Summary
内分泌干扰化学品 (EDC) 是生物体和自然环境的严重问题。果蝇黑色素是研究体内EDC效应的理想模型。在这里,我们提出的方法,以调查果蝇的内分泌中断,解决EDC对苍蝇的生育、生育、发育时间和寿命的影响。
Abstract
近年来,越来越多的证据表明,所有生物体和环境都暴露于激素样的化学物质,即内分泌干扰物(EDCs)。这些化学物质可能改变内分泌系统的正常平衡,导致不利影响,以及人类中荷尔蒙紊乱的数量增加或野生动物物种的生长和繁殖减少。对于某些 EDC,有记录的健康影响和限制其使用。然而,对于他们中的大多数来说,在这个意义上仍然没有科学证据。为了验证一种化学物质在全有机体中的潜在内分泌效应,我们需要在适当的模型系统中以及果蝇,果蝇,果蝇黑色素气。在这里,我们报告详细的体内协议,以研究果蝇的内分泌中断,解决EDC对苍蝇的繁殖/生育能力,发育时间和寿命的影响。在过去几年中,我们使用这些果蝇生命特性来研究暴露于17-β-苯乙醇(EE2)、双酚A(BPA)和双酚AF(BPA F)的影响。总之,这些测定涵盖了所有果蝇生命阶段,并使得评估所有激素介导过程中的内分泌中断成为可能。成熟/生育力和发育时序测定有助于分别测量EDC对苍蝇生殖性能和发育阶段的影响。最后,寿命测定涉及慢性EDC对成人的接触,并测量他们的存活率。然而,这些生命特征也可能受到几个必须仔细控制的实验性因素的影响。因此,在这项工作中,我们建议一系列程序,我们已经优化了这些检测的正确结果。这些方法允许科学家建立内分泌中断的任何EDC或混合不同的EDCs在果蝇,虽然要确定负责这种效果的内分泌机制,可能需要进一步的文章。
Introduction
人类活动已经释放出大量的化学物质,这对生物体和自然生态系统来说是一个严重的问题。在这些污染物中,估计约有1,000种不同的化学物质可能改变内分泌系统的正常平衡;根据这个特性,它们被归类为干扰内分泌的化学物质(EDCs)。具体来说,根据内分泌学会最近的定义,EDCs是"一种外源性化学物质,或化学品的混合物,可以干扰激素作用的任何方面"2 。在过去的三十年里,越来越多的科学证据表明,EDC会影响动植物的繁殖和发育3,4,5,6,7, 8.此外,EDC接触与一些人类疾病的日益流行有关,包括癌症、肥胖症、糖尿病、甲状腺疾病和行为障碍9、10、11。
EDC的一般机制
由于其分子特性,EDCs的行为类似于激素或激素前体3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12.从这个意义上说,它们可以通过模仿激素活性或阻断内源性激素结合来与激素受体结合,扰乱内分泌系统。在第一种情况下,与受体结合后,它们可以像其天然激素那样激活它。在其他情况下,EDC与受体结合会阻止其天然激素的结合,因此受体被阻断,无法再被激活,即使存在其天然激素3。因此,EDC 可以影响多个过程,例如内源性激素的合成、分泌、运输、代谢或外围作用,这些过程负责维持的平衡、繁殖、发展和/或行为。有机体。受体绑定不是迄今为止EDC描述的唯一行动方式。现在很清楚,他们也可以通过在酶通路中招募联合激活剂或核心压榨器,或者通过修改表观遗传标记来解除基因表达10、11、12、13 ,14,不仅对当代人,而且对后代的健康带来影响。
果蝇激素
已广泛研究了选定的EDC的潜在影响,无论是在野生动物物种中,还是在内分泌机制相当广为人知的几个模型系统中。对于无脊椎动物,影响生长、发育和繁殖的内分泌系统在昆虫中被广泛特征,原因有若干原因,涉及它们在生物研究领域的广泛应用、其经济重要性和最后,开发能够专门干扰害虫激素系统的杀虫剂。
特别是在昆虫中,果蝇D.黑色素气仪已被证明是一个非常强大的模型系统,以评估EDCs的潜在内分泌效应。在黑色素和脊椎动物中,激素在整个生命周期中起着重要的作用。在这个有机体中,有三个主要的荷尔蒙系统,其中涉及类固醇激素20-羟基克西酮(20E)15,16,Sesquiterpenoid青少年激素(JH)17,和神经肽和肽/蛋白质激素18.第三组由最近发现但明显涉及各种生理和行为过程的肽组成,如长寿、平衡、代谢、生殖、记忆和运动控制。20E与胆固醇衍生的类固醇激素(如雌二醇)同源,而JH与视黄酸有一些相似之处;他们两者都是德罗索菲拉19,20中比较著名的激素。它们的平衡对于协调蜕皮和蜕变,以及控制几个发育后过程(如生殖、寿命和行为21)至关重要,从而为测试内分泌提供了不同的可能性在果蝇的中断。此外,异类固醇激素和JHs是所谓的第三代杀虫剂的主要目标,这种杀虫剂旨在干扰昆虫的发育和生殖内分泌介导过程。这些化学品的激动剂或拮抗作用模式是众所周知的,因此它们可以作为评估潜在EDCs对昆虫生长、繁殖和发育影响的参考标准22。例如,Methoprene已被广泛用于控制蚊子和其他水生昆虫23,24,作为JH激动剂,抑制20E诱导的基因转录和蜕变。
除了激素,果蝇中的核受体(NR)超级家族也是众所周知的;它包括18个进化保存转录因子,涉及控制激素依赖性发育途径,以及生殖和生理学25。这些激素NR属于所有六个NR超级家族亚型,包括那些涉及神经传递26,两个视黄酸NR,和那些类固醇NR,在脊椎动物,代表EDCs27的主要目标之一。
果蝇作为研究EDC的模型系统
目前,根据分子特性,世界各地的几个环境机构将干扰内分泌系统的可能性归因于不同的人造化学品。鉴于EDC是环境和生物体的全球性和普遍问题,这一领域的研究的总体目标是减轻其疾病负担,并保护生物免受其不利影响。为了加深对一种化学物质潜在的内分泌效应的理解,有必要在体内对其进行测试。为此,D. melanogaster表示一个有效的模型系统。迄今为止,果蝇已被广泛用作体内模型,以评估几种环境EDC的影响;据报道,暴露于几种EDCs,如二丁基邻苯二甲酸酯(DBP)28,双酚A(BPA),4-非基酚(4-NP),4-吨-乙基苯酚(4-t-OP)29,甲基对羟基苯甲酸酯(MP)30,乙基对羟基苯甲酸酯(EP)31, 32、二乙基(乙酰乙酰)邻苯二甲酸酯(DEHP)33和17-α-乙酸乙酯(EE2)34,影响脊椎动物模型中的新陈代谢和内分泌功能。有几个原因导致它作为这一研究领域的一个模型。除了对其内分泌系统的深入了解外,其他优势还包括其生命周期短、成本低、基因组易于操作、研究历史悠久以及多种技术可能性(参见 FlyBase 网站,http://flybase.org/)。D. melanogaster还为轻松研究跨代效应和种群对环境因素的反应提供了强大的模型,并避免了与高等动物体内研究相关的伦理问题。此外,果蝇与人类共享高度的基因保护,这可能使果蝇EDC检测有助于预测或建议这些化学物质对人类健康的潜在影响。除了扩大对人类健康影响的理解外,果蝇还有助于评估EDC暴露于环境中的风险,如生物多样性丧失和环境退化。最后,果蝇提供了在实验室使用的额外优势,在实验室中,可能影响其发育、繁殖和寿命的因素可以加以控制,以便将任何变异归因于要测试的物质。
考虑到这一点,我们优化了简单和强大的健身测定,以确定EDC对一些果蝇激素特性的影响,如生育/生育、发育时机和成人寿命。这些测定已广泛用于一些EDCs 23,24,25,26,27。特别是,我们使用以下协议来评估暴露于合成雌激素 EE234和 BPA 和双酚 AF (BPA F)(未发布数据)的影响。这些协议可以很容易地修改,以研究给定EDC在一次的影响,以及多个EDC在D.melanogaster的综合影响。
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Protocol
1. 食物准备
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对于库存维持和幼虫生长,使用含有3%粉状酵母、10%蔗糖、9%预煮玉米粉、0.4%琼脂的玉米粉培养基,其后称为玉米粉培养基(CM)。
- 将30克酵母放入100 mL的自来水中,煮沸,煮15分钟。
- 另外,将90克预先煮熟的玉米粉、100克糖和4克琼脂混合成900 mL的自来水。
- 将溶液煮沸,降低热量,连续煮5分钟。
- 5分钟后,加入热酵母溶液,再煮15分钟。
- 关闭热源,使溶液冷却至约 60°C。
- 在乙醇中加入5 mL/L的10%甲基4-羟基苯甲酸酯,彻底混合,让它坐10分钟。
注:小心甲基4-羟基苯甲酸酯的含量,因为高浓度的杀菌剂可能对幼虫致命。 - 将介质放入小瓶/瓶中:将介质放入每个飞瓶(25 mm x 95 mm)中,将 3 mL 放入每个飞瓶(22 mm x 63 mm),将 60 mL 放入每个飞瓶(250 mL)。
- 用奶酪布盖住小瓶,在室温(RT)下干燥24小时,然后储存。
- 通过修改使用的琼脂量和/或冷却/干燥时间,校准 CM 的实验正确稠度和水化。
注意:在4°C下,未拔插、装箱和包装的小瓶稳定约15天。
-
对于果蝇成人,使用含有10%粉状酵母、10%蔗糖、2%琼脂的培养基,其后称为成人培养基(AM)。
- 将10克粉状酵母、10克蔗糖、2克琼脂混合成100 mL蒸馏水。
- 使用微波炉将混合物煮沸两次,间隔3分钟,或直到琼脂溶解。
- 溶液冷却至60°C后,在乙醇中加入5 mL/L 10%甲基4-羟基苯甲酸酯,彻底混合,在小瓶中分配(每瓶10 mL)。
- 用奶酪布盖住小瓶,在RT干燥24小时,然后储存。
注:在4°C下,未拔插、装箱和包装的小瓶稳定约15天。
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对于肥度/生育性测定,使用果蝇番茄汁-玉米粉培养基。
- 倒入 70 mL 的温玉米粉食物到 100 mL 烧杯中,加入 30 mL 的番茄汁(30% v/v)。
- 彻底与食品加工机混合,在小瓶中移液 3 mL。
- 用奶酪布盖住小瓶,在储存前在RT干燥24小时。
注:在4°C下,未拔插、装箱和包装的小瓶稳定约15天。
- 对于胚胎收集,使用含有3%琼脂、30%番茄酱和3%糖的琼脂板。
注意:在将介质浇注到板中时,小心不要产生气泡。
2. 果蝇EDC Dosing
- 准备适当的库存溶液,在合适的溶剂中溶解选定的EDC。对于EE2(分子量296.403),在10mL100%乙醇中溶解1.48克,制成0.5 M库存溶液,储存在-80°C。
警告:EDC被视为环境污染物,在处理时应采取预防措施。 - 将EE2库存溶液稀释在水中(v/v)中的10%乙醇中,以获得100 mM溶液。在 CM 食品中进行下一次稀释(0.1 mM、0.5 mM 和 1 mM),从最低浓度开始,每个处理组使用相同的最终浓度溶剂。对于控制小瓶,单独使用相同体积的溶剂。
注意:建议尽可能降低溶剂的最终浓度,同时铭记在飞食中乙醇的最终浓度不应超过2%。 - 在凝固前将含有所选EDC正确稀释的溶液加入玉米粉食品中,与食品加工机彻底混合,将10 mL放入小瓶中,用棉纱布覆盖,在RT干燥16小时后再使用。
注:在准备后立即使用此介质。 -
对于成人饲养,在 10% 乙醇(v/v)和 100 μL 的层中,将不同的工作 EE2 溶液(分别为 10 mM、50 mM 和 100 mM)制备到 AM 表面,以获得所需的 EE2 浓度(0.1 mMM),0.5 mM 和 1 mM)。对于控制使用相同体积的溶剂单独使用。
注:或者,将含有所选EDC正确稀释的溶液添加到50 mL锥形管中的少量AM中,彻底涡旋,并将其分层1 mL到AM小瓶表面。- 用棉纱布盖住小瓶,在轻柔搅拌下,在RT下干燥12-16小时,并立即使用。
注:干燥过程应进行实验调整,因为取决于环境湿度。
- 用棉纱布盖住小瓶,在轻柔搅拌下,在RT下干燥12-16小时,并立即使用。
- 对于进料测定,在凝固前将含有所选EDC(EE2 0.1 mM、0.5 mM和1 mM)正确稀释的溶液和着色食品(例如,1mg/mL时的红色染料40号)35添加到CM中,与食品加工机进行强烈混合,然后配发e 成小瓶。
3. 饲养苍蝇
- 使用强大的同源性菌株,如俄勒冈R,由实验室中几代人维护。
- 将苍蝇保存在一个加湿的、温控的培养箱中,自然光12小时:在含有CM食物的瓶中,在25°C下有12小时暗光期。
- 在每个测定中,在RT处使用小瓶。
4. 喂养测定
注:建议使用此测定,以测试介质中所选 EDC 的存在是否会影响苍蝇的喂食。
- 将15只幼蝇放入含有CM的小瓶中,辅以不同浓度的选定EDC和着色食品。允许苍蝇在介质上喂食 1 天。
注:例如,使用红色染料号4035(1毫克/升)。 - 将15只幼蝇放入含有CM的小瓶中,单独补充溶剂和着色食品进行控制。允许苍蝇在介质上喂食 1 天。
-
用以醚单独麻醉每组苍蝇。
- 将每组苍蝇转移到一个圆柱形玻璃容器(乙醚),将漏斗插入打开端,将小瓶倒置在漏斗上,轻轻敲击两个容器,使苍蝇落入乙醚中。
注: 漏斗会阻止他们从开胃器中出来。 - 敲击通过轻轻敲击软表面上的醚,如鼠标垫,快速更换漏斗与以热浸棉和纱布塞。
- 等待大约1分钟,直到苍蝇掉到底部,停止移动。
注:不要超过时间,否则苍蝇会死亡。
- 将每组苍蝇转移到一个圆柱形玻璃容器(乙醚),将漏斗插入打开端,将小瓶倒置在漏斗上,轻轻敲击两个容器,使苍蝇落入乙醚中。
- 将固定苍蝇置于立体显微镜下,比较每个治疗组相对于对照组的腹部颜色。
5. 肥度/生育性测定
- 对于每个EDC浓度,准备3瓶苍蝇,之后称为亲小瓶,8名女性和4名男性在10 mL CM/EDC食物中;对照制备6小瓶苍蝇,8雌性和4雄,在10mL CM食物中补充溶剂。后部在25°C的培养箱中飞行。
注意:避免幼虫在发育过程中过度拥挤,并尝试在治疗中使用一致的幼虫密度。 - 4天后,取出父母,将小瓶送回孵化器5天以上。
- 在9日下午晚些时候,从小瓶中取出所有新苍蝇,在18°C的培养箱中过夜。
注:必须非常小心地进行拆卸,检查介质表面。- 第10天早上,对于每个治疗组,收集处女和年轻男性分成两组,在轻CO2麻醉下。随机细分每组苍蝇在小分组(10雌和20雄性每瓶)的独立小瓶充满了新鲜的对应CM。
- 重复步骤5.3.1注意在收集前小心地从小瓶中取出所有苍蝇8-10小时,并在18°C下离开小瓶,直到获得至少30名处女和30名男性,每个EDC浓度和至少90处女和90雄性进行对照。
- 这些苍蝇群在25°C下,直到它们在隔离后4天,每两天将它们转移到含有新鲜对应介质的新小瓶中。
注意:4天是苍蝇成为成熟成人的足够时间,但它离衰老的开始很远。 - 两天后,确保雌性小瓶中没有幼虫。如果他们这样做,苍蝇是不可用的,因为它们不是处女,必须丢弃。
- 第10天早上,对于每个治疗组,收集处女和年轻男性分成两组,在轻CO2麻醉下。随机细分每组苍蝇在小分组(10雌和20雄性每瓶)的独立小瓶充满了新鲜的对应CM。
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每个治疗组使用每个性别的20只单苍蝇,将20个单十字放入含有新鲜CM-tomato介质的没有EDC的小瓶中,如下所述。
- 为每个处理组分配一系列不同的序号,唯一标识它并标记相应的小瓶;例如,组1(仅溶剂)从1到20,组2(EDC浓度x)从20到40,等等。
- 制作一个生育电子表格来记录不同的系列,每个系列对应于一个治疗组。
- 对于每个性别麻醉所有属于每个治疗组在光CO2下,并随机转移它们如下。
- 将一名经过溶剂处理的雌性转移到含有新鲜 CM-tomato 介质的小瓶中,而不带 EDC,并在对照交叉中添加一个经过溶剂处理的雄。
注意:番茄汁在制备过程中应加入培养基,因为深色介质会增加与白色胚胎的对比。 - 将一名经过EDC处理的雌性转移到一个含有新鲜CM-tomato的没有EDC的小瓶中,并在每次治疗中添加一名溶剂处理雄性。
- 将一名经过EDC处理的雄性转移到含有新鲜CM-tomato介质的没有EDC的小瓶中,并在每次治疗中添加一名经过溶剂处理的雌性。
- 将一名经过溶剂处理的雌性转移到含有新鲜 CM-tomato 介质的小瓶中,而不带 EDC,并在对照交叉中添加一个经过溶剂处理的雄。
- 房子所有这些单十字架在25°C。
- 在接下来的十天里,每天将每对交配对转移到没有EDC的新鲜CM-番茄小瓶中。按顺序标记每个系列的复制小瓶;例如 1-a、1b、1c...20a、20b、20c,并在生育电子表格上报告这些数字。
- 每天目视检查每个小瓶的卵子,并在生育电子表格上报告其数量。
- 保存每个小瓶,当新苍蝇开始出现时,也记录10天内成年后代的每日数量。从初次交配10天后,删除父母。
注:丢弃父母一人或双方死亡的小瓶;如果父母一人或双方逃脱,请在分析中包括所有数据,直到丢失。 - 将每个治疗组的每日卵子数量和成年后代的每日数量求和,获得总的繁殖/生育能力,平均卵子和成年后代以10天飞产,以及总后代与产卵总数之比。计算每个治疗值相对于对照值的百分比差异。
- 通过为每个治疗组至少使用10只苍蝇,对每组苍蝇进行三次独立的实验。
- 执行统计分析以比较不同的组。
6. 发展时机
注:在以下两个替代协议中,通过计算每天形成的pupae数量和每天成年后代的关闭数来评估发育时间。
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环状测定方案 1
- 对于每个治疗组,设置10小瓶年轻(<2天),健康苍蝇,每个与6名女性和3名男性在10 mL玉米粉食品没有EDC。
- 让苍蝇在食物上飞行24小时,并允许它们交配。
- 为每个治疗组准备10个平行小瓶,每个新鲜玉米粉食品10 mL,辅以不同的EDC浓度或溶剂进行控制。转移交配苍蝇到这些新小瓶。
注:对于每个治疗组分配不同的序列号,唯一标识它并标记相应的小瓶。 - 制作一个开发电子表格来记录不同的系列。
- 允许苍蝇产卵16小时。然后从小瓶中取出父母。
注:父苍蝇可用于重复步骤 6.1.5,将其转移到其他相应的小瓶。 - 在25°C下孵育小瓶3-4天,或直到不再形成幼崽。每天计算每个小瓶中新小瓶的数量,并将其报告在开发电子表格上。为了避免计算同一pupa两次,在小瓶外侧用永久标记在每个pupa上按顺序写一个数字。
- 从第9天开始,每天计算新兴成年人的数量,直到不再有成年人出现,并在发展电子表格上报告。
- 从这些原始数据中,计算平均幼虫期、平均幼虫期,以及每种治疗相对于对照的百分比差异。
- 通过为每个治疗组至少使用5个小瓶,对每组苍蝇进行三个独立的实验。
- 执行统计分析以比较不同的组。
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环状测定方案2
- 后幼健康的女性(约150)和雄性(约50)苍蝇在收集笼(材料表)与琼脂番茄介质补充新鲜面包师的酵母膏(3克面包酵母在5 mL的水),此后称为铺设托盘,2天在25°C。
- 在这2天里,让苍蝇在黑暗、安静的地方适应笼子,然后开始收集卵子,每天更换两次。
- 第三天,在清晨更换铺盘。1小时后,更换下纸盘,丢弃这些产下鸡蛋。
- 让苍蝇产卵2小时,用新鲜的产卵盘代替。
注:到第3天,一个好的下铺盘应在2小时内生产100-200个鸡蛋。 - 对于每个治疗组,准备三个60毫米的菜肴系列,其中含有番茄玉米粉食物,辅以相应的EDC浓度或单独溶剂,并在发育时间电子表格中报告每个系列。或者,如果愿意,请使用小瓶代替盘子。
- 使用画笔或探头在显微镜下轻轻捡起鸡蛋,并将其转移到每个盘子/瓶中的介质顶部。为了便于计数,在产盘上,将鸡蛋分5组,每组10个,每次一组。
注:重复步骤6.2.4的次数,以获得足够的胚胎。 - 在25°C下把所有这些菜肴/小瓶都放在房子里。同时,将每个产下托盘储存在25°C,并计算产蛋的总数。
- 24-30小时后,在立体显微镜下检查每道菜/瓶,并计算白色、未受精的卵子数量和黑死胚胎的数量。
- 从50个转移的卵子值中减去白、未受精的卵子数量,以获得每个碟/瓶的"总胚胎"值。暗死胚胎的数量可用于确定胚胎生成过程中潜在的EDC毒性效应。
- 重复环法测定协议 1 的步骤 6.1.6-6.1.10。
7. 寿命协议
- 设置20小瓶苍蝇与8个女性和4个男性和房子在25°C在CM(每个10 mL)。
- 4天后丢弃苍蝇,并将小瓶放回孵化器中。
注:这些苍蝇可以用来重新开始,以获得其他年龄同步的苍蝇队列。 - 在9日下午晚些时候,从小瓶中取出所有新苍蝇,并将小瓶送回孵化器。
注意:一些成年人应该早在第九天就开始离用;丢弃这些苍蝇可以收集最大数量的同步苍蝇,避免不小心选择早期出现。 - 16-24小时后,将两性成年苍蝇(1天大)分成四组250 mL瓶,内含AM食物,补充三种不同的EDC浓度,一组单独使用溶剂。如果需要,第二天收集另一批。
- 将苍蝇保持在25°C2-3天,以使它们交配。
注:转移到AM食物小瓶的当天相当于成年的第一天。 - 两三天后,在轻CO2麻醉下,按性别对每群苍蝇进行两组分类。以每瓶20人的密度,随机将每个性别分成5个小瓶,直到每个治疗每个性别有3个5个平行小瓶的复制。
注:与小群苍蝇合作,以防止由于长期接触CO2而可能出现的长期健康问题。 - 准备一个寿命电子表格,其中死苍蝇的数量从存活的苍蝇数量减去到以前的转移,以便自动获得每次转移的幸存者人数。
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每3天将苍蝇转移到含有相应食物的新小瓶中,并检查死亡情况。
注意:转移必须在没有麻醉的情况下进行,这种麻醉可能对苍蝇的寿命产生长期的负面影响。- 每次转移时,记录苍蝇的年龄和死苍蝇的数量。
注意:幸存的苍蝇的数量会自动计算在电子表格中,但建议直观地检查它。不应考虑在转移过程中意外逃逸或死亡的苍蝇。小心不要数两次死苍蝇携带到新的小瓶报告这个说明在电子表格。 - 重复步骤 7.8 和 7.8.1,直到所有苍蝇死亡。
- 每次转移时,记录苍蝇的年龄和死苍蝇的数量。
- 对于每个治疗组,创建如图6所示的生存曲线,以显示苍蝇在任何特定时间的生存概率。
- 通过为每个实验使用100只新封闭苍蝇,对每组苍蝇进行三个独立的实验。
- 准备一个表格,其中报告平均寿命(每组所有苍蝇的平均存活天数)、半死亡时间(达到50%死亡率所需的时间)和最长寿命(达到90%死亡率所需的最大天数)。
- 计算每个治疗组相对于对照组之间的百分比差异。
- 执行统计分析以比较不同的治疗组。
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Representative Results
在本节中,以简化方案的形式报告上述协议的关键步骤。鉴于苍蝇倾向于避免令人不快的化合物,第一件事就是测定所选EDC的味道。这可以通过混合食品着色(例如,红色食品染料40号)35与食品补充与选定的EDC在各种剂量或与溶剂单独。以这些介质喂养的苍蝇在立体显微镜下接受检查,食物摄入量由腹部着色估算(图1)。图1显示了一个典型的所需情况,其中两名成年女性:一种在含有所选EDC的介质上进食,另一种在不含EDC的介质上进食,两者腹部呈现相同的颜色。
人们普遍认为,EDCs,像天然激素,在极低的剂量有影响,并且剂量和效果29之间没有简单的线性关系,高剂量不一定有更大的效果36, 37.因此,与其采用剂量反应方法,不如充分评估其影响,最好从环境或其他生物体的相关浓度开始,使用更多的剂量。在任何情况下,重要的是在每个用过的浓度测定EDC味道,以确保苍蝇在每个治疗组中消化可比数量的EDC(图2)。
内分泌干扰影响动物生理学的许多重要特征,如生育力、寿命发育,因此,这些特征是测试EDCs的有用终点。对于上述协议,我们优化了这些果蝇生命特性的EDC影响,主要考虑是,在测试之前必须使用应正确操作的幼蝇和健康苍蝇。考虑到这一点,必须高度重视废旧食品的生产、处理和储存。此外,在适当的最终浓度(即二甲基硫酸盐[DMSO]小于1%,乙醇低于2%)30时,应注意使用所选EDC的最佳溶剂。
生育力和生育力被用来评估D.黑色素的生殖成功。图 3显示了已使用的协议的方案。生育能力是实验性地测量为产卵的总数,而生育力是按成年后代总数来衡量的。基于在成人生命的前10天产卵是整个成年生命卵子/后代生产生物38,39,生育和生育能力测定可以进行10天的良好参考。使用4天大的苍蝇从暴露的幼虫孵化。尝试在每个组的平行小瓶中获取相似值非常重要;否则,很难想象从分析中去除哪个管。因此,建议每天检查每个复制小瓶,以避免压力的环境,如干燥或液化食品;从20个单十字开始,建议在父母双方存活10天的良好条件下至少获得10个小瓶。每天收集的卵子和成年后代的数量必须在表格上报告,如图3所示,用于计算平均卵子和成年后代的苍蝇生产10天。然后,使用以下公式,可以得出EDC处理苍蝇的肥度/生育变化百分比,应用以下公式:肥度/生育力变化百分比=[(控制-治疗)/对照]x100。每个组必须至少获得三个独立的复制。
激素在D.melanogaster40的寿命发育过渡中起着至关重要的作用,对于这些生长阶段来说,它们特别容易受到EDCs的不利影响。在25°C时,幼虫生长和幼虫阶段各跨越约4天。在EDC暴露后,这些阶段的平均持续时间可以受到影响41。基于此考虑,对发育时间方案进行了优化,以确定从幼虫到幼虫以及从幼虫向成人的过渡的百分比和时间,在 EDC 接触未处理苍蝇后。两种替代协议可以进行这种测定。两者都是有效的,并且基于EDC在4天内长期接触幼虫。基于这种幼虫治疗,第一个方案没有考虑到胚胎的年龄,这些胚胎是在16-18小时(过夜)期间收集的。然而,幼虫之间由此引起的年龄变异应存在于每种治疗的所有小瓶中,从而增加治疗内的差异,但不会显著影响通过治疗对发育时间的估计。相反,第二个协议使用固定数量的同步早期胚胎,使得在胚胎生成42、43期间也能够评估选定的EDC的潜在影响。此外,尽量减少幼虫之间的年龄差异减少了治疗内的差异,并提高了估计治疗之间真实差异的能力。图 4报告了环状测定方案。在这两种协议中,必须每天检查板/瓶,并且从接触和未接触EDC的Pupae和成人的数量分别报告在表格上,如图4所示。所有形成的苍蝇和成年苍蝇都必须被计算在内,不管是死还是活。然后,这些原始数据用于计算从幼虫到幼虫和从幼虫到成人的过渡百分比和时间,并计算与对照苍蝇相比,EDC处理苍蝇这些值的变化百分比。在EDC暴露后,预期控制苍蝇的总体发育进展或延迟。所选的协议必须针对每组苍蝇以三次方式执行。对于环化测定方案2,建议用同一铺设轨迹的胚胎进行每系列复制,以保持整个EDC浓度胚胎分期的可靠性和准确性。
最后,图 5显示了测量寿命的关键步骤。对于该协议,所有被分析的苍蝇必须按年龄和性别同步,并结合在一个密度足够低,允许自由流通。对男女分别进行寿命实验是很重要的,因为众所周知,男女在寿命上有显著差异。
食物必须每3天更换一次,以维持健康人口,死亡率也必须每3天评估一次。在寿命电子表格中,如图5所示,报告了死苍蝇的数量,并且该数量将从上一次转移中幸存的苍蝇数量中自动减去。对于每个EDC浓度和溶剂,绘制了累积存活率与经过天数的图,以获得寿命曲线。图 6中报告了典型的生存曲线;在存活曲线保持相对较高的漫长初始期后,在大约60天后呈指数级下降。在EDC暴露后,处理过的苍蝇的存活曲线可能会受到显著影响。为了确定这种影响是否由于选定的EDC,建议至少进行两个,或者更好的三个独立的,非当代复制实验。
在上述每个协议中,都有可能有异常小瓶(例如,没有卵子或异常死亡);这些小瓶可能由不同原因产生,如食物质量差或感染,并可能显著改变措施的价值。管理这些异常情况的最佳方法是通过良好的实验实践来避免它们。因此,必须强调,对于上述所有协议,在复制小瓶、保持苍蝇健康以及处理一旦接触 EDC 的苍蝇时,需要认真做好工作,从而增加死亡风险。操纵。
图1:进料测定。成人苍蝇在含有CM/染料的瓶中,辅以选定的EDC(顶部)或溶剂(底部),留至喂食24小时。两只以培养基为食的苍蝇,仅用EDC(顶部)或溶剂(底部)喂养,腹部颜色相似。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:EDC分用。EDC管理对果蝇的饮食习惯。来自异种股票的成年苍蝇单独暴露于不同浓度的EDC(顶部)或溶剂(底部)。N = EDC 的参考浓度。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:生育测定。协议原理图,描绘了从适当介质中的飞向处女集合到单个十字架的步骤。第1步:来自异种菌株的成人(10个小瓶,每只8名女性和4名男性)被转移到带有CM/EDC(顶部)或CM/溶剂(底部)的瓶中。(请注意,为简单起见,该方案仅指三个小瓶中的一个。第2步:4天后,成人被丢弃,产卵被留9天发育,直到成人阶段。第3步:新封闭的成年人按性别排序,并收集在小瓶(最多20男/瓶和10处女/小瓶)。第4步:成人在相应的幼虫生长媒介上年龄4天。第5步:在没有EDC的CM-tomato培养基中为EDC处理苍蝇设置40个单十字,20x一个EDC处理雄性,一个对照雌,20x一个对照雄性,一个EDC处理雌性(顶部);设置 20 个单十字控制苍蝇, 20x 一个控制公与一个控制女性 (底部).黄色介质是一种CM,辅以EDC(顶部)或溶剂作为控制(底部),红色介质是番茄/CM,不含EDC或溶剂。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:发育定时(环法测定方案2)。在左边,下图显示了收集笼的方案,其中成年人(约150名女性和50名男性)在沉积步骤前被放置在黑暗中适应和交配(见协议)。2 天后,旧的滑动托盘被替换为新鲜食物,在接下来的 1 小时中丢弃的鸡蛋被丢弃,因为它们是异步的。之后,鸡蛋每2小时收集一次,放在一个新的滑动托盘上,计数,并放置在含有番茄/CM的菜肴上,并辅以EDC或单独使用溶剂。数据(产卵总数、未披露的卵子、卵子和封闭成人)在一系列发育时间电子表格(右)上报告。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:寿命测定。一天同步苍蝇被转移到一个250 mL瓶与成人食品(AM)辅以EDC(顶部)或溶剂(底部)作为控制,以允许喂养(留在方案中)。2-3天后,苍蝇按性别排序,并转移到5个小瓶(包含起始瓶的相应介质),每个性别,在20人/瓶。每3天,成人被转移到新鲜的小瓶,直到不再需要(计划的核心部分)。右侧是一个表的方案,其中每天记录数据。请点击此处查看此图的较大版本。
图 6:寿命曲线。在左侧,报告一个代表表,其中每3天记录一次死苍蝇的数量,包括治疗组(中等+EDC [0.05 mM EE2])和对照组(中+溶剂),在整个实验期间。使用 MATRIX SUM 计算了每个组的平均寿命。产品;与对照组相比,处理组缩短了平均寿命。在右侧,显示了一个典型的生存曲线,显示雄性苍蝇喂食含有EE2(0.05 mM)的介质或仅用于对照的乙醇。治疗苍蝇的存活率曲线下降速度比对照组快,拐点较早。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
果蝇D.melanogaster被广泛用作体内模型系统,以研究环境EDC的潜在影响,如DBP28,双酚A,4-NP,4-ter-OP29,MP30,EP31, 32, DEHP33,和 EE234.有几个原因导致它作为模型在这一研究领域使用。除了作为模型系统无可争议的优势外,果蝇与人类共享高度的基因保护,而果蝇EDC测定法可能有助于预测或暗示对人类健康的潜在影响。此外,果蝇属于无脊椎动物,在所有生态系统中广泛存在,需要采取更大的保护措施,防止EDCs的破坏性影响。无脊椎动物位于食物链的底层,对它们所生活的环境执行非常重要的功能。据报道,若干被释放到环境中的EDCs可能对几种动物物种的发育和繁殖产生有害影响。果蝇有在实验室使用的额外优势,在实验室中,可能影响发育、繁殖和寿命的因素可以加以控制,以便将任何变异归因于要测试的物质。
在这里,我们提供详细的方案,用于研究EDC暴露在这个模型系统中对激素调节的生命特征的影响,如生育/生育能力,发育率和寿命。我们优化了这些协议,使得研究EE2 34、BPA和BPAF(未公布数据)暴露的影响成为可能,但它们可以很容易地适应研究其他EDC的影响。特别是,这些测定可用于研究纯EDC和不同EDC的组合,更密切地再现自然界中发生的情况。虽然显然,他们看起来像简单的生长测定,重要的是按照适当的准则工作,确保准确性和可重复性45。众所周知,在D.黑色素气喘中,生育能力、发育时机和寿命可能受外部和内部因素的影响。这些关键因素,包括光周期、温度、湿度、营养、人口密度、遗传结构和年龄,必须仔细控制报告的协议的结果。为了尽量减少遗传变异性的组成部分,应使用同源性菌株。此应变必须在加湿、温度控制的培养箱中小心饲养,在 25°C 下具有自然 12 小时光:12 h 暗光周期。
除了维持受控环境外,必须避免幼虫和苍蝇过度拥挤。据报道,幼虫过度拥挤会影响发育时机,并诱导几个基因的表达,包括热休克或免疫相关基因,影响成年苍蝇的整体健康46。此外,成年苍蝇必须维持在足够低的密度,以便自由移动,以尽量减少成人的压力。此外,考虑到不同浓度的化合物的味道,确保苍蝇在每个治疗组中消耗的EDC的可比数量非常重要,因为苍蝇往往避免令人不快的食物。这些协议的另一个重要方面是食品质量;食物也必须好看,没有气泡,细菌裂缝,等等47,48。此外,有必要记住同步,交配状态和性别同居的苍蝇进行测试。在所有报告的协议中,分析中的平行小瓶必须非常相似,这一点很重要;否则,将很难理解放弃哪些,以便需要最大的关注和良好的实验实践。最后,通过使用这些协议来评估所选EDCs的内分泌效应,必须考虑到与介质中存在的其他EDCs的可能相互作用,如甲基4-羟基苯甲酸酯或塑料瓶的BPA。从这个意义上说,改变抗真菌剂、使用玻璃瓶或进行试验性检测(带或不带可能的污染物)可能是有益的。
报告的果蝇检测可以非常有效地评估任何化学品或化学品混合物,如EDCs,通过评估对激素调节的生命特性的潜在影响,如繁殖,发育和寿命。然而,这些检测不能清楚地识别对EDC不利影响负责的内分泌机制。为了克服这一限制,可以使用参考EDC执行相同的协议,这些EDC可以唤起代表昆虫内分泌系统某种作用模式的反应(例如,作为JH或ecdysors)工作的第三代杀虫剂激动剂/拮抗剂)22.或者,也可以使用分子端点,对激素调节的特定基因进行分子分析,这些基因被认为是内分泌中断的预测性和特定生物标志物34。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢奥索利娜·佩蒂洛的技术支持。作者感谢玛丽亚罗萨里亚·阿莱塔博士(CNR)对书目的支持。作者感谢古斯塔沃·达米诺·米塔博士将其介绍给EDC世界。作者感谢莱卡微系统公司和帕斯夸尔·罗曼诺的帮助。这项研究得到了项目PON03PE_001110_1的支持。"纳米技术定向学的Sviluppo di nanotecnoe a.rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, 在奥东托里亚/奥多里亚/奥科利西亚的植入物 e 感理"acronimo"SORRISO"承诺:PO FESR 2014-2020 CAMPANIA;项目PO FESR坎帕尼亚2007-2013年"纳纳特诺诺诺诺托控制迪莫莱科尔生物-技术纳塔诺诺诺诺诺诺"。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17α-Ethinylestradiol | Sigma | E4876-1G | |
| Agar for Drosophila medium | BIOSIGMA | 789148 | |
| Bisphenol A | Sigma | 239658-50G | |
| Bisphenol AF | Sigma | 90477-100MG | |
| Cornmeal | CA' BIANCA | ||
| Diethyl ether | Sigma | ||
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789008 | 25 mm x 95 mm |
| Drosophila Vials | BIOSIGMA | 789009 | 29 mm x 95 mm |
| Drosophila Vials | Kaltek | 187 | 22 mm x 63 mm |
| Embryo collection cage | Crafts | Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying | |
| Ethanol | FLUKA | 2860 | |
| Etherizer | Crafts | cylindrical glass container with a cotton plug | |
| Glass Bottle | 250 mL Bottles | ||
| Glass Vials | Microtech | ST 10024 | Flat bottom tube 100 x 24 |
| Hand blender Pimmy | Ariete | food processor | |
| Instant Success yeast | ESKA | Powdered yeast | |
| Laying tray | Crafts | plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying | |
| Methyl4-hydroxybenzoate | SIGMA | H5501 | |
| Petri Dish | Falcon | 351016 | 60x5 |
| Red dye no. 40 | SIGMA | 16035 | |
| Stereomicroscope with LED lights | Leica | S4E | |
| Sucrose | HIMEDIA | MB025 | |
| Tomato sauce | Cirio |
References
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