Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Metoder for å teste endokrine forstyrrelser i Drosophila melanogaster

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Endokrine disruptor kjemikalier (EDCs) representerer et alvorlig problem for organismer og for naturlige miljøer. Drosophila melanogaster representerer en ideell modell for å studere EDC effekter in vivo. Her presenterer vi metoder for å undersøke endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressering EDC effekter på fekunditet, fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og levetid på fly.

Abstract

I de senere årene har det vært økende bevis for at alle organismer og miljøet er eksponert for hormon-lignende kjemikalier, kjent som endokrine disruptor kjemikalier (EDCs). Disse kjemikaliene kan endre den normale balansen av endokrine systemer og føre til bivirkninger, samt et økende antall hormonelle lidelser i den menneskelige befolkning eller forstyrret vekst og redusert reproduksjon i dyrelivet arter. For noen EDCs, det er dokumentert helseeffekter og restriksjoner på bruken. Men for de fleste av dem, er det fortsatt ingen vitenskapelige bevis i denne forstand. For å verifisere potensielle endokrine effekter av en kjemisk i hele organismen, må vi teste den i riktig modellsystemer, så vel som i frukten fly, Drosophila melanogaster. Her rapporterer vi detaljert in vivo protokoller for å studere endokrine forstyrrelser i Drosophila, adressering EDC effekter på fekunditet/fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og levetid på fly. I de siste årene, brukte vi disse Drosophila liv egenskaper for å undersøke virkningene av eksponering for 17-α-etinyløstradiol (EE2), bisfenol A (BPA), og bisfenol AF (BPA F). Tilsammen, disse analysene dekket alle Drosophila liv stadier og gjorde det mulig å evaluere endokrine forstyrrelser i alle hormon-mediert prosesser. Fekunditet/fruktbarhet og utviklingsmessige timing analysene var nyttige for å måle EDC innvirkning på fly reproduktiv ytelse og på utviklingsmessige stadier, henholdsvis. Til slutt, levetid analysen involvert kroniske EDC eksponeringer til voksne og målte deres survivorship. Men disse livet egenskaper kan også være påvirket av flere eksperimentelle faktorer som måtte være nøye kontrollert. Så, i dette arbeidet, foreslår vi en rekke prosedyrer vi har optimalisert for riktig utfall av disse analysene. Disse metodene tillater forskere å etablere endokrine avbrudd for noen EDC eller for en blanding av ulike EDCs i Drosophila, men å identifisere den endokrine mekanismen ansvarlig for effekten, ytterligere essays kan være nødvendig.

Introduction

Menneskelige aktiviteter har blitt sluppet ut i miljøet en massiv mengde kjemikalier, som representerer et alvorlig problem for organismer og for naturlige økosystemer1. Av disse forurensende stoffer, er det anslått at om 1 000 forskjellige kjemikalier kan endre den normale balansen av endokrine systemer; henhold til denne eiendommen, er de klassifisert som endokrine forstyrre kjemikalier (EDCs). Nærmere bestemt, basert på en nylig definisjon av det endokrine samfunn, EDCs er "en eksogene kjemisk, eller blanding av kjemikalier, som kan forstyrre noen aspekter av hormon handling"2. I løpet av de siste tre ti årene har det vært økende vitenskapelige bevis for at EDCs kan påvirke reproduksjon og utvikling av dyr og planter3,4,5,6,7, 8i den. Videre har EDC eksponering vært knyttet til den økende utbredelsen av noen menneskelige sykdommer, inkludert kreft, fedme, diabetes, skjoldbrusk sykdommer, og atferdsforstyrrelser9,10,11.

Generelle mekanismer for EDC

På grunn av deres molekylære egenskaper, EDCs oppfører seg som hormoner eller hormon preK UrsOrer3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. I denne forstand, de kan binde til et hormon reseptor og forstyrre endokrine systemer enten ved å etterligne hormon aktivitet eller ved å blokkere endogene hormoner bindende. I det første tilfellet, etter binding til reseptoren, de kan aktivere det som sin naturlige hormonet ville gjøre. I det andre tilfellet, binding av EDC til reseptoren hindrer bindingen av sin naturlige hormon, slik at reseptoren er blokkert og kan ikke lenger aktiveres, selv i nærvær av sin naturlige hormon3. Som en konsekvens, EDCs kan påvirke flere prosesser, for eksempel syntese, sekresjon, transport, metabolisme, eller perifere handling av endogene hormoner som er ansvarlig for vedlikehold av homeostase, reproduksjon, utvikling, og/eller atferd av organismen. Reseptor binding er ikke den eneste handlingsmåten som beskrives så langt for EDCs. Det er nå klart at de kan også fungere ved å rekruttere coactivators eller corepressors i enzymatisk trasé eller ved å endre epigenetic markører deregulating genuttrykk10,11,12,13 ,14, med konsekvenser ikke bare for den nåværende generasjonen, men også for helsen til generasjoner framover8.

Drosophila hormoner

Den potensielle effekten av utvalgte EDCs har blitt studert mye, både i dyrearter og i flere modellsystemer der endokrine mekanismer er rimelig godt kjent. For virvelløse dyr, endokrine systemer som påvirker vekst, utvikling og reproduksjon har vært omfattende preget i insekter av flere grunner, som involverer deres omfattende bruk innen biologisk forskning, deres økonomiske betydning, og endelig utvikling av insektmidler i stand til å forstyrre spesielt med hormon systemet av pest insekter.

Spesielt blant insekter, frukten fly D. melanogaster har vist seg å være en svært kraftig modell system for å evaluere den potensielle endokrine effekten av EDCs. I D. melanogaster, så vel som i virveldyr, hormoner spille en viktig rolle gjennom hele livssyklusen. I denne organismen, det er tre viktigste hormonelle systemer, som involverer steroid hormonet 20-hydroxyecdysone (20e)15,16, sesquiterpenoid juvenile Hormone (JH)17, og nevropeptider og peptid/protein hormoner18. Denne tredje gruppen består av flere peptider oppdaget mer nylig, men tydelig involvert i et stort utvalg av fysiologiske og atferdsmessige prosesser, slik som lang levetid, homeostase, metabolisme, reproduksjon, minne og Locomotor kontroll. 20E er homologe til kolesterol-avledet steroid hormoner som østradiol, mens JH aksjer noen likheter med retinoic syre; begge er de bedre kjente hormonene i Drosophila19,20. Deres balanse er viktig å koordinere molting og forvandling, samt i å kontrollere flere postdevelopmental prosesser, slik som reproduksjon, levetid, og atferd21, og dermed tilbyr ulike muligheter for testing endokrine forstyrrelser i Drosophila. Videre, ecdysteroid hormoner og JHs er de viktigste målene for den såkalte tredje generasjons insektmidler, utviklet for å forstyrre utviklingsmessige og reproduktive endokrine-mediert prosesser i insekter. Den Agonistiske eller motstander modus av handlingen av disse kjemikaliene er godt kjent, og dermed kan de tjene som referanse standarder for å evaluere effekten av potensielle EDCs på vekst, reproduksjon, og utvikling av insekter22. For eksempel, methoprene, som har vært mye brukt i kontrollerende mygg og andre akvatiske insekter23,24, fungerer som en JH Agonistiske og fortrenger 20e-indusert genet transkripsjon og forvandling.

I tillegg til hormoner, den kjernefysiske reseptor (NR) overfamilie i Drosophila er også godt kjent; Det består av 18 evolutionarily bevart transkripsjon faktorer involvert i kontrollerende hormon avhengig utviklingsmessige trasé, samt reproduksjon og fysiologi25. Disse hormon NRs tilhører alle seks NR overfamilie under typer, inkludert de som er involvert i neurotransmission26, to for retinoic acid NRS, og de for steroid NRS som, i virveldyr, representerer en av de primære målene for EDCs27.

Drosophila som et modell system for å studere EDCs

For tiden, på grunnlag av molekylære egenskaper, flere miljø etater rundt om i verden er tildele potensialet til å forstyrre de endokrine systemer til ulike menneskeskapte kjemikalier. Gitt at EDCs er et globalt og allestedsnærværende problem for miljøet og for organismer, er det overordnede målet for forskningen på dette feltet for å redusere deres sykdoms byrde, samt å beskytte levende organismer fra deres bivirkninger. For å utdype forståelsen om de potensielle endokrine virkningene av en kjemisk, er det nødvendig å teste den in vivo. For dette formål representerer D. melanogaster et gyldig modell system. Hittil har frukten fly blitt mye brukt som in vivo-modell for å evaluere virkningene av flere miljømessige EDCs; Det har blitt rapportert at eksponering for flere EDCs, for eksempel dibutyl ftalat (DBP)28, bisfenol A (BPA), 4-nonylfenol (4-np), 4-tert-octylphenol (4-TERT-op)29, metylparaben (MP)30, ethylparaben (EP)31, 32, BIS-(2-etylheksyl) FTALAT (DEHP)33, og 17-α-etinyløstradiol (EE2)34, påvirkninger metabolisme og endokrine funksjoner som i virveldyr modeller. Flere grunner har ført til sin bruk som en modell på dette forskningsområdet. Utover en god kjennskap til sine endokrine systemer, ytterligere fordeler inkluderer sin korte livssyklus, lave kostnader, lett manipulable Genova, en lang historie med forskning, og flere tekniske muligheter (se FlyBase nettsted, http://flybase.org/). D. melanogaster gir også en kraftig modell for enkelt å studere transgenerational effekter og befolknings reaksjoner på miljøfaktorer8 og unngår etiske problemstillinger som er relevante for in vivo-studier hos høyere dyr. I tillegg har frukten fly aksjer en høy grad av gen bevaring med mennesker som kan gjøre det mulig for Drosophila EDC analyser for å hjelpe med å forutsi eller foreslå potensielle virkningene av disse kjemikaliene for menneskers helse. Foruten å utvide forståelsen om menneskers helseeffekter, kan Drosophila bidra til å vurdere risikoen for EDC eksponering for miljøet, slik som tap av biologisk mangfold og miljøødeleggelser. Til slutt tilbyr frukten fly den ekstra fordelen av å være brukt i laboratorier, hvor de faktorer som potensielt påvirker sin utvikling, reproduksjon, og levetid kan holdes under kontroll for å tillegge enhver variasjon til stoffet som skal testes.

Med dette i bakhodet, har vi optimalisert enkle og robuste fitness analyser for å bestemme EDC effekter på noen Drosophila hormonelle egenskaper, slik som fekunditet/fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og voksen levetid. Disse analysene har blitt mye brukt i noen EDCs23, 24,25,26,27. Spesielt har vi brukt følgende protokoller for å evaluere effekten av eksponeringen til syntetisk østrogen EE234 og til BPA og til bisfenol AF (BPA F) (upubliserte data). Disse protokollene kan lett endres for å undersøke virkningene av en gitt EDC om gangen, samt den kombinerte effekten av flere EDCs i D. melanogaster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. matlaging

  1. For lager vedlikehold og for larvestadiet vekst, bruk et cornmeal medium som inneholder 3% pulverisert gjær, 10% sukrose, 9% precooked cornmeal, 0,4% agar, deretter kalt cornmeal medium (CM).
    1. Sett 30 g gjær i 100 mL vann fra springen, bringe den til en byll og la det koke i 15 min.
    2. Separat, bland godt 90 g precooked cornmeal, 100 g sukker, og 4 g av agar inn 900 mL vann fra springen.
    3. Bring løsningen til en byll, Senk varmen og stek i 5 minutter stirring kontinuerlig.
    4. Etter 5 minutter, tilsett den varme gjær løsning og putre for en annen 15 min.
    5. Slå av varme kilden og la løsningen avkjøles til ca 60 ° c.
    6. Tilsett 5 mL/L av 10% methyl 4-hydroksybenzoat i etanol, bland godt og la den sitte i 10 min.
      Merk: Vær forsiktig med mengden av methyl 4-hydroksybenzoat, gitt at en høy konsentrasjon av soppdreper kan være dødelig for larver.
    7. Dispensere mediet inn i hetteglass/flasker: 8 mL i hvert fly hetteglass (25 mm x 95 mm), 3 mL i hvert fly hetteglass (22 mm x 63 mm) og 60 mL i hver flue flaske (250 mL).
    8. Dekk hetteglassene med cheesecloth og la dem tørke ved romtemperatur (RT) i 24 timer før lagring.
    9. Kalibrer eksperimentelt høyre konsistens og hydrering av CM ved å endre enten mengden av agar som brukes og/eller kjøling/tørking ganger.
      Merk: hetteglass med unplugged, eske og innpakket er stabile i ca. 15 dager ved 4 ° c.
  2. For Drosophila voksne, bruk et medium som inneholder 10% pulverisert gjær, 10% sukrose, 2% agar, deretter kalt voksen medium (AM).
    1. Bland 10 g pulverisert gjær, 10 g sukrose, 2 g av agar inn 100 mL destillert vann.
    2. Bring denne blandingen til en byll to ganger, med en 3 minutters intervall, eller til agar er oppløst, ved hjelp av en mikrobølgeovn.
    3. Når løsningen kjøles ned til 60 ° c, tilsett 5 mL/L av 10% methyl 4-hydroksybenzoat i etanol, bland godt og dispensere i hetteglass (10 mL per hetteglass).
    4. Dekk hetteglassene med cheesecloth og la dem tørke ved RT i 24 timer før lagring.
      Merk: unplugged, eske og innpakkede hetteglass er stabile i ca. 15 dager ved 4 ° c.
  3. For fekunditet/fruktbarhet analysen, bruk Drosophila tomat juice-cornmeal medium.
    1. Hell av 70 mL varm cornmeal mat i et 100 mL beger og tilsett 30 mL tomat juice (30% v/v).
    2. Bland godt med en food prosessor og Pipet 3 mL i små hetteglass.
    3. Dekk hetteglassene med cheesecloth og la dem tørke ved RT i 24 timer før lagring.
      Merk: unplugged, eske og innpakkede hetteglass er stabile i ca. 15 dager ved 4 ° c.
  4. For embryo samling, bruk agar plater, inneholder 3% agar, 30% tomatsaus, og 3% sukker.
    Merk: Vær forsiktig så du ikke lage bobler når helle mediet i platene.

2. Drosophila EDC dosering

  1. Klargjør en passende lagerløsning som oppløser den valgte EDC i egnet løsemiddel. For EE2 (molekylvekt 296,403), oppløses 1,48 g i 10 mL 100% etanol for å lage en 0,5 M lagerløsning og lagre ved-80 ° c.
    Forsiktig: EDCs betraktes som forurensende miljø, og forholdsregler bør tas i håndteringen av dem.
  2. Fortynne EE2 lagerløsning i 10% etanol i vann (v/v) for å oppnå en 100 mM løsning. Lag neste fortynninger (0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM) i CM mat, Start med lavest konsentrasjon og bruk den samme endelige konsentrasjonen av løsemiddel til hver behandlingsgruppe. For kontroll hetteglassene brukes samme volum av løsemiddel alene.
    Merk: det anbefales å holde den endelige konsentrasjonen av løsemiddel så lavt som mulig, med tanke på at den endelige konsentrasjonen av etanol ikke bør overstige 2% i fly mat.
  3. Legg løsningen som inneholder riktig fortynning av den valgte EDC til cornmeal mat før herding, bland godt med en food prosessor, dispensere 10 mL i hetteglass, dekk med bomull gasbind og la tørke ved RT for 16 timer før bruk.
    Merk: Bruk dette mediet umiddelbart etter forberedelsen.
  4. For den voksne oppdragelse, forberede ulike arbeider EE2 løsninger (henholdsvis 10 mM, 50 mM og 100 mM) i 10% etanol i vann (v/v) og lag 100 μL av hver på overflaten av AM, for å oppnå den ønskede konsentrasjonen av EE2 (0,1 mM , 0,5 mM og 1 mM). For kontroll bruke samme volum av løsemiddel alene.
    Merk: Alternativt kan du legge til løsningen som inneholder riktig fortynning av den valgte EDC til en liten mengde av am i et 50 ml konisk rør, Vortex grundig og Stratify 1 ml av den på overflaten av am ampuller.
    1. Dekk hetteglass med bomull gasbind, tillate tørking ved RT for 12-16 h under milde agitasjon og bruke dem umiddelbart.
      Merk: tørkeprosessen bør justeres eksperimentelt fordi er avhengig av luftfuktigheten.
  5. For fôring analysen, tilsett både løsningen som inneholder riktig fortynning av den valgte EDC (EE2 0,1 mM, 0,5 mM og 1 mM) og en farge mat (f. eks, den røde Dye no. 40 ved 1 mg/mL)35 til cm før herding, bland sterkt med en food prosessor og deretter stanse uttaket e i hetteglassene.

3. oppdrett av fluer

  1. Bruk en robust isogenic belastning, for eksempel Oregon R, som vedlikeholdes av flere generasjoner i laboratoriet.
  2. Hold fluer i en fuktet, temperatur-kontrollerte inkubator, med en naturlig 12 h lys: 12 h mørk photoperiod ved 25 ° c i hetteglass som inneholder CM mat.
  3. I hver analyse, bruk hetteglass på RT.

4. fôring analysen

Merk: Denne analysen er anbefalt å teste om tilstedeværelsen av den valgte EDC i mediet kan påvirke fôring av fluer.

  1. Sett 15 unge fluer i ampuller som inneholder CM supplert med ulike konsentrasjoner av den valgte EDC og en farge mat. Tillat fluer å mate på Media for 1 dag.
    Merk:bruk for eksempel rødt fargestoff nr. 4035 (1 mg/ml).
  2. Sett 15 unge fluer i hetteglass som inneholder CM supplert med løsemiddel alene og en farge mat for kontroll. Tillat fluer å mate på Media for 1 dag.
  3. Bedøve individuelt hver gruppe fluer med Eter.
    1. Overfør fluer i hver gruppe til en sylindrisk glassbeholder (etherizer) med en trakt satt inn i den åpne enden, invertere hetteglasset over trakten og trykk forsiktig på de to beholderne sammen for å få fluene til å falle ned i etherizer.
      Merk:  Trakten vil hindre dem fra å komme ut av etherizer.
    2. Knock fluer ned ved å forsiktig trykke på etherizer på en myk overflate, for eksempel en mus-pad, og raskt erstatte trakten med en Eter-gjennomvåt bomull og gasbind plugg.
    3. Vent ca 1 min til fluene falle til bunns og slutte å bevege seg.
      Merk: ikke overstiger tiden eller fluene vil dø.
  4. Sett immobilisert fluer under et stereo-mikroskop og sammenligne abdominal farging av hver behandling gruppe med hensyn til kontrollgruppen.

5. fekunditet/fruktbarhet analysen

  1. For hver EDC konsentrasjon, forberede 3 hetteglass med fluer, deretter kalt foreldrenes hetteglass, med 8 kvinner og 4 hanner i 10 mL CM/EDC mat; for kontrollen forberede 6 ampuller av fluer med 8 kvinner og 4 hanner i 10 mL CM mat supplert med løsemiddel. Bakre fluer i en inkubator ved 25 ° c.
    Merk: unngå overbefolkning larver under deres utvikling og prøve å bruke konsistent larvestadiet tettheten på tvers av behandlinger.
  2. Etter 4 dager, fjerne foreldre og returnere hetteglassene inn i inkubator i 5 dager.
  3. På slutten av ettermiddagen av dagen 9, fjerne alle nye fluer fra hetteglassene og Legg hetteglassene i en inkubator ved 18 ° c over natten.
    Merk: Denne fjerningen må gjøres veldig nøye, sjekke overflaten av mediet godt.
    1. På morgenen av dag 10, for hver behandling gruppe, samle jomfru kvinner og unge menn i to grupper, under lys CO2 bedøvelsen. Tilfeldig dele hver gruppe fluer i små undergrupper (10 kvinner og 20 menn per hetteglass) i uavhengige hetteglass fylt med friske tilsvarende CM.
      1. Gjenta trinn 5.3.1 ta vare både å forsiktig fjerne alle fluer fra hetteglassene 8-10 h før innsamling og la hetteglass ved 18 ° c, til få minst 30 jomfru kvinner og 30 menn for hver EDC konsentrasjoner og minst 90 jomfru kvinner og 90 menn for kontroll.
    2. Hus disse gruppene av fluer ved 25 ° c til de er i alderen 4 dager post-eclosion, overføre dem til nye ampuller som inneholder ferske tilsvarende medium annenhver dag.
      Merk: 4 dager er tilstrekkelig tid for at fluene skal bli modne voksne, men det er veldig langt fra begynnelsen av senescence.
    3. Etter to dager sikre at det ikke er noen larver i hetteglassene av kvinner. Hvis de gjør det, er fluene ikke brukbare fordi de ikke er jomfruer og må kastes.
  4. Bruk 20 enkelt fluer i hvert kjønn for hver behandling gruppe for å sette opp 20 enkelt krysser i små ampuller inneholder frisk CM-tomat medium uten EDC, som beskrevet nedenfor.
    1. Til hver behandlingsgruppe tilordne en annen serie med sekvensielle tall, som entydig identifiserer den og merke de respektive hetteglassene; for eksempel Gruppe1 (løsemiddel alene) fra 1 til 20, gruppe 2 (EDC konsentrasjon x) fra 20 til 40, og så videre.
    2. Lag en fruktbarhet regneark for å spille inn ulike serier, hver tilsvarende til en behandling gruppe.
    3. For hvert kjønn bedøve alle fluene som tilhører hver behandling gruppe under lys CO2 og tilfeldig overføre dem som følger.
      1. Overfør en løsemiddel behandlet hunn inn i et lite hetteglass med frisk CM-tomat medium uten EDC og tilsett en løsemiddel-behandlet mannlig for kontroll korset.
        Merk: tomat juice bør legges til medium under forberedelsene fordi mørkt medium øker kontrasten med den hvite embryo.
      2. Overfør en EDC behandlet kvinne i et lite hetteglass inneholder friske CM-tomat uten EDC og tilsett en løsemiddel-behandlet mannlig for hver behandling.
      3. Overfør en EDC behandlet mannlig inn i et lite hetteglass inneholder frisk CM-tomat medium uten EDC og tilsett en løsemiddel-behandlet hunn for hver behandling.
    4. Hus alle disse enkelt krysser ved 25 ° c.
  5. Overfør hver parring par i frisk CM-tomat hetteglass uten EDC hver dag for de påfølgende ti dagene. Merk de replikerte hetteglassene i hver serie sekvensielt. f. eks 1-a, 1B, 1C...... 20A, 20B, 20c og rapporter disse numrene på fruktbarhet regnearket.
  6. Inspiser hvert hetteglass visuelt hver dag for eggene og rapporter deres antall på fruktbarhet regnearket.
  7. Lagre hvert hetteglass og, når nye fluer begynner å dukke opp, også registrere den daglige antall voksne Progenies over 10 dagers periode. Etter 10 dager fra den første paring, fjerne foreldre.
    Merk: kast hetteglass der en eller begge foreldrene døde; i tilfelle flukt av en eller begge foreldrene, ta med i analysen alle data til den dagen de var tapt.
  8. Sum daglig antall egg og daglig antall voksne Progenies fra hver behandling gruppe, for å oppnå den totale fekunditet/fruktbarhet, gjennomsnittlig egg og voksen avkom produksjon av en flue i ti dager, og forholdet mellom total avkom til totalt antall egg lagt. Beregn forskjellene i prosent av hver behandlings verdi med hensyn til kontrollen.
  9. Gjennomføre tre uavhengige eksperimenter for hver gruppe fluer, ved å bruke minst 10 fluer for hver behandling gruppe.
  10. Utføre statistisk analyse for å sammenligne de ulike gruppene.

6. utviklingsmessige timing

Merk: I de to følgende alternative protokollene evalueres den utviklingsmessige timingen ved å telle både antall pupae som dannes per dag og antall voksne avkom eclosing per dag.

  1. Eclosion analysen protokoll 1
    1. For hver behandling gruppe, sette opp 10 hetteglass med unge (< 2 dager), sunne fluer, hver med 6 kvinner og 3 menn i 10 mL cornmeal mat uten EDC.
    2. La fluer på mat for 24 h, og tillate dem å mate.
    3. Forbered 10 parallelle hetteglass per behandlingsgruppe med 10 mL hver av fersk cornmeal mat supplert med ulike EDC konsentrasjoner eller løsemiddel alene for kontrollen. Overfør paret flyr til disse nye hetteglassene.
      Merk: for hver behandlingsgruppe tilordnes en annen serie med sekvensielle tall, som entydig identifiserer den og merker de respektive hetteglassene.
    4. Lag en utviklingsmessige regneark for å spille inn de forskjellige seriene.
    5. Tillat fluer å legge egg for 16 h. Deretter fjerne foreldre fra hetteglass.
      Merk: Den overordnede fluer kan brukes til å gjenta trinn 6.1.5, ved å overføre dem til andre tilsvarende hetteglass.
    6. Ruge hetteglass for 3-4 dager ved 25 ° c, eller til det ikke mer pupae form. Hver dag teller antall nylig pupae i hvert hetteglass og rapporterer det på utviklings regnearket. For å unngå å telle den samme puppe to ganger, skriver du et tall i rekkefølge på hver puppe med en permanent markør på utsiden av hetteglasset.
    7. Starter fra dag 9, telle daglig antall nye voksne inntil ingen flere voksne dukket opp, og rapportere det på utviklingsmessige regnearket.
    8. Fra disse rådata, beregne gjennomsnittlig larvestadiet perioden, gjennomsnittlig puppestadiet perioden, samt forskjeller i prosent av hver behandling med hensyn til kontrollen.
    9. Gjennomføre tre uavhengige eksperimenter for hver gruppe fluer, ved å bruke minimum 5 hetteglass for hver behandling gruppe.
    10. Utføre statistisk analyse for å sammenligne de ulike gruppene.
  2. Eclosion analysen protokollen 2
    1. Bakre ung og sunn kvinne (ca 150) og mannlige (ca 50) fluer på en samling bur (tabell av materialer) med agar-tomat medium supplert med fersk Baker ' s gjær lime (3 g Baker gjær i 5 ml vann), deretter kalt legging skuffen, for 2 dager ved 25 ° c.
    2. I løpet av disse 2 dager, la fluer å acclimate til buret i et mørkt, rolig sted, før du begynner egg samling, og endre legging skuffen to ganger om dagen.
    3. På den tredje dagen, endre legge brettet tidlig på morgenen. Etter 1 t, erstatte legging skuffen, kaste disse lagt egg.
    4. Tillat fluer å legge egg for 2 h og erstatte med fersk legging skuffen.
      Merk: Etter dag 3, bør en god legge skuff produsere 100-200 egg i 2 h.
    5. For hver behandling gruppe, utarbeide en rekke 3 60 mm retter som inneholder tomat cornmeal mat supplert med tilsvarende EDC konsentrasjon eller med løsemiddel alene og rapportere hver serie i utviklingsmessige timing regneark. Alternativt, hvis foretrukket, bruk hetteglass i stedet forretter.
    6. Forsiktig plukke opp egg under et mikroskop ved hjelp av en pensel eller en sonde og overføre dem til toppen av mediet i hver tallerken/hetteglass. For å lette telling, på legging skuffen, arrangere egg i 5 grupper på 10 hver og overføre dem en om gangen.
      Merk: Gjenta trinn 6.2.4 så mange ganger som er nødvendig for å oppnå nok embryo.
    7. Hus alle disse rettene/hetteglassene ved 25 ° c. Oppbevar også hvert legge brett ved 25 ° c, og telle totalt antall lagt egg.
    8. Etter 24-30 h, sjekk hver tallerken/hetteglass under en stereomikroskopet og telle både antall hvite, ubefruktede egg og antall mørke døde embryo.
    9. Trekk fra antall hvite, ubefruktede egg fra 50-tallet overførte egg verdi for å oppnå total embryo verdi per tallerken/hetteglass. Antallet mørke døde embryo kan brukes til å bestemme potensielle EDC toksiske effekter under embryogenesis.
    10. Gjenta trinn 6.1.6-6.1.10 i Eclosion-analysen protokoll 1.

7. levetid protokoll

  1. Sett opp 20 hetteglass med 8 hunner og 4 hanner og hus ved 25 ° c i CM (10 mL hver).
  2. Etter 4 dager forkaste fluer og plassere hetteglass tilbake i inkubator.
    Merk: disse fluene kan brukes til å starte på nytt for å få andre alder-synkroniserte kohorter av fluene.
  3. På slutten av ettermiddagen av dagen 9, fjerne alle nye fluer fra hetteglassene og returnere ampuller til inkubator.
    Merk: noen voksne bør begynne å Eclose så tidlig som den niende dagen; forkaste disse fluene gjør det mulig å samle et maksimalt antall synkroniserte fluer, unngå uforsiktig valg av tidlig emergent.
  4. 16-24 h senere, overføre voksne fluer (1 dag gammel) av begge kjønn i fire grupper på 250 mL flasker som inneholder AM mat supplert med tre ulike EDC konsentrasjoner og ett med løsemiddel alene. Om nødvendig samler du inn et nytt parti neste dag.
  5. Oppretthold fluer ved 25 ° c for 2-3 dager for å tillate dem å mate.
    Merk: dagen for overføring til am mat ampuller tilsvarer den første dagen i voksen alder.
  6. Etter to-tre dager, sortere hver kohort av fluer ved sex i to grupper under lys CO2 bedøvelsen. Tilfeldig dele hvert kjønn i fem hetteglass per behandling med en tetthet på 20 individer per hetteglass, til det er tre replikerer 5 parallelle hetteglass for hvert kjønn per hver behandling.
    Merk: Arbeid med små grupper av fluer for å hindre mulige langvarige helseproblemer på grunn av lang eksponeringstid til CO2.
  7. Forbered en levetid regneark der antall døde fluer er trukket fra antall overlevende flyr til den forrige overføringen, på en slik måte at automatisk få antall overlevende ved hver overføring.
  8. Overføring fluer i nye ampuller som inneholder tilsvarende mat hver 3 dager på samme tid og se etter døden.
    Merk: overføringen må skje uten anestesi som kan ha en langsiktig negativ effekt på fly levetid.
    1. Ved hver overføring, ta opp en alder av fluene og antall døde fluer.
      Merk: antall overlevende fluer beregnes automatisk i regnearket, men det anbefales å sjekke det visuelt. Fluer som tilfeldigvis både flykte eller dø under overføringen bør ikke vurderes. Vær forsiktig så du ikke teller dobbelt døde fluer båret til det nye hetteglasset som rapporterer dette notatet i regnearket.
    2. Gjenta trinn 7,8 og 7.8.1 til alle fluene dør.
  9. For hver behandling gruppe, opprette en overlevelse kurve som vist i figur 6, for å vise overlevelse sannsynligheten for en flue på et bestemt tidspunkt.
  10. Utfør tre uavhengige eksperimenter for hver behandling gruppe fluer, ved å bruke 100 nylig eclosed fluer for hvert eksperiment.
  11. Forbered et bord for å rapportere gjennomsnittet levetid (gjennomsnittlig overlevelse dager av alle fluer for hver gruppe), halvdød tid (tid i dager som kreves for å nå 50% dødelighet) og maksimal levetid (maksimalt antall dager som trengs for å nå 90% dødelighet).
  12. Beregn forskjellene i prosent mellom hver behandlingsgruppe med hensyn til kontrollgruppen.
  13. Utføre statistisk analyse for å sammenligne de ulike behandlingsgruppene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne delen er viktige trinn i protokollene ovenfor rapportert i form av forenklede ordninger. Gitt at fluer har en tendens til å unngå usmakelig forbindelser, den første tingen å gjøre er å analysen smaken av den valgte EDC. Dette kan gjøres ved å blande en konditorfarge (for eksempel rød mat Dye nr. 40)35 med maten supplert med den valgte EDC på ulike doser eller med løsemiddel alene. Fluer matet på disse mediene er undersøkt under en stereomikroskopet og matinntaket er anslått av deres abdominal farging (figur 1). En typisk ønsket situasjon er vist i figur 1 med to voksne kvinner: en matet på medium som inneholder den valgte EDC og en på medium som ikke inneholder EDC, begge presenterer samme farge i sine abdomens.

Det har blitt allment akseptert at EDCs, som naturlige hormoner, har effekter ved ekstremt lave doser og at det ikke er en enkel, lineær sammenheng mellom dose og effekt29, med høyere doser ikke nødvendigvis å ha en større effekt36, i 37. Så, i stedet for en dose-respons tilnærming, for å vurdere fullt ut deres virkninger, er det tilrådelig å bruke flere doser, fra relevante konsentrasjoner for miljøet eller for andre organismer. I alle fall er det viktig å analysen av EDC smak på hver brukte konsentrasjon for å sikre at fluene fordøye sammenlignbare mengder EDC i hver behandling gruppe (figur 2).

Endokrine forstyrrelser påvirker mange viktige trekk av dyre fysiologi som fruktbarhet, lang levetid, og utvikling som derfor er nyttige endepunkter for å teste EDCs. For de ovennevnte protokollene, som vi optimalisert for å måle EDC effekter på disse Drosophila liv egenskaper, primære hensyn er at det er viktig å bruke unge og sunne fluer som skal være riktig manipulert før testing. Med dette i bakhodet, må stor oppmerksomhet rettes til produksjon, håndtering og lagring av brukt mat. I tillegg bør det utvises forsiktighet ved bruk av det beste oppløsningsmidlet for den valgte EDC ved egnede slutt konsentrasjoner (dvs. mindre enn 1% for dimethyl sulfoxide [DMSO] og mindre enn 2% for etanol)30.

Fekunditet og fruktbarhet har blitt brukt til å evaluere den reproduktive suksessen i D. melanogaster. Figur 3 viser en ordning av den brukte protokollen. Fekunditet er eksperimentelt målt som det totale antall lagt egg, mens fruktbarheten måles som totalt voksen avkom. Basert på vederlaget som egg produksjonen i de første 10 dagene av voksenlivet er en god referanse for hele voksenlivet egg/avkom produksjon av en organisme38,39, fruktbarhet og fekunditet analyser kan utføres i 10 dager ved bruker 4 dag gamle fluer klekket fra utsatte larver. Det er viktig å prøve å få lignende verdier i de parallelle hetteglassene til hver gruppe; ellers ville det være vanskelig å forestille seg hvilket rør for å fjerne fra analysen. Så, er det tilrådelig å undersøke daglig hver gjenskape hetteglass for å unngå en stressende miljø, for eksempel tørket eller flytende mat; starter fra 20 enkelt kors, anbefales det å få minst 10 hetteglass i gode forhold der begge foreldrene var i live i 10 dager. Antall egg og voksen avkom, samlet daglig, må rapporteres på et bord som vist i Figur 3 og brukes til å beregne gjennomsnittlig egg og voksen avkom produksjon av en flue i 10 dager. Deretter fekunditet/fruktbarhet endre prosentandel av EDC-behandlede fluer i forhold til kontroll fluer kan fås bruke følgende formel: fekunditet/fruktbarhet endring% = [(kontroll-behandling)/Control] x 100. Minst tre uavhengige replikerer må innhentes for hver gruppe.

Hormoner spiller viktige roller i utviklingsmessige overganger i livet til D. melanogaster40, som det er sannsynlig at disse fasene av veksten er spesielt sårbare for de negative virkningene av EDCs. Ved 25 ° c, både larvestadiet vekst og puppestadiet scenen hver span ca 4 dager. Etter EDC eksponering, kan Gjennomsnittlig varighet av disse stadiene påvirkes41. Basert på denne vurderingen, var de utviklingsmessige timing protokollene optimalisert for å bestemme prosentandelen og tidspunktet for overgangen fra larver til pupae og fra pupae til voksne etter EDC eksponering med hensyn til ubehandlede fluer. To alternative protokoller kan utføre denne analysen. Begge var gyldige og basert på EDC kronisk eksponering for larver over en 4 dagers periode. Basert på denne larvestadiet behandlingen, tok den første protokollen ikke hensyn til alderen på embryo, som ble samlet inn over en 16-18 timer (over natten). Den påfølgende alders variasjonen blant Larvene bør imidlertid være til stede i alle hetteglassene til hver behandling, og dermed øke innenfor behandlings avviket, men uten å påvirke anslagene over utviklingsmessige timing gjennom behandlinger betydelig. I stedet brukte den andre protokollen et fast antall synkron tidlig embryo, noe som gjør det mulig å evaluere også de potensielle virkningene av den valgte EDC under embryogenesis42,43. Videre, redusere alder forskjellene mellom Larvene redusert innenfor behandling varians og økt evne til å anslå sanne forskjeller mellom behandlinger. Figur 4 rapporterer en ordning av eclosion analysen. I begge protokollene måtte platene/hetteglassene sjekkes daglig, og antallet både pupae og voksne fra de eksponerte og ikke til EDC skulle rapporteres separat på et bord som i Figur 4. Alle dannet pupae og voksne fluer måtte telles, enten død eller levende. Deretter ble disse rådata brukt til å beregne prosenter og tider for overgangen fra larver til pupae og fra pupae til voksne og for å beregne endringen prosentandelen av disse verdiene av EDC-behandlede fluer i forhold til kontroll fluer. Etter EDC eksponering, en samlet utviklingsmessige forhånd eller forsinkelse med hensyn til kontroll fluene var å forvente. Den valgte protokollen måtte utføres i tre eksemplarer for hver gruppe fluer. Det var tilrådelig at for eclosion analysen protokollen 2, hver serie av en replikere for en gitt EDC konsentrasjon ble sådd med embryo fra samme legging stien for å opprettholde pålitelighet og nøyaktighet i embryo staging hele EDC konsentrasjoner.

Til slutt viser figur 5 de viktigste trinnene for måling av levetid. For denne protokollen, var det viktig at alle fluene under analysen var synkron av alder og kjønn, kombinert, og holdt på en tetthet lav nok til å tillate fri sirkulasjon. Det er viktig å utføre levetid eksperimenter i begge kjønn separat fordi det er godt kjent er det betydelige forskjeller i levetid mellom menn og kvinner44.

Mat måtte skiftes hver 3 dager for å opprettholde en sunn befolkning, og dødelighet måtte vurderes også hver 3 dager. På en levetid regneark, som i figur 5, antall døde fluer ble rapportert, og at antallet vil automatisk bli trukket fra antall overlevende fluer fra forrige overføring. For hver EDC-konsentrasjon og for løsningsmidlet alene ble de kumulative survivorship i forhold til de utløpte dagene plottet for å oppnå levetids kurver. En typisk survivorship kurve er rapportert i figur 6; etter en lang innledende periode der survivorship kurven forble relativt høy, falt den eksponentielt etter ca 60 dager. Etter EDC eksponering, kan den survivorship kurven av de behandlede fluene påvirkes betraktelig. For å avgjøre om denne effekten skyldes den valgte EDC, var det tilrådelig å gjennomføre minst to, eller enda bedre, tre uavhengige, noncontemporaneous replikere eksperimenter.

I hver av de ovennevnte protokollene, var det mulig å ha uregelrett hetteglass (for eksempel, uten egg eller uregelrett dødsfall); disse hetteglassene kunne ha blitt forårsaket av forskjellige årsaker, for eksempel dårlig matkvalitet eller infeksjon, og kan betydelig endre verdiene av tiltakene. Den beste måten å håndtere disse uregelrett situasjoner var å unngå dem gjennom god eksperimentell praksis. Så må det understrekes at for alle de ovennevnte protokollene, stor og forsiktig arbeid var nødvendig i replikere hetteglassene, holde fluer sunt, og i håndtering fluer som, en gang utsatt for en EDC, kan bli delikat, og dermed øke risikoen for død når Manipulert.

Figure 1
Figur 1: fôring analysen. Voksen fluer i ampuller som inneholder CM/Dye supplert med en valgt EDC (øverst) eller løsemiddel alene (nederst) er igjen å mate for 24 h. To fluer matet på medium supplert med en EDC (øverst) eller løsemiddel alene (nederst) viser lignende coloring på sine abdomens. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: EDC dosering. Skjematisk av EDC administrasjonen til Drosophila av kosthold. Voksen fluer fra en isogenic lager er eksponert for ulike konsentrasjoner av en EDC (topp) eller løsemiddel alene (nederst). N = referanse KONSENTRASJONEN av EDC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: fruktbarhet analysen. Skjematisk av protokollen, som viser trinnene fra flue vekst i egnede medier til jomfru samlingen og opp til enkelt kors. Trinn 1: voksne (10 hetteglass med åtte hunner og fire hanner hver) fra en isogenic belastning overføres til hetteglass med CM/EDC (øverst) eller CM/løsemiddel alene (nederst). (Merk at ordningen, for enkelhet, refererer til bare ett av de tre hetteglassene.) Trinn 2: etter 4 dager, voksne blir forkastet, og lagt egg er igjen å utvikle for 9 dager til voksen scenen. Trinn 3: nylig eclosed voksne sorteres etter kjønn og samles i hetteglass (maks. 20 hanner/hetteglass og 10 Virgin-hunner/hetteglass). Trinn 4: voksne er overlatt til alder for 4 dager på tilsvarende medium for larvestadiet vekst. Trinn 5: oppsett av 40 enkelt kors for EDC-behandlede fluer i CM-tomat medium uten en EDC, 20x en EDC-behandlet mannlig med en kontroll kvinnelig og 20x en kontroll mannlig med en EDC-behandlet hunn (øverst); Oppsett av 20 enkelt kors for kontroll fluer, 20x en kontroll mann med en kontroll hunn (nederst). Gult medium er en CM supplert med en EDC (topp) eller løsemiddel som kontroll (nederst), og rødt medium er en tomat/CM uten en EDC eller løsemiddel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: utviklingsmessige timing (eclosion analysen protokoll 2). På venstre side, viser denne figuren en ordning av samlingen buret der voksne (ca 150 kvinner og 50 hanner) er plassert til acclimate og kompis i mørket før deponering trinn (se protokoll). Etter 2 dager, er den gamle glidende skuffen erstattet med en med fersk mat, og eggene avsatt i neste 1 time kastes fordi de er asynkrone. Heretter blir eggene samlet hver 2 h på en ny glidende brett, telles, og plassert på retter som inneholder tomat/CM supplert med en EDC eller med løsemiddel alene. Data (totalt lagt egg, ukjente egg, pupae, og eclosed voksne) er rapportert på en rekke utviklingsmessige timing regneark (høyre). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: levetid analysen. En dag synkroniserte fluer er overført til en 250 mL flaske med voksen mat (AM) supplert med en EDC (øverst) eller løsemiddel (nederst) som kontroll, slik at fôring (venstre i ordningen). Etter 2-3 dager, er fluene sortert etter kjønn og overført til fem hetteglass (som inneholder tilsvarende medium for start flasken) for hver kjønn, i grupper på 20 individer/hetteglass. Hver 3 dager, de voksne overføres til friske hetteglass til ikke lenger nødvendig (sentrale delen av ordningen). Til høyre er en ordning av tabellen der dataene er registrert for hver dag. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: levetid kurver. Til venstre er en representativ tabell rapportert hvor antall døde fluer er registrert hver 3 dager, både for behandling gruppe (medium + EDC [0,05 mM EE2]) og for kontrollgruppen (medium + løsemiddel), gjennom hele eksperimentelle perioden. Gjennomsnittlig levetid for hver gruppe er beregnet ved hjelp av Matrix sum. PRODUKT; den behandlede gruppen forkortet gjennomsnittlig levetid sammenlignet med kontrollgruppen. Til høyre er en typisk overlevelse kurve vist av mannlige fluer matet med medium som inneholder EE2 (0,05 mM) eller bare etanol for kontrollen. Den survivorship kurven sank hurtigere for behandlede fluer enn for kontrollgruppen, med et tidligere vendepunkt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Frukten fly D. melanogaster har vært utstrakt ansatt som et in vivo-modell system for å undersøke de potensielle virkningene av miljø EDCS som DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31, 32, DEHP33og EE234. Flere grunner har ledet sin bruk som en modell på dette forskningsområdet. Bortsett fra dens ubestridte fordeler som et modell system, Drosophila aksjer en høy grad av gen bevaring med mennesker, som Drosophila EDC analyser kan hjelpe med å forutsi eller foreslå potensielle effekter for menneskers helse. I tillegg tilhører Drosophila til virvelløse dyr, som er allment representert i alle økosystemer og krever større beskyttelse tiltak mot de skadelige virkningene av EDCs. Virvelløse dyr er plassert i bunnen av næringskjeden og utføre svært viktige funksjoner for miljøer der de bor. Det har blitt rapportert at flere EDCs sluppet inn i miljøet kan ha en skadelig innflytelse på utvikling og reproduksjon av flere dyrearter. Drosophila tilbyr den ekstra fordelen av å være brukt i laboratoriet, der faktorene potensielt påvirker utvikling, reproduksjon, og levetid kan holdes under kontroll for å tillegge enhver variasjon til stoffet som skal testes.

Her gir vi detaljerte protokoller for å studere virkningene av EDC eksponering i denne modellen systemet på hormonally regulert livs trekk som fekunditet/fruktbarhet, utviklingsmessige rate, og levetid. Vi har optimalisert disse protokollene som gjorde det mulig å undersøke virkningene av EE234, BPA og BPAF (upubliserte data) eksponering, men de kan lett tilpasses til å studere virkningene av andre EDCs. Spesielt disse analysene kan brukes til å undersøke både ren EDCs og kombinasjoner av ulike EDCs, gjengir tettere hva som skjer i naturen. Selv om de tilsynelatende kan virke som enkle vekst analyser, er det viktig å arbeide i henhold til de aktuelle retningslinjene, noe som sikrer nøyaktighet og reproduserbarhet45. Det er velkjent at fruktbarhet, utviklingsmessige timing, og lang levetid i D. melanogaster kan påvirkes av eksterne og interne faktorer. Disse kritiske faktorene, inkludert photoperiod, temperatur, fuktighet, ernæring, befolkningstetthet, genetisk struktur og alder, må kontrolleres nøye for utfallet av de rapporterte protokollene. For å minimere komponenten av genetisk variasjon, bør en isogenic belastning brukes. Denne belastningen må være omhyggelig oppdratt i en fuktet, temperaturstyrt inkubator, med en naturlig 12 h lys: 12 h mørk photoperiod ved 25 ° c.

I tillegg til vedlikehold av et kontrollert miljø, larvestadiet og fly overbefolkning må unngås. Det har blitt rapportert at larvestadiet overbefolkning kan påvirke utviklingsmessige timing og indusere uttrykk for flere gener, inkludert varme sjokk eller immunitet-relaterte gener, som påvirker den totale egnethet av voksne fluer46. Også voksne fluer må opprettholdes på et lavt nok tetthet for å tillate fri bevegelighet for å minimere voksen stress. Videre er det viktig å sørge for at fluene bruker sammenlignbare mengder av EDC i hver behandling gruppe, tar i betraktning smaken av sammensatte i ulike konsentrasjoner, fordi fluene har en tendens til å unngå usmakelig mat. En annen viktig del av disse protokollene er matkvalitet; maten må også se bra ut, blottet for bobler, bakterier sprekker, og så videre47,48. Videre er det nødvendig å huske på synkronisering, parring status, og kjønn samboerskap for fluene skal testes. I alle de rapporterte protokollene er det viktig at de parallelle hetteglassene under analysen må være svært like; ellers ville det være vanskelig å forstå som å forkaste slik at maksimal oppmerksomhet og god eksperimentell praksis er nødvendig. Til slutt, ved å bruke disse protokollene til å evaluere de endokrine effektene av utvalgte EDCs, er det viktig å ta hensyn til mulige interaksjoner med andre EDCs tilstede i mediet, for eksempel methyl 4-hydroksybenzoat eller BPA av plast hetteglassene. I denne forstand, kan det være nyttig å endre soppdrepende middel, bruke glass ampuller, eller utføre pilot analyser både med og uten mulige forurensninger.

De rapporterte Drosophila analysene kan være svært effektive for vurderingen av eventuelle kjemikalier eller blanding av kjemikalier, for eksempel EDCs, ved å evaluere de potensielle virkningene av hormonally regulerte livs trekk, slik som reproduksjon, utvikling og levetid. Men, disse analysene kan ikke tjene til å klart identifisere den endokrine mekanismen ansvarlig for EDC bivirkninger. For å overvinne denne begrensningen, er det mulig å utføre de samme protokollene ved hjelp av referanse EDCs som fremkalle svar representant for en bestemt modus for handling på insekt endokrine systemet (f. eks tredje generasjons insektmidler fungerer som JH eller ecdysteroid Agonistiske/motstander)22. Alternativt er det også mulig å bruke molekylære endepunkter, utføre molekylær analyse på spesifikke gener som er hormonally regulert og som anses prediktiv og spesifikk biomarkører for endokrine avbrudd34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Orsolina Petillo for teknisk støtte. Forfatterne takker Dr. Mariarosaria Aletta (CNR) for bibliografisk støtte. Forfatterne takker Dr. Gustavo Damiano Mita for å innføre dem til EDC verden. Forfatterne takker Leica Microsystems og Pasquale Romano for deres assistanse. Denne forskningen ble støttet av Project PON03PE_00110_1. "Sviluppo di nanotecnologie orientere Alla Rigenerazione e Ricostruzione Tissutale, Implantologia e Sensoristica i Odontoiatria/oculistica" acronimo "SORRISO"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Prosjekt PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE PER IL RILASCIO CONTROLLATO DI MOLECOLE BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi Drosophila melanogaster endokrine disruptor kjemikalier fekunditet fruktbarhet utvikling levetid
Metoder for å teste endokrine forstyrrelser i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter