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Developmental Biology

ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर में एंडोक्राइन व्यवधान का परीक्षण करने के तरीके

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

एंडोक्राइन disruptor रसायन (EDCs) जीवों के लिए और प्राकृतिक वातावरण के लिए एक गंभीर समस्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. Drosophila मेलेनोगैस्टर विवो में ईडीसी प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ, हम Drosophila में अंत: स्रावी व्यवधान की जांच करने के लिए तरीकों वर्तमान, fecundity पर EDC प्रभाव को संबोधित, प्रजनन क्षमता, विकास के समय, और मक्खी की उम्र.

Abstract

हाल के वर्षों में वहाँ सबूत बढ़ रहा है कि सभी जीवों और पर्यावरण हार्मोन की तरह रसायनों के संपर्क में हैं, अंत: स्रावी disruptor रसायनों के रूप में जाना जाता है (EDCs). ये रसायन अंत: स्रावी प्रणालियों के सामान्य संतुलन को बदल सकते हैं और प्रतिकूल प्रभाव पैदा कर सकते हैं, साथ ही मानव आबादी या परेशान वृद्धि में हार्मोनल विकारों की बढ़ती संख्या और वन्यजीव प्रजातियों में प्रजनन कम हो सकते हैं। कुछ EDCs के लिए, वहाँ स्वास्थ्य प्रभाव और उनके उपयोग पर प्रतिबंध प्रलेखित रहे हैं. हालांकि, उनमें से ज्यादातर के लिए, वहाँ अभी भी इस अर्थ में कोई वैज्ञानिक सबूत है. पूर्ण जीव में एक रसायन के संभावित अंत: स्रावी प्रभाव को सत्यापित करने के लिए, हम इसे उचित मॉडल प्रणाली में परीक्षण की जरूरत है, साथ ही फल मक्खी में, Drosophila मेलेनोगास्टर. यहाँ हम Drosophila में अंत: स्रावी व्यवधान का अध्ययन करने के लिए विवो प्रोटोकॉल में विस्तृत रिपोर्ट, fecundity पर EDC प्रभाव को संबोधित / पिछले कुछ वर्षों में, हम इन Drosophila जीवन लक्षण का इस्तेमाल करने के लिए जोखिम के प्रभाव की जांच करने के लिए 17-जेड-एथिनीलेस्टेराडॉल (EE2), बिसफेनोल ए (BPA), और bisphenol AF (BPA एफ). कुल मिलाकर, इन परख सभी Drosophila जीवन चरणों को कवर किया और यह संभव सभी हार्मोन मध्यस्थता प्रक्रियाओं में अंत: स्रावी व्यवधान का मूल्यांकन करने के लिए बनाया है. प्रजनन क्षमता/उर्वरता और विकासात्मक समय परख क्रमशः मक्खी प्रजनन निष्पादन और विकासात्मक चरणों पर ईडीसी प्रभाव को मापने के लिए उपयोगी थे। अंत में, जीवन परख वयस्कों के लिए पुरानी EDC जोखिम शामिल है और उनके उत्तरजीवी मापा. हालांकि, इन जीवन लक्षण भी कई प्रयोगात्मक कारकों है कि ध्यान से नियंत्रित किया जाना था से प्रभावित किया जा सकता है. तो, इस काम में, हम प्रक्रियाओं हम इन assays के सही परिणाम के लिए अनुकूलित है की एक श्रृंखला का सुझाव देते हैं. इन तरीकों वैज्ञानिकों किसी भी EDC के लिए या Drosophila में विभिन्न EDCs के मिश्रण के लिए अंत: स्रावी व्यवधान स्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं, हालांकि अंत: स्रावी प्रभाव के लिए जिम्मेदार तंत्र की पहचान करने के लिए, आगे निबंध की जरूरत हो सकती है.

Introduction

मानव गतिविधियों को पर्यावरण में रसायनों की एक विशाल मात्रा है, जो जीवों के लिए एक गंभीर समस्या का प्रतिनिधित्व करते हैं और प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों1के लिए जारी किया गया है. इन प्रदूषकों में से, यह अनुमान है कि लगभग 1,000 विभिन्न रसायनों अंत: स्रावी प्रणालियों के सामान्य संतुलन को बदल सकते हैं; इस संपत्ति के अनुसार, उन्हें अंत: स्रावी बाधा वाले रसायनों (ईडीसी) के रूप में वर्गीकृत किया गया है। विशेष रूप से, एंडोक्राइन सोसायटी द्वारा हाल ही में एक परिभाषा के आधार पर, EDCs कर रहे हैं "एक exogenous रासायनिक, या रसायनों का मिश्रण, कि हार्मोन कार्रवाई के किसी भी पहलू के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं"2. पिछले तीन दशकों में इस बात के वैज्ञानिक प्रमाण मिल रहे हैं कि ईडी सी डवप और पशुओं और पौधों के प्रजनन और विकास को प्रभावित कर सकता है3,4,5,6,7, 8. इसके अलावा, ईडीसी जोखिम कैंसर, मोटापा, मधुमेह, थायराइड रोगों, और व्यवहार विकारों9,10,11सहित कुछ मानव रोगोंकेबढ़ते प्रसार से संबंधित रहा है।

ईडीसी के सामान्य तंत्र

उनके आणविक गुणों के कारण, ईडीसी हार्मोन या हार्मोन अग्रदूतों की तरह व्यवहार करते हैं3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. इस अर्थ में, वे एक हार्मोन रिसेप्टर के लिए बाध्य कर सकते हैं और या तो हार्मोन गतिविधि नकल करके या अंतर्जात हार्मोन बंधन अवरुद्ध द्वारा अंत: स्रावी प्रणालियों को बाधित. पहले मामले में, रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी के बाद, वे इसे सक्रिय कर सकते हैं के रूप में अपने प्राकृतिक हार्मोन करना होगा. दूसरे मामले में, रिसेप्टर के लिए EDC की बाइंडिंग अपने प्राकृतिक हार्मोन की बंधन को रोकता है, इसलिए रिसेप्टर अवरुद्ध है और अब सक्रिय किया जा सकता है, यहां तक कि अपने प्राकृतिक हार्मोन की उपस्थिति में3. एक परिणाम के रूप में, EDCs कई प्रक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे संश्लेषण, स्राव, परिवहन, चयापचय, या अंतर्जात हार्मोन है कि homeostasis के रखरखाव के लिए जिम्मेदार हैं की परिधीय कार्रवाई, प्रजनन, विकास, और / जीव. रिसेप्टर बाइंडिंग ईडीसी के लिए अब तक वर्णित कार्रवाई का एकमात्र तरीका नहीं है। अब यह स्पष्ट है कि वे एंजाइमी रास्ते में कोसक्रियित्र या कोरिप्रेसर की भर्ती करके या जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने वाले एपिजेनेटिक मार्कर को संशोधित करके भी कार्य कर सकते हैं10,11,12,13 14, वर्तमान पीढ़ी के लिए ही नहीं बल्कि आने वालीपीढियों के स्वास्थ्य के लिए भी परिणाम हैं .

ड्रोसोफिला हार्मोन

चयनित ईडीसी के संभावित प्रभावों का व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है, दोनों वन्यजीव प्रजातियों में और कई मॉडल प्रणालियों में, जिनमें अंत: स्रावी तंत्र काफी अच्छी तरह से जाना जाता है। अकशेरुकी के लिए, अंत: स्रावी प्रणालियों है कि विकास को प्रभावित, विकास, और प्रजनन बड़े पैमाने पर कई कारणों के लिए कीड़ों में विशेषता है, जैविक अनुसंधान के क्षेत्र में उनके व्यापक उपयोग को शामिल, उनके आर्थिक महत्व, और अंत में कीट कीटों की हार्मोन प्रणाली के साथ विशेष रूप से हस्तक्षेप करने में सक्षम कीटनाशकों का विकास।

विशेष रूप से, कीड़ों के बीच, फल मक्खी डी melanogaster EDCs के संभावित अंत: स्रावी प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. डी मेलेनोगैस्टरमें, साथ ही कशेरुकियों में, हार्मोन पूरे जीवन चक्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इस जीव में, तीन मुख्य हार्मोनल सिस्टम होते हैं, जिनमें स्टेरॉयड हार्मोन 20-hydroxyecdysone (20E)15,16, सेस्क्वीट्रिपेनॉइड किशोर हार्मोन (जेएच)17, और न्यूरोपेप्टाइड और पेप्टाइड/ हार्मोन18| इस तीसरे समूह के कई पेप्टाइड्स के होते हैं और अधिक हाल ही में की खोज की, लेकिन स्पष्ट रूप से इस तरह के दीर्घायु के रूप में शारीरिक और व्यवहार प्रक्रियाओं की एक विशाल विविधता में शामिल, homeostasis, चयापचय, प्रजनन, स्मृति, और चलन नियंत्रण. 20E कोलेस्ट्रॉल व्युत्पन्न स्टेरॉयड हार्मोन के लिए समजात है जैसे एस्ट्राडियोल, जबकि JH रेटिनॉइक एसिड के साथ कुछ समानताएं साझा करता है; ये दोनों ड्रोसोफिला19,20में बेहतर ज्ञात हार्मोन हैं . उनका संतुलन मोलिंग और कायांतरण के समन्वय में महत्वपूर्ण है, साथ ही प्रजनन, जीवन, और व्यवहार21जैसे कई postdevelopmental प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने में, इस प्रकार अंत: स्रावी परीक्षण के लिए विभिन्न संभावनाओं की पेशकश ड्रोसोफिला में व्यवधान। इसके अलावा, कीटों में विकासात्मक और प्रजनन अंत: स्रावी-मध्यस्थ प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप करने के लिए विकसित तथाकथित तीसरी पीढ़ी के कीटनाशकों के मुख्य लक्ष्य हैं। इन रसायनों की कार्रवाई के एगोनिस्ट या विरोधी मोड अच्छी तरह से जाना जाता है, और इस प्रकार वे22कीड़ों के विकास, प्रजनन, और विकास पर संभावित EDCs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए संदर्भ मानकों के रूप में सेवा कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, मेथोप्रीन, जिसका व्यापक रूप से मच्छरों और अन्य जलीय कीटों को नियंत्रित करने में उपयोग किया गया है23,24,एक JH एगोनिस्ट के रूप में काम करता है और 20E प्रेरित जीन प्रतिलेखन और कायांतरण को दबाता है।

हार्मोन के अलावा, परमाणु रिसेप्टर (एनआर) Drosophila में superfamily भी अच्छी तरह से जाना जाता है; इसमें 18 विकासवादी संरक्षित प्रतिलेखन कारक होते हैं जो हार्मोन पर निर्भर विकास पथ को नियंत्रित करने में शामिल होते हैं, साथ ही प्रजनन और शरीर क्रिया विज्ञान25. ये हार्मोन एनआर सभी छह एनआर superfamily subtypes के हैं, neurotransmission में शामिल उन सहित26, दो retinoic एसिड NRs के लिए, और स्टेरॉयड एनआर के लिए उन है कि, कशेरुकियों में, EDCs27के प्राथमिक लक्ष्यों में से एक का प्रतिनिधित्व करते हैं.

EDCs के अध्ययन के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में Drosophila

वर्तमान में, आणविक गुणों के आधार पर, दुनिया भर में कई पर्यावरण एजेंसियों के लिए विभिन्न मानव निर्मित रसायनों के लिए अंत: स्रावी प्रणालियों के साथ हस्तक्षेप करने की क्षमता का योगदान कर रहे हैं. यह देखते हुए कि EDCs पर्यावरण के लिए और जीवों के लिए एक वैश्विक और सर्वव्यापी समस्या है, इस क्षेत्र में अनुसंधान के समग्र लक्ष्य के लिए उनके रोग के बोझ को कम करने के लिए है, साथ ही उनके प्रतिकूल प्रभाव से जीवों की रक्षा के लिए. आदेश में एक रासायनिक के संभावित अंत: स्रावी प्रभाव के बारे में समझ को गहरा करने के लिए, यह vivo में परीक्षण करने के लिए आवश्यक है. यह अंत करने के लिए, डी melanogaster एक वैध मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है. तारीख करने के लिए, फल मक्खी बड़े पैमाने पर कई पर्यावरण EDCs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए vivo मॉडल में के रूप में इस्तेमाल किया गया है; यह सूचित किया गया है कि कई ईडीसी के संपर्क में, जैसे डिब्यूटिल थैलेट (डीबीपी)28,बिस्फेनोल ए (बीपीए), 4-नोनिफेनोल (4-एनपी), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, मिथाइलपैराबेन (एमपी)30,एथिलपैराबेन (ईपी)31, 32, बिस्-(2-एथिहेक्सिल) थैलेट (डीएचपी)33,और 17-जेड-एथिनिलस्टेडियोल (ई2)34,कशेरुकी मॉडल ों के रूप में चयापचय और अंत: स्रावी कार्यों को प्रभावित करता है। कई कारणों से अनुसंधान के इस क्षेत्र में एक मॉडल के रूप में इसके उपयोग के लिए नेतृत्व किया है. अपने अंत: स्रावी प्रणालियों के एक उत्कृष्ट ज्ञान के अलावा, आगे के लाभ अपने छोटे जीवन चक्र, कम लागत, आसानी से manipulable जीनोम, अनुसंधान का एक लंबा इतिहास, और कई तकनीकी संभावनाओं (FlyBase वेबसाइट देखें, http://flybase.org/) शामिल हैं. डी मेलेनोगैस्टर भी आसानी से पर्यावरणीय कारकों के लिए transgenerational प्रभाव और जनसंख्या प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रदान करता है8 और उच्च जानवरों में विवो अध्ययन में के लिए प्रासंगिक नैतिक मुद्दों से बचा जाता है. इसके अलावा, फल मक्खी मानव जो Drosophila EDC assays के लिए यह संभव बनाने के लिए भविष्यवाणी या मानव स्वास्थ्य के लिए इन रसायनों के संभावित प्रभावों का सुझाव देने में मदद करने के लिए संभव हो सकता है के साथ जीन संरक्षण के एक उच्च डिग्री के शेयरों. मानव स्वास्थ्य प्रभाव के बारे में समझ का विस्तार करने के अलावा, Drosophila इस तरह के जैव विविधता हानि और पर्यावरण गिरावट के रूप में पर्यावरण के लिए EDC जोखिम के जोखिम का आकलन करने में मदद कर सकते हैं. अंत में, फल मक्खी प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया जा रहा है, जहां संभावित रूप से इसके विकास को प्रभावित करने वाले कारकों, प्रजनन, और उम्र नियंत्रण में रखा जा सकता है ताकि पदार्थ के लिए किसी भी बदलाव विशेषता के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है.

इसे ध्यान में रखते, हम कुछ Drosophila हार्मोनल लक्षण पर EDC प्रभाव का निर्धारण करने के लिए सरल और मजबूत फिटनेस assays अनुकूलित किया है, जैसे fecundity / इन परखों का व्यापक रूप से उपयोग कुछ ईडीसी23,24,25,26,27 केलिए किया गया है . विशेष रूप से, हम सिंथेटिक एस्ट्रोजन EE234 के लिए जोखिम के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है और BPA करने के लिए और bisphenol वायुसेना (BPA एफ) (अप्रकाशित डेटा). इन प्रोटोकॉल आसानी से एक समय में एक दिया EDC के प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, साथ ही डी melanogasterमें कई EDCs के संयुक्त प्रभाव.

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Protocol

1. खाद्य तैयारी

  1. स्टॉक रखरखाव के लिए और लार्वा वृद्धि के लिए, एक कॉर्नमील माध्यम का उपयोग करें जिसमें 3 % पिसा हुआ खमीर, 10 % सुक्रोज, 9 % पूर्व पका हुआ कॉर्नमील, 0.4 % एगार, उसके बाद कॉर्नमील माध्यम (सीएम) कहा जाता है।
    1. 100 एमएल नल के पानी में 30 ग्राम खमीर डालकर उबालें और इसे 15 मिनट तक उबालें।
    2. 90 ग्राम पहले से पका हुआ कॉर्नमील, 100 ग्राम चीनी और 4 ग्राम आगर को 900 एमएल नल के पानी में अच्छी तरह मिला लें।
    3. एक फोड़ा करने के लिए समाधान लाओ, गर्मी कम और लगातार सरगर्मी 5 मिनट के लिए खाना बनाना.
    4. 5 मिनट के बाद, गर्म खमीर समाधान जोड़ने और एक और 15 मिनट के लिए उबाल.
    5. ऊष्मा स्रोत को बंद करें और समाधान को लगभग 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    6. एथेनॉल में 10% मिथाइल 4-hydroxybenzoate के 5 एमएल/एल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण और यह 10 मिनट के लिए बैठते हैं।
      नोट: मिथाइल 4-हाइड्रॉक्सीबेन्जोएट की मात्रा से सावधान रहें, यह देखते हुए कि कवकनाशी की उच्च एकाग्रता लार्वा के लिए घातक हो सकती है।
    7. प्रत्येक मक्खी शीशी (25 मिमी x 95 मिमी), प्रत्येक मक्खी शीशी में 3 एमएल (22 मिमी x 63 मिमी) और प्रत्येक मक्खी की बोतल (250 एमएल) में 60 एमएल में 8 एमएल प्रत्येक मक्खी शीशी में 8 एमएल) का वितरण करें।
    8. चीज़पोश के साथ शीशियों को कवर करें और भंडारण से पहले 24 एच के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर उन्हें सुखाने की अनुमति दें।
    9. या तो इस्तेमाल किया agar की मात्रा को संशोधित करने के द्वारा मुख्यमंत्री के प्रयोगात्मक सही स्थिरता और जलयोजन कैलिब्रेट करें और /
      नोट: अनप्लग, बॉक्स्ड और लिपटे शीशियों 4 डिग्री सेल्सियस पर के बारे में 15 दिनों के लिए स्थिर हैं।
  2. Drosophila वयस्कों के लिए, 10% पाउडर खमीर, 10% sucrose, 2% agar, उसके बाद वयस्क माध्यम (AM) कहा जाता है युक्त एक माध्यम का उपयोग करें.
    1. 10 ग्राम पिसा हुआ खमीर, 10 ग्राम सुक्रोज, 2 ग्राम आगर को 100 एमएल आसुत जल में मिलाएं।
    2. एक फोड़ा दो बार करने के लिए इस मिश्रण लाओ, एक 3 मिनट के अंतराल के साथ, या जब तक agar भंग कर दिया है, एक माइक्रोवेव का उपयोग करके.
    3. एक बार जब समाधान 60 डिग्री सेल्सियस ठंडा हो जाए, तो एथेनोल में 10% मिथाइल 4-हाइड्रोक्सीबेन्जोएट के 5 एमएल/एल जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण करें और शीशियों (10 एमएल प्रति शीशी) में वितरित करें।
    4. चीज़पोश के साथ शीशियों को कवर करें और भंडारण से पहले उन्हें 24 एच के लिए आरटी पर सूखने दें।
      नोट: अनप्लग, बॉक्स्ड और लिपटे शीशियों 4 डिग्री सेल्सियस पर के बारे में 15 दिनों के लिए स्थिर हैं।
  3. प्रजनन परख के लिए, Drosophila टमाटर का रस-कॉर्नमील माध्यम का उपयोग करें।
    1. एक 100 एमएल बीकर में गर्म cornmeal भोजन के 70 एमएल डालो और टमाटर का रस के 30 एमएल (30% v/
    2. एक खाद्य प्रोसेसर और छोटे शीशियों में pipet 3 एमएल के साथ अच्छी तरह से मिक्स.
    3. चीज़पोश के साथ शीशियों को कवर करें और भंडारण से पहले 24 एच के लिए आरटी पर सुखाने के लिए अनुमति दें।
      नोट: अनप्लग, बॉक्स्ड और लिपटे शीशियों 4 डिग्री सेल्सियस पर के बारे में 15 दिनों के लिए स्थिर हैं।
  4. भ्रूण संग्रह के लिए, आगर प्लेटों का उपयोग करें, जिसमें 3% agar, 30% टमाटर सॉस, और 3% चीनी होती है।
    नोट: प्लेटों में माध्यम डालने जब बुलबुले बनाने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।

2. Drosophila ईडीसी डोसिंग

  1. उपयुक्त विलायक में चयनित EDC भंग एक उपयुक्त शेयर समाधान तैयार करें। EE2 (आण्विक वजन 296.403) के लिए, 100% इथेनॉल के 10 एमएल में 1.48 ग्राम भंग करने के लिए एक 0.5 M शेयर समाधान बनाने के लिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    चेतावनी: ईडीसी को पर्यावरणीय प्रदूषक माना जाता है और उन्हें संभालने में सावधानी बरतनी चाहिए।
  2. 100 एमएम घोल प्राप्त करने के लिए जल में 10% एथेनोल (v/v) में EE2 स्टॉक विलयन को निरूपित करें। मुख्यमंत्री भोजन में अगले कमजोर पड़ने (0.1 एमएम, 0.5 एमएम और 1 एमएम) बनाओ, सबसे कम एकाग्रता के साथ शुरू करने और प्रत्येक उपचार समूह के लिए विलायक की एक ही अंतिम एकाग्रता का उपयोग कर। नियंत्रण शीशियों के लिए अकेले विलायक की एक ही मात्रा का उपयोग करें।
    नोट: यह संभव के रूप में कम के रूप में विलायक के अंतिम एकाग्रता रखने के लिए सिफारिश की है, मन में असर है कि इथेनॉल के अंतिम एकाग्रता मक्खी भोजन में 2% से अधिक नहीं होना चाहिए.
  3. solidification से पहले cornmeal आधारित भोजन के लिए चयनित EDC के सही कमजोर पड़ने युक्त समाधान जोड़ें, एक खाद्य प्रोसेसर के साथ अच्छी तरह से मिश्रण, शीशियों में 10 एमएल वितरित, कपास धुंध के साथ कवर और उपयोग करने से पहले 16 एच के लिए आरटी पर सूखी.
    नोट: इसकी तैयारी के तुरंत बाद इस माध्यम का उपयोग करें।
  4. वयस्क पालन के लिए, विभिन्न कार्य ईई 2 समाधान (10 एमएम, 50 एमएम और 100 एमएम, क्रमशः) पानी में 10% इथेनॉल (v/v) और एएम की सतह पर प्रत्येक की परत 100 डिग्री सेल्सियस तैयार करें, ताकि ईई2 की वांछित सांद्रता प्राप्त की जा सके (0.1 एमएम)। , 0.5 एमएम और 1 एमएम). नियंत्रण के लिए अकेले विलायक की एक ही मात्रा का उपयोग करें.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एक 50 एमएल शंकु ट्यूब में AM की एक छोटी राशि के लिए चयनित EDC के सही कमजोर पड़ने युक्त समाधान जोड़ने के लिए, भंवर अच्छी तरह से और AM शीशियों की सतह पर इसके बारे में 1 एमएल straty.
    1. कपास धुंध के साथ कवर शीशियों, कोमल आंदोलन के तहत 12-16 एच के लिए आरटी पर सुखाने की अनुमति है और उन्हें तुरंत उपयोग करें।
      नोट: सुखाने की प्रक्रिया प्रयोगात्मक समायोजित किया जाना चाहिए क्योंकि परिवेश आर्द्रता पर निर्भर करता है.
  5. खिला परख के लिए, चयनित EDC (EE2 0.1 MM, 0.5 m और 1 MM) और एक रंग भोजन (जैसे, लाल डाई नंबर 40 पर 1 mg/mL)35 के सही कमजोर पड़ने से युक्त दोनों समाधान जोड़ें ठोसीकरण से पहले मुख्यमंत्री को, एक खाद्य प्रोसेसर और फिर वितरण के साथ दृढ़ता से मिश्रण शीशियों में ई.

3. मक्खी पालन

  1. एक मजबूत isogenic तनाव का प्रयोग करें, जैसे ओरेगन आर, प्रयोगशाला में कई पीढ़ी द्वारा बनाए रखा.
  2. एक humidified, तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में मक्खियों रखें, एक प्राकृतिक 12 एच प्रकाश के साथ: 12 एच अंधेरे photoperiod पर 25 डिग्री सेल्सियस मुख्यमंत्री भोजन युक्त शीशियों में.
  3. प्रत्येक परख में, आरटी पर शीशियों का उपयोग करें।

4. खिला परख

नोट: इस परख का परीक्षण करने के लिए सिफारिश की है अगर माध्यम में चयनित EDC की उपस्थिति मक्खियों के खिला ने प्रभावित कर सकता है.

  1. मुख्यमंत्री चयनित EDC और एक रंग भोजन के विभिन्न सांद्रता के साथ पूरक युक्त शीशियों में 15 युवा मक्खियों रखो. मक्खियों को 1 दिन के लिए मीडिया पर फ़ीड करने की अनुमति दें.
    नोट:उदाहरण के लिए, लाल डाई नंबर 4035 (1 मिलीग्राम/
  2. मुख्यमंत्री अकेले विलायक और नियंत्रण के लिए एक रंग भोजन के साथ पूरक युक्त शीशियों में 15 युवा मक्खियों रखो. मक्खियों को 1 दिन के लिए मीडिया पर फ़ीड करने की अनुमति दें.
  3. ईथर के साथ मक्खियों के प्रत्येक समूह को अलग-अलग एनेस्थेटाइज करें।
    1. खुले अंत में डाला एक कीप के साथ एक बेलनाकार ग्लास कंटेनर (ईथर) के लिए प्रत्येक समूह की मक्खियों स्थानांतरण, कीप पर शीशी उलटऔर धीरे से दो कंटेनरों एक साथ दोहन करने के लिए मक्खियों ईथर में गिर जाते हैं.
      नोट:  कीप उन्हें ईथराइज़र से बाहर निकलने से रोक देगा।
    2. दस्तक धीरे इस तरह के एक माउस पैड के रूप में एक नरम सतह पर ईथराइज़र दोहन से नीचे मक्खियों, और जल्दी से एक ईथर से लथपथ कपास और धुंध प्लग के साथ कीप की जगह।
    3. मक्खियों नीचे करने के लिए गिर जाते हैं और आगे बढ़ बंद करो जब तक के बारे में 1 मिनट रुको।
      नोट: समय से अधिक नहीं है या मक्खियों मर जाएगा।
  4. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत स्थिर मक्खियों रखो और नियंत्रण समूह के संबंध में प्रत्येक उपचार समूह के पेट के रंग की तुलना करें।

5. प्रजनन क्षमता /

  1. प्रत्येक EDC एकाग्रता के लिए, मक्खियों की 3 शीशियों तैयार, उसके बाद माता पिता की शीशियों कहा जाता है, 8 महिलाओं और 10 एमएल मुख्यमंत्री में 4 पुरुषों के साथ / नियंत्रण के लिए 8 महिलाओं और 10 एमएल मुख्यमंत्री खाद्य विलायक के साथ पूरक में 4 पुरुषों के साथ मक्खियों की 6 शीशियों तैयार करते हैं। 25 डिग्री सेल्सियस पर एक इन्क्यूबेटर में रियर मक्खियों।
    नोट: उनके विकास के दौरान भीड़ लार्वा से बचें और उपचार में लगातार लार्वा घनत्व का उपयोग करने का प्रयास करें।
  2. 4 दिनों के बाद, माता-पिता को हटा दें और 5 और दिनों के लिए इनक्यूबेटर में शीशियों को वापस करें।
  3. 9 दिन की देर से दोपहर में, शीशियों से सभी नए मक्खियों को हटा दें और शीशियों को रात भर 18 डिग्री सेल्सियस पर एक इन्क्यूबेटर में डाल दिया।
    नोट: इस हटाने बहुत ध्यान से किया जाना चाहिए, अच्छी तरह से मध्यम की सतह की जाँच.
    1. 10 दिन की सुबह, प्रत्येक उपचार समूह के लिए, दो समूहों में कुंवारी महिलाओं और युवा पुरुषों इकट्ठा, प्रकाश सीओ2 एनेस्थेटिफिकेशन के तहत. बेतरतीब ढंग से छोटे उपसमूहों में मक्खियों के प्रत्येक समूह उपविभाजित (10 महिलाओं और 20 पुरुषों प्रति शीशी) स्वतंत्र शीशियों में ताजा इसी मुख्यमंत्री से भरा.
      1. दोहराएँ चरण 5.3.1 ध्यान से सभी मक्खियों को हटाने के लिए ध्यान से सभी मक्खियों को हटाने के लिए 8-10 एच संग्रह से पहले और 18 डिग्री सेल्सियस पर शीशियों छोड़, जब तक प्राप्त कम से कम 30 कुंवारी महिलाओं और प्रत्येक EDC सांद्रता के लिए 30 पुरुषों और कम से कम 90 कुंवारी महिलाओं और नियंत्रण के लिए 90 पुरुषों.
    2. मक्खियों के इन समूहों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि वे 4 दिन के बाद के हैं, उन्हें हर दो दिन में ताजा इसी माध्यम वाले नए शीशियों में स्थानांतरित कर दें।
      नोट: मक्खियों के परिपक्व वयस्क बनने के लिए 4 दिन पर्याप्त समय है, लेकिन यह जीर्णता की शुरुआत से बहुत दूर है।
    3. दो दिनों के बाद सुनिश्चित करें कि महिलाओं की शीशियों में कोई लार्वा नहीं है। यदि वे करते हैं, मक्खियों उपयोग करने योग्य नहीं हैं क्योंकि वे कुंवारी नहीं हैं और खारिज कर दिया जाना चाहिए.
  4. प्रत्येक उपचार समूह के लिए प्रत्येक सेक्स के 20 एकल मक्खियों का प्रयोग करें EDC के बिना ताजा मुख्यमंत्री टमाटर माध्यम युक्त छोटे शीशियों में 20 एकल पार स्थापित करने के लिए, जैसा कि नीचे वर्णित है.
    1. प्रत्येक उपचार समूह के लिए अनुक्रमिक संख्या है, जो विशिष्ट रूप से यह पहचान करता है और संबंधित शीशियों लेबल की एक अलग श्रृंखला आवंटित; जैसे, group1 (अकेले विलायक) 1 से 20, समूह 2 (EDC एकाग्रता x) से 20 में 40, और इतने पर.
    2. अलग श्रृंखला, प्रत्येक एक उपचार समूह के लिए इसी रिकॉर्ड करने के लिए एक प्रजनन स्प्रेडशीट बनाओ.
    3. प्रत्येक सेक्स के लिए प्रकाश सीओ2 के तहत प्रत्येक उपचार समूह से संबंधित सभी मक्खियों anesthetize और बेतरतीब ढंग से उन्हें इस प्रकार के रूप में हस्तांतरण।
      1. EDC के बिना ताजा मुख्यमंत्री टमाटर माध्यम युक्त एक छोटी सी शीशी में एक विलायक इलाज महिला स्थानांतरण और नियंत्रण पार के लिए एक विलायक इलाज पुरुष जोड़ें।
        नोट: टमाटर का रस इसकी तैयारी के दौरान मध्यम में जोड़ा जाना चाहिए क्योंकि गहरे मध्यम सफेद भ्रूण के साथ इसके विपरीत बढ़ जाती है।
      2. एक EDC एक EDC के बिना ताजा मुख्यमंत्री टमाटर युक्त एक छोटी सी शीशी में महिला का इलाज स्थानांतरण और प्रत्येक उपचार के लिए एक विलायक इलाज पुरुष जोड़ें.
      3. एक EDC एक EDC के बिना ताजा मुख्यमंत्री टमाटर माध्यम युक्त एक छोटी सी शीशी में पुरुष इलाज स्थानांतरण और प्रत्येक उपचार के लिए एक विलायक इलाज महिला जोड़ें.
    4. 25 डिग्री सेल्सियस पर इन सभी एकल पार हाउस.
  5. बाद के दस दिनों के लिए हर दिन EDC बिना ताजा मुख्यमंत्री टमाटर शीशियों में प्रत्येक संभोग जोड़ी स्थानांतरण. प्रत्येक श्रृंखला की प्रतिकृति शीशियों को क्रमिक रूप से लेबल करें; उदा. 1-ए, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c और प्रजनन स्प्रेडशीट पर इन नंबर की रिपोर्ट.
  6. नेत्रहीन अंडे के लिए हर दिन प्रत्येक शीशी का निरीक्षण और प्रजनन स्प्रेडशीट पर उनकी संख्या की रिपोर्ट.
  7. प्रत्येक शीशी को बचाने और, जब नई मक्खियों उभरने के लिए शुरू, भी 10 दिन की अवधि में वयस्क संतानों की दैनिक संख्या रिकॉर्ड. प्रारंभिक संभोग से 10 दिनों के बाद, माता पिता को हटा दें.
    नोट: शीशी त्यागें जिसमें एक या दोनों माता-पिता की मृत्यु हो गई; एक या दोनों माता पिता के भागने के मामले में, दिन उन्हें खो दिया था जब तक सभी डेटा विश्लेषण में शामिल हैं.
  8. अंडे की दैनिक संख्या और प्रत्येक उपचार समूह से वयस्क संतानों की दैनिक संख्या, दस दिनों के लिए एक मक्खी द्वारा कुल fecundity/उर्वरता, मतलब अंडे और वयस्क संतान उत्पादन प्राप्त करने के लिए, और अंडे की कुल संख्या के लिए कुल संतान का अनुपात रखी. नियंत्रण के संबंध में प्रत्येक उपचार मानों के प्रतिशत में अंतर की गणना करें।
  9. प्रत्येक उपचार समूह के लिए कम से कम 10 मक्खियों का उपयोग करके, मक्खियों के प्रत्येक समूह के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोग करें।
  10. विभिन्न समूहों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

6. विकास समय

नोट: दो निम्नलिखित वैकल्पिक प्रोटोकॉल में विकास ात्मक समय प्रति दिन फार्म है कि प्यूपा की संख्या और प्रति दिन eclosing वयस्क संतान की संख्या दोनों की गिनती द्वारा मूल्यांकन किया जाता है.

  1. Eclosion परख प्रोटोकॉल 1
    1. प्रत्येक उपचार समूह के लिए, युवा की 10 शीशियों की स्थापना (lt;2 दिन), स्वस्थ मक्खियों, EDC के बिना 10 एमएल कॉर्नमील भोजन में 6 महिलाओं और 3 पुरुषों के साथ प्रत्येक.
    2. 24 ज के लिए भोजन पर मक्खियों चलो, और उन्हें दोस्त के लिए अनुमति देते हैं.
    3. विभिन्न EDC सांद्रता या नियंत्रण के लिए अकेले विलायक के साथ पूरक ताजा cornmeal भोजन के प्रत्येक 10 एमएल के साथ उपचार समूह प्रति 10 समानांतर शीशियों तैयार करें। इन नए शीशियों के लिए mated मक्खियों स्थानांतरण।
      नोट: प्रत्येक उपचार समूह के लिए अनुक्रमिक संख्या है, जो विशिष्ट रूप से यह पहचान करता है और संबंधित शीशियों लेबल की एक अलग श्रृंखला आवंटित.
    4. विभिन्न श्रृंखला रिकॉर्ड करने के लिए एक विकास स्प्रेडशीट बनाओ.
    5. 16 ज के लिए अंडे देने के लिए मक्खियों की अनुमति दें। फिर शीशियों से माता पिता को हटा दें.
      नोट: माता पिता मक्खियों अन्य इसी शीशियों के लिए उन्हें स्थानांतरित करके, चरण 6.1.5 दोहराने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    6. 25 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 दिनों के लिए शीशियों इनक्यूबेट, या जब तक कोई और प्यूपा फार्म. हर दिन प्रत्येक शीशी में नए प्यूपा की संख्या गिनती और विकास स्प्रेडशीट पर यह रिपोर्ट. दो बार एक ही प्यूपा की गिनती से बचने के लिए, शीशी के बाहर पर एक स्थायी मार्कर के साथ प्रत्येक प्यूपा पर अनुक्रम में एक संख्या लिखें।
    7. 9 दिन से शुरू, कोई और अधिक वयस्कों उभरा जब तक उभरते वयस्कों की संख्या दैनिक गिनती, और विकास स्प्रेडशीट पर यह रिपोर्ट.
    8. इन कच्चे आंकड़ों से, माध्य लार्वा अवधि, माध्य प्यूपल अवधि, साथ ही नियंत्रण के संबंध में प्रत्येक उपचार के प्रतिशत में अंतर की गणना करें।
    9. मक्खियों के प्रत्येक समूह के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों बाहर ले, प्रत्येक उपचार समूह के लिए 5 शीशियों की एक न्यूनतम का उपयोग करके.
    10. विभिन्न समूहों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें।
  2. Eclosion परख प्रोटोकॉल 2
    1. रियर युवा और स्वस्थ महिला (लगभग 150) और पुरुष (लगभग 50) एक संग्रह पिंजरे पर मक्खियों (सामग्री कीतालिका) agar-tomato मध्यम ताजा बेकर खमीर पेस्ट के साथ पूरक (3 ग्राम बेकर खमीर के 5 एमएल पानी में), उसके बाद बिछाने ट्रे कहा जाता है, 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. इन 2 दिनों के दौरान, मक्खियों एक अंधेरे, शांत जगह में पिंजरे के लिए acclimate करने के लिए अनुमति देते हैं, अंडे संग्रह शुरू करने से पहले, और बिछाने ट्रे एक दिन में दो बार बदल जाते हैं.
    3. तीसरे दिन, सुबह जल्दी बिछाने ट्रे बदलें। 1 ज के बाद, बिछाने ट्रे की जगह, इन रखी अंडे discarding.
    4. 2 एच के लिए अंडे देने के लिए और ताजा बिछाने ट्रे के साथ की जगह मक्खियों की अनुमति दें।
      नोट: 3 दिन तक, एक अच्छा बिछाने ट्रे 2 ज में 100-200 अंडे का उत्पादन करना चाहिए.
    5. प्रत्येक उपचार समूह के लिए, तीन 60 मिमी व्यंजन युक्त टमाटर cornmeal भोजन इसी EDC एकाग्रता के साथ या अकेले विलायक के साथ पूरक व्यंजन की एक श्रृंखला तैयार करने और विकास के समय स्प्रेडशीट में प्रत्येक श्रृंखला की रिपोर्ट. वैकल्पिक रूप से, यदि पसंद किया जाए, तो व्यंजन के बजाय शीशियों का उपयोग करें।
    6. एक तूलिका या जांच का उपयोग करके सूक्ष्मदर्शी के नीचे अंडे उठाएं और उन्हें प्रत्येक डिश/वील में मध्यम के शीर्ष पर स्थानांतरित करें। गिनती की सुविधा के लिए, बिछाने ट्रे पर, 10 प्रत्येक के 5 समूहों में अंडे की व्यवस्था और उन्हें एक समय में एक हस्तांतरण.
      नोट: दोहराएँ चरण 6.2.4 के रूप में कई बार के रूप में पर्याप्त भ्रूण प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
    7. इन सभी व्यंजनों/विल्लियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें। प्रत्येक बिछाने ट्रे को 25 डिग्री सेल्सियस पर भी स्टोर करें, और निर्धारित अंडे की कुल संख्या की गणना करें।
    8. 24-30 ज के बाद, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक डिश/वील की जांच करें और सफेद, अनिषेचित अंडे और काले मृत भ्रूणों की संख्या दोनों की गणना करें।
    9. प्रति डिश/वील के प्रति 'कुल भ्रूण' मूल्य प्राप्त करने के लिए 50 स्थानांतरित अंडे मूल्य से सफेद, अनिषेक अंडे की संख्या घटाएं। अंधेरे मृत भ्रूण की संख्या भ्रूणजनन के दौरान संभावित EDC विषाक्त प्रभाव निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    10. Eclosion परख प्रोटोकॉल 1 के चरण 6-1.6.1.10 दोहराएँ।

7. लाइफस्पैन प्रोटोकॉल

  1. 8 महिलाओं और 4 पुरुषों और मुख्यमंत्री (10 एमएल प्रत्येक) में 25 डिग्री सेल्सियस पर घर के साथ मक्खियों की 20 शीशियों की स्थापना की।
  2. 4 दिनों के बाद मक्खियों को त्यागें और शीशियों को इनक्यूबेटर में वापस रखें।
    नोट: इन मक्खियों मक्खियों के अन्य उम्र सिंक्रनाइज़ सहगण प्राप्त करने के लिए फिर से शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. 9 दिन की देर से दोपहर में, शीशियों से सभी नए मक्खियों को हटा दें और इनक्यूबेटर को शीशियों वापस करें।
    नोट: कुछ वयस्कों के लिए नौवें दिन के रूप में जल्दी eclose शुरू कर देना चाहिए; इन मक्खियों discarding सिंक्रनाइज़ मक्खियों की एक अधिकतम संख्या इकट्ठा करने के लिए, जल्दी आकस्मिक के लापरवाह चयन से बचने के लिए अनुमति देता है।
  4. 16-24 एच बाद में, वयस्क मक्खियों हस्तांतरण (1 दिन पुराने) दोनों लिंगों के चार समूहों में 250 एमएल की बोतलों युक्त AM भोजन तीन अलग EDC सांद्रता और अकेले विलायक के साथ एक के साथ पूरक. यदि आवश्यक हो, तो अगले दिन एक और बैच एकत्रित करें.
  5. उन्हें दोस्त के लिए अनुमति देने के लिए 2-3 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मक्खियों को बनाए रखें।
    नोट: AM खाद्य शीशियों के लिए स्थानांतरण के दिन वयस्कता के पहले दिन से मेल खाती है.
  6. दो-तीन दिनों के बाद, प्रकाश सीओ2 एनेस्थेटाइजेशन के तहत दो समूहों में सेक्स द्वारा मक्खियों के प्रत्येक सहगण को सॉर्ट करें। बेतरतीब ढंग से प्रत्येक लिंग प्रति 20 व्यक्तियों के घनत्व पर उपचार के प्रति पांच शीशियों में प्रत्येक सेक्स उपविभाजित, जब तक वहाँ प्रत्येक उपचार के प्रति प्रत्येक लिंग के लिए 5 समानांतर शीशियों के तीन प्रतिकृति कर रहे हैं.
    नोट: सीओ2के लिए लंबे समय से जोखिम समय के कारण संभव लंबे समय से स्थायी स्वास्थ्य मुद्दों को रोकने के लिए मक्खियों के छोटे समूहों के साथ काम करते हैं।
  7. एक जीवन स्प्रेडशीट जिसमें मृत मक्खियों की संख्या जीवित मक्खियों की संख्या से पिछले हस्तांतरण करने के लिए, इस तरह के रूप में स्वचालित रूप से प्रत्येक हस्तांतरण पर जीवित बचे लोगों की संख्या प्राप्त करने के लिए घटाया जाता है तैयार करें।
  8. स्थानांतरण एक ही समय में हर 3 दिन इसी भोजन युक्त नई शीशियों में मक्खियों स्थानांतरण और मौत के लिए जाँच करें।
    नोट: हस्तांतरण संज्ञाहरण कि मक्खी दीर्घायु पर एक दीर्घकालिक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है बिना जगह ले जाना चाहिए.
    1. प्रत्येक हस्तांतरण पर, मक्खियों की उम्र और मृत मक्खियों की संख्या रिकॉर्ड करें।
      नोट: जीवित मक्खियों की संख्या स्वचालित रूप से स्प्रेडशीट में गणना की है, लेकिन यह नेत्रहीन यह जाँच करने के लिए सिफारिश की है। मक्खी है कि गलती से दोनों बच या हस्तांतरण के दौरान मर जाते हैं पर विचार नहीं किया जाना चाहिए. स्प्रेडशीट में इस नोट रिपोर्टिंग नई शीशी के लिए किया दो बार मृत मक्खियों गिनती करने के लिए नहीं सावधान रहें।
    2. सभी मक्खियों मर जाते हैं जब तक 7.8 और 7.8.1 कदम दोहराएँ.
  9. प्रत्येक उपचार समूह के लिए, किसी विशेष समय पर मक्खी के उत्तरजीविता की संभावना को प्रदर्शित करने के लिए चित्र 6में दर्शाए अनुसार एक जीवितता वक्र बनाएँ।
  10. प्रत्येक प्रयोग के लिए 100 नए eclosed मक्खियों का उपयोग करके, मक्खियों के प्रत्येक उपचार समूह के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोग प्रदर्शन.
  11. एक तालिका तैयार करें जिसमें औसत आयु (प्रत्येक समूह के लिए सभी मक्खियों के औसत जीवित रहने के दिनों), आधा मृत्यु समय (50% मृत्यु तक पहुंचने के लिए आवश्यक दिनों की अवधि) और अधिकतम आयु (90% मृत्यु तक पहुंचने के लिए आवश्यक दिनों की अधिकतम मात्रा) की रिपोर्ट करें।
  12. नियंत्रण समूह के संबंध में प्रत्येक उपचार समूह के बीच प्रतिशत में अंतर की गणना करें।
  13. विभिन्न उपचार समूहों की तुलना करने के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

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Representative Results

इस अनुभाग में, सरलीकृत योजनाओं के रूप में उपरोक्त प्रोटोकॉल के मुख्य चरण रिपोर्ट किए गए हैं। यह देखते हुए कि मक्खियों unpalatable यौगिकों से बचने के लिए करते हैं, पहली बात करने के लिए चयनित EDC के स्वाद परख है. यह एक खाद्य रंग मिश्रण द्वारा किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, लाल खाद्य डाई नंबर 40)35 भोजन के साथ विभिन्न खुराक पर चयनित EDC के साथ या अकेले विलायक के साथ पूरक. इन मीडिया पर खिलाया जाने वाला फ्लीट एक स्टीरियोस्कोप के तहत जांच की जाती है और भोजन का सेवन उनके पेट के रंग से अनुमान लगाया जाता है (चित्र 1)। एक ठेठ वांछित स्थिति चित्रा 1 में दो वयस्क महिलाओं के साथ दिखाया गया है: एक चयनित EDC युक्त माध्यम पर खिलाया और एक EDC युक्त माध्यम पर एक, दोनों अपने पेट में एक ही रंग पेश.

यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि EDCs, प्राकृतिक हार्मोन की तरह, बहुत कम खुराक पर प्रभाव पड़ता है और है कि खुराक और प्रभाव के बीच एक सरल, रैखिक संबंध नहीं है29, उच्च खुराक के साथ जरूरी नहीं कि एक बड़ा प्रभाव होने के साथ36, 37. इसलिए, एक खुराक-प्रतिक्रिया दृष्टिकोण के बजाय, पूरी तरह से उनके प्रभावों का आकलन करने के लिए, पर्यावरण के लिए या अन्य जीवों के लिए प्रासंगिक सांद्रता से शुरू करते हुए अधिक खुराक का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। किसी भी मामले में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि मक्खियां प्रत्येक उपचार समूह में ईडीसी की तुलनीय मात्रा को पचाने के लिए प्रत्येक प्रयुक्त सांद्रता पर ईडीसी स्वाद का परख लेना महत्वपूर्ण है (चित्र2)।

अंत: स्रावी व्यवधान पशु शरीर क्रिया विज्ञान के कई महत्वपूर्ण लक्षणों को प्रभावित करता है जैसे प्रजनन क्षमता, दीर्घायु, और विकास जो, इसलिए, ईडीसी का परीक्षण करने के लिए उपयोगी अंतिम बिंदु हैं। उपरोक्त प्रोटोकॉल के लिए, जो हम इन Drosophila जीवन लक्षण पर EDC प्रभाव को मापने के लिए अनुकूलित, प्राथमिक विचार कर रहे हैं कि यह युवा और स्वस्थ मक्खियों कि सही ढंग से परीक्षण से पहले हेरफेर किया जाना चाहिए का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. इसे ध्यान में रखते हुए, उपयोग किए गए भोजन के उत्पादन, हैंडलिंग, और भंडारण पर बहुत ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, उचित अंतिम सांद्रता पर चयनित EDC के लिए सबसे अच्छा विलायक का उपयोग करने में सावधानी बरती जानी चाहिए (यानी, डाइमेथिल सल्फाइड के लिए 1% से कम [DMSO] और इथेनॉल के लिए 2% से कम)30.

द. मेलिनोगैस्टरमें प्रजनन सफलता का मूल्यांकन करने के लिए प्रजनन क्षमता और उर्वरता का उपयोग किया गया है . चित्र 3 प्रयुक्त प्रोटोकॉल की एक योजना को दर्शाता है। प्रजनन क्षमता प्रयोगात्मक रखी अंडे की कुल संख्या के रूप में मापा जाता है, जबकि प्रजनन क्षमता कुल वयस्क वंश के रूप में मापा जाता है. विचार के आधार पर कि वयस्क जीवन के पहले 10 दिनों में अंडे का उत्पादन पूरे वयस्कजीवन के लिए एक अच्छा संदर्भ है अंडे / उजागर लार्वा से निकली 4 दिन पुरानी मक्खियों का उपयोग करना। यह प्रत्येक समूह के समानांतर शीशियों में समान मान प्राप्त करने के लिए प्रयास करने के लिए महत्वपूर्ण है; अन्यथा, यह कल्पना करना मुश्किल होगा जो ट्यूब विश्लेषण से हटाने के लिए. इसलिए, एक तनावपूर्ण वातावरण से बचने के लिए दैनिक प्रत्येक प्रतिकृति शीशी की जांच करने की सलाह दी जाती है, जैसे सूखे या तरलीकृत भोजन; 20 एकल पार से शुरू, यह अच्छी स्थिति में कम से कम 10 शीशियों प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है जिसमें दोनों माता पिता के लिए जीवित थे 10 दिनों. अंडे और वयस्क संतान की संख्या, दैनिक एकत्र, चित्र 3 में दिखाया गया है और 10 दिनों के लिए एक मक्खी के मतलब अंडे और वयस्क संतान उत्पादन की गणना करने के लिए इस्तेमाल के रूप में एक मेज पर रिपोर्ट किया जाना चाहिए। फिर, नियंत्रण मक्खियों की तुलना में ईडीसी-उपचारित मक्खियों का फेकंडिटी/फर्टिलिटी परिवर्तन प्रतिशत निम्नलिखित सूत्र को लागू करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है: fecundity/fertility change % [ (नियंत्रण - उपचार)/नियंत्रण] x 100. प्रत्येक समूह के लिए कम से कम तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियां प्राप्त करसकते हैं।

हार्मोन डी मेलेनोगैस्टर40के जीवन में विकासात्मक संक्रमण में आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जिसके लिए यह संभावना है कि विकास के इन चरणों विशेष रूप से EDCs के प्रतिकूल प्रभाव के लिए कमजोर हैं. 25 डिग्री सेल्सियस पर, लार्वा विकास और प्यूपल चरण दोनों प्रत्येक अवधि लगभग 4 दिन। EDC जोखिम के बाद, इन चरणों का मतलब अवधि41प्रभावित हो सकता है. इस विचार के आधार पर, विकासात्मक समय प्रोटोकॉल को लार्वा से प्यूपा में संक्रमण के प्रतिशत और समय और प्यूपा से वयस्कों के लिए अनुपचारित मक्खियों के संबंध में ईडीसी जोखिम के बाद निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया गया था। दो वैकल्पिक प्रोटोकॉल इस परख बाहर ले जा सकता है. वे दोनों वैध थे और एक 4 दिन की अवधि में लार्वा के लिए EDC पुरानी जोखिम के आधार पर. इस लार्वा उपचार के आधार पर, पहले प्रोटोकॉल में भ्रूण की उम्र को ध्यान में नहीं रखा गया था, जो 16-18 एच अवधि (रात भर) से अधिक एकत्र किए गए थे। लार्वा के बीच परिणामी आयु परिवर्तनशीलता, हालांकि, प्रत्येक उपचार की सभी शीशियों में मौजूद होना चाहिए, इस प्रकार उपचार के भीतर विचरण में वृद्धि, लेकिन उपचार के माध्यम से विकास के समय के अनुमानों को काफी प्रभावित किए बिना। इसके बजाय, दूसरे प्रोटोकॉल में एक निश्चित संख्या में तुल्यकालिक प्रारंभिक भ्रूणों का उपयोग किया गया, जिससे भ्रूणजनन42,43के दौरान चयनित ईडीसी के संभावित प्रभावों का मूल्यांकन करना भी संभव हो गया। इसके अलावा, लार्वा के बीच उम्र के अंतर को कम करने से उपचार के भीतर विचरण कम हो गया और उपचार के बीच सही अंतर का अनुमान लगाने की क्षमता में वृद्धि हुई। चित्र 4 eclosion परख की एक योजना की रिपोर्ट. दोनों प्रोटोकॉलों में प्लेटों/विशलों की प्रतिदिन जांच की जानी थी और ईडीसी को उजागर और गैर-प्रदर्शित दोनों प्यूपा और वयस्कों की संख्या को चित्र 4के अनुसार एक टेबुल पर अलग से रिपोर्ट किया जाना था। सभी गठित प्यूपा और वयस्क मक्खियों को गिना जाना था, चाहे वह मृत हो या जिंदा। फिर, इन कच्चे डेटा का उपयोग लार्वा से प्यूपा और प्यूपा से वयस्कों में संक्रमण के प्रतिशत और समय की गणना करने और मक्खियों को नियंत्रित करने की तुलना में ईडीसी-उपचारित मक्खियों के इन मूल्यों के परिवर्तन प्रतिशत की गणना करने के लिए किया गया था। ईडीसी एक्सपोजर के बाद, नियंत्रण मक्खियों के संबंध में एक समग्र विकास अग्रिम या देरी की उम्मीद की जानी थी। चुने गए प्रोटोकॉल को मक्खियों के प्रत्येक समूह के लिए त्रिफला में किया जाना था। यह सलाह दी गई थी कि, eclosion परख प्रोटोकॉल के लिए 2, एक दिया EDC एकाग्रता के लिए एक प्रतिकृति की प्रत्येक श्रृंखला एक ही बिछाने निशान से भ्रूण के साथ बीज थे ताकि EDC सांद्रता भर में भ्रूण मचान में विश्वसनीयता और सटीकता को बनाए रखने के लिए.

अंत में, चित्र 5 उम्र को मापने के लिए महत्वपूर्ण कदम दिखाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, यह आवश्यक था कि विश्लेषण के तहत सभी मक्खियों उम्र और सेक्स द्वारा तुल्यकालिक थे, युग्मित, और एक घनत्व पर रखा काफी कम मुक्त परिसंचरण की अनुमति है. दोनों लिंगों में जीवन के प्रयोग अलग से करना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि पुरुषों और महिलाओं के बीच जीवन में महत्वपूर्ण अंतरहै 44.

एक स्वस्थ जनसंख्या बनाए रखने के लिए हर 3 दिन में भोजन को बदलना पड़ा, और मृत्यु दर का भी हर 3 दिन में मूल्यांकन किया जाना था। एक जीवन स्प्रेडशीट पर, के रूप में चित्र 5में, मृत मक्खियों की संख्या की सूचना दी गई थी, और यह संख्या स्वचालित रूप से पिछले हस्तांतरण से जीवित मक्खियों की संख्या से घटाया जाएगा. प्रत्येक EDC एकाग्रता के लिए और अकेले विलायक के लिए, संचयी उत्तरजीवी बनाम बीता हुआ दिन उम्र घटता प्राप्त करने के लिए साजिश रची गई थी. चित्र 6में एक सामान्य उत्तरजीवी वक्र की सूचना दी गई है; एक लंबी प्रारंभिक अवधि के बाद जिसमें उत्तरजीवी वक्र अपेक्षाकृत उच्च रहा, यह लगभग 60 दिनों के बाद तेजी से गिरावट आई। ईडीसी जोखिम के बाद, इलाज मक्खियों के उत्तरजीवी वक्र काफी प्रभावित हो सकता है। आदेश में निर्धारित करने के लिए अगर इस प्रभाव चयनित EDC के कारण है, यह सलाह दी गई थी कि कम से कम दो, या बेहतर अभी तक बाहर ले जाने के लिए, तीन स्वतंत्र, noncontemporeous प्रतिकृति प्रयोगों.

उपरोक्त प्रोटोकॉल में से प्रत्येक में, यह असंगत शीशियों के लिए संभव था (उदाहरण के लिए, कोई अंडे या असंगत मौतों के साथ); इन शीशियों इस तरह के गरीब भोजन की गुणवत्ता या संक्रमण के रूप में विभिन्न कारणों से उत्पन्न किया जा सकता है, और काफी उपायों के मूल्यों को बदल सकता है। सबसे अच्छा तरीका है इन असंगत स्थितियों का प्रबंधन करने के लिए उन्हें अच्छा प्रयोगात्मक अभ्यास के माध्यम से बचने के लिए किया गया था. तो, यह जोर दिया जाना चाहिए कि, सभी उपरोक्त प्रोटोकॉल के लिए, महान और सावधान काम शीशियों नकल में आवश्यक था, मक्खियों को स्वस्थ रखने, और मक्खियों से निपटने में है कि, एक बार एक EDC के संपर्क में, नाजुक हो सकता है, इस प्रकार मौत का खतरा बढ़ जब हेरफेर.

Figure 1
चित्र 1: खिला परख. एक चयनित EDC (ऊपर) या विलायक अकेले (नीचे) के साथ पूरक मुख्यमंत्री / डाई युक्त शीशियों में वयस्क मक्खियों 24 घंटे के लिए फ़ीड करने के लिए छोड़ दिया जाता है। एक EDC (ऊपर) या विलायक अकेले (नीचे) के साथ पूरक मध्यम पर खिलाया दो मक्खियों उनके पेट पर इसी तरह के रंग दिखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: EDC dosing. आहार द्वारा Drosophila करने के लिए ईडीसी प्रशासन के Schematic. एक आइसोनिक स्टॉक से वयस्क मक्खियों एक EDC (ऊपर) या विलायक अकेले (नीचे) के विभिन्न सांद्रता को उजागर कर रहे हैं. एन - EDC के संदर्भ एकाग्रता. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रजननता परख. प्रोटोकॉल के Schematic, उचित मीडिया में उड़ान विकास से कुंवारी संग्रह करने के लिए और एकल पार करने के लिए कदम का चित्रण. चरण 1: वयस्क (10 शीशियों आठ महिलाओं और चार पुरुषों प्रत्येक के साथ) एक isogenic तनाव से मुख्यमंत्री / (ध्यान दें कि योजना, सादगी के लिए, तीन शीशियों में से सिर्फ एक को संदर्भित करता है.) चरण 2: 4 दिनों के बाद, वयस्कों को छोड़ दिया जाता है, और अंडे दिए जाते हैं जो वयस्क चरण तक 9 दिनों के लिए विकसित होते हैं। चरण 3: नए eclosed वयस्कों सेक्स द्वारा हल कर रहे हैं और शीशियों में एकत्र (अधिकतम 20 पुरुषों / चरण 4: वयस्क लार्वा विकास के इसी माध्यम पर 4 दिनों के लिए उम्र के लिए छोड़ दिया जाता है। चरण 5: एक EDC के बिना सीएम-टमाटर माध्यम में EDC इलाज मक्खियों के लिए 40 एकल पार की स्थापना, 20x एक EDC एक नियंत्रण महिला और 20x एक नियंत्रण पुरुष के साथ एक EDC इलाज महिला (ऊपर); नियंत्रण मक्खियों के लिए 20 एकल पार की स्थापना, 20x एक नियंत्रण महिला (नीचे) के साथ एक नियंत्रण पुरुष. पीला माध्यम एक मुख्यमंत्री नियंत्रण के रूप में एक EDC (ऊपर) या विलायक के साथ पूरक है (नीचे), और लाल मध्यम एक EDC या विलायक के बिना एक टमाटर / कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: विकासात्मक समय(एक्लोशन परख प्रोटोकॉल 2)। बाईं ओर, यह आंकड़ा संग्रह पिंजरे की एक योजना से पता चलता है जिसमें वयस्कों (लगभग 150 महिलाओं और 50 पुरुषों) जमा कदम से पहले अंधेरे में acclimate और दोस्त के लिए रखा जाता है ( प्रोटोकॉल देखें). 2 दिनों के बाद, पुराने फिसलने ट्रे ताजा भोजन के साथ एक के साथ बदल दिया है, और अगले 1 एच में deposed अंडे क्योंकि वे अतुल्यकालिक हैं त्याग रहे हैं. इसके बाद, अंडे एक नया फिसलने ट्रे पर हर 2 घंटे एकत्र कर रहे हैं, गिना, और टमाटर युक्त व्यंजन पर रखा / डेटा (कुल रखी अंडे, अज्ञात अंडे, प्यूपा, और eclosed वयस्कों) विकास समय स्प्रेडशीट (दाएं) की एक श्रृंखला पर सूचित कर रहे हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: लाइफस्पैन परख। एक दिन सिंक्रनाइज़ मक्खियों वयस्क भोजन के साथ एक 250 एमएल की बोतल में स्थानांतरित कर रहे हैं (AM) नियंत्रण के रूप में एक EDC (ऊपर) या विलायक (नीचे) के साथ पूरक, खिला की अनुमति देने के लिए (योजना में छोड़ दिया). 2-3 दिनों के बाद, मक्खियों सेक्स द्वारा हल कर रहे हैं और पांच शीशियों को स्थानांतरित कर रहे हैं (शुरू बोतल के इसी माध्यम युक्त) प्रत्येक सेक्स के लिए, 20 व्यक्तियों के समूहों में / हर 3 दिन, वयस्कों अब आवश्यक (योजना के केंद्रीय भाग) जब तक ताजा शीशियों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। दाईं ओर तालिका की एक योजना है जिसमें प्रत्येक दिन के लिए डेटा रिकॉर्ड किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: लाइफस्पैन वक्र। बाईं ओर, एक प्रतिनिधि तालिका में मृत मक्खियों की संख्या हर 3 दिन दर्ज किया गया है, दोनों उपचार समूह के लिए (मध्यम + EDC [0.05 एमएम EE2]) और नियंत्रण समूह के लिए (मध्यम + विलायक), पूरे प्रयोगात्मक अवधि के दौरान सूचित किया गया है. प्रत्येक समूह के माध्य आयु की गणना MATRIX SUM का उपयोग करके की गई है। उत्पाद; उपचारित समूह ने नियंत्रण समूह की तुलना में औसत आयु को छोटा कर दिया। सही पर, एक ठेठ अस्तित्व वक्र पुरुष EE2 (0.05 एमएम) या नियंत्रण के लिए केवल इथेनॉल युक्त माध्यम के साथ खिलाया मक्खियों का दिखाया गया है. उत्तरजीवी वक्र नियंत्रण समूह की तुलना में इलाज मक्खियों के लिए और अधिक तेजी से कमी आई, एक पहले मोड़ ड्रॉप बिंदु के साथ. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फल मक्खी डी मेलेनोगास्टर को डीबीपी28,बीपीए, 4-एनपी, 4-टर्ट-ओपी29,एमपी30,ईपी31 जैसे पर्यावरणीय ईडीसी के संभावित प्रभावों की जांच करने के लिए एक इनविवो मॉडल प्रणाली के रूप में बड़े पैमाने पर नियोजित किया गया है। 32, DEHP33, और EE234. कई कारणों से अनुसंधान के इस क्षेत्र में एक मॉडल के रूप में इसके उपयोग का नेतृत्व किया है. एक मॉडल प्रणाली के रूप में अपने निर्विवाद लाभ के अलावा, Drosophila मानव के साथ जीन संरक्षण के एक उच्च डिग्री के शेयरों, जिसके लिए Drosophila EDC assays भविष्यवाणी या मानव स्वास्थ्य के लिए संभावित प्रभाव का सुझाव देने में मदद कर सकते हैं. इसके अलावा, Drosophila अकशेरुकी है, जो व्यापक रूप से सभी पारिस्थितिकी प्रणालियों में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं और EDCs के हानिकारक प्रभावों के खिलाफ अधिक से अधिक सुरक्षा उपायों की आवश्यकता है के अंतर्गत आता है. Invertebrates खाद्य श्रृंखला के आधार पर स्थित हैं और वातावरण में वे रहते हैं के लिए बहुत महत्वपूर्ण कार्य करते हैं. यह सूचित किया गया है कि पर्यावरण में जारी कई EDCs कई पशु प्रजातियों के विकास और प्रजनन पर एक हानिकारक प्रभाव हो सकता है. Drosophila प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया जा रहा है, जहां संभावित विकास को प्रभावित करने वाले कारकों, प्रजनन, और उम्र नियंत्रण में रखा जा सकता है ताकि पदार्थ के लिए किसी भी बदलाव का गुण करने के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है.

यहाँ हम हार्मोनल विनियमित जीवन लक्षण जैसे fecundity/fertility, विकास दर, और उम्र पर इस मॉडल प्रणाली में EDC जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. हम इन प्रोटोकॉल है कि यह संभव EE234के प्रभाव की जांच करने के लिए बनाया अनुकूलित है, BPA, और BPAF (अप्रकाशित डेटा) जोखिम, लेकिन वे आसानी से अन्य EDCs के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. विशेष रूप से, इन परख दोनों शुद्ध EDCs और विभिन्न EDCs के संयोजन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अधिक बारीकी से प्रजनन क्या प्रकृति में होता है. हालांकि जाहिरा तौर पर, वे सरल विकास परख की तरह लग सकता है, यह उचित दिशा निर्देशों के अनुसार काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, सटीकता और reproducibility45सुनिश्चित करने. यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि प्रजनन क्षमता, विकास समय, और डी मेलेनोगैस्टर में लंबी उम्र बाहरी और आंतरिक कारकों से प्रभावित हो सकता है। इन महत्वपूर्ण कारकों, photoperiod, तापमान, आर्द्रता, पोषण, जनसंख्या घनत्व, आनुवंशिक संरचना, और उम्र सहित, ध्यान से सूचित प्रोटोकॉल के परिणाम के लिए नियंत्रित किया जाना है. आनुवंशिक परिवर्तनशीलता के घटक को कम करने के लिए, एक isogenic तनाव का इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस तनाव को ध्यान से एक humidified, तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में पाला जाना चाहिए, एक प्राकृतिक 12 एच प्रकाश के साथ:12 एच अंधेरे photoperiod पर 25 डिग्री सेल्सियस.

एक नियंत्रित वातावरण के रखरखाव के अलावा, लार्वा और मक्खी भीड़ से बचा जाना चाहिए। यह सूचित किया गया है कि लार्वा अत्यधिक भीड़ विकास के समय को प्रभावित कर सकती है और गर्मी के झटके या प्रतिरक्षा से संबंधित जीन सहित कई जीनों की अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकती है, जो वयस्क मक्खियों की कुल फिटनेस को प्रभावित करती है46. इसके अलावा, वयस्क मक्खियों को वयस्क तनाव को कम करने के लिए मुक्त आंदोलन की अनुमति देने के लिए कम पर्याप्त घनत्व पर बनाए रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि मक्खियां प्रत्येक उपचार समूह में ईडीसी की तुलनीय मात्रा का उपभोग करती हैं, विभिन्न सांद्रता में यौगिक के स्वाद को ध्यान में रखते हुए, क्योंकि मक्खियां अखाद्य भोजन से बचने के लिए होती हैं। इन प्रोटोकॉल का एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू भोजन की गुणवत्ता है; भोजन भी अच्छा लग रहा होगा, बुलबुले से रहित, बैक्टीरिया दरारें, और इतने पर47,48. इसके अलावा, मक्खियों का परीक्षण करने के लिए तुल्यकालन, संभोग की स्थिति, और लिंग सहवास को ध्यान में रखना आवश्यक है। सभी रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल में, यह महत्वपूर्ण है कि विश्लेषण के तहत समानांतर शीशियों बहुत समान होना चाहिए; अन्यथा, यह समझना मुश्किल होगा कि किसे त्यागना है ताकि अधिकतम ध्यान और अच्छा प्रयोगात्मक अभ्यास की आवश्यकता हो। अंत में, इन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए चयनित EDCs के अंत: स्रावी प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, यह इस तरह के मिथाइल 4 hydroxybenzoate या प्लास्टिक शीशियों के BPA के रूप में इस तरह के माध्यम में मौजूद अन्य EDCs के साथ खाते में संभव बातचीत लेने के लिए महत्वपूर्ण है. इस अर्थ में, एंटीफंगल एजेंट को बदलने, कांच की शीशियों का उपयोग करने, या संभव संदूषकों के साथ और बिना पायलट परख लगाने के लिए उपयोगी हो सकता है।

रिपोर्ट Drosophila परख किसी भी रसायन या रसायनों के मिश्रण के आकलन के लिए बहुत प्रभावी हो सकता है, जैसे EDCs के रूप में, ऐसे प्रजनन, विकास, और उम्र के रूप में हार्मोनल विनियमित जीवन लक्षण पर संभावित प्रभाव का मूल्यांकन करके. हालांकि, इन परख स्पष्ट रूप से EDC प्रतिकूल प्रभाव के लिए जिम्मेदार अंत: स्रावी तंत्र की पहचान करने के लिए सेवा नहीं कर सकते. इस सीमा को दूर करने के लिए, यह संदर्भ EDCs कि कीट अंत: स्रावी प्रणाली पर कार्रवाई की एक निश्चित मोड के प्रतिक्रिया प्रतिनिधि आह्वान का उपयोग करके एक ही प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए संभव है (जैसे, तीसरी पीढ़ी के जेएच या ecdysteroid के रूप में काम कर रहे कीटनाशकों विरोधी/विरोधी)22| वैकल्पिक रूप से, यह भी आणविक समापन बिंदु का उपयोग करने के लिए संभव है, विशिष्ट जीन है कि हार्मोनल विनियमित कर रहे हैं और कि अंत: स्रावी विघटन34के लिए भविष्य कहनेवाला और विशिष्ट biomarkers माना जाता है पर आणविक विश्लेषण बाहर ले.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक तकनीकी सहायता के लिए Orsolina Petillo धन्यवाद. लेखकों ग्रंथ सूची समर्थन के लिए डॉ Mariarosaria Aletta (CNR) धन्यवाद. लेखकों उन्हें EDC दुनिया के लिए शुरू करने के लिए डॉ गुस्तावो Damiano मिता धन्यवाद. लेखकों उनकी सहायता के लिए Leica माइक्रोसिस्टम्स और Pascule Romano धन्यवाद. इस शोध परियोजना PON03PE द्वारा समर्थित किया गया था $00110$1. "Sviluppo di nanotecnologie ओरिएंटेट alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" एक्रोनिमो "सोरिसो"; समिति: पीओ FESR 2014-2020 CAMPANIA; परियोजना पीओ FESR कैम्पेनिया 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 149 Drosophila melanogaster अंत: स्रावी disruptor रसायन fecundity प्रजनन विकास उम्र
<em>ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टर</em> में एंडोक्राइन व्यवधान का परीक्षण करने के तरीके
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Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

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