Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית בדרוזופילה מלאנוסטר

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

המערכת האנדוקרינית (EDCs) מייצגת בעיה רצינית עבור אורגניזמים ובסביבות טבעיות. דרוזופילה מלאנוסטר מייצגת מודל אידיאלי לחקר אפקטי edc בvivo. כאן אנו מציגים שיטות לחקירת שיבוש המערכת האנדוקרינית בדרוזוהילה, לטיפול באפקטי EDC על פוריות, פוריות, תזמון התפתחותי ותוחלת חיים של הזבוב.

Abstract

בשנים האחרונות הוכחה גוברת כי כל האורגניזמים והסביבה חשופים לכימיקלים כמו הורמונים, המכונה המערכת האנדוקרינית כימיקלים (EDCs). כימיקלים אלה עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות להוביל לתופעות לוואי, כמו גם מספר גדל והולך של הפרעות הורמונליות באוכלוסייה האנושית או צמיחה מופרעת ורבייה מופחתת במינים חיות הבר. עבור חלק מ-EDCs, קיימים השפעות בריאותיות מתועדות והגבלות על השימוש בהם. עם זאת, עבור רובם, עדיין אין ראיות מדעיות במובן הזה. כדי לאמת את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל באורגניזם המלא, אנו צריכים לבדוק אותו במערכות מודל מתאימות, כמו גם בזבוב הפירות, דרוזופילה מלאנוגסטר. כאן אנו מדווחים מפורט בפרוטוקולים vivo כדי לחקור את ההפרעה האנדוקרינית בדרוזוהילה, מטפל בהשפעות EDC על פוריות/פוריות, התפתחות העיתוי, ותוחלת החיים של הזבוב. בשנים האחרונות, השתמשנו בתכונות אלה החיים הדרוזובית כדי לחקור את ההשפעות של חשיפה 17-α-ethinyלסטרנול (EE2), ביאגנול A (BPA), ו ביאגנול AF (BPA F). בסך הכל, אלה האומרים מכוסים כל החיים Drosophila ילה והפכה את האפשרות להעריך את ההפרעה האנדוקרינית בכל תהליכי הורמון בתיווך. פוריות/פריון והתפתחות עיתוי התפתחותי היו שימושיים למדוד את השפעת ה-EDC על ביצועי הרבייה לטוס ועל שלבים התפתחותיים, בהתאמה. בסופו של דבר, שיטת תוחלת החיים מעורבת בחשיפות EDC כרוניות למבוגרים ומדדו את ההישרדות שלהם. עם זאת, תכונות חיים אלה יכולים גם להיות מושפעים על ידי כמה גורמים ניסיוניים כי צריך להיות נשלט בקפידה. לכן, בעבודה זו, אנו מציעים סדרה של הליכים שאנו ממוטבים עבור התוצאה הנכונה של אלה מספר. שיטות אלה מאפשרות למדענים להקים שיבוש אנדוקריניות עבור כל EDC או לתערובת של מחשבי ה-Edc שונים בדרוזוהילה, למרות שכדי לזהות את המנגנון האנדוקרינית האחראי לאפקט, ניתן יהיה לדרוש חיבורים נוספים.

Introduction

פעילויות אנושיות משחררים לסביבה כמות עצומה של כימיקלים, המייצגים בעיה רצינית לאורגניזמים ולמערכת אקולוגית טבעית1. מזהמים אלה, מעריכים כי על 1,000 כימיקלים שונים עשויים לשנות את האיזון הרגיל של מערכות אנדוקריניות; לפי תכונה זו, הם מסווגים כימיקלים המערכת האנדוקרינית משבש (EDCs). באופן ספציפי, מבוסס על הגדרה לאחרונה על ידי החברה האנדוקרינית, EDCs הם "כימיקל אקסוגני, או תערובת של כימיקלים, כי יכול להפריע לכל היבט של פעולה הורמונלית"2. בשלושת העשורים האחרונים, יש כבר גידול ראיות מדעיות כי edcs יכול להשפיע על רבייה ופיתוח של בעלי חיים וצמחים3,4,5,6,7, שמונה. יתר על כן, חשיפה edc היתה קשורה השכיחות הגוברת של כמה מחלות האדם, כולל סרטן, השמנת יתר, סוכרת, מחלות בלוטת התריס, הפרעות התנהגותיות9,10,11.

מנגנונים כלליים של EDC

עקב התכונות המולקולריות שלהם, edcs להתנהג כמו הורמונים או הורמונים מקדים3,4,5,6,7,8,9, . עשר,11,12 במובן זה, הם יכולים לאגד קולטן הורמון לשבש מערכות אנדוקריניות או על ידי מחקה פעילות הורמון או על ידי חסימת הורמונים אנדוגניים מחייב. במקרה הראשון, לאחר הכריכה לקולטן, הם יכולים להפעיל אותו כמו הורמון הטבעי שלו יעשה. במקרה השני, קשירה של ה-EDC לקולטן מונע את הכריכה של הורמון הטבעי שלה, כך הקולטן חסומה ולא ניתן עוד להפעיל, אפילו בנוכחות הורמון טבעי3. כתוצאה מכך, EDCs יכול להשפיע על מספר תהליכים, כגון סינתזה, הפרשה, תחבורה, חילוף החומרים, או פעולה היקפית של הורמונים אנדוגניים האחראים לתחזוקת הומאוסטזיס, רבייה, פיתוח, ו/או התנהגות של האורגניזם כריכת הקולטן אינה הדרך היחידה לפעולה המתוארת עד כה ל-EDCs. כעת ברור כי הם יכולים גם לפעול על ידי גיוס מפעילים או corepressors ב מסלולים אנזימטיים או על ידי שינוי סמנים אפיגנטיים להסיר ביטוי גנים10,11,12,13 ,14, עם השלכות לא רק עבור הדור הנוכחי אלא גם עבור בריאות של דורות לבוא8.

הורמוני דרוזופילה

ההשפעות הפוטנציאליות של ה-EDCs שנבחרו נחקרו רבות, הן במינים של חיות הבר והן במערכות מודל מסוימות בהן מנגנונים אנדוקריניים ידועים באופן סביר. עבור חסרי חוליות, מערכות אנדוקריניות המשפיעות על הצמיחה, הפיתוח והרבייה האופיינים בהרחבה בחרקים מכמה סיבות, תוך שימוש נרחב בתחום המחקר הביולוגי, החשיבות הכלכלית שלהם ו לבסוף התפתחות של קוטלי חרקים המסוגלים להתערב במיוחד במערכת ההורמונים של חרקים מזיקים.

במיוחד, בין חרקים, זבוב הפירות D. melanogaster הוכיחה להיות מערכת מודל רבת עוצמה כדי להעריך את ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של edcs. ב D. melanogaster, כמו גם בעלי חוליות, הורמונים לשחק תפקיד חשוב לאורך כל מחזור החיים. באורגניזם זה, יש שלוש מערכות הורמונליות הראשי, אשר כרוכות הורמון הסטרואידים 20-hydroxyecdysone (20e)15,16, הורמון הקטין לנוער sesquאיטראיד (jh)17, ואת נוירופפטידים ו פפטיד/חלבון הורמונים18. קבוצה שלישית זו מורכבת ממספר פפטידים שהתגלו לאחרונה אך בבירור מעורבים במגוון עצום של תהליכים פיזיולוגיים והתנהגותיים, כגון אריכות ימים, הומאוסטזיס, חילוף החומרים, רבייה, זיכרון, ו locomotor control. 20E הוא הומוולוגי להורמונים סטרואידים נגזרים כולסטרול כגון estradiol, בעוד JH שותפים כמה קווי דמיון עם חומצה retinoic; שניהם הורמונים ידועים יותר. בדרוזוהילה19,20 האיזון שלהם חיוני בתיאום המולטינג והגלגול, כמו גם בשליטה על מספר תהליכים פוסט-התפתחותיים, כגון רבייה, תוחלת חיים, והתנהגות21, ובכך מציעה אפשרויות שונות לבדיקה אנדוקרינית הפרעה בדרוזופילה. יתרה מזאת, הורמונים ecdysteroid ו-JHs הם המטרות העיקריות של האינסקטיצידים הדור השלישי, שפותחו כדי להפריע לתהליכים התפתחותיים והרבייה בתיווך בחרקים. הסוג האגוניסט או מצב היריב של הכימיקלים האלה ידוע היטב, ולכן הם יכולים לשמש כסטנדרטים להתייחסות להערכת ההשפעות של מחשבי ה-EDCs הפוטנציאליים על הצמיחה, הרבייה והפיתוח של חרקים22. לדוגמה, מתיונין, אשר כבר בשימוש נרחב בשליטה יתושים וחרקים מימיים אחרים23,24, עובד כמו אגוניסט jh ו לוחץ מחדש 20e המושרה שעתוק ומטמורפוזה.

בנוסף להורמונים הורמונים, הקולטן הגרעינית (NR) בדרוסופילה ידועה גם כן; הוא מורכב מ -18 מקדמי שימור ושימור שימור הקשורים במסלולים התפתחותיים תלויי הורמונים, כמו גם רבייה ופיזיולוגיה25. הורמון זה NRs שייך לכל ששת מיני-משפחה של ה-NR, כולל אלה מעורבים נוירותמסורת26, שניים עבור חומצה Retinoic nrs, אלה עבור סטרואידים nrs כי, בעלי חוליות, מייצגים אחד היעדים העיקריים של edcs27.

דרוסופילה כמערכת מודל לחקר הפקולטה למדעי המחשב

כיום, על בסיס של תכונות מולקולריות, מספר סוכנויות סביבתיות ברחבי העולם מייחס את הפוטנציאל להפריע למערכות האנדוקריניות לכימיקלים שונים מעשה ידי אדם. בהינתן כי EDCs הם בעיה גלובלית בכל מקום עבור הסביבה ועבור אורגניזמים, המטרה הכוללת של המחקר בתחום זה היא להפחית את נטל המחלה שלהם, כמו גם כדי להגן על אורגניזמים חיים מהשפעות שליליות שלהם. על מנת להעמיק את ההבנה על ההשפעות האנדוקריניות הפוטנציאליות של כימיקל, יש צורך לבחון אותו בvivo. למטרה זו, ד. מלאנוגסטר מייצג מערכת מודל תקפה. עד היום, זבוב הפירות היה בשימוש נרחב כמו במודל vivo כדי להעריך את ההשפעות של מספר EDCs סביבתיים; דווח כי חשיפה לכמה edcs, כגון דיבוטיל פתלאט (dbp)28, בינתנול A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-OP)29, מתיל paraben (MP)30, ethylparen (EP)31, 32, bis-(2-ethylyl) פתלאט (dehp)33, ו-17-α-ethinyלסטרנול (EE2)34, משפיע על חילוף החומרים ופונקציות אנדוקריניות כמו במודלים בעלי חוליות. מספר סיבות הובילו לשימוש בו כמודל בתחום זה של המחקר. מעבר לידע מצוין של המערכות האנדוקריניות שלה, יתרונות נוספים כוללים את מחזור החיים הקצר שלה, עלות נמוכה, בקלות manipulable הגנום, היסטוריה ארוכה של מחקר, ומספר אפשרויות טכניות (לראות את האתר FlyBase, http://flybase.org/). ד. melanogaster מספק גם מודל רב עוצמה לחקר בקלות השפעות טרנסדוריים ותגובות האוכלוסייה לגורמים סביבתיים8 ונמנע בעיות אתיות הרלוונטיות למחקרים vivo בבעלי חיים גבוהים יותר. בנוסף, זבוב הפירות משתף מידה גבוהה של שימור גנים עם בני אדם שעשויים לאפשר לדרוזוהילה edc בחני לסייע בחיזוי או בהצעת השפעות פוטנציאליות של כימיקלים אלה לבריאות האדם. מלבד הרחבת ההבנה על השפעות בריאותיות של האדם, דרוזופילה יכול לעזור להעריך את הסיכונים של חשיפת EDC לסביבה, כגון אובדן מגוון המינים והשפלה סביבתית. לבסוף, זבוב הפירות מציע את היתרון הנוסף של השימוש במעבדות, שבו הגורמים העלולים להשפיע על התפתחותו, הרבייה ותוחלת החיים ניתן לשמור תחת שליטה על מנת לייחס כל וריאציה על החומר להיבדק.

עם זאת בראש, יש לנו אופטימיזציה כושר פשוטה ואיתנה לקביעת אפקטים של EDC על כמה מאפיינים הורמונליים של דרוזוהילה, כגון פוריות/פוריות, עיתוי התפתחותי, ותוחלת חיים של מבוגרים. מספר זה שימשו באופן נרחב לכמה מהנגמ ש23,24,25,26,27. בפרט, השתמשנו בפרוטוקולים הבאים כדי להעריך את ההשפעות של החשיפה לאסטרוגן סינתטי EE234 ו BPA ו ביפרונול AF (BPA F) (נתונים שלא פורסמו). פרוטוקולים אלה עשויים להיות שונה בקלות כדי לחקור את ההשפעות של EDC נתון בכל פעם, כמו גם את ההשפעות המשולבות של מספר Edc ב D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מזון

  1. לתחזוקת מניות ולגידול זחל, השתמש במדיום ארוחה בינונית המכילה 3% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 9% קמח תירס מבושל מראש, 0.4% אגר, לאחר מכן המכונה בינונית קמח תירס (CM).
    1. לשים 30 גרם של שמרים לתוך 100 mL של מי ברז, להביא אותו לרתיחה ולתת לו לרתוח עבור 15 דקות.
    2. בנפרד, מערבבים היטב 90 g של ארוחה תירס מבושל מראש, 100 גרם סוכר, ו 4 גרם של אגר לתוך 900 mL של מי ברז.
    3. הביאו את הפתרון לרתיחה, הורידו את החום ומבשלים 5 דקות זע ברציפות.
    4. לאחר 5 דקות, להוסיף את הפתרון שמרים חם מבשלים לעוד 15 דקות.
    5. כבו את מקור החום והניחו לפתרון להתקרר עד 60 ° c.
    6. הוסף 5 מ"ל/L של 10% מתיל 4-hydroxyבנזואט אתנול, לערבב היטב ולתת לו לשבת 10 דקות.
      הערה: היזהר עם כמות מתיל 4-hydroxyבנזואט, בהתחשב כי ריכוז גבוה של פטריות יכול להיות קטלני עבור הזחלים.
    7. לוותר על המדיום לתוך מבחנות/בקבוקים: 8 מ ל לתוך כל בקבוקון זבוב (25 מ"מ x 95 מ"מ), 3 מ ל לתוך כל בקבוקון זבוב (22 מ"מ x 63 מ"מ) ו 60 mL לתוך כל בקבוק זבוב (250 mL).
    8. כיסוי מבחנות עם גזה ולאפשר להם להתייבש בטמפרטורת החדר (RT) עבור 24 שעות לפני האחסון.
    9. כיילו את העקביות הימנית הנכונה והידרציה של ס מ על ידי שינוי הכמות של אגר בשימוש ו/או זמני קירור/ייבוש.
      הערה: המבחנות מנותקת, מקופסאות ועטופות בארבעה ° c, הינם יציבים במשך כ-15 יום.
  2. עבור מבוגרים דרוזופילה, השתמשו במדיום המכיל 10% אבקת שמרים, 10% סוכרוז, 2% אגר, לאחר מכן נקרא בינוני מבוגר (AM).
    1. מערבבים 10 גרם של אבקת שמרים, 10 גרם של סוכרוז, 2 גרם של אגר לתוך 100 mL של מים מזוקקים.
    2. הביאו את התערובת לרתיחה פעמיים, עם מרווח של 3 דקות, או עד שאגר מומס, באמצעות מיקרוגל.
    3. לאחר הפתרון מתקרר 60 ° c, להוסיף 5 מ ל/L של 10% מתיל 4-hydroxyבנזואט באתנול, לערבב היטב ולוותר בבקבוקונים (10 מ"ל לבקבוקון).
    4. כיסוי מבחנות עם גזה ולתת להם להתייבש ב-RT עבור 24 שעות לפני האחסון.
      הערה: המבחנות מנותקת, מקופסאות ועטופות בעוד כ-15 יום ב -4 ° c.
  3. עבור שיטת פוריות/פריון, השתמש במדיום ארוחה מקורזופילה למיץ עגבניות.
    1. שופכים את 70 mL של מזון מקמח תירס חם לתוך בספל 100 mL ולהוסיף 30 מ ל של מיץ עגבניות (30% v/v).
    2. מערבבים ביסודיות עם מעבד מזון ו-pipet 3 mL בבקבוקונים קטנים.
    3. כיסוי מבחנות עם גזה ולאפשר להם להתייבש ב-RT עבור 24 h לפני האחסון.
      הערה: המבחנות מנותקת, מקופסאות ועטופות בעוד כ-15 יום ב -4 ° c.
  4. עבור איסוף העובר, להשתמש לוחות אגר, המכיל 3% אגר, 30% רוטב עגבניות, ו 3% סוכר.
    הערה: להיזהר לא לעשות בועות בעת שפיכת המדיום בלוחות.

2. דרוזופילה EDC מינון

  1. להכין פתרון מניות המתאים המסת EDC שנבחרו בממס מתאים. עבור EE2 (מולקולרית משקל 296.403), לפזר 1.48 g ב 10 מ ל של 100% אתנול לעשות מניות 0.5 M פתרון וחנות ב-80 ° c.
    זהירות: EDCs נחשבים מזהמים סביבתיים ואמצעי זהירות יש לנקוט בטיפול בהם.
  2. לדלל את הפתרון EE2 stock 10% אתנול במים (v/v) על מנת להשיג פתרון 100 mM. הפוך את הדילול הבא (0.1 מ"מ, 0.5 mM ו 1 מ"מ) במזון CM, החל בריכוז הנמוך ביותר ושימוש באותו ריכוז סופי של הממס עבור כל קבוצת טיפול. עבור מבחנות הבקרה להשתמש באותו כמות של הממס לבד.
    הערה: מומלץ לשמור את הריכוז הסופי של הממס נמוך ככל האפשר, הנושאת בראש כי הריכוז הסופי של אתנול לא יעלה על 2% במזון לעוף.
  3. להוסיף את הפתרון המכיל את הדילול הנכון של EDC הנבחר למזון תירס מבוסס לפני מיצוק, לערבב ביסודיות עם מעבד מזון, לחלק 10 מ ל לתוך בבקבוקונים, לכסות עם גזה כותנה ולתת יבש ב RT עבור 16 h לפני השימוש.
    הערה: השתמש במדיום זה מיד לאחר הכנתו.
  4. לגידול מבוגרים, להכין פתרונות עבודה שונים EE2 (10 מ"מ, 50 מ"מ ו 100 mM, בהתאמה) ב 10% אתנול במים (v/v) ו שכבה 100 μL של כל אחד על פני השטח של AM, על מנת להשיג את הריכוז הרצוי של EE2 (0.1 mM , 0.5 מ"מ ו 1 מ"מ). עבור הפקד להשתמש באותו נפח של הממס לבד.
    הערה: לחילופין, להוסיף את הפתרון המכיל את הדילול הימני של edc הנבחר כמות קטנה של AM בצינור 50 mL, מערבולת ביסודיות וסטרtify 1 מ ל על פני השטח של הבקבוקונים AM.
    1. כיסוי מבחנות עם גזה כותנה, לאפשר ייבוש ב RT עבור 12-16 h תחת עצבנות עדינה להשתמש בהם מיד.
      הערה: יש לכוונן את תהליך הייבוש משום שהוא תלוי בלחות הסביבה.
  5. עבור שיטת האכלה, להוסיף הן את הפתרון המכיל את הדילול הנכון של EDC הנבחר (EE2 0.1 mM, 0.5 mM ו 1 מ"מ) ו מזון צביעה (למשל, את צבע אדום no. 40 ב 1 מ"ג/mL)35 ס מ לפני מיצוק, מערבבים בחוזקה עם מעבד מזון ואז מלאגנים . לתוך מבחנות

3. גידול זבובים

  1. השתמש זן איזוגניים חזקים, כגון אורגון R, מתוחזק על ידי דור מספר במעבדה.
  2. שמרו זבובים בתוך מחולל לחות, חממה מבוקרת טמפרטורה, עם אור טבעי 12 h: 12 h photoperiod כהה ב 25 ° c בבקבוקונים המכילים מזון CM.
  3. בכל אחת מהבחנות, השתמשו בבקבוקונים ב-RT.

4. שיטת האכלה

הערה: השיטה מומלצת לבדיקה אם הנוכחות של EDC שנבחרה במדיום עלולה להשפיע על האכלה של זבובים.

  1. שים 15 זבובים צעירים בבקבוקונים המכיל CM בתוספת ריכוזים שונים של EDC נבחר ומזון צביעה. אפשר לזבובים להיזון במדיה ליום אחד.
    הערה:לדוגמה, השתמש בצבע אדום no. 4035 (1 מ"ג/mL).
  2. שים 15 זבובים צעירים בבקבוקונים המכילים CM בתוספת עם הממס לבד ומזון צביעה לשליטה. אפשר לזבובים להיזון במדיה ליום אחד.
  3. מורדם באופן אינדיבידואלי כל קבוצה של זבובים עם האתר.
    1. העבר זבובים של כל קבוצה למיכל זכוכית גלילי (מיכל) עם משפך מוכנס לקצה הפתוח, הופך את הבקבוקון מעל המשפך ומקיש בעדינות על שני המכולות יחד כדי לגרום לזבובים ליפול לתוך החלון.
      הערה:  המשפך ימנע מהם. לצאת מהאתפה
    2. להקיש על הזבובים על ידי הקשה בעדינות על האוויר על משטח רך, כגון משטח העכבר, ובמהירות להחליף את המשפך עם כותנה ספוגה האתר תקע גזה.
    3. חכו בערך 1 דקות עד הזבובים נופלים לתחתית ולהפסיק לזוז.
      הערה: אל תחרוג מהזמן או אם הזבובים ימותו.
  4. הניחו זבובים מתחת למיקרוסקופ סטריאו והשוו את צבע הבטן של כל קבוצת הטיפול ביחס לקבוצת הביקורת.

5. שיטת פוריות

  1. עבור כל ריכוז EDC, להכין 3 מבחנות של זבובים, לאחר מכן נקרא בבחנות הורים, עם 8 נקבות ו 4 גברים ב 10 mL ס"מ/EDC מזון; עבור הפקד להכין 6 מבחנות של זבובים עם 8 נקבות ו 4 גברים ב 10 mL ס"מ מזון בתוספת ממיס. מאחור מתעופף בחממה ב -25 ° c.
    הערה: הימנע מהזחלים של צפיפות היתר במהלך התפתחותם ונסה להשתמש בצפיפויות זחל עקביות על פני טיפולים.
  2. לאחר 4 ימים, להסיר הורים ולהחזיר את הבקבוקונים לתוך החממה למשך חמישה ימים נוספים.
  3. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום 9, להסיר את כל הזבובים החדשים מתוך הבקבוקונים ולשים את הבקבוקונים בחממה ב 18 ° c בלילה.
    הערה: הסרה זו חייבת להיעשות בזהירות רבה, בדיקת פני השטח של הבאר המדיום.
    1. בבוקר של יום 10, עבור כל קבוצת טיפול, לאסוף נשים בתולה וזכרים צעירים לשתי קבוצות, תחת אור CO2 המגורטיזציה. משנה באופן אקראי כל קבוצה של זבובים בקבוצות קטנות (10 נקבות ו 20 זכרים לכל בקבוקון) בבקבוקונים עצמאיים ממולא CM המקביל טרי.
      1. חזור על שלב 5.3.1 טיפול שניהם כדי להסיר בזהירות את כל הזבובים מן הבקבוקונים 8-10 h לפני איסוף ולעזוב את הבקבוקונים ב 18 ° c, עד להשיג לפחות 30 נקבות הבתולה ו 30 זכרים עבור כל ריכוזי EDC ולפחות 90 נקבות הבתולה ו 90 הזכרים עבור השליטה.
    2. הבית קבוצות אלה של זבובים על 25 ° צ' עד שהם גילאי 4 ימים לאחר eclosion, העברת אותם לתוך מבחנות חדש המכיל מדיום המקביל טרי מדי יומיים.
      הערה: 4 ימים הוא זמן מספיק עבור זבובים להיות מבוגרים בוגרים, אבל זה רחוק מאוד מתחילת הזדקנות.
    3. לאחר יומיים תבטיח שאין. זחלים בבקבוקונים של נקבות אם כן, הזבובים אינם שמישים משום שהם אינם בתולות ויש להיפטר מהם.
  4. השתמש 20 זבובים בודדים של כל מין עבור כל קבוצת טיפול להקים 20 צלבים בודדים לתוך מבחנות קטנות המכילות מדיום טרי-עגבנייה ללא EDC, כפי שמתואר להלן.
    1. לכל קבוצת טיפולים מקצים סידרה שונה של מספרים רציפים, המזהה אותה באופן ייחודי ומתייג את הבקבוקונים המתאימים; לדוגמה, group1 (ממס בלבד) מ 1 עד 20, קבוצה 2 (ריכוז EDC x) מ-20 עד 40, וכן הלאה.
    2. הפוך גיליון אלקטרוני לפוריות כדי לתעד את הסדרות השונות, שכל אחת מהן מתאימה לקבוצת טיפולים.
    3. עבור כל מין מורדם כל הזבובים השייכים לכל קבוצת טיפול תחת האור CO2 באופן אקראי להעביר אותם כדלקמן.
      1. להעביר אחת הממיסים מטופלים לתוך בקבוקון קטן המכיל מדיום בינונית טריים-עגבניות ללא EDC ולהוסיף זכר הממס מטופל אחד עבור צלב השליטה.
        הערה: מיץ עגבניות יש להוסיף למדיום במהלך ההכנה שלה כי בינוני כהה מגביר את הניגוד עם העוברים הלבנים.
      2. העבר אחד EDC מטופל נקבה לתוך בקבוקון קטן המכיל ס מ עגבניות טריים ללא EDC ולהוסיף זכר מטופל אחד עבור כל טיפול.
      3. העבר אחד EDC מטופלים זכר לתוך בקבוקון קטן המכיל מדיום בינונית-עגבניות טריים ללא EDC ולהוסיף אחת הממס מטופל נקבה עבור כל טיפול.
    4. הבית כל הצלבים האלה. ב -25 ° c
  5. העבר כל זוג הזדווגות לתוך מבחנות טרי-עגבניות טריים ללא EDC כל יום במשך עשרת הימים הבאים. תייג את הבקבוקונים המשוכפלת של כל סדרה ברצף; לדוגמה 1-a, 1b, 1b...... 20a, 20 ב', 20a ודווח על המספר הזה. בגיליון האלקטרוני של הפוריות
  6. לבדוק באופן חזותי כל בקבוקון כל יום על הביצים ולדווח על המספר שלהם על הגיליון האלקטרוני פוריות.
  7. שמור כל בקבוקון, כאשר זבובים החדש מתחיל לצוץ, גם להקליט את המספר היומי של progenies למבוגרים במשך 10 הימים. לאחר 10 ימים מההזדווגות. הראשונית, הסר הורים
    הערה: למחוק בקבוקון שבו אחד או שני ההורים מתו; במקרה של בריחה של אחד או שניהם ההורים, לכלול בניתוח כל הנתונים עד היום שבהם אבדו.
  8. סיכום המספר היומי של ביצים והמספר היומי של progenies למבוגרים מכל קבוצת טיפול, כדי לקבל את הפוריות הכוללת/פוריות, ביצה מרושע והפקת צאצאים למבוגרים על ידי זבוב במשך עשרה ימים, ואת היחס של צאצאים סה ל מספר הכולל של ביצים הניח. חשב את ההבדלים באחוזים של כל אחד מערכי הטיפול ביחס לפקד.
  9. ביצוע שלושה ניסויים עצמאיים עבור כל קבוצה של זבובים, באמצעות מינימום של 10 זבובים עבור כל קבוצת טיפול.
  10. בצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות בין הקבוצות השונות.

6. התפתחות העיתוי

הערה: בשני הפרוטוקולים החלופיים הבאים מוערך העיתוי ההתפתחותי על-ידי ספירת מספר הגלמים היוצרים ליום ומספר הצאצאים הבוגרים המפסידים ביום.

  1. פרוטוקול שיטת שיאון 1
    1. עבור כל קבוצת טיפול, להגדיר 10 מבחנות של צעירים (< 2 ימים), זבובים בריאים, כל אחד עם 6 נקבות ו 3 גברים ב 10 מ"ל מזון מקמח תירס ללא EDC.
    2. הניחו לזבובים לאכול 24 שעות ביממה, והרשו להם להזדווג.
    3. הכינו 10 מבחנות מקבילות לכל קבוצת טיפול עם 10 מ ל כל אחד מזון טרי קמח מאכל בתוספת ריכוזי EDC שונים או הממס לבד עבור השליטה. . העברת זבובים לבקבוקונים החדשים
      הערה: עבור כל קבוצת טיפולים מקצים סידרה שונה של מספרים רציפים, המזהה אותה באופן ייחודי ומתייג את הבקבוקונים המתאימים.
    4. הפוך גיליון אלקטרוני התפתחותי להקלטת הסדרות השונות.
    5. אפשר לזבובים להטיל ביצים במשך 16 שעות. . אז תסיר הורים מבקבוקונים
      הערה: ניתן להשתמש בזבובי ההורה כדי לחזור על השלב ה6.1.5, על-ידי העברתם לבקבוקונים תואמים אחרים.
    6. הדגירה מבחנות עבור 3-4 ימים ב 25 ° c, או עד לא עוד טופס הגלמים. כל יום סופרים את מספר הגלמים החדשים בכל בקבוקון ומדווחים על הגיליון האלקטרוני ההתפתחותי. כדי להימנע מספירת הגולם פעמיים, כתוב מספר ברצף בכל גולם עם סמן קבוע מחוץ לבקבוקון.
    7. החל מהיום ה -9, ספור את מספר המבוגרים עד שלא הופיעו יותר מבוגרים, ודווח על כך בגיליון האלקטרוני ההתפתחותי.
    8. מנתונים גולמיים אלה, חשב את תקופת הזחל הממוצע, את התקופה גולמי הממוצע, כמו גם את ההבדלים באחוזים של כל טיפול ביחס לפקד.
    9. ביצוע שלושה ניסויים עצמאיים עבור כל קבוצה של זבובים, באמצעות מינימום של 5 מבחנות עבור כל קבוצת טיפול.
    10. בצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות בין הקבוצות השונות.
  2. פרוטוקול שיטת שיאון 2
    1. נקבה אחורית צעירה ובריאה (על 150) וזכר (על 50) זבובים על כלוב האוסף (טבלה של חומרים) עם אגר בינוני עגבניות בתוספת עם משחת שמרים טריים של בייקר (3 גרם של שמרים של בייקר ב 5 מ ל של מים), לאחר מכן נקרא מגש הנחת, במשך יומיים ב -25 ° c.
    2. במהלך היומיים הללו, אפשר לזבובים להיכנס לכלוב במקום חשוך ושקט, לפני תחילת איסוף הביציות, ולהחליף את המגש פעמיים ביום.
    3. ביום השלישי, החליפו את המגשים. מוקדם בבוקר לאחר 1 h, להחליף את מגש הנחת, להשליך אלה הביצים הונחו.
    4. אפשר זבובים להטיל ביצים עבור 2 h ולהחליף עם מגש הנחת טרי.
      הערה: ביום 3, מגש הנחת טוב צריך לייצר 100-200 ביצים 2 h.
    5. עבור כל קבוצת טיפול, להכין סדרה של 3 60 מ"מ מנות המכילות עגבניות מזון תירס בתוספת עם ריכוז EDC המקביל או עם ממס לבד ולדווח על כל סדרה בגיליון העיתוי ההתפתחותי. לחילופין, אם מעדיפים, השתמשו בבקבוקונים במקום בכלים.
    6. בעדינות להרים את הביצים תחת מיקרוסקופ באמצעות מברשת צבע או בדיקה ולהעביר אותם לחלק העליון של המדיום בכל תבשיל/בקבוקון. על מנת להקל על הספירה, על מגש הנחת, לסדר ביצים 5 קבוצות של 10 כל אחד ולהעביר אותם אחד בכל פעם.
      הערה: חזור על השלב 6.2.4 פעמים רבות ככל הנדרש כדי להשיג מספיק עוברים.
    7. השאר את כל הכלים/הבקבוקונים האלה ב -25 ° c. אחסן גם כל מגש הנחה ב -25 ° c, וספור את המספר הכולל של הביצים המטילות.
    8. לאחר 24-30 h, בדוק כל תבשיל/בקבוקון תחת stereomicroscope ולספור הן את מספר הביצים הלבנות, הבלתי מופרות ואת מספר עוברים מתים אפלים.
    9. הפחת את מספר הביציות הלבנות והבלתי מופרות מ50 הועברו על מנת לקבל את הערך הכולל של העוברים לכל מנה/בקבוקון. מספר העוברים מתים כהה ניתן להשתמש כדי לקבוע את ההשפעות הרעילות EDC פוטנציאליים במהלך embryogenesis.
    10. חזור על שלבים ה6.1.6-6.1.10 של הקוד הראשון של פרוטוקול Eclosion.

7. פרוטוקול תוחלת החיים

  1. הגדר 20 מבחנות של זבובים עם 8 נקבות ו 4 זכרים ובתים בגובה 25 ° c ס"מ (10 מ"ל כל אחד).
  2. לאחר 4 ימים להשליך זבובים ומניחים את הבקבוקונים בחממה.
    הערה: ניתן להשתמש בזבובים אלה כדי להתחיל שוב כדי לקבל מחדש את הגיל המסונכרן של הזבובים.
  3. בשעות אחר הצהריים המאוחרות של היום 9, להסיר את כל הזבובים החדשים מן הבקבוקונים ולהחזיר בבקבוקונים לחממה.
    הערה: כמה מבוגרים צריכים להתחיל להפסיד כבר ביום התשיעי; להשליך זבובים אלה מאפשר לאסוף מספר מירבי של זבובים מסונכרנים, הימנעות בחירה רשלנית של מתהווה מוקדם.
  4. 16-24 h מאוחר יותר, להעביר את הזבובים למבוגרים (1 יום בן) של שני המינים לארבע קבוצות של 250 mL בקבוקים המכילים מזון AM בתוספת עם שלושה ריכוזי EDC שונים ואחד עם הממס לבד. במקרה הצורך, אספו חבילה נוספת למחרת.
  5. לשמור על זבובים ב 25 ° c עבור 2-3 ימים כדי לאפשר להם להזדווג.
    הערה: יום המעבר לבקבוקונים מזון מתאים ליום הראשון של הבגרות.
  6. לאחר שניים-שלושה ימים, למיין כל קבוצה של זבובים על ידי מין לשתי קבוצות תחת אור CO2 מורדם. באופן אקראי לחלק כל מין לחמש מבחנות לכל טיפול בצפיפות של 20 אנשים לבקבוקון, עד שיהיו שלושה משכפל של 5 מבחנות מקבילות עבור כל מגדר לכל טיפול.
    הערה: לעבוד עם קבוצות קטנות של זבובים על מנת למנוע בעיות בריאות לטווח ארוך אפשרי עקב זמן חשיפה ארוכה ל-CO2.
  7. הכינו גיליון אורך חיים שבו מספר הזבובים המתים מופחתים ממספר הזבובים ששרדו להעברה הקודמת, באופן שיהיה באופן אוטומטי להשיג את מספר הניצולים בכל העברה.
  8. העברת זבובים לתוך מבחנות חדשות המכילות את המזון המתאים כל 3 ימים באותו זמן ולבדוק את המוות.
    הערה: ההעברה חייבת להתקיים ללא הרדמה שיכולה להיות השפעה שלילית ארוכת טווח על אריכות החיים.
    1. בכל העברה, הקליטו את גיל הזבובים ואת מספר הזבובים המתים.
      הערה: מספר הזבובים השורדים מחושב באופן אוטומטי בגיליון האלקטרוני, אך מומלץ לבדוק אותו בצורה חזותית. זבובים שבטעות גם לברוח או למות במהלך ההעברה לא צריך להיחשב. היזהר שלא לספור פעמיים זבובים מתים הנישאים לבקבוקון החדש המדווח על הערה זו בגיליון האלקטרוני.
    2. חזור על שלבים 7.8 ו7.8.1 עד למות כל הזבובים.
  9. עבור כל קבוצת טיפול, צור עקומת הישרדות כפי שמוצג באיור 6, כדי להציג את ההסתברות להישרדות של זבוב בכל זמן נתון.
  10. לבצע שלושה ניסויים עצמאיים עבור כל קבוצת טיפול של זבובים, באמצעות 100 החדש זבובים eclosed עבור כל ניסוי.
  11. הכן טבלה שבה לדווח על תוחלת החיים הממוצע (מתכוון ימי הישרדות של כל הזבובים עבור כל קבוצה), חצי זמן מוות (תקופת הזמן בימים הנדרשים כדי להגיע 50% תמותה) ואת אורך החיים המקסימלי (כמות מקסימלית של ימים הדרושים כדי להגיע 90% תמותה).
  12. חשב את ההבדלים באחוזים בין כל קבוצת טיפולים ביחס לקבוצת הביקורת.
  13. בצע ניתוח סטטיסטי כדי להשוות בין קבוצות הטיפול השונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בסעיף זה, מדווחים שלבי המפתח של הפרוטוקולים הנ ל בצורה של סכימות פשוטות יותר. בהינתן כי זבובים נוטים להימנע תרכובות טעים, הדבר הראשון לעשות הוא לקבוע את הטעם של EDC נבחר. זה יכול להיעשות על ידי ערבוב של צביעה מזון (למשל, צבע אדום מאכל no. 40)35 עם המזון שיושלם עם edc נבחר במינונים שונים או עם הממס לבד. זבובים הניזונים ממדיה אלה נבדקים תחת stereomicroscope וצריכת המזון מוערך על ידי צביעה הבטן שלהם (איור 1). המצב הרצוי אופייני מוצג באיור 1 עם שתי נקבות מבוגרות: אחד ניזון בינונית המכילה את edc שנבחרו ואחד על בינוני לא מכיל edc, שניהם הצגת צבע זהה בבטנם שלהם.

זה היה מקובל באופן נרחב כי EDCs, כמו הורמונים טבעיים, יש השפעות במינונים נמוכים מאוד וכי אין קשר פשוט, ליניארי בין המינון והתוצאה29, עם מינונים גבוהים יותר לא בהכרח בעל אפקט גדול יותר36, 37. כך, במקום גישה מינון-תגובה, על מנת להעריך באופן מלא את ההשפעות שלהם, מומלץ להשתמש במינונים יותר, החל מריכוזים רלוונטיים עבור הסביבה או אורגניזמים אחרים. בכל מקרה, חשוב לקבוע את טעם ה-EDC בכל ההתרכזות בשימוש כדי לוודא כי זבובים לעכל כמויות דומות של EDC בכל קבוצת טיפול (איור 2).

הפרעה אנדוקרינית משפיע על תכונות חשובות רבות של פיזיולוגיה של בעלי חיים כגון פריון, אריכות ימים, ופיתוח כי, לכן, הן נקודות קצה שימושיות כדי לבדוק EDCs. עבור הפרוטוקולים הנ ל, אשר אנו אופטימיזציה כדי למדוד את אפקטי ה-EDC על התכונות החיים האלה Drosophila ילה, שיקולים עיקריים הם כי הוא הכרחי להשתמש זבובים צעירים ובריאים כי צריך להיות מניפולציות כראוי לפני בדיקה. עם זאת בראש, יש לשלם תשומת לב רבה לייצור, טיפול ואחסון של המזון המשמש. בנוסף, הטיפול צריך להילקח באמצעות הממס הטוב ביותר עבור EDC הנבחר בריכוזים הסופי המתאים (כלומר, פחות מ 1% עבור diמתיל סולפוקסיד [DMSO] ופחות 2% אתנול)30.

פוריות ופריון שימשו להערכת הצלחת הרבייה D. מלאנוגסטר. איור 3 מציג ערכה של הפרוטוקול שבשימוש. פוריות מוערכת כמספר הכולל של ביצים מטילות, ואילו הפוריות נמדדת כצאצאים מבוגרים לחלוטין. בהתבסס על השיקול כי ייצור ביצים ב 10 הימים הראשונים של החיים הבוגרים הוא התייחסות טובה לכל החיים מבוגרים ביצה/צאצאים ייצור של אורגניזם38,39, פריון ופוריות asunצלילות יכול להתבצע במשך 10 ימים על ידי השתמשו בזבובים בני 4 ימים בקעו מהזחלים החשופים. חשוב לנסות להשיג ערכים דומים בבקבוקונים המקבילים של כל קבוצה; אחרת, יהיה קשה לדמיין איזו צינורית להסיר מהניתוח. לכן, מומלץ לבחון כל יום כל בקבוקון שכפול כדי למנוע סביבה מלחיצה, כגון מזון מיובש או נוזלי; החל מ -20 צלבים בודדים, מומלץ להשיג לפחות 10 בבקבוקונים בתנאים טובים, בהם שני הוריו חיים במשך 10 ימים. מספר ביצים וצאצאים מבוגרים, שנאספו מדי יום, יש לדווח על שולחן כפי שמוצג באיור 3 ומשמש כדי לחשב את הביצה ממוצע והפקת צאצאים מבוגרים של זבוב למשך 10 ימים. לאחר מכן, את אחוזי השינוי הפוריות/הפוריות של זבובים מטופלים בהשוואה לזבובי שליטה ניתן להשיג החלת הנוסחה הבאה: פוריות/שינוי פוריות% = [(בקרת הטיפול)/בקרה] x 100. יש להשיג לפחות שלושה משכפל בלתי תלוי עבור כל קבוצה.

הורמונים לשחק תפקידים חיוניים במעברים התפתחותיים בחייו של D. melanogaster40, כי סביר להניח כי שלבים אלה של צמיחה פגיעים במיוחד להשפעות השליליות של edcs. ב-25 ° c, הן צמיחת הזחל והן השלב גולמי כל תוחלת כ 4 ימים. בעקבות חשיפת EDC, משך הזמן הממוצע של שלבים אלה יכול להיות מושפע41. בהסתמך על שיקול זה, הפרוטוקולים ההתפתחותיים היו ממוטבים לקביעת אחוזי המעבר מזחלים לגלמים ומגלמים למבוגרים בעקבות חשיפת EDC ביחס לזבובים שאינם מטופלות. שני פרוטוקולים חלופיים יכולים לבצע את היכולת הזאת. שניהם היו תקפים ומבוססים על חשיפה כרונית EDC לזחלים במשך 4 ימים. בהתבסס על הטיפול הזחל הזה, הפרוטוקול הראשון לא לקחת בחשבון את גיל העוברים, אשר נאספו במשך תקופה של 16-18 h (לילה). עם זאת, על ההבדלים בגיל הסוגר בין הזחלים להיות נוכחים בכל הבקבוקונים של כל טיפול, ובכך להגדיל את השונות בתוך הטיפול, אך מבלי להשפיע באופן משמעותי על האומדנים של העיתוי ההתפתחותי באמצעות טיפולים. במקום זאת, הפרוטוקול השני השתמש במספר קבוע של עוברים מוקדמים סינכרוניים, דבר המאפשר להעריך גם את ההשפעות הפוטנציאליות של הקובץ edc שנבחר במהלך embryogenesis42,43. יתרה מזאת, צמצום הבדלי הגיל בין הזחלים הפחיתו את השונות בתוך הטיפול והגדיל את היכולת להעריך את ההבדלים האמיתיים בין הטיפולים. איור 4 מדווח על ערכה של שיטת ה-eclosion. בשני הפרוטוקולים, היו צריכים לבדוק את הצלחות/מבחנות מדי יום, ומספרם של הגלמים והמבוגרים מאלה שנחשפו ולא נחשפו ל-EDC דווחו בנפרד על שולחן בדומה לאיור 4. יש לספור את כל הגלמים והזבובים הבוגרים, בין אם הם מתים או חיים. לאחר מכן, הנתונים הגולמיים האלה שימשו לחישוב האחוזים והשעות של המעבר מזחלים לגלמים ומגלמים למבוגרים ולחישוב אחוז השינוי של הערכים הללו של הזבובים המוטפלים ב-EDC בהשוואה לזבובי שליטה. בעקבות חשיפת EDC, מקדמה התפתחותית כוללת או עיכוב ביחס זבובים הבקרה היה צפוי. הפרוטוקול הנבחר היה צריך להתבצע בטרילקאט עבור כל קבוצה של זבובים. זה היה מומלץ, עבור פרוטוקול שיטת הניתוח 2, כל סדרה של שכפול עבור ריכוז EDC נתון הופרה עם העוברים מאותו שביל הנחת על מנת לשמור על אמינות ודיוק בזמני העובר ברחבי ריכוזי EDC.

לבסוף, איור 5 מציג את שלבי המפתח למדידת תוחלת החיים. עבור פרוטוקול זה, היה זה חיוני כי כל הזבובים בניתוח היו סינכרוני על ידי גיל ומין, ביחד, ושמרו בצפיפות נמוכה מספיק כדי לאפשר מחזור חופשי. חשוב לבצע ניסויים בשני המינים בנפרד משום שידוע היטב שיש הבדלים משמעותיים בתוחלת החיים בין זכרים לנקבות44.

המזון היה צריך להשתנות כל 3 ימים כדי לשמור על אוכלוסיה בריאה, ואת התמותה צריך להיות מוערך גם כל 3 ימים. בגיליון חיים, כמו באיור 5, דווחו מספר הזבובים המתים, ומספר זה יושאר באופן אוטומטי ממספר הזבובים השורדים מההעברה הקודמת. עבור כל ריכוז EDC ועל הממס בלבד, הספינה הישרדות המצטבר לעומת הימים שחלפו הותווה כדי להשיג עקומות תוחלת חיים. עקומת שרידות טיפוסית מדווחת באיור 6; לאחר תקופה ראשונית ארוכה שבה העיקול ההישרדות נשאר גבוה יחסית, הוא דחה אקספוננציאלית לאחר כ 60 ימים. בעקבות חשיפת EDC, עקומת ההישרדות של הזבובים התייחסו יכול להיות מושפע באופן משמעותי. כדי לקבוע אם אפקט זה נובע EDC שנבחרו, היה מומלץ לבצע לפחות שניים, או יותר טוב, שלושה בלתי תלויים, noncontemporaneous שכפול ניסויים.

בכל אחד מהפרוטוקולים הנ ל, ניתן היה לקבל מבחנות חריגות (למשל, ללא ביצים או מקרי מוות חריגות); מבחנות אלה יכול להיות מקורו בסיבות שונות, כגון איכות המזון המסכן או זיהום, והוא יכול לשנות באופן משמעותי את הערכים של האמצעים. הדרך הטובה ביותר לנהל מצבים אלה חריגות היתה להימנע מהם באמצעות תרגול ניסיוני טוב. לכן, יש להדגיש כי, עבור כל הפרוטוקולים הנ ל, העבודה הגדולה והזהירה נדרשה בשכפול הבקבוקונים, שמירה על זבובים בריאים, ובטיפול זבובים כי, לאחר שנחשף ל-EDC, עשוי להיות עדין, ובכך להגדיל את הסיכון למוות כאשר ניפולציות.

Figure 1
איור 1: שיטת האכלה. למבוגרים זבובים בבקבוקונים המכילים CM/צבען בתוספת EDC שנבחרו (למעלה) או ממס לבד (למטה) נשארו להאכיל עבור 24 h. שתי זבובים ניזון בינוני בתוספת עם EDC (למעלה) או ממס לבד (למטה) להראות צביעה דומה על בטנם שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מינון EDC. סכימטי של מינהל EDC לדרוזופילה באמצעות דיאטה. מבוגרים זבובים מתוך מניות איזוגניים חשופים ריכוזים שונים של EDC (למעלה) או ממס לבד (למטה). N = ריכוז הייחוס של ה-edc. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שיטת פוריות. סכמטית של הפרוטוקול, המתאר את הצעדים מגידול הזבובים במדיה המתאימה לאוסף הבתולים ועד לצלבים בודדים. שלב 1: מבוגרים (10 מבחנות עם שמונה נקבות וארבעה זכרים כל אחד) מתוך זן איזוגניים מועברים לבקבוקונים עם CM/EDC (למעלה) או CM/ממס לבד (למטה). (שים לב שהערכה, למען פשטות, מתייחסת רק לאחד משלושת הבקבוקונים). שלב 2: לאחר 4 ימים, מבוגרים נזרקו, והביצים הונחו נותרו 9 ימים עד לשלב המבוגר. שלב 3: מבוגרים לאחרונה eclosed ממוינים לפי מין ונאסף בבקבוקונים (מקס. 20 זכרים/בקבוקון ו 10 בתולה-נקבות/בקבוקון). שלב 4: מבוגרים משמאל לגיל 4 ימים על המדיום המתאים של צמיחת הזחל. שלב 5: הכיוונון של 40 צלבים בודדים עבור זבובים EDC מטופלים בינונית-עגבניות ללא EDC, 20x אחד התייחס EDC הגבר עם אחת שליטה נקבה 20x אחד בקרת זכר עם אחת EDC מטופל נקבה (למעלה); כיוונון של 20 צלבים בודדים עבור זבובי בקרה, 20x אחד שליטה זכר עם אחת שליטה נקבה (למטה). בינוני צהוב הוא ס מ בתוספת עם EDC (למעלה) או ממס כמו שליטה (למטה), ובינוני אדום הוא עגבניה/CM ללא EDC או ממס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: העיתוי ההתפתחותי (פרוטוקול שיטת מיון 2). משמאל, איור זה מציג ערכה של כלוב האוסף שבו מבוגרים (כ 150 נקבות ו-50 זכרים) ממוקמים כדי התאקלם ו להזדווג בחושך לפני השלב התצהיר (ראה פרוטוקול). לאחר יומיים, מגש הגלישה הישן מוחלף עם אחד עם מזון טרי, ואת הביצים המועדות ב 1 h הבאה נמחקים משום שהם אסינכרוניים. להלן, ביצים נאספים כל 2 h על מגש הזזה חדש, נספר, והניח על מנות המכילות עגבניות/CM בתוספת EDC או עם ממס לבד. מידע (מימין) מדווחים על סדרה של גיליונות אלקטרוניים בעיתוי התפתחותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שיטת תוחלת החיים. יום אחד זבובים מסונכרנים מועברים לבקבוק 250 mL עם מזון למבוגרים (AM) שיושלם עם EDC (למעלה) או ממס (למטה) כפקד, כדי לאפשר האכלה (שמאל בערכה). לאחר 2-3 ימים, הזבובים ממוינים לפי מין והועברו חמש מבחנות (המכיל את המדיום המתאים של הבקבוק ההתחלתי) עבור כל מין, בקבוצות של 20 אנשים/בקבוקון. כל 3 ימים, המבוגרים מועברים לבקבוקונים טרי עד שאין צורך עוד (החלק המרכזי של התוכנית). מימין היא ערכה של הטבלה שבה הנתונים נרשמים בכל יום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: תוחלת חיים עקומות. משמאל, שולחן נציג מדווח שבו מספר זבובים מתים נרשם כל 3 ימים, הן עבור קבוצת הטיפול (בינוני + EDC [0.05 mM EE2]) ועבור קבוצת הביקורת (בינוני + ממס), לאורך כל התקופה ניסיוני. תוחלת החיים הממוצע של כל קבוצה חושבה באמצעות המטריצה SUM. מוצר המוצר; הקבוצה המטופלת קיצרה את תוחלת החיים הממוצע בהשוואה לקבוצת הביקורת. מימין, עקומת הישרדות טיפוסית מוצג של זבובים זכרים הניזונים עם בינוני המכיל EE2 (0.05 mM) או רק אתנול עבור השליטה. עקומת ההישרדות ירדה במהירות רבה יותר עבור זבובים מטופלים מאשר עבור קבוצת הביקורת, עם נקודת המפנה המוקדמת יותר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זבוב הפירות D. melanogaster היה מועסק בהרחבה כמו במערכת vivo model כדי לחקור את ההשפעות הפוטנציאליות של הסביבה edcs כגון dbp28, BPA, 4-NP, 4-tert-OP29, MP30, EP31, 32, dehp33, ו EE234. מספר סיבות הובילו את השימוש בו כמודל בתחום זה של המחקר. מלבד היתרונות הבלתי מעורער שלה כמערכת מודל, מחולקת דרוזופילה מידה גבוהה של שימור גנים עם בני אדם, שעבורם הדרוזולה edc בחני עשוי לסייע בחיזוי או בהצעת השפעות פוטנציאליות לבריאות האדם. בנוסף, משתייך דרוסופילה לחסרי החוליות, המיוצגים באופן נרחב בכל הסביבה, ודורשים אמצעי הגנה גבוהים יותר כנגד ההשפעות המזיקות של EDCs. יצורים חסרי חוליות ממוקמים בבסיס של שרשרת המזון ולבצע פונקציות חשובות מאוד עבור סביבות שבו הם חיים. דווח כי כמה EDCs שפורסמו לסביבה עשויה להיות השפעה מזיקה על התפתחות ורבייה של כמה מיני בעלי חיים. דרוזופילה מציעה את היתרון הנוסף של השימוש במעבדה, שבו גורמים המשפיעים על פיתוח, רבייה, ותוחלת חיים ניתן לשמור תחת שליטה על מנת לייחס כל וריאציה על החומר להיבדק.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים עבור לימוד ההשפעות של חשיפה EDC במערכת מודל זו על ורמונאלי תכונות החיים מוסדרים כגון פוריות/פוריות, שיעור התפתחותי, ותוחלת חייהם. יש לנו אופטימיזציה פרוטוקולים אלה שאפשרו לחקור את ההשפעות של EE234, BPA, ו BPAF (נתונים שלא פורסמו) חשיפה, אבל הם יכולים להיות מותאמים בקלות כדי ללמוד את ההשפעות של edcs אחרים. במיוחד, מאמר זה יכול לשמש כדי לחקור את שני EDCs טהור ושילובים של EDCs שונים, להתרבות באופן הדוק יותר מה שמתרחש בטבע. למרות שככל הנראה, הם עשויים להיראות כמו הצמיחה הפשוטה אומר, חשוב לעבוד על פי ההנחיות המתאימות, להבטיחדיוק וה45 הנקרא. ידוע היטב כי פוריות, תזמון התפתחותי ואריכות-חיים ברה מלאנוגסטר יכולים להיות מושפעים מגורמים חיצוניים ופנימיים. גורמים קריטיים אלה, כולל photoperiod, טמפרטורה, לחות, תזונה, צפיפות אוכלוסין, מבנה גנטי, וגיל, צריך להיות נשלט בקפידה עבור תוצאות הפרוטוקולים שדווחו. כדי למזער את המרכיב של השונות הגנטית, זן איזוגניים צריך לשמש. מאמץ זה חייב להיות גדל בזהירות בתוך מחולל, חממה מבוקרת טמפרטורה, עם הטבעי 12 h אור: 12 h photoperiod כהה ב 25 ° c.

בנוסף לשמירה על סביבה מבוקרת, יש להמנע מזחל וצפיפות יתר של מטוס. דווח כי צפיפות יתר של זחל יכולה להשפיע על העיתוי ההתפתחותי ולגרום לביטוי של גנים מסוימים, כולל הלם חום או גנים הקשורים לחסינות, המשפיעים על הכושר הכולל של מבוגרים זבובים46. כמו כן, יש לשמור על זבובים מבוגרים בצפיפות נמוכה מספיק כדי לאפשר תנועה חופשית כדי למזער את המתח הבוגר. יתר על כן, חשוב לוודא כי זבובים צורכים כמויות דומות של EDC בכל קבוצת טיפול, לקיחת בהתחשב בטעם של התרכובת בריכוזים שונים, כי הזבובים נוטים להימנע מאוכל טעים. היבט חשוב נוסף של פרוטוקולים אלה הוא איכות המזון; האוכל צריך גם להיראות טוב, נטול בועות, בקטריה סדקים, וכך ב47,48. יתר על כן, יש צורך לשמור על סנכרון המוח, מעמד ההזדווגות, ומין למגורי הזבובים כדי להיבדק. בכל הפרוטוקולים המדווחים, חשוב שהבקבוקונים המקבילים בניתוח חייבים להיות דומים מאוד; אחרת, יהיה קשה להבין מה להשליך כך שתשומת הלב המירבית והניסיון הנסיוני הטוב נדרשים. לבסוף, על ידי שימוש בפרוטוקולים אלה כדי להעריך את ההשפעות האנדוקריניות של EDCs שנבחרו, חשוב לקחת בחשבון אינטראקציות אפשריות עם EDCs אחרים הנוכחים במדיום, כגון מתיל 4-הידרוקסיבנזואט או BPA של בבקבוקי פלסטיק. במובן זה, זה יכול להיות שימושי כדי לשנות את הסוכן פטריות, להשתמש בבקבוקונים זכוכית, או לבצע הטייס שניהם עם ובלי מזהמים אפשריים.

הדיווח על drosophila ילה בחני יכול להיות יעיל מאוד להערכת כל הכימיקלים או תערובת של כימיקלים, כגון edcs, על ידי הערכת ההשפעות הפוטנציאליות על תכונות החיים מוסדר ורמונאלי, כגון רבייה, פיתוח, ותוחלת חייהם. עם זאת, מספר זה לא יכול לשמש כדי לזהות בבירור את המנגנון האנדוקרינית האחראי על תופעות לוואי EDC. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן לבצע את הפרוטוקולים אותם באמצעות התייחסות EDCs שעוררו תגובות נציג של מצב מסוים של פעולה על המערכת האנדוקרינית החרק (למשל, הדור השלישי הקוטלי העובדים כמו JH או ecdysteroid אגוניסט/יריב)22. לחילופין, אפשר גם להשתמש בנקודות קצה מולקולריות, ביצוע ניתוח מולקולרי על גנים ספציפיים כי הם ורמונאלי מוסדרים והם נחשבים חזוי סמנים ספציפיים עבור ההפרעה האנדוקרינית34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מודים לאורסולינה פטורו לקבלת תמיכה טכנית. המחברים מודים לד ר מריארטריה אלטה (CNR) לתמיכה ביבליוגרפית. המחברים מודים לד ר גוסטבו דמייאנו מיטה עבור הצגת אותם בעולם EDC. המחברים מודים לייקה מיקרוסיסטמס ופסקואלה רומנו על עזרתם. מחקר זה נתמך על ידי Project PON03PE_00110_1. "המילה הטובה ביותר היא מילה של משפחה, ולהשתלות את הצ" בדונטויטיקה, לאחר שacronimo, הייתה מאוד מלאה בשיניים ובקללות. Committente: פו FESR 2014-2020 קמפאנייה; פרויקט פו פהאב קמפאנייה 2007-2013 "ננו-לוגי לפני RILASCIO בלטו בסין".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 149 דרוזופילה מלאנוגסטר כימיקלים האנדוקריניים פוריות פריון פיתוח תוחלת חיים
שיטות לבדיקת הפרעה אנדוקרינית <em>בדרוזופילה מלאנוסטר</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter