Developmental Biology

초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535

Tiziana Francesca Bovier¹, Daniela Cavaliere¹, Michele Colombo¹, Gianfranco Peluso², Ennio Giordano³, Filomena Anna Digilio^1,2

¹Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), ²Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), ³Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

내분비 파괴 물질 (EDC)은 유기체와 자연 환경에 심각한 문제를 나타냅니다. 드로소필라 멜라노가스터는 생체 내에서 EDC 효과를 연구하는 이상적인 모델을 나타낸다. 여기에서, 우리는 Drosophila에 있는 내분비 중단을 조사하는 방법을 제시합니다, fecundity에 EDC 효력을, 비옥, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하.

Abstract

최근 몇 년 동안 모든 유기체와 환경이 내분비 장애 화학 물질 (EDC)으로 알려진 호르몬과 같은 화학 물질에 노출된다는 증거가 증가하고 있습니다. 이러한 화학 물질 내 분 비 시스템의 정상적인 균형을 변경 하 고 부작용으로 이어질 수 있습니다., 인간 인구에 호르몬 장애의 증가 뿐만 아니라 또는 방해 성장 및 야생 동물 종에서 감소 된 재생산. 일부 EDC의 경우, 문서화 된 건강 효과 및 그들의 사용에 제한이 있다. 그러나, 그들 대부분에 대 한, 여전히 이 의미에서 과학적 증거가 있다. 전체 유기체에서 화학 물질의 잠재적 인 내분비 효과를 확인하기 위해, 우리는 적절한 모델 시스템뿐만 아니라 과일 파리, Drosophila 멜라 노가스터에서테스트해야합니다. 여기에서 우리는 초파리에 있는 내분비 중단을 공부하기 위하여 생체 내비염에서 상세한 보고, fecundity/불임에 EDC 효력을, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하. 지난 몇 년 동안, 우리는 17-α-에티닐에스트라디올 (EE2), 비스페놀 A (BPA) 및 비스페놀 AF (BPA F)에 노출의 효력을 조사하기 위하여 이 Drosophila 생활 특선 특성을 이용했습니다. 전부, 이 asays는 모든 Drosophila 생활 단계를 커버하고 가능한 모든 호르몬 중재프로세스에 있는 내분비 중단을 평가하는 가능하게 했습니다. fecundity/fertility 및 발달 타이밍 측정은 각각 비행 생식 성과 및 발달 단계에 EDC 충격을 측정하는 데 유용했습니다. 마지막으로, 수명 분석성인에 만성 EDC 노출을 관련시키고 그들의 생존을 측정했습니다. 그러나, 이러한 생활 특성또한 신중 하 게 제어 했다 몇 가지 실험 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 그래서, 이 작품에서는, 우리는 이 검소의 적당한 결과를 위해 우리가 최적화한 일련의 절차를 건의합니다. 이 방법은 과학자가 어떤 EDC든지를 위한 내분비 중단을 설치하거나 Drosophila에 있는 다른 EDC의 혼합물을 위해, 효력에 책임 있는 내분비 기계장치를 확인하기 위하여, 추가 에세이가 필요할 수 있었습니다.

Introduction

인간의 활동은 유기체와 자연 생태계에 대한 심각한 문제를 나타내는 화학 물질의 엄청난 양의 환경에 방출되고있다¹. 이러한 오염 물질 중 약 1,000 개의 다른 화학 물질이 내분비 시스템의 정상적인 균형을 바꿀 수 있다고 추정됩니다. 이 속성에 따르면, 그들은 내분비 파괴 화학 물질 (EDC)로 분류됩니다. 구체적으로, 내분비 학회에 의한 최근의 정의에 기초하여, EDC는 "호르몬 작용의 어떤 양상든지 방해할수 있는 외인성 화학물질, 또는 화학물질의 혼합물"2 . 지난 3 년 동안, EDC가 동물과 식물의 번식과 발달에영향을 미칠 수 있다는 과학적 증거가 증가하고있다 3,^4,⁵^,⁶^,⁷^, ⁸. 또한, EDC 노출은 암, 비만, 당뇨병, 갑상선 질환 및 행동 장애를 포함하는 일부 인간 질병의 증가 보급과 관련이^있다9,^10,^11.

EDC의 일반적인 메커니즘

그들의 분자 속성 때문에, EDC는 호르몬 또는 호르몬 전구체 처럼 행동^3,^4,⁵^,⁶, 7^,⁸^,⁹^, ¹⁰^,¹¹^,¹². 이 의미에서, 그들은 호르몬의 수용 체에 바인딩 하 고 호르몬 활동을 모방 하 여 또는 내 인 성 호르몬 바인딩을 차단 하 여 내 분 비 시스템을 중단 수 있습니다. 첫 번째 경우에, 수용 체에 바인딩 후, 그들은 그것의 자연 호르몬 으로 그것을 활성화할 수 있습니다. 다른 경우에는 EDC를 수용체에 결합하면 자연 호르몬의 결합을 방지하므로 수용체가 차단되고 자연 호르몬이있는 경우에도 더 이상활성화 될 수 없습니다 3. 결과적으로, EDC는 항상성의 유지 보수, 재생산, 발달 및 / 또는 행동의 유지를 담당하는 내인성 호르몬의 합성, 분비, 수송, 신진 대사 또는 말초 작용과 같은 여러 과정에 영향을 미칠 수 있습니다. 유기체. 수용체 결합은 EDC에 대해 지금까지 설명된 유일한 작용 방법이 아니다. 그것은 지금 그(것)들이 또한 효소 통로에 있는 coactivators 또는 코어프레서를 모집하거나 유전자 발현을 통제하는 후성 유전학 마커를 수정해서 작동할 수 있다는 것을 명백합니다^10,^11,^12,¹³ ^,¹⁴, 현재 세대뿐만 아니라 올 세대의 건강에 대한 뿐만 아니라 결과와^{함께 8}.

초파리 호르몬

선택된 EDC의 잠재적인 효력은 야생 동물 종및 내분비 기계장치가 합리적으로 잘 알려진 몇몇 모형 체계에서 넓게 공부되었습니다. 무척추 동물의 경우, 성장, 개발 및 번식에 영향을 미치는 내분비 시스템은 생물학적 연구 분야에서 광범위하게 사용, 경제적 중요성 및 여러 가지 이유로 곤충을 광범위하게 특징으로합니다. 마지막으로 해충 곤충의 호르몬 시스템을 구체적으로 방해 할 수있는 살충제의 개발.

특히, 곤충 중에서 과일 플라이 D. 멜라노가스터는 EDC의 잠재적 내분비 효과를 평가하는 매우 강력한 모델 시스템으로 입증되었습니다. D. 멜라노가스터에서,뿐만 아니라 척추 동물에서, 호르몬은 전체 수명 주기 에 걸쳐 중요 한 역할을. 이 유기체에는 스테로이드 호르몬 20-하이드록시엑디손(20E)^15,^16,세스키트르페노이드 청소년 호르몬(JH)^17,및 뉴로펩타이드 및 펩티드/단백질을 포함하는 3가지 주요 호르몬 시스템이 있다. 호르몬¹⁸. 이 세 번째 그룹은 장수, 항상성, 신진 대사, 재생, 기억 및 운동 조절과 같은 다양한 생리 적 및 행동 과정에 명확하게 관여하는 여러 펩티드로 구성되어 있습니다. 20E는 에스트라디올과 같은 콜레스테롤 유래 스테로이드 호르몬에 상동성이며 JH는 레티노산과 몇 가지 유사점을 공유합니다. 둘 다 초파리19,^20에서더 잘 알려진 호르몬이다. 그들의 균형은 몰팅과 변태를 조정하는 데 매우 중요하며, 재생, 수명 및 행동^21과같은 여러 개발 후 프로세스를 제어하여 내분비 검사를 위한 다양한 가능성을 제공합니다. 초파리에 있는 중단. 또한, ecdysteroid 호르몬과 JHs는 곤충에 있는 발달과 생식 내분비 중재프로세스를 방해하기 위하여 개발된 소위 제 3 세대 살충제의 주요 표적입니다. 이러한 화학물질의 작용의 작용의 작용의 작용 또는 길항제 모드는 잘 알려져 있으며, 따라서 곤충의 성장, 번식 및 발달에 대한 잠재적 EDC의 영향을 평가하기 위한 기준으로서 작용할 수 있다^22. 예를 들어, 메토프레네는 모기 및 기타 수생^곤충(23,^24)을조절하는 데 널리 사용되어 왔으며, JH 작용제로서 작용하고 20E-유도 유전자 전사 및 변태를 억압한다.

호르몬 이외에, 핵 수용체 (NR) 초등파의 슈퍼 패밀리는 또한 잘 알려져 있다; 그것은 호르몬 의존적인 발달 통로 통제에서 관련시킨 18의 진화적으로 보존한 전사 요인, 뿐만 아니라 재생산 및 생리학^25로이루어져 있습니다. 이 호르몬 NR은 신경전달에 관여하는 사람들을 포함하여 모든 6개의 NR superfamily 특수형에 속합니다 26, 레티노산 NR을 위한 2개, 및 척추동물에서, EDC27의 1차 표적의 한을 나타내는 스테로이드 NR을 위한 그.

EDC 를 연구하기위한 모델 시스템으로 초파리

현재 분자 특성에 기초하여 전 세계의 여러 환경 기관은 내분비 계통을 다른 인공 화학 물질에 방해할 수 있는 잠재력을 기인하고 있습니다. EDC가 환경과 유기체에 대한 세계적이고 유비쿼터스적인 문제라는 점을 감안할 때, 이 분야의 연구의 전반적인 목표는 질병 부담을 줄이고 살아있는 유기체를 부작용으로부터 보호하는 것입니다. 화학 물질의 잠재적인 내 분 비 효과 대 한 이해를 심화 하기 위해, 생체 내에서 그것을 테스트 하는 데 필요한. 이를 위해, D. 멜라노가스터는 유효한 모델 시스템을 나타낸다. 현재까지, 과일 파리는 여러 환경 EDC의 효과를 평가하기 위해 생체 내 모델로 광범위하게 사용되어 왔다; 디부틸 프탈레이트(DBP)^28,비스페놀 A(BPA), 4-논일페놀(4-NP), 4-테르트-옥틸페놀(4-tert-OP)^29,메틸파라벤(MP)^30,에틸파라벤(EP) 30, 에틸파라벤(EP)^31, ^32,비스-(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP)^33,및 17-α-에티닐에스트라디올(EE2)^34,척추동물 모델에서와 같이 대사 및 내분비 기능에 영향을 미친다. 몇 가지 이유가 연구의이 분야에서 모델로 그것의 사용을 주도 했다. 내분비 시스템에 대한 뛰어난 지식을 넘어, 더 많은 장점은 짧은 수명 주기, 저렴한 비용, 쉽게 관리 게놈, 연구의 오랜 역사, 여러 기술적 가능성 (FlyBase 웹 사이트, http://flybase.org/ 참조)를 포함한다. D. melanogaster는 또한 환경 요인에 대한 세대 간 효과 및 인구 반응을 쉽게 연구하기위한 강력한 모델을 제공8 높은 동물의 생체 내 연구와 관련된 윤리적 문제를 방지 할 수 있습니다. 또한, 과일 파리 예측 또는 인간의 건강에 대 한 이러한 화학 물질의 잠재적인 효과 제안에 도움이 Drosophila EDC 검사에 대 한 가능 할 수 있는 인간과 유전자 보존의 높은 학위를 공유. 인간의 건강 효과에 대한 이해를 확대하는 것 외에도, Drosophila는 생물 다양성 손실 및 환경 저하와 같은 환경에 대한 EDC 노출의 위험을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 과일 파리는 실험실에서 사용되는 추가 이점을 제공하며, 이 곳에서 잠재적으로 개발, 번식 및 수명에 영향을 미치는 요인이 테스트할 물질의 변형을 특성화하기 위해 통제할 수 있습니다.

이 점을 염두에 두고, 우리는 여성/불 임, 발달 타이밍 및 성인 수명과 같은 일부 Drosophila 호르몬 특성에 EDC 효과를 결정하기 위한 간단하고 강력한 피트니스 분석에 최적화했습니다. 이러한 어세이는 일부 EDC^23,^24,^25,^26,^27에널리 사용되어 왔다. 특히, 우리는 합성 에스트로겐 EE2(34) 및 BPA 및 비스페놀 AF(BPA F)에 대한 노출의 효과를 평가하기 위해 다음 프로토콜을 사용하였다(미공개 데이터). 이러한 프로토콜은 D. melanogaster에있는 다중 EDC의 결합된 효력 뿐만 아니라, 한 번에 주어진 EDC의 효력을 조사하기 위하여 쉽게 수정될 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 음식 준비

재고 유지 및 애벌레 성장을 위해 3 % 분말 효모, 10 % 자당, 9 % 미리 조리 된 옥수수 가루, 0.4 % 한천을 포함하는 옥수수 가루 배지를 사용하십시오.
1. 효모 30g을 수돗물 100 mL에 넣고 끓여서 15 분 동안 끓입니다.
2. 별도로, 미리 조리된 옥수수가루 90g, 설탕 100g, 한천 4g을 수돗물 900 mL에 잘 섞습니다.
3. 용액을 끓이고 불을 낮추고 5 분간 계속 저어줍니다.
4. 5분 후, 뜨거운 효모 용액을 넣고 15분 간 더 끓입니다.
5. 열원을 끄고 용액을 약 60°C로 식힙니다.
6. 에탄올에 메틸 4-하이드록시벤조에 5 mL/L을 넣고, 완전히 섞어서 10분 간 기다립니다.
  참고: 고농도의 살균제가 유충에게 치명적일 수 있다는 점을 감안할 때 메틸 4-하이드록시벤조이트(methyl 4-hydroxybenzoate)의 양에 주의하십시오.
7. 바이알/병에 매 개체를 분배합니다: 각 플라이 바이알(25mm x 95mm)에 8mL, 각 플라이 바이알(22mm x 63mm)에 3mL, 각 플라이 보틀(250mL)에 60mL를 분배합니다.
8. 바이알을 치즈천으로 덮고 보관 하기 전에 24 시간 동안 실온 (RT)에서 건조시키십시오.
9. 사용된 한천의 양 및/또는 냉각/건조 시간을 수정하여 CM의 실험적으로 올바른 일관성과 수분을 교정합니다.
  참고: 플러그를 뽑지 않고, 박스로 포장되고, 포장된 바이알은 4°C에서 약 15일 동안 안정적입니다.
Drosophila 성인의 경우, 10 % 분말 효모, 10 % 자당, 2 % 한천을 함유 한 배지를 사용하십시오.
1. 가루 효모 10g, 자당 10g, 한천 2 g을 증류수 100 mL에 섞습니다.
2. 이 혼합물을 전자레인지를 사용하여 3분 간격으로 두 번 끓이거나 한천이 녹을 때까지 끓입니다.
3. 용액이 60°C로 냉각되면 에탄올에 10% 메틸 4-하이드록시벤조에 5 mL/L을 넣고 완전히 섞어서 바이알(바이알당 10mL)을 분배합니다.
4. 치즈 천으로 바이알을 덮고 보관하기 전에 RT에서 24시간 동안 말리십시오.
  참고: 플러그를 뽑지 않고, 박스로 포장되고, 포장된 바이알은 4°C에서 약 15일 동안 안정적입니다.
여성분비/불임 분석의 경우, 초파리 토마토 주스-옥수수가루 매체를 사용하십시오.
1. 따뜻한 옥수수가루 음식 70mL를 100 mL 비커에 붓고 토마토 주스 30 mL (30 % v / v)를 추가하십시오.
2. 푸드 프로세서와 파이펫 3 mL를 작은 바이알에 완전히 섞으세요.
3. 바이알을 치즈천으로 덮고 보관 하기 전에 RT에서 24 시간 동안 건조시키십시오.
  참고: 플러그를 뽑지 않고, 박스로 포장되고, 포장된 바이알은 4°C에서 약 15일 동안 안정적입니다.
배아 수집을 위해 한천 접시에 한천, 30% 토마토 소스, 설탕 3%를 넣으세요.
참고 : 접시에 매체를 부을 때 거품을 만들지 않도록주의하십시오.

2. 초파리 EDC 소약

선택한 EDC를 적합한 용매에 용해하는 적절한 스톡 용액을 준비한다. EE2(분자량 296.403)의 경우 10mL에 10mL에 1.48 g를 용해하여 0.5M 스톡 용액을 만들고 -80°C에서 보관합니다.
주의 사항: EDC는 환경 오염 물질로 간주되며 이를 처리할 때 예방 조치를 취해야 합니다.
100 mM 용액을 얻기 위해 EE2 스톡 용액을 물 (v / v)에 10 % 에탄올로 희석하십시오. CM 식품에서 다음 희석(0.1 mMM, 0.5 mM 및 1 mM)을 가장 낮은 농도로 시작하여 각 처리 군에 대해 동일한 최종 농도의 용매를 사용합니다. 제어 용 바이알은 용매단독의 동일한 부피를 사용한다.
참고 : 에탄올의 최종 농도가 플라이 푸드에서 2 %를 초과해서는 안된다는 것을 염두에 두고 용매의 최종 농도를 가능한 한 낮게 유지하는 것이 좋습니다.
고형화 하기 전에 옥수수 가루 기반 식품에 선택 된 EDC의 오른쪽 희석을 포함 하는 솔루션을 추가, 식품 프로세서와 철저 하 게 혼합, 바이알에 10 mL를 분배, 면 거 즈로 커버 하 고 사용 하기 전에 16 시간 동안 RT에서 건조 하자.
참고 : 준비 직후이 매체를 사용하십시오.
성인 양육을 위해, EE2(0.1 mM)의 원하는 농도를 얻기 위해, 각각 10% 에탄올(v/v)과 층 100 μL의 물(v/v)에서 다른 작동 EE2 용액(각각 10mMM, 100mMM)을 준비합니다. , 0.5 mM 및 1 mM). 제어용은 용매단독의 동일한 부피를 사용한다.
참고: 또는, 선택된 EDC의 오른쪽 희석을 함유하는 용액을 50 mL 원엽 튜브에 소량의 AM에 첨가하고, 소용돌이를 철저히 하고, 1 mL을 AM 바이알의 표면에 계층화한다.
1. 면 거즈로 바이알을 덮고 RT에서 12-16 시간 동안 부드러운 교반으로 건조시키고 즉시 사용하십시오.
  참고 : 건조 공정은 주변 습도에 따라 달라지므로 실험적으로 조정해야합니다.
수유 분석의 경우, 선택한 EDC(EE2 0.1 mM, 0.5 mM 및 1mM)의 오른쪽 희석을 포함하는 용액과 착색 식품(예: 적색 염료 40호(1 mg/mL)을 CM에 첨가한 후, 고화하기 전에 CM에^35번을 넣고 식품 가공업체와 함께 강하게 섞은 다음 분배합니다. 전자를 바이알로 넣습니다.

3. 파리 사육

실험실에서 여러 세대에 의해 유지되는 오리건 R과 같은 견고한 등소원 균주를 사용하십시오.
가습, 온도 제어 인큐베이터에 파리를 유지, 자연 12 시간 빛: CM 식품을 포함 하는 유리병에 25 °C에서 12 시간 어두운 포토 기간.
각 분석에서 RT에서 바이알을 사용하십시오.

4. 먹이 분석

참고: 이 분석실험은 배지에 선택된 EDC의 존재가 파리의 먹이에 영향을 미칠 수 있는지 시험하는 것이 좋습니다.

선택한 EDC와 착색 식품의 다른 농도로 보충 CM을 포함하는 유리병에 15 어린 파리를 넣어. 파리가 1일 동안 미디어를 통해 먹을 수 있도록 허용합니다.
참고:예를 들어, 적색 염료 번호 40³⁵ (1 mg/mL)를 사용하십시오.
15마리의 어린 파리를 CM이 들어 있는 바이알에 넣고 용매만으로 보충하고 조절을 위한 착색식품을 넣습니다. 파리가 1일 동안 미디어를 통해 먹을 수 있도록 허용합니다.
각 비행 그룹이 에테르로 개별적으로 마취합니다.
1. 각 그룹의 파리를 열린 끝에 삽입된 깔때기로 원통형 유리 용기(에테르이저)로 옮기고, 깔때기 위에 바이알을 반전시키고 두 용기를 함께 부드럽게 두드려 파리가 에테르라이저에 빠지게 합니다.
  참고: 깔때기는 에테르이저에서 빠져 나오지 못하게 합니다.
2. 노크는 마우스 패드와 같은 부드러운 표면에 에테르이저를 가볍게 두드려 날아가서 깔때기를 에테르에 적신 면과 거즈 플러그로 빠르게 교체합니다.
3. 파리가 바닥으로 떨어질 때까지 약 1 분 정도 기다렸다가 움직이지 않습니다.
  참고 : 시간을 초과하거나 파리가 죽을 것을 초과하지 마십시오.
고정된 파리를 스테레오 현미경 아래에 놓고 대조군에 대하여 각 치료군의 복부 착색을 비교한다.

5. 여성분과/불임 분석

각 EDC 농도에 대 한, 준비 3 파리의 유리병, 그 후 라는 부모 유리병, 와 함께 8 여성 과 4 남성 10 mL CM/EDC 음식에; 대조군을 위해 용매로 보충된 10 mL CM 식품에 암컷 8마리와 수컷 4마리를 가진 파리 6병을 준비한다. 후면은 25°C에서 인큐베이터로 날아갑니다.
참고 : 개발 하는 동안 과밀 유충을 방지 하 고 치료에 걸쳐 일관 된 애벌레 밀도 사용 하려고.
4 일 후, 부모를 제거하고 5 일 동안 인큐베이터에 바이알을 반환합니다.
9일 늦은 오후에, 바이알에서 새로 날아온 모든 파리를 제거하고 밤새 18°C에서 인큐베이터에 바이알을 넣는다.
참고: 이 제거는 매체의 표면을 잘 확인, 매우 신중하게 수행해야합니다.
1. 10일 아침, 각 치료 군에 대해, 밝은 CO₂ 마취하에 처녀 여성과 젊은 남성을 두 그룹으로 모읍니다. 무작위로 작은 하위 그룹 (10 여성과 유리병 당 20 남성)에 파리의 각 그룹을 신선한 해당 CM으로 채워진 독립적 인 유리병에 세분화.
  1. 반복 단계 5.3.1 조심스럽게 수집하기 전에 바이알 8-10 시간에서 모든 파리를 제거하고 18 °C에서 바이알을 두고, 각 EDC 농도에 대해 적어도 30 처녀 여성과 30 마리의 남성을 얻을 때까지 적어도 90 처녀 여성과 90 남성을 대조합니다.
2. 이 파리 그룹을 25°C에서 4일 후 부터 숙성시키고, 2일마다 신선한 상응하는 배지를 함유하는 새로운 바이알로 옮김을 넣는다.
  참고 : 4 일은 파리가 성숙한 성인이되기에 충분한 시간이지만 노화의 시작과는 매우 거리가 있습니다.
3. 이틀 후 여성의 유리병에 애벌레가 없는지 확인하십시오. 그들이 할 경우, 파리는 처녀가 아니기 때문에 사용할 수 없으며 버려야합니다.
아래 설명된 바와 같이 각 치료 그룹에 대해 각 성별의 단일 파리 20개를 사용하여 EDC없이 신선한 CM-토마토 배지를 함유하는 작은 바이알에 20개의 단일 십자가를 설정합니다.
1. 각 치료 그룹에 는 고유하게 식별하고 각각의 바이알에 라벨을 지정하는 다른 일련의 순차적 숫자를 할당합니다. 예를 들어, 그룹1(용매 단독)은 1~20, 그룹 2(EDC 농도 x) 등등이다.
2. 다산 스프레드시트를 만들어 각 계열이 치료 그룹에 해당하는 다른 계열을 기록합니다.
3. 각 성체에 대해 가벼운 CO 2하에서 각 치료 그룹에 속하는 모든 파리를 마취시키고 다음과 같이 무작위로 전달한다.
  1. EDC 없이 신선한 CM-토마토 배지를 함유하는 작은 바이알에 용매 처리된 암컷 1개를 옮기고 대조군 십자가에 용매 처리된 수컷 을 1개 첨가한다.
    참고 : 어두운 매체는 흰색 배아와의 대비를 증가시키기 때문에 토마토 주스는 준비 중에 매체에 추가해야합니다.
  2. EDC 없이 신선한 CM-토마토를 함유하는 작은 바이알에 처리된 1개의 EDC를 옮기고 각 치료에 대해 1개의 용매 처리 된 남성을 추가합니다.
  3. EDC 없이 신선한 CM-토마토 배지를 함유하는 작은 바이알에 처리된 1개의 EDC를 옮기고 각 치료에 대해 1개의 용매 처리 암컷을 첨가하였다.
4. 이 모든 단일 십자가를 25°C에서 보관하십시오.
이후 10일 동안 매일 EDC가 없는 신선한 CM-토마토 바이알에 각 짝짓기 쌍을 옮김을 옮김을 드시면 됩니다. 각 계열의 복제된 바이알에 순차적으로 라벨을 붙입니다. 예를 들어 1-a, 1b, 1c... 20a, 20b, 20c 및 불임 스프레드시트에 이 숫자를 보고합니다.
매일 각 유리병을 육안으로 검사하고 다산 스프레드시트에 그 수를 보고합니다.
각 유리병을 저장하고, 새로 파리가 등장하기 시작할 때, 또한 10 일 기간 동안 성인 자손의 일일 수를 기록합니다. 초기 짝짓기로부터 10 일 후에 부모를 제거하십시오.
참고 : 하나 또는 두 부모가 사망 한 유리병을 폐기; 부모 중 하나 또는 둘 다의 탈출의 경우, 잃어버린 날까지 모든 데이터를 분석에 포함시다.
각 치료 그룹에서 계란의 일일 수와 성인 자손의 일일 수를 합하면, 총 여성 /불임, 10 일 동안 비행에 의한 평균 계란 및 성인 자손 생산, 그리고 총 자손의 비율을 총 계란 의 총 수에 따라 다수 낳는다. 대조군과 관련하여 각 치료 값의 백분율 차이를 계산합니다.
각 치료 그룹에 대해 최소 10개의 파리를 사용하여 각 파리 그룹에 대해 3개의 독립적인 실험을 수행합니다.
통계 분석을 수행하여 여러 그룹을 비교합니다.

6. 발달 시기

참고: 다음 의정서 2개에서 발달 타이밍은 하루에 형성되는 번데기의 수와 하루에 종결되는 성인 자손의 수를 모두 계산하여 평가된다.

에클로시온 분석 프로토콜 1
1. 각 치료 그룹에 대해, EDC가없는 10 mL 옥수수 가루 음식에 각각 6 마리의 암컷과 3 마리의 남성과 함께 건강한 파리 10 개의 젊은 (&2 일)의 바이알을 설정합니다.
2. 24 시간 동안 음식에 날아 보자, 그들이 짝짓기를 할 수 있도록.
3. 대조군을 위해 다른 EDC 농도 또는 용매 단독으로 보충된 신선한 옥수수가루 식품각각 10 mL로 치료 군당 10개의 평행 바이알을 준비한다. 이 새로운 바이알로 메이트된 파리를 옮김을 옮김.
  참고 : 각 치료 그룹에 대해 고유하게 식별하고 각 바이알에 레이블을 지정하는 순차적 숫자의 다른 시리즈를 할당합니다.
4. 여러 계열을 기록하기 위해 개발 스프레드시트를 만듭니다.
5. 파리가 16시간 동안 알을 낳을 수 있도록 허용합니다. 그런 다음 유리병에서 부모를 제거합니다.
  참고: 상위 파리는 6.1.5 단계를 반복하는 데 사용할 수 있으며, 이를 다른 상응하는 바이알로 전송할 수 있습니다.
6. 25 °C에서 3-4 일 동안 또는 더 이상 번데기 형태가 없을 때까지 바이알을 배양하십시오. 매일 각 유리병에 새로 번다의 수를 계산하고 개발 스프레드 시트에보고합니다. 같은 강아지를 두 번 계산하지 않으려면, 바이알의 외부에 영구 마커와 함께 각 강아지에서 순서대로 숫자를 작성합니다.
7. 9일부터 매일 신진 성인수를 계산하여 더 이상 성인이 나오지 않도록 하고 발달 스프레드시트에 보고합니다.
8. 이러한 원시 데이터로부터, 평균 애벌레 기간, 평균 pupal 기간, 대조군과 관련하여 각 치료의 백분율의 차이를 계산한다.
9. 각 치료 그룹에 대해 최소 5개의 바이알을 사용하여 파리의 각 그룹에 대해 3개의 독립적인 실험을 수행합니다.
10. 통계 분석을 수행하여 여러 그룹을 비교합니다.
에클로시온 분석 프로토콜 2
1. 후면 젊고 건강한 여성 (약 150)과 남성 (약50)은 신선한 베이커 효모 페이스트 (5 mL의 베이커 효모 3g)를 보충 한 한 천 토마토 배지로 수집 케이지 (재료 표)에 날아 갑니다. 25 °C에서.
2. 이 2 일 동안, 파리가 계란 수집을 시작하기 전에 어둡고 조용한 장소에서 케이지에 적응하고 하루에 두 번 누워 트레이를 변경합니다.
3. 셋째 날에는 이른 아침에 누워 있는 트레이를 교체하십시오. 1 시간 후, 누워 트레이를 교체, 이 누워 계란을 폐기.
4. 파리가 2 시간 동안 계란을 낳고 신선한 누워 트레이로 교체 할 수 있습니다.
  참고: 3 일째까지, 좋은 누워 트레이는 2 시간 안에 100-200 개의 계란을 생산해야합니다.
5. 각 치료 군에 대해, 해당 EDC 농도 또는 용매만으로 보충된 토마토 옥수수가루 식품을 함유한 3개의 60mm 접시시리즈를 준비하고 각 시리즈를 개발 타이밍 스프레드시트에 보고합니다. 또는, 선호하는 경우, 요리 대신 바이알을 사용하십시오.
6. 페인트 브러시 나 프로브를 사용하여 현미경으로 계란을 부드럽게 집어 들고 각 접시 / 유리병의 중간 크기로 옮김으로 옮김하십시오. 계수를 용이하게하기 위해, 누워 트레이에, 10 각각의 5 그룹으로 계란을 배열하고 한 번에 하나씩 전송합니다.
  참고: 충분한 배아를 얻기 위해 필요한 만큼 6.2.4 단계를 반복합니다.
7. 이 모든 요리/유리병을 25°C에 보관하십시오. 또한 각 누워 트레이를 25°C에서 보관하고, 누워 있는 계란의 총 수를 계산한다.
8. 24-30 시간 후, 입체 현미경에서 각 접시 / 유리병을 확인하고 흰색, 수정되지 않은 계란의 수와 어두운 죽은 배아의 수를 모두 계산합니다.
9. 접시/바이알당 '총 배아' 값을 얻기 위해 50개의 이송된 계란 값에서 흰색, 수정되지 않은 계란의 수를 뺍니다. 어두운 죽은 태아의 수는 배아 발생 동안 잠재적인 EDC 독성 효과 확인 하는 데 사용할 수 있습니다.
10. Eclosion 분석 프로토콜 1의 6.1.6-6.1.10 단계를 반복합니다.

7. 수명 프로토콜

8마리의 암컷과 4마리의 암컷으로 20개의 파리 를 설치하고 CM(각 10mL)에서 25°C에 집을 마련합니다.
4 일 후 파리를 버리고 인큐베이터에 다시 바이알을 놓습니다.
참고 : 이 파리는 파리의 다른 연령 동기화 코호트를 얻기 위해 다시 시작하는 데 사용할 수 있습니다.
9일 늦은 오후에 바이알에서 새로 날아온 모든 파리를 제거하고 바이알을 인큐베이터로 되돌려 보라고 합니다.
참고 : 몇 성인은 9 일 일찍 닫기 시작해야합니다; 이 파리를 폐기하면 동기화 된 파리의 최대 수를 수집 할 수 있습니다, 초기 비상 사태의 부주의 선택을 피하기.
16-24 시간 후, 성인 파리 (1 일 이전)를 두 남녀의 4 개의 그룹으로 옮기고 250 mL 병을 함유 한 AM 식품을 함유 한 3 개의 다른 EDC 농도와 용매 만으로 보충했습니다. 필요한 경우 다음 날 다른 일괄 처리를 수집합니다.
2-3일 동안 25°C에서 파리를 유지하여 메이트할 수 있도록 합니다.
참고 : AM 음식 바이알로 전송하는 날은 성인의 첫 날에 해당합니다.
2-3 일 후, 가벼운 CO₂ 마취하에 성별에 의해 파리의 각 코호트를 두 그룹으로 분류합니다. 각 치료당 각 성별에 대해 3개의 평행 바이알이 있을 때까지 바이알 당 20명의 개인의 밀도로 치료당 5개의 바이알로 무작위로 세분화합니다.
참고: CO2에 장시간 노출되기 때문에 가능한 오래 지속되는 건강 문제를 방지하기위해 파리의 작은 그룹과 함께 일합니다.
각 전송에서 생존자 수를 자동으로 가져오는 방식으로 죽은 파리의 수가 살아남은 파리 수에서 이전 전송으로 차감되는 수명 스프레드시트를 준비합니다.
전송은 동시에 3 일마다 해당 음식이 들어있는 새로운 유리병으로 날아 와 사망여부를 확인합니다.
참고 : 전송은 비행 장수에 장기적인 부정적인 영향을 미칠 수있는 마취없이 이루어져야합니다.
1. 각 전송에서, 파리의 나이와 죽은 파리의 수를 기록합니다.
  참고: 살아남은 파리의 수는 스프레드시트에서 자동으로 계산되지만 시각적으로 확인하는 것이 좋습니다. 전송 중에 실수로 탈출하거나 사망한 파리는 고려해서는 안 됩니다. 스프레드시트에서 이 메모를 보고하는 새 유리병으로 운반된 죽은 파리를 두 번 계산하지 않도록 주의하십시오.
2. 모든 파리가 죽을 때까지 7.8 및 7.8.1 단계를 반복합니다.
각 치료 군에 대해, 도6에 도시된 바와 같이 생존 곡선을 생성하고, 특정 시간에 비행의 생존 확률을 표시하기 위해.
각 실험에 대해 100개의 새로 폐쇄된 파리를 사용하여 파리의 각 치료 그룹에 대해 3개의 독립적인 실험을 수행합니다.
평균 수명(각 그룹에 대한 모든 파리의 평균 생존 일수), 반사년(사망률 50%에 도달하는 데 필요한 일의 기간) 및 최대 수명(사망률 90%에 도달하는 데 필요한 최대 일수)을 보고하는 테이블을 준비합니다.
대조군에 대하여 각 처리 단 사이 백분율에 있는 차이를 계산합니다.
통계 분석을 수행하여 다른 치료 군을 비교합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

이 섹션에서는 위의 프로토콜의 주요 단계가 단순화된 체계의 형태로 보고됩니다. 파리가 불쾌한 화합물을 피하는 경향이 있다는 것을 감안할 때, 가장 먼저 해야 할 일은 선택한 EDC의 맛을 분석하는 것입니다. 이는 식품 착색제(예를 들어, 적색 식품 염료 제40호)(35)를 다양한 용량으로 또는 단독으로 선택된 EDC로 보충된 식품과 혼합함으로써 행해질 수 있다. 이러한 매체에 공급된 파리는 입체현미경으로 검사되고 음식 섭취량은 복부착색에 의해 추정됩니다(그림 1). 전형적인 바람직한 상황은 2명의 성인 암컷을 가진 그림 1에 도시됩니다: 선택된 EDC를 포함하는 매체에 공급하고 하나는 EDC를 포함하지 않는 매체에, 둘 다 그들의 복부에 있는 동일 착색을 제시합니다.

그것은 널리 받아 들여졌다 EDC, 자연 호르몬 처럼, 매우 낮은 복용량에 효과 가지고 있으며, 복용량과 효과 사이 간단 하 고 선형 관계^29,더 높은 복용량반드시 더 큰 효과 가지고 있지³⁶^, ³⁷. 그래서, 복용량 응답 접근 보다는, 완전히 그들의 영향을 평가 하기 위해, 더 많은 복용량을 사용 하는 것이 좋습니다., 환경 또는 다른 유기 체에 대 한 관련 농도에서 시작. 어쨌든, 각 치료 군에서 파리가 EDC의 비교 가능한 양을 소화하는지 확인하기 위해 사용된 각 농도에서 EDC 맛을 분석하는 것이 중요합니다(그림 2).

내 분 비 중단 다 산 등 동물 생리학의 많은 중요 한 특성에 영향을 미치는, 장 수, 그리고 개발, 따라서, EDC를 테스트 하는 데 유용한 끝점. 위의 프로토콜에 대 한, 우리가 이러한 Drosophila 생활 특성에 EDC 효과 측정 하도록 최적화, 주요 고려 사항은 테스트 하기 전에 올바르게 조작 해야 하는 젊고 건강 한 파리를 사용 하 여 필수적이다. 이를 염두에 두고 중고 식품의 생산, 취급 및 보관에 큰 주의를 기울여야 합니다. 또한, 선택된 EDC에 대해 적절한 최종 농도(즉, 디메틸 설폭사이드[DMSO]의 경우 1% 미만, 에탄올의 경우 2% 미만)에서최상의 용매를 사용하는 데 주의를 기울여야 한다 30.

출산과 다산은 D. 멜라노가스터의생식 성공을 평가하는 데 사용되었습니다. 도 3은 사용된 프로토콜의 구성표를 나타낸다. 출산은 총 계란 의 수로 실험적으로 측정되고, 다산은 총 성인 자손으로 측정됩니다. 성인 생활의 첫 10 일 동안 계란 생산이 유기체^38,^39,불임 및 여성성 검사의 전체 성인 생활 에 대한 좋은 참조라는 점을 고려하여 10 일 동안 수행 할 수 있습니다. 노출된 애벌레에서 부화한 4일 된 파리를 사용합니다. 각 그룹의 병렬 바이알에서 유사한 값을 얻는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 분석에서 제거할 튜브를 상상하기 가 어렵습니다. 그래서, 매일 각 복제 유리병을 검사 하는 것이 좋습니다 스트레스가 많은 환경을 피하기 위해, 건조 또는 액화 식품 등; 20 개의 단일 십자가에서 시작하여 양 부모가 10 일 동안 살아있는 좋은 조건에서 적어도 10 개의 바이알을 얻는 것이 좋습니다. 매일 수집되는 계란 과 성인 자손의 수는 그림 3에 도시된 바와 같이 표에 보고되어야 하며 10일 동안 비행의 평균 계란 및 성인 자손 생산을 계산하는 데 사용되어야 합니다. 이어서, 대조파리에 비해 EDC 처리된 파리의 배분/불임 변화 비율은 다음과 같은 공식을 적용하여 얻을 수 있다: 배분/불임 변화 % = = [(대조군-치료)/대조군] x 100. 각 그룹에 대해 적어도 3개의 독립적인 복제를 얻어야 합니다.

호르몬D. melanogaster의생활에서 개발 전환에 필수적인 역할을^40,성장의 이 단계는 EDC의 부작용에 특히 취약 한 가능성이 있는. 25°C에서, 애벌레 생장 및 푸팔 단계 둘 다 각각 약 4일 동안 스팬. EDC 노출 에 이어, 이 단계의 평균 기간은^41에영향을 받을 수 있습니다. 이러한 고려를 바탕으로, 발달 타이밍 프로토콜은 유충에서 번데기로, 그리고 치료되지 않은 파리에 대하여 EDC 노출을 따르는 성인으로의 전환의 비율과 시간을 결정하기 위해 최적화되었다. 2개의 대체 프로토콜은 이 분석서를 실행할 수 있었습니다. 둘 다 유효하고 4 일 기간 동안 애벌레에 EDC 만성 노출에 근거를 두었다. 이 애벌레 치료에 기초하여, 첫 번째 프로토콜은 16-18 h 기간 (하룻밤)에 걸쳐 수집 된 배아의 나이를 고려하지 않았다. 유충 중 결과적인 나이 가변성은, 그러나, 각 처리의 모든 유리병에 나타나야 합니다, 따라서 처리를 통해 개발 타이밍의 추정에 크게 영향을 미치지 않고 처리 내 편광을 증가합니다. 대신, 제2 프로토콜은 고정된 수의 동기 조기 배아를 사용했으며, 배아 발생 시 선택된 EDC의 잠재적 효과를 또한 평가할 수 있게 하는^42,^43. 추가, 애벌레 사이의 나이 차이를 최소화 하는 치료 내 편차를 감소 하 고 치료 간의 진정한 차이 추정 하는 능력을 증가. 도 4는 에클로시온 분석의 계획을 보고한다. 두 프로토콜 모두에서 플레이트/바이알은 매일 확인해야 했으며, EDC에 노출되고 노출되지 않은 사람들의 pupae 및 성인의 수는 그림4와 같이 테이블에 별도로 보고되어야 했습니다. 모든 형성 된 강아지와 성인 파리는 죽은 또는 살아 있는지, 계산했다. 그런 다음, 이러한 원시 데이터는 유충에서 번데기와 pupae에서 성인으로의 전환 비율과 시간을 계산하고 제어 파리에 비해 EDC 처리 된 파리의 이러한 값의 변화 비율을 계산하는 데 사용되었습니다. EDC 노출에 이어, 제어 파리에 대하여 전반적인 발달 전진 또는 지연이 예상되었다. 선택한 프로토콜은 각 파리 그룹에 대해 세 배로 수행되어야 했습니다. 에로션 분석 프로토콜 2의 경우, 주어진 EDC 농도에 대한 복제의 각 시리즈는 EDC 농도 전반에 걸쳐 배아 스테이징의 신뢰성과 정확성을 유지하기 위해 동일한 누워 흔적에서 배아로 파종하는 것이 바람직했습니다.

마지막으로 그림 5는 수명을 측정하기 위한 주요 단계를 보여 주었습니다. 이 프로토콜의 경우, 분석 중인 모든 파리는 연령과 성별에 따라 동기를 유지하고, 결합되어 자유로운 순환을 허용할 만큼 낮은 밀도로 유지하는 것이 필수적이었습니다. 남녀 모두 수명 실험을 따로 수행하는 것이 중요하며, 이는 남성과^여성(44)사이의 수명에 유의한 차이가 있다는 것이 잘 알려져 있기 때문이다.

건강한 인구를 유지하기 위해 3일마다 음식을 교체해야 했으며, 사망률도 3일마다 평가되어야 했습니다. 그림5와 같이 수명 스프레드시트에서 죽은 파리의 수가 보고되었으며, 그 수는 이전 전송에서 살아남은 파리 수에서 자동으로 차감됩니다. 각 EDC 농도및 용매 단독의 경우, 경과일 대비 누적 생존기간을 수명 곡선을 얻기 위해 플롯하였다. 일반적인 생존 곡선은 그림6에 보고됩니다. 생존 곡선이 상대적으로 높은 남아있는 긴 초기 기간 후, 그것은 약 60 일 후 기하 급수적으로 감소했다. EDC 노출 에 이어, 처리된 파리의 생존 곡선은 현저하게 영향을 받을 수 있었습니다. 이 효과가 선택된 EDC 때문인지 를 결정하기 위해, 적어도 두 개, 또는 더 나은 아직, 세 개의 독립적이고 비동시복제 실험을 수행하는 것이 바람직하였다.

위의 각 프로토콜에서 비정상적인 바이알 (예 : 계란이나 비정상적인 사망이없는)이 가능했습니다. 이 유리병은 나쁜 음식 질 또는 감염과 같은 다른 원인에 기인할 수 있고, 측정의 값을 현저하게 바꿀 수 있었습니다. 이러한 비정상적인 상황을 관리하는 가장 좋은 방법은 좋은 실험 연습을 통해 이를 피하는 것이었습니다. 따라서 위의 모든 프로토콜에서 바이알을 복제하고, 파리를 건강하게 유지하고, EDC에 노출되면 섬세해질 수 있는 파리를 처리하는 데 크고 신중한 작업이 필요했기 때문에 사망 위험이 증가할 수 있음을 강조해야 합니다. 조작.

그림 1: 먹이 분석. 선택한 EDC (상단) 또는 용매 단독으로 보충 CM / 염료를 포함하는 바이알에 성인 파리는 24 시간 동안 공급 남아있다. EDC (상단) 또는 용매 단독으로 보충 매체에 공급 두 파리 (아래) 자신의 복부에 유사한 착색을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: EDC 견지. 식이요법에 의한 드로소필라에 EDC 투여의 회로도. 등소성 스톡으로부터의 성인 파리는 EDC(상부) 또는 용매 단독(아래)의 상이한 농도에 노출된다. N = EDC의 기준 농도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 불임 분석. 프로토콜의 회로도, 처녀 컬렉션에 적절한 미디어의 비행 성장에서 단계를 묘사하고 단일 십자가까지. 1 단계 : 등소 성 균주에서 성인 (암컷 8 명과 남성 4 명이 각각 10 개의 바이알)을 CM / EDC (상단) 또는 CM / 용매 만 (아래)으로 바이알로 옮김. (이 구성표는 간단히 하기 위해 세 개의 바이알 중 하나만 을 의미합니다.) 2 단계 : 4 일 후, 성인은 폐기되고, 누워 계란은 성인 단계까지 9 일 동안 개발하기 위해 남아있다. 3 단계 : 새로 폐쇄 된 성인은 성별에 따라 분류되고 바이알 (최대 20 남성 / 바이알 및 10 처녀 여성 / 바이알)으로 수집됩니다. 4 단계 : 성인은 애벌레 성장의 해당 배지에 4 일 동안 나이를 남게됩니다. 5 단계 : EDC없이 CM-토마토 배지에서 EDC 처리 된 파리에 대한 40 개의 단일 십자가를 설정, 1 개의 대조군 여성과 20 x 하나의 제어 남성을 가진 20 x 1 EDC 처리 된 남성 (상단); 컨트롤 플라이에 대한 20 개의 단일 십자가 설정, 1 개의 컨트롤 여성 (아래)을 가진 20 x 하나의 제어 남성. 노란색 배지는 EDC(상부) 또는 용매를 대조군(아래)으로 보충한 CM이고, 적색 배지는 EDC 또는 용매가 없는 토마토/CM이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 4: 발달 타이밍(에클로시온분석 프로토콜 2). 왼쪽에, 이 그림은 성인 (약 150 여성과 50 남성)이 증착 단계 전에 어둠 속에서 적응하고 짝짓기 배치하는 수집 케이지의 계획을 보여줍니다 (프로토콜 참조). 2 일 후, 오래된 슬라이딩 트레이는 신선한 음식으로 대체되고, 다음 1 시간에서 폐기 된 계란은 비동기이기 때문에 폐기됩니다. 그 후, 달걀은 새로운 슬라이딩 트레이에 2시간마다 수집되고, 토마토/CM이 함유된 접시에 EDC 또는 용매만으로 보충됩니다. 데이터 (총 누워 계란, 미공개 계란, pupae, 및 eclosed 성인) 일련의 개발 타이밍 스프레드 시트에 보고 됩니다 (오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 수명 분석. 1일 동기화된 파리는 EDC(상단) 또는 용매(아래쪽)를 제어로 보충한 성인 식품(AM)이 있는 250 mL 병으로 옮겨져 수유를 허용합니다(계획상 왼쪽). 2-3 일 후, 파리는 성별에 의해 분류되고 20 개인 / 바이알의 그룹에서 각 성별에 대해 5 개의 바이알 (시작 병의 해당 배지포함)으로 옮겨질 수 있습니다. 3 일마다 성인은 더 이상 필요하지 않은 (계획의 중앙 부분)까지 신선한 바이알로 옮겨질 수 있습니다. 오른쪽에는 매일 데이터가 기록되는 테이블의 구성표가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 수명 곡선. 왼쪽에, 대표적인 표는 죽은 파리의 수가 치료 군(medium + EDC [0.05 mM EE2])과 대조군(중간 + 용매)에 대해 전체 실험 기간 동안 3일마다 기록된 것으로 보고된다. 각 그룹의 평균 수명은 MATRIX SUM을 사용하여 계산되었습니다. 제품; 치료군은 대조군에 비해 평균 수명을 단축시켰다. 오른쪽에는 EE2(0.05 mM) 또는 대조군용 에탄올만을 함유하는 배지로 공급되는 수컷 파리가 전형적인 생존 곡선을 나타내고 있다. 생존 곡선은 대조군보다 처리된 파리의 경우 더 빠르게 감소했으며, 이전 의 전환점이 있었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

과일 플라이 D. 멜라노가스터는 DBP^28,BPA, 4-NP, 4-tert-OP^29,MP^30,EP³¹ ^{과 같은 환경 EDC의 잠재적 효과를 조사하기 위해 생체 내 모델 시스템으로 광범위하게 사용되고 있습니다. 32}, DEHP³³및 EE2³⁴. 몇 가지 이유가 연구의이 분야에서 모델로 그것의 사용을 주도 했다. 모델 시스템으로 그것의 명백한 이점 외에도, Drosophila는 인간과 유전자 보존의 높은 수준을 공유, 있는 초파리 EDC 검사 예측 또는 인간의 건강에 대 한 잠재적인 효과 제안에 도움이 될 수 있습니다. 또한, Drosophila는 모든 생태계에서 널리 표현되고 EDC의 해로운 영향에 대한 더 큰 보호 조치가 필요한 무척추 동물에 속합니다. 무척추 동물은 먹이 사슬의 기지에 위치하 고 그들이 살고 있는 환경에 대 한 매우 중요 한 기능을 수행. 환경에 방출된 몇몇 EDC가 몇몇 동물 종의 발달 그리고 재생산에 유해한 영향을 미칠 수 있다는 것을 보고되었습니다. Drosophila는 실험실에서 사용 되 고의 추가 이점을 제공 합니다., 어디 잠재적으로 개발에 영향을 미치는 요인, 재생, 그리고 수명 테스트 하는 물질에 어떤 변화를 속성하기 위해 제어 를 유지 될 수 있습니다.

여기에서 우리는 fecundity/불임, 발달 비율 및 수명과 같은 호르몬으로 통제된 생활 특성에 이 모형 체계에 있는 EDC 노출의 효력을 공부하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. EE2^34,BPA 및 BPAF(게시되지 않은 데이터) 노출의 효과를 조사할 수 있도록 이러한 프로토콜을 최적화했지만 다른 EDC의 효과를 연구하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다. 특히, 이러한 검정은 순수한 EDC와 다른 EDC의 조합을 모두 조사하고 자연에서 발생하는 것을 더 밀접하게 재현하는 데 사용할 수 있습니다. 비록 분명히, 그들은 간단한 성장 분석처럼 보일 수 있지만, 정확성과 재현성을 보장, 적절한 지침에 따라 작동하는 것이 중요하다^45. D. melanogaster에 있는 비옥, 발달 타이밍 및 장수는 외부와 내부 요인에 의해 영향을 받을 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다. 포토기간, 온도, 습도, 영양, 인구 밀도, 유전 구조 및 나이를 포함한 이러한 중요한 요소는 보고된 프로토콜의 결과를 위해 신중하게 제어되어야 합니다. 유전 적 가변성의 구성 요소를 최소화하기 위해 등소 성 균주를 사용해야합니다. 이 균주는 25 °C에서 자연 12 시간 빛 : 12 시간 어두운 광주기와 가습, 온도 제어 인큐베이터에서 신중하게 사육해야합니다.

통제 된 환경의 유지 보수 외에도 애벌레와 비행 과밀을 피해야합니다. 애벌레 과밀화는 발달 타이밍에 영향을 미칠 수 있으며 열 쇼크 또는 면역 관련 유전자를 포함한 여러 유전자의발현을 유도할 수 있으며, 이는 성인 파리의 총 체력에 영향을 미치는 46마리이다. 또한, 성인 파리는 성인의 스트레스를 최소화하기 위해 자유로운 움직임을 허용하기에 충분한 밀도로 유지되어야 합니다. 또한, 파리가 다른 농도에서 화합물의 맛을 고려하여 각 치료 그룹에서 EDC의 유사한 양을 소비하는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 측면은 음식 품질입니다. 음식은 또한 거품, 박테리아 균열 등이없는 47^,^48등,좋아 보일 수 있어야합니다. 또한, 파리의 동기화, 짝짓기 상태 및 성별 동거를 염두에 두어야 합니다. 보고된 모든 프로토콜에서 분석 중인 병렬 바이알이 매우 유사해야 합니다. 그렇지 않으면, 최대의 관심과 좋은 실험 연습이 필요하도록 폐기하는 것을 이해하기 어려울 것입니다. 마지막으로, 이러한 프로토콜을 사용하여 선택된 EDC의 내분비 효과를 평가함으로써, 메틸 4-하이드록시벤조에이트 또는 플라스틱 바이알의 BPA와 같은 배지에 존재하는 다른 EDC와의 가능한 상호작용을 고려하는 것이 중요하다. 이러한 의미에서, 항진균제를 변경하거나, 유리 바이알을 사용하거나, 가능한 오염물질의 유무에 관계없이 파일럿 검사를 수행하는 것이 유용할 수 있습니다.

보고된 초파리 측정은 생식, 발달 및 수명과 같은 호르몬 조절 된 수명 특성에 대한 잠재적 인 영향을 평가함으로써 EDC와 같은 화학 물질 또는 화학 물질의 혼합물을 평가하는 데 매우 효과적일 수 있습니다. 그러나, 이 비약은 EDC 부작용에 책임 있는 내분비 기계장치를 명확하게 확인하는 역할을 할 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 곤충 내분비 시스템에 대한 특정 작용 모드의 대표적인 반응을 불러일으키는 레퍼런스 EDC를 사용하여 동일한 프로토콜을 수행할 수 있습니다(예를 들어, JH 또는 ecdysteroid로 작동하는 3세대 살충제) [사진]^22. 대안적으로, 호르몬조절되고 내분비 중단에 대한 예측 및 특정 바이오마커로 간주되는 특정 유전자에 대한 분자 분석을 수행하는 분자 종점을 사용하는 것도 가능하다^34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 기술 지원을 위해 오르솔리나 페티요에게 감사드립니다. 저자는 마리아로사리아 아레타 박사(CNR)에게 서지 지원에 감사드립니다. 저자들은 구스타보 다미아노 미타 박사가 EDC 세계에 소개해 준 것에 대해 감사를 표합니다. 저자들은 라이카 마이크로시스템스와 파스칼레 로마노의 도움에 감사를 표한다. 이 연구는 프로젝트 PON03PE_00110_1에 의해 지원되었다. "Sviluppo di nanotecnologie 오리엔타테 알라 리제네지오네 e 리코스트루지오네 티수탈, 임플란트톨로지아 e 감각학 오돈토이아트리아/오큘리스티카" 아크로니모 "소리소"; 커밋텐트: PO FESR 2014-2020 캄파니아; 프로젝트 PO FESR 캄파니아 2007-2013 "일 릴라시오 제어라토 디 몰레콜 바이오 -ATTIVE 나노 테놀로지 당 나노 테놀로지".

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α-Ethinylestradiol	Sigma	E4876-1G
Agar for Drosophila medium	BIOSIGMA	789148
Bisphenol A	Sigma	239658-50G
Bisphenol AF	Sigma	90477-100MG
Cornmeal	CA' BIANCA
Diethyl ether	Sigma
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789008	25 mm x 95 mm
Drosophila Vials	BIOSIGMA	789009	29 mm x 95 mm
Drosophila Vials	Kaltek	187	22 mm x 63 mm
Embryo collection cage	Crafts		Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol	FLUKA	2860
Etherizer	Crafts		cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle			250 mL Bottles
Glass Vials	Microtech	ST 10024	Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy	Ariete		food processor
Instant Success yeast	ESKA		Powdered yeast
Laying tray	Crafts		plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate	SIGMA	H5501
Petri Dish	Falcon	351016	60x5
Red dye no. 40	SIGMA	16035
Stereomicroscope with LED lights	Leica		S4E
Sucrose	HIMEDIA	MB025
Tomato sauce	Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Developmental Biology

초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.