de linaje. Sin embargo, el dispim ha demostrado de hecho una capacidad prometedora para capturar eventos de Neurodesarrollo y rastrear algunas posiciones celulares en las etapas post-twitching de la embriogénesis23,29. Si los usuarios están interesados en examinar el embrión post-twitching, el diSPIM proporciona la velocidad para obtener instantáneas volumétricas y realizar un seguimiento de los eventos de Neurodesarrollo finos, como el crecimiento de la neurita, en embriones que se mueven rápidamente.
Este Protocolo será fundamental para la terminación celda por célula del Atlas de WormGUIDES30, ya que proporcionará un enfoque integrado con imágenes isotrópicas de alta resolución para identificar y capturar morfologías 3D de neuronas etiquetadas durante los primeros 430 minutos de embriogénesis. Tal y como está, el prototipo del Atlas WormGUIDES proporciona posiciones nucleares de las células en el embrión en desarrollo y tiene como objetivo capturar la dinámica de desarrollo de un subconjunto de neuronas embrionarias. Este Protocolo será una clave para la integración de las neuronas en desarrollo adicionales en el Atlas30de wormguides.
Nuestro protocolo integrado también simplificará la exploración de nuevos perfiles de expresión génica en el embrión de C. elegans . En C. eleganstransgénicos, muchos promotores específicos de células controlan espacialmente y temporariamente la expresión transgénica. Mientras que los patrones de expresión de la mayoría de los genes se han caracterizado extensivamente en el animal adulto31,32,33,34, casi todos todavía tienen que ser caracterizados en el desarrollo (especialmente embrión en etapa tardía). El C. elegans promoterome ha sido un recurso útil para la comunidad de gusanos para impulsar la expresión transgénica específica de la célula, así como para determinar si la función génica es autónoma de células o no autónoma. La captura de los patrones de expresión dinámica y de alta resolución isotrópica de los genes, e identificar con precisión las células que expresan a través del lineaje será valiosa para muchos en la comunidad científica.
La embriogénesis comprende dos procesos principales entrelazados, la diferenciación celular y la morfogénesis de los tejidos. Se sabe mucho sobre los mecanismos y moléculas que definen distintos tipos de células durante el desarrollo de C. elegans. Sin embargo, se sabe poco sobre los mecanismos importantes para la migración celular, la adherencia celular y la forma celular en el embrión de C. elegans . Con el linaje de células invariantes de C. elegans conocido, nuestro protocolo nos permite discernir fácilmente la microanatomía 3D catalogada del embrión durante la morfogénesis a nuevos niveles de detalle: p. ej., fasciculación Axon, sinaptogénesis y actividad neuronal. Ardiel et al. han demostrado previamente el poder del diSPIM para capturar los transitorios de calcio a nivel de una sola neuronas en los embriones23de C. elegans . Muchos otros aspectos de la fisiología del desarrollo están maduros para la investigación por estos métodos.
Por último, este protocolo está en gran medida automatizado y reduce sistemáticamente el tiempo que se tarda en generar imágenes de deconvolución y realizar lineaje celular a través de StarryNite y Acetree. Las estrategias de software utilizadas en este protocolo se pueden aplicar a muchas cuestiones de la biología lejos de los campos muy específicos en los que los hemos demostrado aquí.
Detalles sobre compatibilidad de software y acceso de descarga
La información sobre micro-Manager y plugins para imágenes de diSPIM están disponibles en http://dispim.org/software/micro-manager y https://micro-manager.org/wiki/ASIdiSPIM_Plugin.
La canalización de procesamiento de datos requiere actualmente un sistema operativo Windows. Hemos incluido un único archivo de almacenamiento para simplificar la instalación de todos los programas de procesamiento de datos y archivos de soporte necesarios. Está disponible para su descarga en http://dispimlineage.wormguides.org.
CytoSHOW (http://run.cytoshow.org/) se basa en la plataforma de análisis de imágenes de código abierto y ampliamente utilizada, ImageJ (V1). Java debe estar instalado y actualizado en el equipo para utilizar CytoSHOW, y las actualizaciones de CytoSHOW se implementan automáticamente a través de Java Web Start. Muchas funciones basadas en ImageJ de CytoSHOW son como se describe e ilustra en https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.html. CytoSHOW se ha personalizado para Mostrar datos sin procesar multidimensionales de la ASI diSPIM, así como otro software de imágenes que crea salida TIFF. En principio, otros sistemas de imagen SPIM multivista podrían ser apoyados por pequeñas modificaciones de CytoSHOW para permitir que este protocolo se lleve a cabo en diferentes sistemas de microscopio.
SpimFusion se escribió en CUDA/C++ con Visual Studio 2013 con el kit de herramientas CUDA v 7.5. La ejecución de SpimFusion requiere hardware informático específico: una tarjeta de unidad de procesamiento de gráficos NVIDIA (GPU) con capacidad de cómputo CUDA 1,0 o superior y un mínimo de 2 GB de memoria de tarjeta gráfica. En el momento de la publicación de nuestro protocolo, SpimFusion está inédito (min Guo y Hari Shroff), pero está disponible en el archivo de paquete de software mencionado anteriormente.
Una versión de StarryNite basada en la línea de comandos especialmente diseñada requiere que MATLAB Compiler Runtime esté disponible de forma gratuita, pero no requiere una licencia para el software de MATLAB comercial. MATLAB Compiler Runtime se incluye en el archivo de paquete de software mencionado anteriormente. El código para StarryNite, tal como se utiliza en este protocolo, es esencialmente igual al utilizado para las imágenes confocales6. Sin embargo, varios aspectos operacionales en la creación de imágenes de entrada para el procesamiento de StarryNite y el manejo de los resultados de StarryNite han sido abordados aquí por métodos en CytoSHOW que permiten una canalización de procesamiento de datos continua para el isótropo diSPIM fusionado Volúmenes. Estos cambios se automatizan mediante el código CytoSHOW que gestiona estos pasos previos y posteriores al procesamiento. Cytoshow también edita una plantilla preoptimizada para dispim específica del parámetro starrynite configurada para ajustar automáticamente el algoritmo de segmentación a la intensidad de fluorescencia de los núcleos en los datos imágenes. Los parámetros únicos utilizados por StarryNite en cada conjunto de datos diSPIM se guardan en un archivo junto con la imagen de salida y los datos de lineaje.
Una versión personalizada de AceTree que funciona con imágenes de 16 bits y mantiene la compatibilidad con la representación de Java3D es la más adecuada para este protocolo. También se incluye en el archivo de paquete de software mencionado anteriormente.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a John Murray por la cepa integrada, ujIs113, para generar la cepa lineaging BV514; Brandon Harvey (NIBIB) para obtener ayuda para probar el protocolo; Jon Daniels y Gary Rondeau (instrumental científico aplicado) para asistencia con el instrumento micro-Manager y diSPIM; y Andrew York y Hank Eden por sus comentarios críticos sobre el sistema diSPIM. También agradecemos al programa del centro de investigación para instituciones minoritarias y al Instituto de Neurobiología Jose del castillo (Universidad de Puerto Rico) por proporcionar una plataforma de reunión y lluvia de ideas. Gran parte de este trabajo se llevó a cabo en el laboratorio biológico marino en Woods Hole a través del programa Whitman. Este trabajo fue apoyado por los programas de investigación intramuros del Instituto Nacional NIH de imágenes biomédicas y Bioingenierías y por el NIH Grant no. U01-HD075602 y no. R24-OD016474. Mark W. Moyle fue apoyado por F32-NS098616 y Leighton H. Duncan fue apoyado por un suplemento de diversidad a R24-OD016474.
Steps 1-4 | |||
Concavity slides | ThermoFisher Scientific | 1519006 | 5-18mm diameter, 0.6-0.8mm deep, 1.2-1.5mm |
Dissecting microscope with 10×–50× zoom range | Motic | SMZ-171 | |
E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Glass coverslips, no. 1.5, 24 × 50 mm | VWR International | 48393-241 | |
M9 Buffer | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | H7509-25G | |
Microcapillary pipette aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
Microcapillary pipettes, 0.4-mm i.d | Drummond Scientific | 1-000-800 | |
Needle, no. 18G x 1 ½ (1.2mm x 40mm) | BD Precision Glide | 305196 | |
NGM plates | prepared as described by Brenner (1974) | ||
O-ring for imaging chamber | O-Rings West | M1.5X40 | |
Pasteur pipette | Corning/Sigma-Aldrich | CLS7095D5X | |
Platinum wire, 0.5-mm diameter | Sigma-Aldrich | 267201 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
Stainless steel rectangular chamber (76.0 mm x 50.5 mm) | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | I2450 | |
Worm Eyelash Pick | Hart, A. C. Behavior. WormBook. (2006). | ||
Worm Pick | Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1, (2006). | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 5-6 | |||
488 nm long-pass filter | Semrock | LP02-488 RU-2 | |
561-nm notch filter | Semrock | NF03-561E-25 | |
BLP02-561R-25, quantity 2 | Semrock | 561 nm EdgeBasic best-value long-pass edge filter | |
Control software for bottom camera | Jenoptik | ProgRes CapturePro | |
diSIPM assembly video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/TAgbr6IrTqw ; http://www.asiimaging.com | |
diSPIM alignment video | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | https://youtu.be/qnOrg30NNuE | |
diSPIM imaging PC | Intel | Intel Xeon CPU E5-2630 2.6GHz, 12 cores in total, 64 GB memory, Windows 7 | |
FF01-525/45-25, quantity 2 | Semrock | 525/45 nm BrightLine single-band bandpass filter | |
FF555-DI03-25X36, quantity 2 | Semrock | 555 nm edge BrightLine single-edge dichroic beamsplitter | |
Imaging PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Kumar et al diSPIM Setup | Applied Scientifics Instrumentations (ASI) | Instrument setup for this protocol is identical to Kumar et al 10,11 diSPIM, which makes use of 40x 0.8NA water immersion lenses for imaging. (See steps 5.1 and note) | |
Micro Manager | Micro-Manager | https://micro-manager.org/ | |
Modifications to Kumar et al diSPIM Setup (see below) | |||
Optical table with isolators, 4 feet × 6 feet × 12 inches | TMC | 784-651-02DR and 14-416-34 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Steps 7-10 | |||
Analysis PC | Intel | Intel Core i7-8700K CPU 3.70GHz, 6 cores in total, 64 GB memory, Windows 10 | |
Analysis PC Graphics Card | NVIDIDA | NVIDIA GeForce GTX 1080 Ti graphics cards | |
Installation instructions | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org/diSPIMlineaging_InstallationInstructions.htm | |
Software bundle | Software bundle | http://dispimlineage.wormguides.org |