Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei Drosophila melanogaster

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) stellen ein ernstes Problem für Organismen und natürliche Umgebungen dar. Drosophila melanogaster stellt ein ideales Modell dar, um EDC-Effekte in vivo zu untersuchen. Hier stellen wir Methoden zur Untersuchung der endokrineStörung in Drosophila vor, die EDC-Effekte auf Fruchtbarkeit, Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Lebensdauer der Fliege adressieren.

Abstract

In den letzten Jahren mehren sich die Hinweise, dass alle Organismen und die Umwelt hormonähnlichen Chemikalien ausgesetzt sind, die als endokrine Disruptorchemikalien (EDCs) bekannt sind. Diese Chemikalien können das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern und zu negativen Auswirkungen führen, sowie eine zunehmende Anzahl von hormonellen Störungen in der menschlichen Bevölkerung oder gestörtes Wachstum und verminderte Fortpflanzung in den Wildtierarten. Für einige EDCs gibt es dokumentierte gesundheitliche Auswirkungen und Einschränkungen für ihre Verwendung. Für die meisten von ihnen gibt es jedoch immer noch keine wissenschaftlichen Beweise in diesem Sinne. Um mögliche endokrine Wirkungen einer Chemikalie im vollwertigen Organismus zu überprüfen, müssen wir sie in geeigneten Modellsystemen sowie in der Fruchtfliege, Drosophila melanogaster,testen. Hier berichten wir über detaillierte In-vivo-Protokolle zur Untersuchung endokriner Störungen in Drosophila, die edC-Effekte auf die Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, den Entwicklungszeitpunkt und die Lebensdauer der Fliege angehen. In den letzten Jahren haben wir diese Drosophila-Lebensmerkmale verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber 17-Ethinylestradiol (EE2), Bisphenol A (BPA) und Bisphenol AF (BPA F) zu untersuchen. Insgesamt deckten diese Assays alle Drosophila-Lebensstadien ab und ermöglichten es, endokrine Störungen in allen hormonvermittelten Prozessen zu bewerten. Fecundity/Fertility und Developmental Timing Assays waren nützlich, um die Auswirkungen des EDC auf die Reproduktivleistung der Fliege bzw. auf die Entwicklungsstadien zu messen. Schließlich umfasste der Lebensdauertest chronische EDC-Expositionen bei Erwachsenen und maß deren Überleben. Diese Lebensmerkmale können jedoch auch durch mehrere experimentelle Faktoren beeinflusst werden, die sorgfältig kontrolliert werden mussten. In dieser Arbeit schlagen wir daher eine Reihe von Verfahren vor, die wir für das richtige Ergebnis dieser Assays optimiert haben. Diese Methoden ermöglichen es Wissenschaftlern, endokrine Störungen für jedes EDC oder für eine Mischung verschiedener EDCs in Drosophila festzustellen, obwohl zur Identifizierung des für die Wirkung verantwortlichen endokkrinen Mechanismus weitere Essays erforderlich sein könnten.

Introduction

Menschliche Aktivitäten haben eine enorme Menge an Chemikalien in die Umwelt freigesetzt, die ein ernstes Problem für Organismen und für natürliche Ökosysteme darstellen1. Von diesen Schadstoffen wird geschätzt, dass etwa 1.000 verschiedene Chemikalien das normale Gleichgewicht der endokrinen Systeme verändern können; nach dieser Eigenschaft werden sie als endokrine störende Chemikalien (EDCs) klassifiziert. Insbesondere auf der Grundlage einer kürzlichen Definition der Endokrinen Gesellschaft sind die EDCs "eine exogene Chemikalie oder eine Mischung von Chemikalien, die jeden Aspekt der Hormonwirkung beeinträchtigen können"2. In den letzten drei Jahrzehnten hat es immer mehr wissenschaftliche Beweise dafür gegeben, dass EDCs die Fortpflanzung und Entwicklung von Tieren und Pflanzen beeinflussen können3,4,5,6,7, 8. Darüber hinaus wurde die EDC-Exposition mit der zunehmenden Prävalenz einiger menschlicher Krankheiten zusammen, einschließlich Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Schilddrüsenerkrankungen und Verhaltensstörungen9,10,11.

Allgemeine Mechanismen der EZ

Aufgrund ihrer molekularen Eigenschaften verhalten sich EDCs wie Hormone oder Hormonvorläufer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. In diesem Sinne, Sie können an einen Hormonrezeptor binden und stören endokrine Systeme entweder durch Nachahmung der Hormonaktivität oder durch Blockierung endogene Hormone Bindung. Im ersten Fall, nach der Bindung an den Rezeptor, Sie können es aktivieren, wie sein natürliches Hormon tun würde. Im anderen Fall verhindert die Bindung des EDC an den Rezeptor die Bindung seines natürlichen Hormons, so dass der Rezeptor blockiert ist und auch in Gegenwart seines natürlichen Hormons3nicht mehr aktiviert werden kann. Infolgedessen können EDCs mehrere Prozesse beeinflussen, wie die Synthese, Sekretion, Transport, Stoffwechsel oder periphere Wirkung von endogenen Hormonen, die für die Aufrechterhaltung der Homöostase, Fortpflanzung, Entwicklung und/oder Verhalten von den Organismus. Die Rezeptorbindung ist nicht die einzige bisher beschriebene Wirkungsweise für die EDCs. Es ist jetzt klar, dass sie auch handeln können, indem sie Koaktivatoren oder Corepressoren in enzymatischen Bahnen rekrutieren oder epigenetische Marker modifizieren, die die Genexpression10,11,12,13 deregulieren. ,14, mit Folgen nicht nur für die aktuelle Generation, sondern auch für die Gesundheit der kommenden Generationen8.

Drosophila-Hormone

Die potenziellen Auswirkungen ausgewählter EDCs wurden umfassend untersucht, sowohl bei Tierarten als auch in mehreren Modellsystemen, in denen endokrine Mechanismen einigermaßen gut bekannt sind. Bei wirbellosen Tieren wurden endokrine Systeme, die Wachstum, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, bei Insekten aus mehreren Gründen stark charakterisiert, was ihre umfangreiche Verwendung im Bereich der biologischen Forschung, ihre wirtschaftliche Bedeutung und schließlich die Entwicklung von Insektiziden, die in der Lage sind, speziell in das Hormonsystem von Schädlingsinsekten einzugreifen.

Insbesondere unter Insekten hat sich die Fruchtfliege D. melanogaster als ein sehr leistungsfähiges Modellsystem zur Bewertung der möglichen endokrinen Wirkungen von EDCs erwiesen. Bei D. melanogaster, sowie bei Wirbeltieren, Hormone spielen eine wichtige Rolle über den gesamten Lebenszyklus. In diesem Organismus gibt es drei Haupthormonsysteme, die das Steroidhormon 20-Hydroxyecdyson (20E)15,16, das sesquiterpenoide Juvenile Hormon (JH)17, und die Neuropeptide und Peptid/Protein beinhalten Hormone18. Diese dritte Gruppe besteht aus mehreren Peptiden, die in jüngerer Zeit entdeckt wurden, aber eindeutig an einer Vielzahl von physiologischen und Verhaltensprozessen beteiligt sind, wie Langlebigkeit, Homöostase, Stoffwechsel, Reproduktion, Gedächtnis und Bewegungssteuerung. 20E ist homologe zu Cholesterin-abgeleiteten Steroidhormonen wie Estradiol, während JH einige Ähnlichkeiten mit Retinsäure teilt; beide sind die bekannteren Hormone in Drosophila19,20. Ihr Gleichgewicht ist entscheidend für die Koordination von Molting und Metamorphose sowie für die Steuerung mehrerer postentwicklungsmäßiger Prozesse, wie Fortpflanzung, Lebensdauer und Verhalten21, und bietet somit verschiedene Möglichkeiten zur Erprobung endokriner Störung in Drosophila. Darüber hinaus sind Ecdysteroidhormone und JHs die Hauptziele der sogenannten Insektizide der dritten Generation, die entwickelt wurden, um entwicklungs- und reproduktive endokrine Prozesse bei Insekten zu stören. Die agonistische oder antagonistische Wirkungsweise dieser Chemikalien ist bekannt und kann daher als Referenzstandards für die Bewertung der Auswirkungen potenzieller EDCs auf das Wachstum, die Fortpflanzung und die Entwicklung von Insekten dienen22. Zum Beispiel, Methopren, das weit verbreitet bei der Bekämpfung von Mücken und anderen Wasserinsekten23,24, arbeitet als JH-Agonist und unterdrückt 20E-induzierte Gentranskription und Metamorphose.

Neben Hormonen ist auch die Superfamilie des Nuklearrezeptors (NR) in Drosophila bekannt; Es besteht aus 18 evolutionär konservierten Transkriptionsfaktoren, die an der Kontrolle hormonabhängiger Entwicklungspfade sowie Reproduktion und Physiologie25beteiligt sind. Diese Hormon NRs gehören zu allen sechs NR-Überfamilie Subtypen, einschließlich der an der Neurotransmissionbeteiligt 26, zwei für Retinsäure NRs, und diejenigen für Steroid NRs, die bei Wirbeltieren, eines der primären Ziele von EDCs27darstellen.

Drosophila als Modellsystem zum Studium von EDCs

Derzeit führen mehrere Umweltagenturen auf der ganzen Welt auf der Grundlage molekularer Eigenschaften das Potenzial, die endokrinen Systeme zu stören, verschiedenen vom Menschen hergestellten Chemikalien zu. Da die EDC ein globales und allgegenwärtiges Problem für die Umwelt und für Organismen darstellen, besteht das übergeordnete Ziel der Forschung auf diesem Gebiet darin, ihre Krankheitslast zu verringern und lebende Organismen vor ihren nachteiligen Auswirkungen zu schützen. Um das Verständnis über die möglichen endokrinen Wirkungen einer Chemikalie zu vertiefen, ist es notwendig, sie in vivo zu testen. Zu diesem Zweck stellt D. melanogaster ein gültiges Modellsystem dar. Bis heute wurde die Fruchtfliege ausgiebig als In-vivo-Modell verwendet, um die Auswirkungen mehrerer Umwelt-EDCs zu bewerten; Es wurde berichtet, dass die Exposition gegenüber mehreren EDCs, wie Dibutylphthalat (DBP)28, Bisphenol A (BPA), 4-Nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, Methylparaben (MP)30, Ethylparaben (EP)31, 32, bis-(2-ethylhexyl) phthalat (DEHP)33, und 17-a-ethinylestradiol (EE2)34, beeinflusst den Stoffwechsel und die endokrinen Funktionen wie bei Wirbeltiermodellen. Mehrere Gründe haben dazu geführt, dass er als Modell in diesem Forschungsbereich verwendet wurde. Neben der hervorragenden Kenntnis seiner endokrinen Systeme sind weitere Vorteile sein kurzer Lebenszyklus, niedrige Kosten, leicht zu manipulierbares Genom, eine lange Forschungsgeschichte und mehrere technische Möglichkeiten (siehe FlyBase-Website, http://flybase.org/). D. melanogaster bietet auch ein leistungsfähiges Modell für die einfache Untersuchung der transgenerationalen Effekte und Der Population Reaktionen auf Umweltfaktoren8 und vermeidet ethische Fragen, die für In-vivo-Studien an höheren Tieren relevant sind. Darüber hinaus teilt die Fruchtfliege ein hohes Maß an Generhaltung mit menschenweisen, was es Drosophila EDC-Assays ermöglichen könnte, bei der Vorhersage oder Demindizierung möglicher Auswirkungen dieser Chemikalien auf die menschliche Gesundheit zu helfen. Neben der Erweiterung des Verständnisses über die Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit kann Drosophila dazu beitragen, die Risiken einer EDC-Exposition gegenüber der Umwelt, wie den Verlust der biologischen Vielfalt und die Umweltzerstörung, zu bewerten. Schließlich bietet die Fruchtfliege den zusätzlichen Vorteil, in Laboratorien eingesetzt zu werden, in denen die Faktoren, die ihre Entwicklung, Fortpflanzung und Lebensdauer beeinflussen, unter Kontrolle gehalten werden können, um jede Variation dem zu prüfenden Stoff zuzuschreiben.

Vor diesem Hintergrund haben wir einfache und robuste Fitness-Assays optimiert, um EDC-Effekte auf einige Drosophila-Hormonmerkmale wie Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Erwachsenenlebensdauer zu bestimmen. Diese Assays wurden weit verbreitet für einige EDCs23,24,25,26,27verwendet. Insbesondere haben wir die folgenden Protokolle verwendet, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber dem synthetischen Östrogen EE234 und BPA und Bisphenol AF (BPA F) (unveröffentlichte Daten) zu bewerten. Diese Protokolle können leicht geändert werden, um die Auswirkungen eines bestimmten EDC zu einem Zeitpunkt zu untersuchen, sowie die kombinierten Wirkungen mehrerer EDCs in D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Lebensmittelzubereitung

  1. Für die Bestandspflege und das Larvenwachstum ein Maismehlmedium verwenden, das 3 % Pulverhefe, 10 % Saccharose, 9 % vorgekochtes Maismehl, 0,4 % Agar, danach Maismehlmedium (CM) enthält.
    1. 30 g Hefe in 100 ml Leitungswasser geben, zum Kochen bringen und 15 min kochen lassen.
    2. Getrennt gut 90 g vorgekochtes Maismehl, 100 g Zucker und 4 g Agar in 900 ml Leitungswasser mischen.
    3. Bringen Sie die Lösung zum Kochen, senken Sie die Hitze und kochen Sie für 5 Minuten unter ständigem Rühren.
    4. Nach 5 Minuten die heiße Hefelösung hinzufügen und weitere 15 min köcheln lassen.
    5. Schalten Sie die Wärmequelle aus und lassen Sie die Lösung auf ca. 60 °C abkühlen.
    6. 5 ml/L 10% Methyl4-Hydroxybenzoat in Ethanol geben, gründlich mischen und 10 min sitzen lassen.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit der Menge an Methyl 4-Hydroxybenzoat, da eine hohe Konzentration von Fungizid für Larven tödlich sein könnte.
    7. Geben Sie das Medium in Fläschchen/Flaschen: 8 ml in jede Fliegenfläschchen (25 mm x 95 mm), 3 ml in jede Fliegenfläschchen (22 mm x 63 mm) und 60 ml in jede Flugflasche (250 ml).
    8. Fläschchen mit Käsetuch abdecken und bei Raumtemperatur (RT) 24 h vor der Lagerung trocknen lassen.
    9. Kalibrieren Sie experimentell die richtige Konsistenz und Hydratation des CM, indem Sie entweder die Menge des verwendeten Agars und/oder die Kühl-/Trocknungszeiten ändern.
      Hinweis: Unplugged, boxed und gewickelte Fläschchen sind für ca. 15 Tage bei 4 °C stabil.
  2. Für Drosophila Erwachsene, verwenden Sie ein Medium mit 10% pulverisierte Hefe, 10% Saccharose, 2% Agar, danach genannt Adult Medium (AM).
    1. 10 g Pulverhefe, 10 g Saccharose, 2 g Agar in 100 ml destilliertes Wasser mischen.
    2. Bringen Sie diese Mischung zum Kochen zwei Mal, mit einem 3 Minuten Intervall, oder bis Agar gelöst ist, mit einer Mikrowelle.
    3. Sobald die Lösung auf 60 °C abkühlt, 5 ml/L 10% Methyl 4-Hydroxybenzoat in Ethanol hinzufügen, gründlich mischen und in Fläschchen (10 ml pro Durchstechflasche) abgeben.
    4. Fläschchen mit Käsetuch bedecken und bei RT 24 h trocknen lassen, bevor sie gelagert werden.
      HINWEIS: Unplugged, boxed und verpackte Fläschchen sind für ca. 15 Tage bei 4 °C stabil.
  3. Für Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeitstest verwenden Sie Drosophila Tomatensaft-Maismehl-Medium.
    1. 70 ml warmes Maismehl in ein 100 ml Becherglas geben und 30 ml Tomatensaft (30% v/v) hinzufügen.
    2. Mit einer Küchenmaschine und einer Pipte 3 ml in kleinen Fläschchen gründlich mischen.
    3. Fläschchen mit Käsetuch abdecken und bei RT 24 h vor der Lagerung trocknen lassen.
      HINWEIS: Unplugged, boxed und verpackte Fläschchen sind für ca. 15 Tage bei 4 °C stabil.
  4. Für die Embryo-Sammlung verwenden Sie Agar-Platten, die 3% Agar, 30% Tomatensauce und 3% Zucker enthalten.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Blasen zu machen, wenn Sie das Medium in die Platten gießen.

2. Drosophila EDC Dosieren

  1. Bereiten Sie eine geeignete Stofflösung vor, die das ausgewählte EDC in dem geeigneten Lösungsmittel auflöst. Für den EE2 (Molekulargewicht 296.403) 1,48 g in 10 ml 100% Ethanol auflösen, um eine 0,5 M Lagerlösung herzustellen und bei -80 °C aufzubewahren.
    ACHTUNG: EDC gelten als Umweltschadstoffe, und es sollten Vorsichtsmaßnahmen bei deren Handhabung getroffen werden.
  2. Verdünnen Sie die EE2-Stammlösung in 10% Ethanol in Wasser (v/v), um eine 100 mM-Lösung zu erhalten. Stellen Sie die nächsten Verdünnungen (0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM) in CM-Lebensmitteln her, beginnend mit der niedrigsten Konzentration und der gleichen Endkonzentration an Lösungsmitteln für jede Behandlungsgruppe. Für die Steuerung verwenden Durchstechflaschen das gleiche Volumen des Lösungsmittels allein.
    Hinweis: Es wird empfohlen, die Endkonzentration des Lösungsmittels so gering wie möglich zu halten, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Endkonzentration von Ethanol 2 % in Flugfutter nicht überschreiten sollte.
  3. Fügen Sie die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC enthält, vor der Erstarrung in das Maismehl-basierte Lebensmittel ein, mischen Sie sie gründlich mit einer Küchenmaschine, geben Sie 10 ml in Fläschchen, decken Sie sie mit Wattese ab und lassen Sie sie bei RT 16 h trocknen, bevor Sie sie verwenden.
    HINWEIS: Verwenden Sie dieses Medium sofort nach seiner Herstellung.
  4. Für die Erwachsenenaufzucht verschiedene EE2-Lösungen (10 mM, 50 mM bzw. 100 mM) in 10% Ethanol in Wasser (v/v) und Schicht 100 l von jeweils auf die Oberfläche des AM vorbereiten, um die gewünschte Konzentration des EE2 (0,1 mM) zu erhalten 0,5 mM und 1 mM). Für die Steuerung verwenden Sie das gleiche Volumen des Lösungsmittels allein.
    ANMERKUNG: Alternativ fügen Sie die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC enthält, einer kleinen Menge von AM in einem 50 ml konischen Rohr hinzu, wirbeln Sie gründlich und schichten Sie 1 ml davon auf die Oberfläche der AM-Fläschchen.
    1. Fläschchen mit Watte bedecken, bei RT 12-16 h unter sanftem Rühren trocknen lassen und sofort verwenden.
      HINWEIS: Der Trocknungsprozess sollte experimentell eingestellt werden, da er von der Umgebungsfeuchtigkeit abhängt.
  5. Zum Fütterungstest sowohl die Lösung, die die richtige Verdünnung des ausgewählten EDC (EE2 0,1 mM, 0,5 mM und 1 mM) enthält, als auch ein Färbefutter (z. B. den roten Farbstoff Nr. 40 bei 1 mg/ml)35 in den CM vor der Erstarrung, stark mit einem e in Fläschchen.

3. Rearing Fliegen

  1. Verwenden Sie einen robusten isogenen Stamm, wie Oregon R, der von mehreren Generationen im Labor gehalten wird.
  2. Halten Sie Fliegen in einem befeuchteten, temperaturgeregelten Inkubator mit einem natürlichen 12 h Licht: 12 h dunkle Photoperiode bei 25 °C in Fläschchen mit CM-Lebensmitteln.
  3. Verwenden Sie in jedem Test Fläschchen bei RT.

4. Fütterung assay

HINWEIS: Dieser Test wird empfohlen, um zu testen, ob das Vorhandensein des ausgewählten EDC im Medium die Fütterung von Fliegen beeinflussen könnte.

  1. Legen Sie 15 junge Fliegen in Fläschchen mit CM, ergänzt mit unterschiedlichen Konzentrationen des ausgewählten EDC und einem Färbefutter. Lassen Sie Fliegen für 1 Tag von den Medien ernähren.
    HINWEIS:Verwenden Sie z. B. den roten Farbstoff Nr. 4035 (1 mg/ml).
  2. Legen Sie 15 junge Fliegen in Fläschchen mit CM, die nur mit dem Lösungsmittel und einem Färbefutter zur Kontrolle ergänzt werden. Lassen Sie Fliegen für 1 Tag von den Medien ernähren.
  3. Anästhetisieren Sie einzeln jede Gruppe von Fliegen mit Äther.
    1. Übertragen Sie fliegen von jeder Gruppe auf einen zylindrischen Glasbehälter (Äther) mit einem Trichter in das offene Ende eingeführt, invertiert die Durchstechflasche über den Trichter und sanft tippen die beiden Behälter zusammen, um die Fliegen in den Äther fallen.
      HINWEIS:  Der Trichter verhindert, dass sie aus dem Äther herauskommen.
    2. Knock fliegt nach unten, indem man sanft auf den Äther auf einer weichen Oberfläche, wie z. B. einem Mauspad, tippt, und ersetzt den Trichter schnell durch einen ethergetränkten Baumwoll- und Gaze-Stecker.
    3. Warten Sie ca. 1 min, bis die Fliegen auf den Boden fallen und aufhören sich zu bewegen.
      HINWEIS: überschreiten Sie nicht die Zeit oder die Fliegen sterben.
  4. Setzen Sie immobilisierte Fliegen unter ein Stereomikroskop und vergleichen Sie die Bauchfärbung jeder Behandlungsgruppe in Bezug auf die Kontrollgruppe.

5. Fecundity/Fertility Assay

  1. Für jede EDC-Konzentration 3 Fläschchen fliegen, danach Elternfläschchen genannt, mit 8 Weibchen und 4 Männchen in 10 ml CM/EDC-Lebensmitteln; zur Kontrolle bereiten 6 Fläschchen von Fliegen mit 8 Weibchen und 4 Männchen in 10 ml CM Lebensmittel mit Lösungsmittel ergänzt. Hinterfliegen in einem Inkubator bei 25 °C.
    HINWEIS: Vermeiden Sie eine Überbelegung von Larven während ihrer Entwicklung und versuchen Sie, konsistente Larvendichten in allen Behandlungen zu verwenden.
  2. Nach 4 Tagen, entfernen Sie die Eltern und geben Sie die Fläschchen für 5 weitere Tage in den Inkubator zurück.
  3. Am späten Nachmittag des Tages 9 alle neuen Fliegen von den Fläschchen entfernen und die Fläschchen über Nacht bei 18 °C in einen Brutkasten stellen.
    HINWEIS: Diese Entfernung muss sehr sorgfältig durchgeführt werden, überprüfen Sie die Oberfläche des Mediums gut.
    1. Am Morgen des 10. Tages sammeln Für jede Behandlungsgruppe jungfräuliche Weibchen und junge Männchen in zwei Gruppen unter leichter CO2-Anästhesisierung. Unterteilen Sie jede Gruppe von Fliegen zufällig in kleine Untergruppen (10 Weibchen und 20 Männchen pro Durchstechflasche) in unabhängigen Durchstechflaschen, die mit frischen entsprechenden CM gefüllt sind.
      1. Wiederholen Sie Schritt 5.3.1 mit Vorsicht, um sorgfältig alle Fliegen von den Fläschchen 8-10 h vor der Sammlung zu entfernen und lassen Sie Fläschchen bei 18 °C, bis mindestens 30 jungfräuliche Weibchen und 30 Männchen für jede EDC-Konzentration und mindestens 90 jungfrauen Weibchen und 90 Männchen für die Kontrolle zu erhalten.
    2. Beherbergen Sie diese Gruppen von Fliegen bei 25 °C, bis sie 4 Tage nach der Eclosion alt sind, und übertragen Sie sie alle zwei Tage in neue Fläschchen mit frischem entsprechendem Medium.
      Hinweis: 4 Tage ist ausreichend Zeit für die Fliegen, um reife Erwachsene zu werden, aber es ist sehr weit vom Anfang der Seneszenz.
    3. Nach zwei Tagen stellen Sie sicher, dass es keine Larven in den Fläschchen von Frauen. Wenn sie das tun, sind die Fliegen nicht verwendbar, weil sie keine Jungfrauen sind und verworfen werden müssen.
  4. Verwenden Sie 20 Einzelfliegen jedes Geschlechts für jede Behandlungsgruppe, um 20 einzelne Kreuze in kleine Durchstechflaschen mit frischem CM-Tomatenmedium ohne EDC zu setzen, wie unten beschrieben.
    1. Weisen Sie jeder Behandlungsgruppe eine andere Reihe von fortlaufenden Nummern zu, die sie eindeutig identifiziert und die jeweiligen Durchstechflaschen kennzeichnet; z. B. Gruppe1 (allein Lösungsmittel) von 1 bis 20, Gruppe 2 (EDC-Konzentration x) von 20 bis 40 usw.
    2. Erstellen Sie eine Fruchtbarkeitstabelle, um die verschiedenen Serien aufzuzeichnen, die jeweils einer Behandlungsgruppe entsprechen.
    3. Für jedes Geschlecht anästhesieren alle Fliegen, die zu jeder Behandlungsgruppe unter Licht CO2 gehören, und übertragen Sie sie nach dem Zufallsprinzip wie folgt.
      1. Übertragen Sie ein lösungsmittelbehandeltes Weibchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischem CM-Tomatenmedium ohne EDC und fügen Sie ein lösungsmittelbehandeltes Männchen für das Kontrollkreuz hinzu.
        Hinweis: Tomatensaft sollte während seiner Zubereitung dem Medium zugesetzt werden, da dunkles Medium den Kontrast zu den weißen Embryonen erhöht.
      2. Übertragen Sie ein EDC behandeltes Weibchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischer CM-Tomate ohne EDC und fügen Sie für jede Behandlung ein lösungsmittelbehandeltes Männchen hinzu.
      3. Übertragen Sie ein mit EDC behandeltes Männchen in eine kleine Durchstechflasche mit frischem CM-Tomatenmedium ohne EDC und fügen Sie für jede Behandlung ein lösungsmittelbehandeltes Weibchen hinzu.
    4. Beherbergen Sie alle diese einzelnen Kreuze bei 25°C.
  5. Übertragen Sie jedes Paar in frische CM-Tomaten-Fläschchen ohne EDC jeden Tag für die folgenden zehn Tage. Beschriften Sie die replizierten Durchstechflaschen jeder Serie sequenziell; z.B. 1-a, 1b, 1c...... 20a, 20b, 20c und melden Sie diese Zahl auf der Fruchtbarkeitstabelle.
  6. Überprüfen Sie jede Durchstechflasche jeden Tag visuell auf die Eier und melden Sie ihre Nummer auf der Fruchtbarkeitstabelle.
  7. Speichern Sie jede Durchstechflasche und, wenn neue Fliegen beginnen zu entstehen, erfassen Sie auch die tägliche Anzahl der erwachsenen Progenies über den 10-Tage-Zeitraum. Nach 10 Tagen nach der ersten Paarung, entfernen Sie die Eltern.
    ANMERKUNG: Durchwahl von Durchstechflasche, in der ein oder beide Elternteile gestorben sind; im Falle der Flucht eines oder beider Elternteile alle Daten bis zum Tag des Verlusts in die Analyse einzubeziehen.
  8. Summieren Sie die tägliche Anzahl der Eier und die tägliche Anzahl der erwachsenen Vorfahren aus jeder Behandlungsgruppe, um die Gesamtfruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, die mittlere Ei- und Nachkommenproduktion durch eine Fliege für zehn Tage und das Verhältnis der Gesamtnachkommen schaft zur Gesamtzahl der gelegten Eier zu erhalten. Berechnen Sie die prozentualen Unterschiede der einzelnen Behandlungswerte in Bezug auf das Steuerelement.
  9. Führen Sie drei unabhängige Experimente für jede Gruppe von Fliegen durch, wobei mindestens 10 Fliegen für jede Behandlungsgruppe verwendet werden.
  10. Führen Sie statistische Analysen durch, um die verschiedenen Gruppen zu vergleichen.

6. Entwicklungszeitpunkt

HINWEIS: In den beiden folgenden alternativen Protokollen wird der Entwicklungszeitpunkt bewertet, indem sowohl die Anzahl der Welpen, die sich pro Tag bilden, als auch die Anzahl der erwachsenen Nachkommen pro Tag gezählt wird.

  1. Eclosion Assay Protokoll 1
    1. Für jede Behandlungsgruppe 10 Fläschchen junger (<2 Tage), gesunde Fliegen mit jeweils 6 Weibchen und 3 Männchen in 10 ml Maismehl-Nahrung ohne EDC einrichten.
    2. Lassen Sie Fliegen auf Nahrung für 24 h, und lassen Sie sie zu paaren.
    3. Bereiten Sie 10 parallele Durchstechflaschen pro Behandlungsgruppe mit je 10 ml frischem Maismehlfutter vor, das mit unterschiedlichen EDC-Konzentrationen oder dem Lösungsmittel allein zur Kontrolle ergänzt wird. Transfer-Partnerfliegen auf diese neuen Fläschchen.
      HINWEIS: Weisen Sie für jede Behandlungsgruppe eine andere Reihe von fortlaufenden Nummern zu, die sie eindeutig identifiziert und die jeweiligen Durchstechflaschen kennzeichnet.
    4. Erstellen Sie eine Entwicklungstabelle, um die verschiedenen Serien aufzuzeichnen.
    5. Lassen Sie Fliegen Eier für 16 h legen. Dann entfernen Sie die Eltern von Fläschchen.
      HINWEIS: Die übergeordneten Fliegen können verwendet werden, um den Schritt 6.1.5 zu wiederholen, indem sie auf andere entsprechende Durchstechflaschen übertragen werden.
    6. Inkubieren Sie Durchstechflaschen für 3-4 Tage bei 25 °C, oder bis keine Welpen mehr bilden. Zählen Sie jeden Tag die Anzahl der neu pupae in jeder Durchstechflasche und melden Sie es auf der Entwicklungstabelle. Um zu vermeiden, dass die gleiche Pupa zweimal gezählt wird, schreiben Sie eine Zahl nacheinander an jeder Pupa mit einem permanenten Marker auf der Außenseite der Durchstechflasche.
    7. Ab dem Tag 9, zählen Sie täglich die Anzahl der aufstrebenden Erwachsenen, bis keine Erwachsenen mehr auftauchten, und melden Sie es auf der Entwicklungstabelle.
    8. Aus diesen Rohdaten berechnen Sie die mittlere Larvenperiode, die mittlere Pupalperiode sowie die prozentualen Unterschiede in der jeweiligen Behandlung in Bezug auf die Kontrolle.
    9. Führen Sie drei unabhängige Experimente für jede Gruppe von Fliegen durch, indem Sie mindestens 5 Durchstechflaschen für jede Behandlungsgruppe verwenden.
    10. Führen Sie statistische Analysen durch, um die verschiedenen Gruppen zu vergleichen.
  2. Eclosion Assay Protokoll 2
    1. Junge und gesunde Weibchen (ca. 150) und Männchen (ca. 50) fliegen auf einem Sammelkäfig(Materialtabelle) mit Agar-Tomaten-Medium, ergänzt mit frischer Bäckerhefepaste (3 g Bäckerhefe in 5 ml Wasser), danach als Legeschale bezeichnet, für 2 Tage bei 25 °C.
    2. Während dieser 2 Tage lassen Sie fliegen, um den Käfig an einem dunklen, ruhigen Ort zu akklimatisieren, bevor Sie mit der Eiersammlung beginnen, und wechseln Sie das Legetablett zweimal täglich.
    3. Wechseln Sie am dritten Tag frühmorgens die Legeschale. Nach 1 h die Legeschale ersetzen und diese gelegten Eier entsorgen.
    4. Lassen Sie Fliegen Eier für 2 h legen und ersetzen Sie durch frische Lege Tablett.
      HINWEIS: Am 3. Tag sollte ein gutes Legetablett 100-200 Eier in 2 h produzieren.
    5. Bereiten Sie für jede Behandlungsgruppe eine Reihe von drei 60-mm-Gerichten vor, die Tomatenmaismehl enthalten, die mit der entsprechenden EDC-Konzentration oder allein mit Lösungsmittel ergänzt werden, und melden Sie jede Serie in der Entwicklungs-Timing-Tabelle. Alternativ, wenn gewünscht, verwenden Sie Fläschchen anstelle von Geschirr.
    6. Nehmen Sie die Eier vorsichtig unter dem Mikroskop auf, indem Sie einen Pinsel oder eine Sonde verwenden und in jeder Schale/Durchstechflasche auf die Oberseite des Mediums übertragen. Um das Zählen zu erleichtern, auf dem Legetablett, ordnen Eier in 5 Gruppen von je 10 und übertragen sie eine nach der anderen.
      HINWEIS: Wiederholen Sie Schritt 6.2.4 so oft wie nötig, um genügend Embryonen zu erhalten.
    7. Beherbergen Sie alle diese Gerichte / Fläschchen bei 25 °C. Bewahren Sie auch jedes Legetablett bei 25 °C auf und zählen Sie die Gesamtzahl der gelegten Eier.
    8. Nach 24-30 h, überprüfen Sie jede Schale / Durchstechflasche unter einem Stereomikroskop und zählen Sowohl die Anzahl der weißen, unbefruchteten Eier als auch die Anzahl der dunkeltoten Embryonen.
    9. Subtrahieren Sie die Anzahl der weißen, unbefruchteten Eier von den 50 übertragenen Eiern, um den Wert "Gesamtembryonen" pro Schale/Durchstechflasche zu erhalten. Die Anzahl der dunkeltoten Embryonen kann verwendet werden, um mögliche toxische Wirkungen des EDC während der Embryogenese zu bestimmen.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 6.1.6-6.1.10 des Eclosion Assay Protocol 1.

7. Lifespan-Protokoll

  1. Richten Sie 20 Fläschchen mit 8 Weibchen und 4 Männchen auf und beherbergen Sie bei 25 °C in CM (jeweils 10 ml).
  2. Nach 4 Tagen fliegen entsorgen und Fläschchen wieder in den Inkubator legen.
    HINWEIS: Diese Fliegen können verwendet werden, um wieder zu beginnen, um andere alterssynchronisierte Kohorten der Fliegen zu erhalten.
  3. Am späten Nachmittag des Tages 9, entfernen Sie alle neuen Fliegen von den Fläschchen und kehren Sie Fläschchen zum Inkubator zurück.
    Hinweis: ein paar Erwachsene sollten schon am neunten Tag anfangen zu schließen; Das Wegwerfen dieser Fliegen ermöglicht es, eine maximale Anzahl synchronisierter Fliegen zu sammeln, wodurch die sorglose Auswahl des frühen Auftauchens vermieden wird.
  4. 16-24 h später die erwachsenen Fliegen (1 Tage alt) beider Geschlechter in vier Gruppen von 250 ml Flaschen mit AM-Lebensmitteln, die mit drei verschiedenen EDC-Konzentrationen und eine mit dem Lösungsmittel allein ergänzt werden. Sammeln Sie bei Bedarf am nächsten Tag eine weitere Charge.
  5. Halten Sie Fliegen bei 25 °C für 2-3 Tage, damit sie sich paaren können.
    HINWEIS: Der Tag der Überführung auf AM Food-Fläschchen entspricht dem ersten Tag des Erwachsenenalters.
  6. Nach zwei-drei Tagen sortieren Sie jede Kohorte von Fliegen nach Geschlecht in zwei Gruppen unter leichter CO2-Anästhesisierung. Unterteilen Sie jedes Geschlecht zufällig in fünf Durchstechflaschen pro Behandlung mit einer Dichte von 20 Individuen pro Durchstechflasche, bis es drei Wiederholungen von 5 parallelen Durchstechflaschen für jedes Geschlecht pro Behandlung gibt.
    HINWEIS: Arbeiten Sie mit kleinen Gruppen von Fliegen, um mögliche lang anhaltendeGesundheitsprobleme aufgrund der langen Expositionszeit mit CO2 zu verhindern.
  7. Bereiten Sie eine Lebensspanne Tabelle, in der die Anzahl der toten Fliegen wird von der Anzahl der überlebenden Fliegen auf den vorherigen Transfer subtrahiert, so dass automatisch die Anzahl der Überlebenden bei jedem Transfer zu erhalten.
  8. Transferfliegen in neue Fläschchen mit dem entsprechenden Futter alle 3 Tage zur gleichen Zeit und überprüfen auf Tod.
    HINWEIS: Der Transfer muss ohne Anästhesie erfolgen, was sich langfristig negativ auf die Lebensdauer des Fliegens auswirken könnte.
    1. Notieren Sie bei jedem Transfer das Alter der Fliegen und die Anzahl der toten Fliegen.
      HINWEIS: Die Anzahl der überlebenden Fliegen wird automatisch in der Kalkulationstabelle berechnet, aber es wird empfohlen, sie visuell zu überprüfen. Fliegen, die während des Transfers versehentlich entkommen oder sterben, sollten nicht berücksichtigt werden. Achten Sie darauf, nicht zu zählen zweimal tote Fliegen auf die neue Durchstechflasche, die diese Notiz in der Tabelle berichtet.
    2. Wiederholen Sie die Schritte 7.8 und 7.8.1, bis alle Fliegen sterben.
  9. Erstellen Sie für jede Behandlungsgruppe eine Überlebenskurve, wie in Abbildung 6dargestellt, um die Überlebenswahrscheinlichkeit einer Fliege zu einem bestimmten Zeitpunkt anzuzeigen.
  10. Führen Sie drei unabhängige Experimente für jede Behandlungsgruppe von Fliegen durch, indem Sie 100 neu geschlossene Fliegen für jedes Experiment verwenden.
  11. Bereiten Sie eine Tabelle vor, in der die mittlere Lebensdauer (mittlere Überlebenstage aller Fliegen für jede Gruppe), die Halbzeittodeszeit (Zeitraum in Tagen erforderlich, um 50 % Sterblichkeit zu erreichen) und die maximale Lebensdauer (maximale Anzahl von Tagen, die benötigt werden, um 90 % Sterblichkeit zu erreichen) gemeldet werden soll.
  12. Berechnen Sie die prozentualen Unterschiede zwischen den einzelnen Behandlungsgruppen in Bezug auf die Kontrollgruppe.
  13. Führen Sie statistische Analysen durch, um die verschiedenen Behandlungsgruppen zu vergleichen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In diesem Abschnitt werden die wichtigsten Schritte der oben genannten Protokolle in Form vereinfachter Schemata beschrieben. Da Fliegen dazu neigen, ungenießbare Verbindungen zu vermeiden, ist das erste, was zu tun ist, den Geschmack des ausgewählten EDC zu überprüfen. Dies kann durch Mischen einer Lebensmittelfärbung (z. B. roter Lebensmittelfarbstoff Nr. 40)35 mit dem Lebensmittel erfolgen, das mit dem ausgewählten EDC in verschiedenen Dosen oder mit dem Lösungsmittel allein ergänzt wird. Fliegen, die von diesen Medien gefüttert werden, werden unter einem Stereomikroskop untersucht und die Nahrungsaufnahme wird durch ihre Bauchfärbung geschätzt (Abbildung 1). Eine typische gewünschte Situation ist in Abbildung 1 mit zwei erwachsenen Weibchen dargestellt: eine mit Medium gefüttert, das das ausgewählte EDC enthält, und eine auf einem Medium, das nicht das EDC enthält, die beide die gleiche Färbung in ihrem Bauch zeigen.

Es ist weithin anerkannt, dass EDCs, wie natürliche Hormone, Effekte bei extrem niedrigen Dosen haben und dass es keine einfache, lineare Beziehung zwischen Dosis und Wirkung29gibt, mit höheren Dosen, die nicht unbedingt eine größere Wirkung haben36, 37. Anstatt also einen Dosis-Wirkungs-Ansatz zu wählen, ist es ratsam, mehr Dosen zu verwenden, beginnend mit relevanten Konzentrationen für die Umwelt oder für andere Organismen. In jedem Fall ist es wichtig, den EDC-Geschmack bei jeder verwendeten Konzentration zu prüfen, um sicherzustellen, dass Fliegen vergleichbare Mengen von EDC in jeder Behandlungsgruppe verdauen (Abbildung 2).

Endokrine Störungen betreffen viele wichtige Merkmale der Tierphysiologie wie Fruchtbarkeit, Langlebigkeit und Entwicklung, die daher nützliche Endpunkte sind, um EDCs zu testen. Für die oben genannten Protokolle, die wir optimiert haben, um die EDC-Effekte auf diese Drosophila-Lebensmerkmale zu messen, sind primäre Überlegungen, dass es unerlässlich ist, junge und gesunde Fliegen zu verwenden, die vor dem Testen korrekt manipuliert werden sollten. Vor diesem Hintergrund muss der Herstellung, Handhabung und Lagerung der verwendeten Lebensmittel große Aufmerksamkeit geschenkt werden. Darüber hinaus ist darauf zu achten, dass das beste Lösungsmittel für das ausgewählte EDC in geeigneten Endkonzentrationen (d. h. weniger als 1 % für Dimethylsulfoxid [DMSO] und weniger als 2 % für Ethanol) verwendet wird30.

Fecundity und Fruchtbarkeit wurden verwendet, um den Fortpflanzungserfolg in D. melanogasterzu bewerten. Abbildung 3 zeigt ein Schema des verwendeten Protokolls. Die Fruchtbarkeit wird experimentell als Gesamtzahl der gelegten Eier gemessen, während die Fruchtbarkeit als Gesamtnachkommen erwachsener Tiere gemessen wird. Basierend auf der Überlegung, dass die Eiproduktion in den ersten 10 Tagen des Erwachsenenlebens eine gute Referenz für die gesamte Erwachsenenlebensei/Nachkommenproduktion eines Organismus38,39ist, können Fruchtbarkeits- und Fruchtbarkeitstests für 10 Tage von mit 4 Tage alten Fliegen, die aus den exponierten Larven geschlüpft sind. Es ist wichtig, zu versuchen, ähnliche Werte in den parallelen Durchstechflaschen jeder Gruppe zu erhalten; andernfalls wäre es schwer vorstellbar, welches Rohr aus der Analyse entfernt werden soll. Daher ist es ratsam, täglich jede replizierte Durchstechflasche zu untersuchen, um eine stressige Umgebung zu vermeiden, wie getrocknete oder verflüssigte Lebensmittel; Ab 20 Einzelkreuzen wird empfohlen, mindestens 10 Fläschchen unter guten Bedingungen zu erhalten, in denen beide Elternteile 10 Tage am Leben waren. Die Anzahl der Eier und der erwachsenen Nachkommen, die täglich gesammelt werden, müssen auf einer Tabelle in Abbildung 3 gemeldet und zur Berechnung der durchschnittlichen Ei- und Erwachsenennachkommenproduktion einer Fliege für 10 Tage verwendet werden. Dann kann der Fecundity/Fruchtbarkeitsänderungsprozentsatz der MIT EDC behandelten Fliegen im Vergleich zu Kontrollfliegen unter Anwendung der folgenden Formel ermittelt werden: Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeitsänderung % = [(Kontrolle - Behandlung)/Kontrolle] x 100. Für jede Gruppe müssen mindestens drei unabhängige Replikationen abgerufen werden.

Hormone spielen eine wesentliche Rolle bei Entwicklungsübergängen im Leben von D. melanogaster40, für die es wahrscheinlich ist, dass diese Wachstumsphasen besonders anfällig für die negativen Auswirkungen von EDCs sind. Bei 25 °C erstrecken sich sowohl das Larvenwachstum als auch das Pupalstadium jeweils über ca. 4 Tage. Nach der EDC-Exposition kann die mittlere Dauer dieser Phasen beeinflusst werden41. Basierend auf dieser Überlegung wurden die Entwicklungs-Timing-Protokolle optimiert, um den Prozentsatz und die Zeit des Übergangs von Larven zu Pupae und von Pupae zu Erwachsenen nach EDC-Exposition in Bezug auf unbehandelte Fliegen zu bestimmen. Zwei alternative Protokolle könnten diesen Test durchführen. Beide waren gültig und basierten auf der chronischen Larvenexposition des EDC über einen Zeitraum von 4 Tagen. Basierend auf dieser Larvenbehandlung berücksichtigte das erste Protokoll nicht das Alter der Embryonen, die über einen Zeitraum von 16-18 h (über Nacht) gesammelt wurden. Die daraus resultierende Altersvariabilität zwischen den Larven sollte jedoch in allen Fläschchen jeder Behandlung vorhanden sein, wodurch die Varianz innerhalb der Behandlung erhöht wird, ohne jedoch die Schätzungen des Entwicklungszeitpunkts durch Behandlungen signifikant zu beeinflussen. Stattdessen verwendete das zweite Protokoll eine feste Anzahl synchroner Frühembryonen, was es ermöglichte, auch die möglichen Wirkungen des ausgewählten EDC während der Embryogenese42,43zu bewerten. Darüber hinaus verringerte die Minimierung der Altersunterschiede zwischen den Larven die Varianz innerhalb der Behandlung und erhöhte die Fähigkeit, wahre Unterschiede zwischen den Behandlungen abzuschätzen. Abbildung 4 gibt ein Schema des Eclosion-Assays. In beiden Protokollen mussten Platten/Fläschchen täglich überprüft werden, und die Zahl der Welpen und Erwachsenen von den dem EDC exponierten und nicht exponierten Personen war getrennt auf einer Tabelle zu melden, wie in Abbildung 4. Alle gebildeten Welpen und erwachsenen Fliegen mussten gezählt werden, ob tot oder lebendig. Dann wurden diese Rohdaten verwendet, um Prozentsätze und Zeiten des Übergangs von Larven zu Pupae und von Pupae zu Erwachsenen zu berechnen und um den Veränderungsprozentsatz dieser Werte der MIT EDC behandelten Fliegen im Vergleich zu Kontrollfliegen zu berechnen. Nach der EDC-Exposition war ein allgemeiner Entwicklungsfortschritt oder eine Verzögerung in Bezug auf die Kontrollfliegen zu erwarten. Das gewählte Protokoll musste in dreifacher Ausfertigung für jede Fliegengruppe durchgeführt werden. Es war ratsam, für das Eclosions-Assay-Protokoll 2 jede Folge einer Replikation für eine bestimmte EDC-Konzentration mit Embryonen aus derselben Verlegespur auszusäen, um die Zuverlässigkeit und Genauigkeit der Embryo-Inszenierung während der gesamten EDC-Konzentrationen zu gewährleisten.

Schließlich zeigt Abbildung 5 die wichtigsten Schritte zur Messung der Lebensdauer. Für dieses Protokoll war es von wesentlicher Bedeutung, dass alle untersuchten Fliegen nach Alter und Geschlecht synchron waren, gekoppelt und mit einer Dichte gehalten wurden, die niedrig genug war, um den freien Verkehr zu ermöglichen. Es ist wichtig, Lebenszeitexperimente bei beiden Geschlechtern getrennt durchzuführen, da es bekannt ist, dass es signifikante Unterschiede in der Lebensdauer zwischen Männern und Frauengibt 44.

Die Nahrung musste alle 3 Tage gewechselt werden, um eine gesunde Bevölkerung zu erhalten, und die Sterblichkeit musste auch alle 3 Tage beurteilt werden. In einer Lebensspanne wurden, wie in Abbildung5, die Anzahl der toten Fliegen gemeldet, und diese Zahl würde automatisch von der Anzahl der überlebenden Fliegen von der vorherigen Übertragung subtrahiert werden. Für jede EDC-Konzentration und für das Lösungsmittel allein wurde das kumulative Überleben im Vergleich zu den verstrichenen Tagen dargestellt, um Lebensdauerkurven zu erhalten. Abbildung 6ist eine typische Überlebenskurve dargestellt; nach einer langen Anfangsphase, in der die Überlebenskurve relativ hoch blieb, ging sie nach etwa 60 Tagen exponentiell zurück. Nach der EDC-Exposition könnte die Überlebenskurve der behandelten Fliegen erheblich beeinträchtigt werden. Um festzustellen, ob dieser Effekt auf das ausgewählte EDC zurückzuführen ist, war es ratsam, mindestens zwei oder besser noch drei unabhängige, nicht zeitgleiche Replikationsexperimente durchzuführen.

In jedem der oben genannten Protokolle war es möglich, anomale Durchstechflaschen zu haben (z. B. ohne Eier oder anomale Todesfälle); diese Fläschchen könnten aus unterschiedlichen Ursachen stammen, wie z. B. schlechte Lebensmittelqualität oder Infektionen, und die Werte der Maßnahmen erheblich verändern. Der beste Weg, um diese anomalen Situationen zu bewältigen, war, sie durch gute experimentelle Praxis zu vermeiden. Es muss daher betont werden, dass bei allen oben genannten Protokollen große und sorgfältige Arbeit bei der Replikation der Fläschchen, der gesundhaltenden Fliegen und im Umgang mit Fliegen erforderlich war, die, sobald sie einem EDC ausgesetzt waren, empfindlich werden könnten, was das Risiko des Todes erhöht, wenn Manipuliert.

Figure 1
Abbildung 1: Fütterungstest. Erwachsene Fliegen in Fläschchen, die CM/Farbstoff enthalten, die mit einem ausgewählten EDC (oben) oder Lösungsmittel allein (unten) ergänzt werden, müssen 24 h gefüttert werden. Zwei Fliegen, die auf Medium gefüttert werden, ergänzt mit einem EDC (oben) oder Lösungsmittel allein (unten) zeigen eine ähnliche Färbung auf ihrem Bauch. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: EDC-Dosierung. Schematische der EDC-Verabreichung an Drosophila durch Diät. Erwachsene Fliegen aus einem isogenen Bestand sind unterschiedlichen Konzentrationen eines EDC (oben) oder Lösungsmittels allein (unten) ausgesetzt. N = die Referenzkonzentration des EDC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Fruchtbarkeitstest. Schematisch des Protokolls, das die Schritte vom Fliegenwachstum in geeigneten Medien über die jungfräuliche Sammlung bis hin zu einzelnen Kreuzen darstellt. Schritt 1: Erwachsene (10 Durchstechflaschen mit je acht Weibchen und vier Männchen) aus einem isogenen Stamm werden auf Fläschchen mit CM/EDC (oben) oder CM/Lösungsmittel allein (unten) übertragen. (Beachten Sie, dass sich das Schema der Einfachheit halber nur auf einen der drei Durchstechflaschen bezieht.) Schritt 2: Nach 4 Tagen werden Erwachsene weggeworfen, und legte Eier werden für 9 Tage bis zum Erwachsenenstadium entwickelt. Schritt 3: Neu geschlossene Erwachsene werden nach Geschlecht sortiert und in Fläschchen gesammelt (max. 20 Männchen/Fläschchen und 10 Jungfrauenweibchen/Fläschchen). Schritt 4: Erwachsene werden für 4 Tage auf dem entsprechenden Medium des Larvenwachstums zu altern gelassen. Schritt 5: Einrichtung von 40 Einzelkreuzen für EDC-behandelte Fliegen in CM-Tomatenmedium ohne EDC, 20x ein EDC-behandeltes Männchen mit einem Kontrollweibchen und 20x ein Kontrollmännchen mit einem EDC-behandelten Weibchen (oben); Einrichtung von 20 Einzelkreuzen für Steuerfliegen, 20x ein Steuermännchen mit einem Steuerweibchen (unten). Gelbes Medium ist ein CM, der durch ein EDC (oben) oder Lösungsmittel als Kontrolle (unten) ergänzt wird, und rotes Medium ist eine Tomate/CM ohne EDC oder Lösungsmittel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Entwicklungszeitpunkt(Eclosion Assay-Protokoll 2). Auf der linken Seite zeigt diese Abbildung ein Schema des Sammelkäfigs, in dem Erwachsene (ca. 150 Weibchen und 50 Männchen) vor dem Ablagerungsschritt zur Akklimatisierung und Paarung im Dunkeln gebracht werden (siehe Protokoll). Nach 2 Tagen wird das alte Schiebetablett durch eins durch frische Nahrung ersetzt, und die in den nächsten 1 H abgesetzten Eier werden entsorgt, weil sie asynchron sind. Danach werden die Eier alle 2 stunden auf einem neuen Schiebetablett gesammelt, gezählt und auf Gerichte mit Tomaten/CM gelegt, die mit einem EDC oder allein mit Lösungsmittel ergänzt werden. Die Daten (gesamtgelegte Eier, nicht offenbarte Eier, Welpen und geschlossene Erwachsene) werden auf einer Reihe von Entwicklungs-Timing-Tabellen (rechts) gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Lebensdauer-Assay. Eines Tages werden synchronisierte Fliegen auf eine 250 ml Flasche mit Erwachsenennahrung (AM) übertragen, die mit einem EDC (oben) oder Lösungsmittel (unten) als Kontrolle ergänzt wird, um die Fütterung zu ermöglichen (links im Schema). Nach 2-3 Tagen werden die Fliegen nach Geschlecht sortiert und in fünf Fläschchen (mit dem entsprechenden Medium der Startflasche) für jedes Geschlecht in Gruppen von 20 Individuen/Durchstechflasche übertragen. Alle 3 Tage werden die Erwachsenen auf frische Fläschchen übertragen, bis sie nicht mehr benötigt werden (zentraler Teil des Programms). Auf der rechten Seite befindet sich ein Schema der Tabelle, in dem die Daten für jeden Tag aufgezeichnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Lebensdauerkurven. Auf der linken Seite wird eine repräsentative Tabelle gemeldet, in der die Anzahl der toten Fliegen alle 3 Tage sowohl für die Behandlungsgruppe (Medium + EDC [0,05 mM EE2]) als auch für die Kontrollgruppe (Medium + Lösungsmittel) während des gesamten Versuchszeitraums aufgezeichnet wurde. Die mittlere Lebensdauer jeder Gruppe wurde mit dem MATRIX-SUMME berechnet. PRODUKT; die behandelte Gruppe verkürzte die mittlere Lebensdauer im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auf der rechten Seite wird eine typische Überlebenskurve von männlichen Fliegen gezeigt, die mit einem Mittel gefüttert werden, das EE2 (0,05 mM) oder nur Ethanol zur Kontrolle enthält. Die Überlebenskurve verringerte sich bei behandelten Fliegen schneller als für die Kontrollgruppe, mit einem früheren Wendepunkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die Fruchtfliege D. melanogaster wurde ausgiebig als In-vivo-Modellsystem eingesetzt, um die potenziellen Auswirkungen von Umwelt-EDCs wie DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, DEHP33und EE234. Mehrere Gründe haben seine Verwendung als Modell in diesem Forschungsbereich geführt. Abgesehen von seinen unbestrittenen Vorteilen als Modellsystem, Drosophila teilt einen hohen Grad an Genkonservierung mit Menschen, für die Drosophila EDC Assays bei der Vorhersage oder dem Vorschlag potenzieller Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit helfen können. Darüber hinaus gehört Drosophila zu den wirbellosen Tieren, die in allen Ökosystemen stark vertreten sind und größere Schutzmaßnahmen gegen die schädlichen Auswirkungen von EDCs erfordern. Wirbellose befinden sich an der Basis der Nahrungskette und erfüllen sehr wichtige Funktionen für die Umgebungen, in denen sie leben. Es wurde berichtet, dass mehrere in die Umwelt freigesetzte EDC einen schädlichen Einfluss auf die Entwicklung und Fortpflanzung mehrerer Tierarten haben können. Drosophila bietet den zusätzlichen Vorteil, im Labor eingesetzt zu werden, wo die Faktoren, die sich möglicherweise auf Entwicklung, Fortpflanzung und Lebensdauer auswirken, unter Kontrolle gehalten werden können, um jede Variation dem zu prüfenden Stoff zuzuordnen.

Hier bieten wir detaillierte Protokolle für die Untersuchung der Auswirkungen der EDC-Exposition in diesem Modellsystem auf hormonell regulierte Lebensmerkmale wie Fruchtbarkeit/Fruchtbarkeit, Entwicklungsrate und Lebensdauer. Wir haben diese Protokolle optimiert, die es ermöglichten, die Auswirkungen der Exposition von EE234, BPA und BPAF (unveröffentlichte Daten) zu untersuchen, aber sie können leicht angepasst werden, um die Auswirkungen anderer EDCs zu untersuchen. Insbesondere können diese Assays verwendet werden, um sowohl reine EDCs als auch Kombinationen verschiedener EDCs zu untersuchen und dabei genauer zu reproduzieren, was in der Natur vorkommt. Obwohl sie scheinbar wie einfache Wachstumstests erscheinen, ist es wichtig, nach den entsprechenden Richtlinien zu arbeiten, um Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu gewährleisten45. Es ist bekannt, dass Fruchtbarkeit, Entwicklungszeitpunkt und Langlebigkeit in D. melanogaster durch externe und interne Faktoren beeinflusst werden können. Diese kritischen Faktoren, einschließlich Photoperiode, Temperatur, Feuchtigkeit, Ernährung, Bevölkerungsdichte, genetische Struktur und Alter, müssen sorgfältig auf das Ergebnis der gemeldeten Protokolle kontrolliert werden. Um die Komponente der genetischen Variabilität zu minimieren, sollte ein isogener Stamm verwendet werden. Diese Sorte muss sorgfältig in einem befeuchteten, temperaturgeregelten Inkubator mit einem natürlichen 12 h Licht: 12 h dunkle Photoperiode bei 25 °C aufgezogen werden.

Neben der Aufrechterhaltung einer kontrollierten Umgebung muss eine Überbelegung von Larven und Fliegen vermieden werden. Es wurde berichtet, dass Larvenüberfüllung den Entwicklungszeitpunkt beeinflussen und die Expression mehrerer Gene induzieren kann, einschließlich Hitzeschock oder immunitätsbezogene Gene, die die Gesamttauglichkeit von erwachsenen Fliegen beeinflussen46. Außerdem müssen erwachsene Fliegen mit einer niedrigen Dichte gehalten werden, um freie Bewegung zu ermöglichen, um den Stress von Erwachsenen zu minimieren. Darüber hinaus ist es wichtig, sicherzustellen, dass Fliegen in jeder Behandlungsgruppe vergleichbare Mengen des EDC verbrauchen, wobei der Geschmack der Verbindung in unterschiedlichen Konzentrationen berücksichtigt wird, da die Fliegen dazu neigen, ungenießbare Lebensmittel zu vermeiden. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Protokolle ist die Lebensmittelqualität; das Essen muss auch gut aussehen, frei von Blasen, Bakterien Risse, und so weiter47,48. Darüber hinaus ist es notwendig, Synchronisation, Paarungsstatus und Geschlechtskohabitation im Auge zu behalten, damit die Fliegen getestet werden können. In allen gemeldeten Protokollen ist es wichtig, dass die zu analysierenden parallelen Durchstechflaschen sehr ähnlich sein müssen; andernfalls wäre es schwer zu verstehen, was verworfen werden sollte, so dass maximale Aufmerksamkeit und gute experimentelle Praxis erforderlich sind. Schließlich ist es bei der Verwendung dieser Protokolle zur Bewertung der endokrinen Wirkungen ausgewählter EDCs wichtig, mögliche Wechselwirkungen mit anderen im Medium vorhandenen EDCs wie Methyl 4-Hydroxybenzoat oder dem BPA der Kunststofffläschchen zu berücksichtigen. In diesem Sinne könnte es nützlich sein, das Antimykotika zu ändern, Glasfläschchen zu verwenden oder Pilottests sowohl mit als auch ohne mögliche Verunreinigungen durchzuführen.

Die gemeldeten Drosophila-Assays können sehr effektiv für die Bewertung von Chemikalien oder Mischungen von Chemikalien, wie EDCs, sein, indem sie die möglichen Auswirkungen auf hormonell regulierte Lebensmerkmale wie Fortpflanzung, Entwicklung und Lebensdauer bewerten. Diese Assays können jedoch nicht dazu dienen, den endokkrinen Mechanismus, der für die Nebenwirkungen des EDC verantwortlich ist, eindeutig zu identifizieren. Um diese Einschränkung zu überwinden, ist es möglich, die gleichen Protokolle durchzuführen, indem Referenz-EDCs verwendet werden, die Reaktionen hervorrufen, die für eine bestimmte Wirkungsweise auf das endokrine System von Insekten repräsentativ sind (z. B. Insektizide der dritten Generation, die als JH oder Ecdysteroid wirken. Agonist/Antagonist)22. Alternativ ist es auch möglich, molekulare Endpunkte zu verwenden, indem molekulare Analysen an spezifischen Genen durchgeführt werden, die hormonell reguliert sind und die als prädiktive und spezifische Biomarker für die endokrine Störung34gelten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Orsolina Petillo für die technische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) für die bibliographische Unterstützung. Die Autoren danken Dr. Gustavo Damiano Mita für die Einführung in die EDC-Welt. Die Autoren danken Leica Microsystems und Pasquale Romano für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde vom Projekt PON03PE_00110_1 unterstützt. "Sviluppo di nanotecnologie Orientate alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica in Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Projekt PO FESR Kampanien 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

Entwicklungsbiologie Ausgabe 149 Drosophila melanogaster endokrine Disruptor Chemikalien Fruchtbarkeit Fruchtbarkeit Entwicklung Lebensdauer
Methoden zur Prüfung der endokkrinen Disruption bei <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter