Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

Published: July 3, 2019 doi: 10.3791/59535
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1,2
1Institute of Biosciences and BioResources, National Research Council of Italy (CNR), 2Institute of Research on Terrestrial Ecosystems (IRET), National Research Council of Italy (CNR), 3Department of Biology, UniNa "Federico II"

Summary

Endokrin parçalayıcı kimyasalları (EDCs), organizmalar ve doğal ortamlar için ciddi bir sorun oluşturmaktadır. Drosophila melanogaster EDC efektleri içinde vivo çalışmak için ideal bir model temsil eder. Burada, Drosophila endokrin bozulması araştırmak için yöntemler mevcut, fitabet üzerinde EDC etkileri ele, fertilite, gelişimsel zamanlama, ve sinek ömrü.

Abstract

Son yıllarda tüm organizmaların ve çevrenin endokrin parçalayıcı kimyasalları (EDCs) olarak bilinen hormon benzeri kimyasallara maruz kaldığı kanıtlar büyüyor. Bu kimyasallar endokrin sistemlerin normal dengesini değiştirebilir ve olumsuz etkilere yol açabilir, hem de insan nüfusunda hormonal bozuklukların artan sayıda ya da rahatsız edici büyüme ve yaban hayatı türlerinde üreme azalır. Bazı EDCs için, onların kullanımı üzerinde belgelenen sağlık etkileri ve kısıtlamalar vardır. Ancak, çoğu için, bu anlamda hala bilimsel bir kanıt yoktur. Tam organizmada bir kimyasal potansiyel endokrin etkilerini doğrulamak için, biz uygun model sistemlerinde test etmek gerekir, yanı sıra meyve sinek, Drosophila melanogaster. Burada Drosophila endokrin bozulma çalışması için ayrıntılı in vivo protokolleri rapor, uzallık/fertilite üzerinde EDC etkileri ele, gelişimsel zamanlama, ve sinek ömrü. Son birkaç yılda, bu Drosophila yaşam özelliklerini 17-α-ethinylestradiol (EE2), Bisfenol A (BPA) ve Bisfenol AF (BPA F) maruz kalma etkilerini araştırmak için kullandık. Tamamen, bu tüm Drosophila yaşam aşamalarını kapsanan ve tüm hormon aracılı süreçlerde endokrin bozulması değerlendirmek mümkün hale gösteriyor. Gelişimsel/fertilite ve gelişim zamanlamaları, sırasıyla, sinek üreme performansı ve gelişim aşamalarında EDC etkisini ölçmek için yararlıdır. Son olarak, ömrü tahlil yetişkinler için kronik EDC pozlama dahil ve onların survivorship ölçülen. Ancak, bu yaşam özellikleri de dikkatle kontrol edilmesi gereken birkaç deneysel faktörler tarafından etkilenebilir. Yani, bu iş, biz bu süreçlerin doğru sonucu için optimize ettik prosedürleri bir dizi öneririz. Bu yöntemler, bilim adamlarının herhangi EDC için veya Drosophila farklı EDCs bir karışımı için endokrin bozulma kurmak için izin, ancak etki için sorumlu endokrin mekanizması tanımlamak için, daha fazla denemeler gerekli olabilir.

Introduction

İnsan faaliyetleri çevreye büyük miktarda kimyasallar, organizmalar için ciddi bir sorun ve doğal ekosistemler1için temsil serbest edilmiştir. Bu kirleticilerin, yaklaşık 1.000 farklı kimyasallar endokrin sistemlerin normal dengesini değiştirebilir tahmin edilmektedir; Bu özelliğe göre, endokrin bozma kimyasalları (EDCs) olarak sınıflandırılır. Özellikle, endokrin Society tarafından son tanımına dayanarak, EDCs "bir eksojen kimyasal, ya da kimyasallar karışımı, hormon eylem herhangi bir yönü ile müdahale edebilir"2. Son üç yıl içinde, EDCs üreme ve hayvanların ve bitkilerin gelişimini etkileyebilir bilimsel kanıtlar büyüyen olmuştur3,4,5,6,7, 8' den itibaren. Ayrıca, EDC pozlama kanser, obezite, diyabet, tiroid hastalıkları, ve davranışsal bozukluklar da dahil olmak üzere bazı insan hastalıkları, artan prevalansı ile ilgili olmuştur9,10,11.

EDC genel mekanizmaları

Moleküler özelliklerinedeniyle, EDCs hormonlar veya hormon öncüleri gibi davranır3,4,5,6,7,8,9, 10,11,12. Bu anlamda, onlar bir hormon reseptörü bağlamak ve hormon aktivitesini taklit ederek ya da endojen hormonları bağlama bloke ederek endokrin sistemlerini bozabilir. İlk durumda, reseptör bağladıktan sonra, doğal hormon yapacağını olarak etkinleştirebilirsiniz. Diğer durumda, reseptör EDC bağlayıcı doğal hormon bağlama önler, bu nedenle reseptör bloke edilir ve artık aktif olabilir, doğal hormonu varlığında bile3. Sonuç olarak, EDCs, homeostasis, üreme, gelişim ve/veya davranışlarının bakımından sorumlu endojen hormonların sentezlenmesi, salgılanması, taşınması, metabolizması veya periferik etkisi gibi çeşitli süreçleri etkileyebilir organizma. Reseptör bağlayıcı eylem şimdiye kadar EDCs için açıklanan tek yolu değildir. Şimdi onlar da enzimatik yolların koaktijen veya corepressors işe tarafından ya da gen ifadesi deregülasyonu epigenetik işaretçileri değiştirerek hareket edebilir açıktır10,11,12,13 ,14, sadece mevcut nesil için değil, aynı zamanda nesiller sağlık için8gelmek için sonuçları ile.

Drosophila hormonları

Seçilen EDCs potansiyel etkileri yaygın olarak incelenmiştir, hem yaban hayatı türleri ve çeşitli model sistemlerde hangi endokrin mekanizmaları makul iyi bilinmektedir. Omurgasızlar için, büyüme, geliştirme ve üreme etkileyen endokrin sistemler yaygın olarak çeşitli nedenlerden dolayı böcekler ile karakterize edilmiştir, biyolojik araştırma alanında geniş kullanımı içeren, ekonomik önemi, ve son olarak böcek böceklerin hormon sistemi ile özellikle müdahale edebilmek için insektisit gelişimi.

Özellikle, böcekler arasında, meyve sinek D. melanogaster EDCs potansiyel endokrin etkilerini değerlendirmek için çok güçlü bir model sistemi olduğu kanıtlanmıştır. D. melanogaster, hem de omurgalı olarak, hormonlar tüm yaşam döngüsü boyunca önemli bir rol oynamaktadır. Bu organizmada, üç ana hormonal sistem vardır, hangi steroid hormonu içeren 20-hidroxyecdysone (20E)15,16, seskuiterpenoid Juvenil hormonu (JH)17, ve nörofobik ve peptid/protein hormon18. Bu üçüncü grup birçok peptitler daha son zamanlarda keşfedilen ancak açıkça fizyolojik ve davranışsal süreçler, uzun ömürlü, homeostasis, metabolizma, üreme, bellek ve Lokomotor kontrol gibi çok çeşitli yer oluşur. 20E kolesterol türevi steroid hormonları estradiol gibi homolog, JH retinoik asit ile bazı benzerlik paylaşırken; ikisi de Drosophila19,20daha iyi bilinen hormonlar vardır. Onların dengesi kalıp ve Metamorphosis koordine hayati, yanı sıra, üreme, ömür ve davranış21gibi çeşitli postdevelopmental süreçleri kontrol etmek, böylece endokrin test etmek için farklı olanaklar sunan Drosophila 'da bozulma. Dahası, ecdysteroid hormonları ve JHs, böceklerde gelişimsel ve üreme endokrin aracılı süreçlere müdahale etmek için geliştirilen, sözde üçüncü nesil böcek öldürücülerin ana hedefleridir. Agonisti veya bu kimyasalların eylem antagonisti modu iyi bilinmektedir ve böylece onlar büyüme, üreme, ve böcek gelişimi üzerinde potansiyel EDCs etkilerini değerlendirmek için referans standartları olarak hizmet verebilir22. Örneğin, sivrisinekler ve diğer su böcekler23,24kontrol yaygın olarak kullanılan Methoprene, bir JH agonist olarak çalışır ve 20E kaynaklı gen transkripsiyon ve Metamorphosis bastırır.

Hormonlara ek olarak, Drosophila 'daki nükleer reseptör (NR) süper ailesi de bilinmektedir; hormon bağımlı gelişimsel yolların kontrol edilmesi, üreme ve Fizyoloji25' in yanı sıra evrimsel olarak gerçekleştirilen 18 transkripsiyon faktöründen oluşur. Bu hormon NRs tüm altı NR süper aile alt türlerine aittir, nörotransmisyon katılan olanlar dahil olmak üzere26, retinoik asit NRS için iki, ve steroid NRS için bu, omurates Içinde, EDCs temel hedeflerinden birini temsil27.

EDCs okumak için bir model sistemi olarak Drosophila

Şu anda, moleküler özellikleri temelinde, dünya çapında çeşitli çevre kurumları endokrin sistemleri farklı insan yapımı kimyasallara müdahale potansiyeline atanıyor. EDCs çevre ve organizmalar için küresel ve her yerde bir sorun olduğu göz önüne alındığında, bu alanda araştırma genel amacı onların hastalık yükünü azaltmak, yanı sıra onların olumsuz etkilerinden yaşayan organizmaları korumak için. Bir kimyasalın potansiyel endokrin etkileri hakkında anlayış derinleştirmek için, It in vivo test etmek gereklidir. Bu amaçla, D. melanogaster geçerli bir model sistemi temsil eder. Bugüne kadar, meyve sinek çeşitli çevresel EDCs etkilerini değerlendirmek için in vivo modeli olarak yaygın olarak kullanılmıştır; Bu birkaç EDCs maruz olduğu bildirilmiştir, örneğin Dibutil ftalat (DBP)28, Bisfenol A (BPA), 4-nonylphenol (4-NP), 4-tert-octylphenol (4-tert-op)29, metilparaben (MP)30, etilparaben (EP)31, 32, bis-(2-etilhekil) FTALAT (dehp)33ve 17-α-ethinylestradiol (EE2)34, omurga modellerinde olduğu gibi metabolizma ve endokrin fonksiyonları etkiler. Çeşitli nedenlerle bu araştırma alanında bir model olarak kullanımına yol açmıştır. Endokrin sistemlerinin mükemmel bir bilgi ötesinde, daha fazla avantaj, kısa yaşam döngüsü, düşük maliyetli, kolayca manipulable genom, araştırma uzun bir geçmişi ve çeşitli teknik olanaklar (bkz: FlyBase Web sitesi, http://flybase.org/). D. melanogaster Ayrıca çevre faktörleri8 ' e transjenerasyonel etkileri ve nüfus yanıtlarını kolayca incelemek için güçlü bir model sağlar ve yüksek hayvanlarda in vivo çalışmalar için ilgili etik sorunları önler. Buna ek olarak, meyve sinek, Drosophila EDC için mümkün kılan insanlar ile gen koruma yüksek derecede hisse öngörü veya insan sağlığı için bu kimyasalların potansiyel etkilerini düşündürmektedir yardımcı olduğunu söylüyor. İnsan sağlığı etkileri hakkında anlayış genişleyen yanı sıra, Drosophila, biyolojik çeşitlilik kaybı ve çevresel bozulma gibi çevreye EDC maruz kalma riskleri değerlendirmek için yardımcı olabilir. Son olarak, meyve sinek test edilecek maddeye herhangi bir varyasyon niteliği için kontrol altında tutulabilir faktörler potansiyel olarak gelişimi, üreme ve ömrünü etkileyen laboratuvarlarda kullanılan ek avantajı sunar.

Bu akılda, biz, bazı Drosophila hormonal özellikleri üzerinde EDC etkilerini belirlemek için basit ve sağlam Fitness deneyleri optimize edilmiştir, gibi özlülik/fertilite, gelişimsel zamanlama, ve yetişkin ömrü. Bu çeşitli EDCs23,24,25,26,27için yaygın olarak kullanılmıştır. Özellikle, biz sentetik östrojene maruz kalma etkilerini değerlendirmek için aşağıdaki protokolleri kullandık EE234 ve BPA ve Bisfenol için AF (BPA F) (yayımlanmamış veriler). Bu protokoller, bir defada belirli bir EDC etkilerini araştırmak için kolayca değiştirilebilir, hem de D. melanogasterbirden fazla EDCs kombine etkileri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. gıda hazırlama

  1. Stok bakım ve larva büyüme için,% 3 toz Maya,% 10 sakaroz,% 9 önceden pişmiş mısır unu, 0,4% agar, daha sonra Mısır unu Orta (cm) denilen içeren bir Mısır yemeği ortamı kullanın.
    1. 100 mL musluk suyu içine Maya 30 g koyun, bir kaynatma getirmek ve 15 dakika boyunca kaynatın izin.
    2. Ayrı olarak, Mix iyi 90 g önceden pişmiş mısır unu, 100 g şeker ve 4 g agar içine 900 mL musluk suyu.
    3. Bir kaynatma çözümü getirmek, ısı düşük ve sürekli karıştırma 5 dakika pişirin.
    4. 5 dakika sonra, sıcak Maya solüsyonu ekleyin ve başka bir 15 dk için kaynamaya.
    5. Isı kaynağını kapatın ve çözümün yaklaşık 60 °C ' ye kadar soğumasını bekleyin.
    6. Ekle 5 mL/L 10% metil 4-hidroxybenzoat etanol, iyice karıştırın ve 10 dakika oturup izin.
      Not: Metil 4-hidroxybenzoate miktarına dikkat edin, yüksek konsantrasyon fungisit larvaları için ölümcül olabilir verilen.
    7. Orta şişeleri/şişeler içine dağıtmak: 8 mL her sinek şişesine (25 mm x 95 mm), 3 mL her sinek şişesine (22 mm x 63 mm) ve 60 mL her sinek şişesi (250 mL) içine.
    8. Loks ile örtüsü şişeleri ve onları oda sıcaklığında kuru izin (RT) 24 saat önce depolama.
    9. Kullanılan agar miktarını ve/veya soğutma/kurutma sürelerini değiştirerek CM 'nin deneysel olarak doğru tutarlılık ve hidrasyon kalibrasyonu yapın.
      Not: takılı olmayan, kutulu ve sarılmış şişeler 4 °C ' de yaklaşık 15 gün boyunca stabildir.
  2. Drosophila yetişkinler için,% 10 tozlu Maya,% 10 sakaroz,% 2 agar, daha sonra yetişkin Orta (AM) denilen içeren bir orta kullanın.
    1. Mix 10 g toz Maya, 10 g sucrose, 2 g agar içine 100 mL distile su.
    2. Bu karışımı bir kaynatma iki kez getirin, 3 dakika aralığı ile, ya da agar çözünür kadar, bir mikrodalga kullanarak.
    3. Çözelti 60 °C ' ye kadar soğuduktan sonra, etanol içinde% 10 metil 4-hidroxybenzoat 5 mL/L ekleyin, iyice karıştırın ve şişeleri (şişe başına 10 mL) dağıtın.
    4. Örtmek ile şişeler ve onları RT 24 saat depolama önce kuru izin.
      Not: takılı olmayan, kutulu ve sarılmış şişeler 4 °c ' de yaklaşık 15 gün boyunca stabildir.
  3. Doğum/fertilite tahlil için, Drosophila domates suyu-Mısır yemeği orta kullanın.
    1. 70 ml sıcak Mısır unu Gıda 100 ml kabı içine dökün ve 30 ml domates suyu (30% v/v) ekleyin.
    2. Küçük şişeler içinde bir gıda işlemci ve pipet 3 mL ile iyice karıştırın.
    3. Loks ile örtüsü şişeleri ve onları RT 24 saat önce depolama için kurumasına izin.
      Not: takılı olmayan, kutulu ve sarılmış şişeler 4 °c ' de yaklaşık 15 gün boyunca stabildir.
  4. Embriyo koleksiyonu için,% 3 Agar,% 30 domates sosu ve% 3 şeker içeren agar plakaları kullanın.
    Not: plakaları orta dökme zaman kabarcıklar yapmak için dikkatli olun.

2. Drosophila EDC dozajı

  1. Seçilen EDC 'nin uygun solvent içinde çözülmesini uygun bir stok solüsyonu hazırlayın. EE2 (moleküler ağırlık 296,403) için, 1,48 g 'yi 10 mL% 100 etanol içinde çözülür ve 0,5 M 'lik bir stok çözümü yapmak ve-80 °C ' de saklamak.
    Dikkat: EDCs çevresel kirletici olarak kabul edilir ve önlemler onları ele alınmalıdır.
  2. 100 mM 'Lik bir çözüm elde etmek için EE2 stok çözümünü suda% 10 etanol içinde (v/v) seyreltin. En düşük konsantrasyonla başlayan ve her bir tedavi grubu için aynı son solvent konsantrasyonunu kullanarak CM gıdalarına sonraki dilüsyonları (0,1 mm, 0,5 mM ve 1 mM) yapın. Kontrol şişeleri için tek başına solvent aynı hacim kullanın.
    Not: mümkün olduğunca düşük solvent son konsantrasyonu tutmak için tavsiye edilir, etanol son konsantrasyonu sinek gıda% 2 geçmemelidir akılda taşıyan.
  3. Eklenmeden önce cornmeal tabanlı Gıda için seçilen EDC doğru seyreltme içeren çözüm ekleyin, bir gıda işlemcisi ile iyice karıştırın, şişeler içine 10 mL dağıtmak, pamuk gazlı bez ile kapak ve RT kuru izin 16 h kullanmadan önce.
    Not: bu ortamı hazırlanmasından hemen sonra kullanın.
  4. Yetişkin yetiştirme için, EE2 (0,1 mM) istenilen konsantrasyon elde etmek için, farklı çalışma EE2 çözümleri (10 mM, 50 mM ve 100 mM, sırasıyla) su içinde% 10 etanol (v/v) ve tabaka 100 μL, yüzeyi üzerine hazırlamak , 0,5 mM ve 1 mM). Kontrol için tek başına solvent aynı hacim kullanın.
    Not: alternatif olarak, bir 50 ml konik tüp küçük bir miktar için seçilen EDC doğru seyreltme içeren çözüm eklemek, iyice Vortex ve şişeleri yüzeyine 1 ml tabakalaşmak.
    1. Pamuk gazlı bez ile kapak şişeleri, RT içinde 12-16 h için yumuşak ajitasyon altında kuruma izin ve onları hemen kullanın.
      Not: ortam nemi bağlı olduğu için kurutma işlemi deneysel olarak ayarlanması gerekir.
  5. Tahlil besleme için, seçilen EDC (EE2 0,1 mm, 0,5 mm ve 1 mm) ve bir boyama gıda (örneğin, kırmızı boya No. 40 at 1 mg/ml) doğru seyreltme içeren her iki çözüm ekleyin, bir gıda işlemcisi ile güçlü bir şekilde Mix önce cm için35 ve sonra duruş e içine şişeleri.

3. yükselen sinekler

  1. Laboratuvarda birkaç nesil tarafından tutulan Oregon R gibi sağlam bir izogenik gerinim kullanın.
  2. Bir nemlendirici, sıcaklık kontrollü kuluçka, doğal 12 h ışık ile sinekler tutun: 12 h Dark fotoperiyodun 25 °c cm gıda içeren şişeler.
  3. Her tahlil, RT at şişeleri kullanın.

4. besleme tahlil

Not: Bu tahlil orta seçilen EDC varlığı sineklerin beslenmesini etkileyebilir Eğer test etmek için tavsiye edilir.

  1. Seçilen EDC ve bir boyama gıda farklı konsantrasyonları ile tamamlayıcı CM içeren şişeleri 15 genç uçar koyun. Uçlara medya üzerinde 1 gün beslenmesine izin verin.
    Not:Örneğin, kırmızı boya no. 4035 (1 mg/ml) kullanın.
  2. Tek başına solvent ve kontrol için bir boyama gıda ile tamamlayıcı CM içeren şişeleri 15 genç uçar koyun. Uçlara medya üzerinde 1 gün beslenmesine izin verin.
  3. Eter ile sinekler her grup bireysel anestezize.
    1. Transfer her grup için bir silindirik cam konteyner (etherizer) bir huni ile açık ucuna yerleştirilen, huni üzerinde şişenin ters ve yavaşça iki konteynır dokunarak sineklerin etherizer içine düşmek yapmak için uçarak.
      Not:  Huni etherizer dışarı almak onları önleyecek.
    2. Knock aşağı nazikçe bir fare-pad gibi yumuşak bir yüzeyde etherizer dokunarak aşağı uçar ve hızlı bir eter-ıslatılmış pamuk ve gazlı bez fişi ile huni değiştirin.
    3. Uçar alta düşmek ve hareket durdurmak kadar 1 dakika bekleyin.
      Not: zaman aşmayın veya sinekler ölecek.
  4. Bir stereo mikroskop altında immobilize sinekler koymak ve kontrol grubu ile ilgili her tedavi grubu karın boyama karşılaştırın.

5. fecundity/fertilite assay

  1. Her EDC konsantrasyonu için, 3 şişe sinek hazırlamak, daha sonra ebeveyn şişeleri denilen, 8 kadın ve 4 erkek 10 mL CM/EDC gıda; kontrol için 8 dişi ve 4 erkek ile 10 mL CM gıda çözücü ile tamamlayıcı 6 şişe sinek hazırlamak. 25 °C ' de bir kuluçte arka uçar.
    Not: gelişimi sırasında larvaları aşırı kalabalık kaçının ve tedaviler arasında tutarlı larva yoğunlukları kullanmaya çalışın.
  2. 4 gün sonra, ebeveynler kaldırın ve 5 gün daha kuluçkörü içine şişeleri iade.
  3. 9. günün geç saatlerinde, tüm yeni uçlarına şişeleri çıkarın ve 18 °C gecede bir kuluçkıya şişeleri koyun.
    Not: Bu kaldırma çok dikkatle yapılmalıdır, iyi orta yüzey kontrol.
    1. 10 gün sabahı, her tedavi grubu için, hafif CO2 anestezizasyon altında, iki gruba bakire kadın ve genç erkek toplamak. Rasgele küçük alt gruplar halinde sinekler her grup (10 kadın ve şişe başına 20 erkek) taze karşılık gelen CM ile dolu bağımsız şişeleri alt bölümlere ayırın.
      1. Her ikisi de dikkatle toplama ve 18 °C ' de şişeleri bırakın 8-10 h tüm sinekleri kaldırmak için bakım alarak tekrar adım 5.3.1, her EDC konsantrasyonları için en az 30 bakire kadın ve 30 erkek elde kadar ve kontrol için en az 90 bakire kadın ve 90 erkek.
    2. Ev bu gruplar 25 °C ' de 4 gün sonrası, her iki günde bir taze karşılık gelen orta içeren yeni şişeler içine aktarılıyor.
      Not: 4 gün olgun yetişkinler olmak için sinekler için yeterli zaman, ama çok uzaklarda senescence başından itibaren.
    3. İki gün sonra kadınların şişeleri hiçbir larva vardır emin olun. Eğer onlar bakireler değildir ve atılmalıdır çünkü eğer, sinekler kullanılabilir değildir.
  4. Aşağıda açıklandığı gibi, EDC olmadan taze CM-domates Orta içeren küçük şişeleri içine 20 tek haçlar kurmak için her cinsel her cinsiyetten 20 tek sinek kullanın.
    1. Her tedavi grubu için benzersiz olarak tanıtan ve ilgili şişeleri etiket sıralı sayılar, farklı bir dizi atamak; örn. (tek başına solvent) 1 ' den 20 ' ye, Grup 2 ' den (EDC konsantrasyonu x) 20 ile 40 arasında vb.
    2. Her bir tedavi grubuna karşılık gelen farklı seriyi kaydetmek için bir doğurganlık tablo olun.
    3. Her seks için ışık CO2 altında her tedavi grubuna ait tüm sinekler anestezize ve rastgele aşağıdaki gibi aktarın.
      1. Bir solvent-tedavi dişi EDC olmadan taze CM-domates Orta içeren küçük bir şişe içine transfer ve kontrol haç için bir solvent tedavi erkek ekleyin.
        Not: koyu orta beyaz embriyolar ile kontrastı artırdığından, domates suyu hazırlık sırasında Orta olarak eklenmelidir.
      2. Bir EDC 'yi EDC olmadan taze CM-domates içeren küçük bir şişeye aktarabilir ve her tedavi için bir solvent tedavi edilen erkek ekleyebilirsiniz.
      3. Bir EDC 'yi EDC olmadan taze CM-domates Orta içeren küçük bir şişeye aktarabilir ve her tedavi için bir solvent tedavi edilen dişi ekleyebilirsiniz.
    4. 25 °C ' de tüm bu tek haç evi.
  5. Her bir çiftleşme çiftini, sonraki on gün boyunca her gün EDC olmadan taze CM-domates şişeleri içine aktarın. Her serinin çoğaltılmış şişeleri sıralı olarak etiketleyin; Örneğin 1-a, 1b, 1C...... 20A, 20B, 20C ve bu numarayı doğurganlık elektronik tablosunda bildirin.
  6. Görsel her şişe yumurta için her gün incelemek ve doğurganlık tablo üzerinde sayısını rapor.
  7. Her şişe kaydedin ve, yeni uçar ortaya çıkmaya başlar, aynı zamanda 10 gün boyunca yetişkin nesil günlük sayısını kaydedin. İlk çiftleşme 10 gün sonra, ebeveynler kaldırın.
    Not: bir veya her iki ebeveynin öldüğü Şişeyi atın; bir ya da her iki ebeveyn kaçış durumunda, analiz tüm verileri onları kaybolduğu gün kadar dahil.
  8. Toplam yumurta sayısı ve her bir tedavi grubundan yetişkin nesil günlük sayısı toplamı, on gün boyunca bir sinek ile ortalama yumurta ve yetişkin Döl üretim, ve toplam yumurta sayısı için Total Döl oranı koydu. Kontrol ile ilgili olarak her tedavi değerlerinin yüzdesi farklılıkları hesaplayın.
  9. Her bir tedavi grubu için en az 10 sinek kullanarak, her bir sinek grubu için üç bağımsız deney gerçekleştirin.
  10. Farklı grupları karşılaştırmak için istatistiksel analiz gerçekleştirin.

6. gelişimsel zamanlama

Not: Aşağıdaki iki alternatif protokolde, günde her iki pupa sayısını ve günlük yetişkin yavruların sayısını sayarak gelişimsel Zamanlama değerlendirilir.

  1. Eclosion tahlil protokolü 1
    1. Her tedavi grubu için, 10 şişe genç (< 2 gün), sağlıklı sinekler, her biri 6 kadın ve 3 erkek ile 10 mL Mısır maması gıda EDC olmadan ayarlayın.
    2. 24 saat yiyecek sinekler izin ve onları Mate izin.
    3. Hazırlamak 10 tedavi grubu başına paralel şişeler 10 mL her taze mısır maması gıda farklı EDC konsantrasyonları veya kontrol için tek başına çözücü ile tamamlayıcı. Transfer montaj ilişkili bu yeni şişeler için sinek.
      Not: her tedavi grubu için, benzersiz olarak tanımlayan ve ilgili şişeleri etiketlemek üzere farklı bir sıralı sayı dizisi atayın.
    4. Farklı seriyi kaydetmek için gelişimsel bir elektronik tablo yapın.
    5. İzin sinek 16 h için yumurta yatıyordu. Sonra ebeveyn şişeleri çıkarın.
      Not: Ebeveyn uçar diğer karşılık gelen şişeleri aktararak, adım 6.1.5 tekrar etmek için kullanılabilir.
    6. 3-4 gün boyunca 25 °c ' de ya da pupa formuna ulaşıncaya kadar şişeleri inküktir. Her gün her şişede yeni pupa sayısını saymak ve gelişimsel tablo üzerinde rapor. İki kez aynı pupa sayma önlemek için, şişenin dışında kalıcı bir marker ile her pupa sırayla bir sayı yazın.
    7. 9 günden başlayarak, günlük büyüyen yetişkinler sayısı daha fazla yetişkin ortaya çıkana kadar saymak ve gelişimsel tablo üzerinde rapor.
    8. Bu ham verilerden, ortalama larva süresini, ortalama pupa döneminin yanı sıra kontrol ile ilgili her tedavinin yüzdesi farklılıkları hesaplayın.
    9. Her bir tedavi grubu için en az 5 şişe kullanarak, her bir sinek grubu için üç bağımsız deney gerçekleştirin.
    10. Farklı grupları karşılaştırmak için istatistiksel analiz gerçekleştirin.
  2. Eclosion tahlil Protokolü 2
    1. Arka genç ve sağlıklı kadın (yaklaşık 150) ve erkek (yaklaşık 50) bir koleksiyon kafesi üzerinde uçar (malzeme tablosu) agar ile-domates Orta taze fırıncı Maya hamur ile takviye (5 ml su içinde fırıncı Maya 3 g), daha sonra 2 gün boyunca tepsi döşeme denilen 25 °C ' de.
    2. Bu 2 gün boyunca, yumurta koleksiyonuna başlamadan önce, karanlık ve sessiz bir yerde kafese eşlik etmek için uçar ve günde iki kez döşeme tepsisini değiştirin.
    3. Üçüncü gün, sabah erken döşeme tepsisini değiştirin. 1 saat sonra, bu koydu yumurta atarak, döşeme tepsisini değiştirin.
    4. 2 h için yumurta yatıyordu ve taze döşeme tepsisi ile değiştirmek için uçar izin verir.
      Not: 3 gün, iyi bir döşeme tepsisi 100-200 yumurta üretmek gerekir 2 saat.
    5. Her tedavi grubu için, ilgili EDC konsantrasyonu veya tek başına solvent ile tamamlayıcı domates mısır maması içeren 3 60 mm yemekler bir dizi hazırlamak ve gelişim zamanlaması tablo her dizi rapor. Alternatif olarak, tercih ederseniz, yemek yerine şişeleri kullanın.
    6. Hafifçe bir fırça veya prob kullanarak bir mikroskop altında yumurta almak ve her çanak/şişe içinde orta üst aktarmak. Sayım kolaylaştırmak için, döşeme tepsisinde, 10 her 5 grupta yumurta düzenlemek ve bir kerede onları bir transfer.
      Not: Yeterli embriyo elde etmek için gerekli olduğu kadar adım 6.2.4 yineleyin.
    7. 25 °C ' de tüm bu yemekleri/şişeleri ev. Ayrıca her döşeme tepsisini 25 °C ' de saklayın ve toplam yumurta sayısını Sayın.
    8. Sonra 24-30 h, bir mikroskoptan altında her çanak/şişe kontrol ve beyaz, döllenmemiş yumurta ve karanlık ölü embriyo sayısının hem sayısını saymak.
    9. 50 gelen beyaz, döllenemez yumurta sayısını çıkarın, çanak/şişe başına ' Toplam embriyo ' değeri elde etmek için transfer yumurta değeri. Embriyogenit sırasında potansiyel EDC toksik etkilerini belirlemek için karanlık ölü embriyo sayısı kullanılabilir.
    10. Eclosion assay protokol 1 6.1.6-6.1.10 adımlarını yineleyin.

7. kullanım ömrü Protokolü

  1. 8 kadın ve 4 erkek ve ev 25 °C CM (her biri 10 mL) ile 20 şişe sinek ayarlayın.
  2. 4 gün sonra sinekler ve yer şişeleri geri kuluçkörü atın.
    Not: Bu sinekler, sineklerin diğer yaş senkronize Kohortlar elde etmek için tekrar başlamak için kullanılabilir.
  3. Günün geç öğleden sonra 9, tüm yeni sinek şişeleri ve inkükörü geri şişeler çıkarın.
    Not: birkaç yetişkin Dokuzuncu gün kadar erken eclose başlamalıdır; Bu sinekler atarken erken acil dikkatsiz seçim kaçınarak, senkronize sinekler maksimum sayıda toplamak için izin verir.
  4. 16-24 h daha sonra, Yetişkin sinekleri aktarmak (1 günlük) her iki cinsiyede dört gruba 250 mL şişe içeren gıda üç farklı EDC konsantrasyonları ile tamamlayıcı ve tek başına çözücü ile. Gerekirse, ertesi gün başka bir toplu topla.
  5. 2-3 gün boyunca 25 °C ' de sinek koruyun.
    Not: gıda şişeleri transfer günü yetişkinliğin ilk gününe karşılık gelir.
  6. İki-üç gün sonra, ışık CO2 anestezizasyon altında iki gruba seks tarafından Sineklerin her kohort sıralamak. Her bir tedavi için her cinsiyet için 5 paralel şişeler üç çoğaltır kadar rasgele, şişe başına 20 bireyin bir yoğunlukta tedavi başına beş şişe içine her cinsiyetini alt bölümlere ayırın.
    Not: CO2' ye uzun pozlama süresi nedeniyle uzun ömürlü olası sağlık sorunlarını önlemek için küçük sinek gruplarıyla çalışın.
  7. Hangi ölü sineklerin sayısının önceki transferine kalan uçar sayısı çıkarılır bir yaşam tablo hazırlamak, otomatik olarak her transfer kurtulan sayısını elde etmek gibi bir şekilde.
  8. Transfer, aynı anda her 3 günde bir ilgili gıda içeren yeni şişeleri içine uçar ve ölüm kontrol.
    Not: transfer, uzun ömürlü bir süre boyunca olumsuz bir etkiye sahip olabilecek anestezi olmaksızın gerçekleşmelidir.
    1. Her transferde, sineklerin yaşını ve ölü sineklerin sayısını kaydedin.
      Not: kalan sineklerin sayısı otomatik olarak elektronik tabloda hesaplanır, ancak görsel olarak kontrol edilmesi önerilir. Yanlışlıkla hem kaçış ya da ölüm sırasında transfer dikkate alınmalıdır sinekler. İki kez ölü sinekler bu notu elektronik tabloda raporlama yeni şişe taşınan saymak için dikkatli olun.
    2. 7,8 ve 7.8.1 adımları yineleyin tüm sinekler ölür kadar.
  9. Her bir tedavi grubu için, Şekil 6' da gösterildiği gibi bir hayatta kalma eğrisi oluşturun, belirli bir zamanda bir uçun hayatta kalma olasılığını görüntülemek için.
  10. Her deney için 100 yeni eklosed sinekler kullanarak, sinek her tedavi grubu için üç bağımsız deneyler gerçekleştirin.
  11. Ortalama ömrü (her grup için tüm sineklerin ortalama hayatta kalma günleri), yarım ölüm süresi (50% mortalite ulaşmak için gereken gün süresi) ve maksimum ömrü (% 90 mortalite ulaşmak için gereken en fazla gün miktarı) rapor etmek için bir tablo hazırlayın.
  12. Kontrol grubu ile ilgili her bir tedavi grubu arasında yüzde farklılıkları hesaplayın.
  13. Farklı tedavi gruplarını karşılaştırmak için istatistiksel analizler gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu bölümde, yukarıdaki protokollerin önemli adımları Basitleştirilmiş düzenleri şeklinde bildirilir. Bu sinekler tatsız bileşikler önlemek eğilimindedir göz önüne alındığında, yapılacak ilk şey assay seçilen EDC tadı etmektir. Bu bir gıda boyama karıştırma yapılabilir (örneğin, kırmızı gıda boya No. 40)35 çeşitli dozlarda veya tek başına çözücü Ile seçilen EDC ile tamamlayıcı gıda ile. Bu medyada beslenen sinekler bir stereomikoscope altında incelenir ve gıda alımı karın boyama ile tahmin edilir (Şekil 1). Tipik bir istenen durum iki yetişkin kadın ile Şekil 1 ' de gösterilir: bir orta seçilen EDC ve bir EDC içeren değil, hem de aynı renklenme sunan, kendi ağdında içerir besleniyor.

Bu yaygın olarak kabul edilmiştir, EDCs, doğal hormonlar gibi, son derece düşük dozlarda etkileri var ve doz ve etkisi arasında basit, doğrusal bir ilişki değildir29, yüksek dozlarda mutlaka daha büyük bir etkiye sahip değil36, 37. Yani, bir doz-yanıt yaklaşımı yerine, tam olarak etkilerini değerlendirmek için, daha fazla doz kullanmak için tavsiye edilir, çevre veya diğer organizmalar için ilgili konsantrasyonlarından başlayarak. Her durumda, o sinekler her tedavi grubunda EDC karşılaştırılabilir miktarlarda sindirmek emin olmak için her kullanılan konsantrasyon EDC tadı tahlil önemlidir (Şekil 2).

Endokrin bozulma fertilite gibi hayvan fizyolojisi birçok önemli özellikleri etkiler, uzun ömürlü, ve geliştirme, bu nedenle, EDCs test etmek için yararlı uç noktaları vardır. Bu Drosophila yaşam özellikleri üzerinde EDC etkilerini ölçmek için optimize edilen yukarıdaki protokoller için, birincil hususlar bu doğru test etmeden önce manipüle edilmelidir genç ve sağlıklı sinekler kullanmak zorunludur olmasıdır. Bu akılda, kullanılan gıda üretim, taşıma ve depolama için büyük dikkat ödenmesi gerekir. Buna ek olarak, uygun son konsantrasyonlarda seçilen EDC için en iyi solvent kullanılarak bakım alınmalıdır (yani, az 1% dimetil sülventid için [DMSO] ve daha az 2% etanol için)30.

Doğum ve fertilite, D. melanogasterüreme başarısını değerlendirmek için kullanılmıştır. Şekil 3 kullanılan protokolün bir düzenini gösterir. Doğurganlık toplam yetişkin yavru olarak ölçülürken, deneysel olarak atlayan yumurtaların toplam sayısı olarak ölçülür. Yetişkin yaşamının ilk 10 gününde yumurta üretiminin, bir organizmanın tüm yetişkin yaşam yumurtası/Progeny üretimi için iyi bir referans olduğunu dikkate alınarak38,39, fertilite ve özüne göre 10 gün boyunca yapılabilir 4 gün eski sinekler kullanarak maruz larvaları gelen yumurtadan. Her grubun paralel şişeleri benzer değerler elde etmek için denemek önemlidir; Aksi takdirde, hangi tüp analiz kaldırmak için hayal etmek zor olurdu. Bu yüzden, günlük her çoğaltmak şişe stres bir ortam önlemek için incelemek için tavsiye edilir, gibi kurutulmuş veya sıvılaştırılmış gıda; 20 tek haç başlayarak, her iki ebeveyn 10 gün boyunca hayatta olduğu iyi koşullarda en az 10 şişe elde etmek için tavsiye edilir. Yumurta ve yetişkin Döl sayısı, günlük toplanan, Şekil 3 ' te gösterildiği gibi bir masada rapor edilmelidir ve 10 gün boyunca bir sinek ortalama yumurta ve yetişkin Döl üretimini hesaplamak için kullanılır. Daha sonra, EDC-tedavi sinekleri kontrol sinekler karşılaştırıldığında/fertilite değişim yüzdesi aşağıdaki formülü uygulayarak elde edilebilir uçar: dışılık/fertilite değişikliği% = [(kontrol-tedavi)/Control] x 100. Her grup için en az üç bağımsız çoğaltır elde edilmelidir.

Hormonlar D. melanogaster40hayatında gelişimsel geçişler önemli roller oynar, bu büyüme bu aşamaları özellikle EDCs olumsuz etkileri için savunmasız olduğu için. 25 °c ' de larva büyümesi ve pupa aşaması yaklaşık 4 gün sürer. EDC pozlamasını takiben, bu aşamaların ortalama süresi41etkilenebilir. Bu göz önüne alındığında, gelişimsel zamanlama protokolleri, larvadan pupa 'ya ve pupa 'den yetişkinlere geçiş süresini, tedavi edilmemiş sinekler açısından EDC pozlama sonrasında belirlemek için optimize edilmiştir. İki alternatif protokoller bu tahlil yürütmek olabilir. Her ikisi de geçerli ve 4 günlük bir süre içinde larvaları EDC kronik maruz dayalı. Bu larva tedavisine dayanarak, ilk protokol bir 16-18 h dönemi (gecede) üzerinden toplanan embriyoların yaşını dikkate almadı. Larvaları arasında sonuç yaş değişkenlik, ancak, her tedavinin tüm şişeleri mevcut olması, böylece içinde-tedavi farkı artırmak ancak önemli ölçüde tedaviler yoluyla gelişimsel zamanlamanın tahminleri etkilemeden. Bunun yerine, ikinci protokol eşzamanlı erken embriyo sabit sayıda kullanılan, aynı zamanda embriyogenesis42,43sırasında seçilen EDC potansiyel etkilerini değerlendirmek mümkün hale. Ayrıca, larvaları arasındaki yaş farkını en aza indirmek, tedavi arasındaki farkı azalttı ve tedaviler arasındaki gerçek farklılıkları tahmin etme yeteneğini artırdı. Şekil 4 eklosion tahlil bir düzeni bildiriyor. Her iki protokolde, plakalar/şişeler günlük kontrol edilmelidir, ve hem pupa ve yetişkinler bu maruz ve EDC maruz olmayan numaraları Şekil 4gibi bir masada ayrı olarak bildirilmesi gerekiyordu. Tüm kuklalar ve yetişkin sinekler, ölü ya da diri olup sayılmalıdır. Daha sonra, bu ham veriler larvalar 'dan pupa 'ye ve pupa 'den yetişkinlere geçiş yüzdeleri ve sürelerini hesaplamak ve kontrol sinekleri ile karşılaştırıldığında EDC tarafından işlenmiş sineklerin bu değerlerinin değişiklik yüzdesini hesaplamak için kullanılmıştır. EDC pozlama sonrasında, genel bir gelişimsel avans ya da kontrol sinekleri ile ilgili gecikme bekleniyordu. Seçilen protokol, her bir sinekler grubu için triplicate olarak yapılmalıdır. Bu tavsiye edildi, eclosion assay protokolü için 2, belirli bir EDC konsantrasyonu için bir çoğaltır her dizi, EDC konsantrasyonları boyunca embriyo evreleme güvenilirlik ve doğruluk korumak için aynı döşeme izi embriyolar ile seribaşı edildi.

Son olarak, Şekil 5 kullanım ömrünü ölçmek için önemli adımları gösterir. Bu protokol için, tüm analiz altında sinekler yaş ve cinsiyet ile senkron, birleştiğinde ve serbest dolaşım izin vermek için yeterince düşük bir yoğunlukta tutulan esastır. Her iki cinsiyet de ömür boyu deneyler yürütmek için önemlidir, çünkü iyi bilinen erkek ve dişi44arasında ömrü önemli farklılıklar vardır.

Gıda, sağlıklı bir nüfus korumak için her 3 günde bir değiştirilmesi gerekiyordu ve mortalite de her 3 günde bir değerlendirilmelidir. Bir ömrü e-tabloda, Şekil 5gibi, ölü sineklerin sayısı bildirilmiştir, ve bu sayı otomatik olarak önceki transfer gelen uçar sayısı çıkarılır olacaktır. Her EDC konsantrasyonu ve tek başına solvent için, geçen günlere karşı birikimli survivorship yaşam ömrü eğrileri elde etmek için çizilmiş. Şekil 6' da tipik bir survivorship eğrisi bildirilmiştir; survivorship eğrisi nispeten yüksek kaldığı uzun bir başlangıç döneminden sonra, yaklaşık 60 gün sonra katlanarak reddetti. EDC pozlama sonrasında, tedavi uçar survivorship eğrisi önemli ölçüde etkilenebilir. Bu etkiyi seçilen EDC nedeniyle olup olmadığını belirlemek için, en az iki yürütmek için tavsiye edildi, ya da daha iyi, üç bağımsız, nonzamaneous çoğaltmak deneyler.

Yukarıdaki protokollerin her birinde, anormalli şişeleri (örneğin, yumurta veya anormal ölümleri ile) olması mümkün oldu; Bu şişeler, kötü gıda kalitesi veya enfeksiyon gibi farklı nedenlerle kökenli olabilir ve önemli ölçüde önlemlerin değerlerini değiştirebilir. Bu anormal durumları yönetmenin en iyi yolu, iyi deneysel pratikte onları önlemek içindi. Bu yüzden, tüm yukarıdaki protokoller için, büyük ve dikkatli çalışma şişeleri çoğaltarak, sağlıklı sinekler tutmak gerekli olduğunu vurgulanmış olmalı, ve işleme sinekler, bir kez bir EDC maruz, böylece ölüm riskini artırmak, hassas hale gelebilir Manipüle.

Figure 1
Şekil 1: besleme tahlili. Yetişkin bir seçilen EDC (üst) veya tek başına çözücü (alt) ile tamamlayıcı CM/boya içeren şişeleri içinde uçar 24 saat beslemek için bırakılır. İki bir EDC (üst) veya tek başına çözücü (alt) ile takviye orta beslenen sinekler kendi ağdında benzer renklendirme gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: EDC dozajı. Diyet tarafından Drosophila için EDC yönetiminin şematik. Bir isojenik stoktaki yetişkin uçar, farklı bir EDC (üst) veya tek başına (alt) Solvent konsantrasyonuna maruz kalır. N = EDC 'nin referans konsantrasyonu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: fertilite tahlil. Protokol şematik, bakire koleksiyona uygun medyada sinek büyüme ve tek haç kadar adımları tasvir. Adım 1: yetişkinler (sekiz kadın ve dört erkek her biri ile 10 şişe) bir izojenik gerinim cm/EDC (üst) veya cm/solvent tek başına (alt) ile şişeleri aktarılır. (Basitlik için düzenin, üç şişeden sadece birini ifade ettiğini unutmayın.) Adım 2:4 gün sonra, yetişkinler atılır ve koydu yumurta yetişkin aşamasına kadar 9 gün boyunca geliştirmek için bırakılır. Adım 3: yeni eklosed yetişkinler seks tarafından sıralanır ve şişeler içinde toplanan (maks. 20 erkek/şişe ve 10 bakire-kadın/şişe). Adım 4: yetişkinler larva büyüme ilgili Orta üzerinde 4 gün yaş bırakılır. Adım 5:40 kurulum EDC-tedavi için tek haçlar bir EDC olmadan CM-domates Orta sinekler, 20X bir EDC-tedavi erkek bir kontrol dişi ve 20X tek kontrol erkek bir EDC-tedavi dişi (üst); kontrol sinekleri için 20 tek haç kurulumu, bir kontrol dişi (alt) ile 20X bir kontrol erkek. Sarı orta bir EDC (üst) veya çözücü olarak kontrol (alt) ve kırmızı orta bir EDC veya çözücü olmadan bir domates/CM ile tamamlayıcı bir CM olduğunu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: gelişimsel zamanlama (eclosion assay protokol 2). Solda, bu rakam, yetişkinler (yaklaşık 150 kadın ve 50 erkek) bir toplama kafesi bir düzeni gösterir bir yer ve karadan önce karanlıkta Mate yerleştirilir (protokol bakın). 2 gün sonra, eski sürgülü tepsi bir taze gıda ile değiştirilir, ve yumurta sonraki 1 h devrik onlar asenkron çünkü atılır. Bundan sonra, yumurtalar yeni bir sürgülü tepsi üzerinde her 2 saat toplanır, sayılır, ve bir EDC ile tamamlayıcı veya tek başına solvent ile domates/CM içeren yemeklere yerleştirilir. Veri (Toplam laid yumurta, açıklanmayan yumurta, pupae, ve eklosed yetişkinler) bir dizi gelişimsel zamanlama tabloları (sağ) bildirilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: ömür tahlil. Bir gün senkronize sinekler bir 250 mL şişe yetişkin gıda (AM) ile desteklenen bir EDC (üst) veya çözücü (alt) kontrol olarak, beslenme (şemaya sol) sağlamak için aktarılır. 2-3 gün sonra, sinekler seks ile sıralanır ve beş şişe (başlangıç şişesi karşılık gelen orta içeren) transfer 20 birey/şişe gruplar halinde, her seks için. Her 3 günde bir, yetişkinler taze şişeleri artık gerekli (şemasının Merkezi parçası) kadar aktarılır. Sağda, veri her gün için kaydedilen tablonun bir düzenidir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: ömür eğrileri. Sol tarafta, her iki tedavi grubu için (orta + EDC [0,05 mM EE2]) ve kontrol grubu (orta + solvent) için, tüm deneysel dönemde ölü sineklerin sayısının her 3 günde bir kaydedildiği temsili bir tablo bildirilmiştir. Her grubun ortalama ömrü MATRIS toplamı kullanılarak hesaplanır. Ürün; tedavi edilen grup, kontrol grubuna kıyasla ortalama ömrünü kısalttı. Sağda, tipik bir hayatta kalma eğrisi orta içeren EE2 (0,05 mM) veya kontrol için sadece etanol ile beslenen erkek sinekler gösterilir. Survivorship eğrisi, daha önceki bir dönüm bırakma noktası ile kontrol grubuna göre daha hızlı tedavi edilen uçar için azaldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Meyve sinek D. melanogaster yaygın olarak DBP28, BPA, 4-NP, 4-tert-op29, MP30, EP31 gibi çevresel EDCs potansiyel etkilerini araştırmak için bir In vivo model sistemi olarak istihdam edilmiştir 32, DEHP33ve EE234. Çeşitli nedenlerle bu araştırma alanında bir model olarak kullanımını açtı. Bir model sistemi olarak onun tartışmasız avantajları dışında, Drosophila insan sağlığı için potansiyel etkileri tahmin veya düşündürerek yardımcı olabilir hangi Drosophila EDC deneyleri insanlar ile gen koruma yüksek derecede paylaşır. Ayrıca, Drosophila, tüm ekosistemlerde yaygın olarak temsil edilen ve EDCs 'nin zararlı etkilerine karşı daha fazla koruma önlemi gerektiren omurgasızlar 'a aittir. Omurgasızlar gıda zincirinin üssünde yer alır ve yaşadığı ortamlar için çok önemli fonksiyonlar gerçekleştirir. Bu çevreye yayımlanan birkaç EDCs çeşitli hayvan türlerinin geliştirilmesi ve üreme üzerinde zararlı bir etkiye sahip olabilir bildirilmiştir. Drosophila test edilecek maddeye herhangi bir varyasyon niteliği için potansiyel olarak geliştirme, üreme ve yaşam ömrünü etkileyen faktörler kontrol altında tutulabilir Laboratuvarda kullanılan ek avantajı sunuyor.

Burada, bu model sistemde EDC pozlama etkilerini incelemek için ayrıntılı protokoller sağlamak gibi hormonal olarak düzenlenmiş yaşam özellikleri bu tür/fertilite, gelişimsel oranı, ve ömrü. Biz mümkün EE234, BPA ve BPAF (yayımlanmamış veri) pozlama etkilerini araştırmak için yapılan bu protokolleri optimize ettik, ancak kolayca diğer EDCs etkilerini incelemek için adapte edilebilir. Özellikle, bu nitelikteki her iki saf EDCs ve farklı EDCs kombinasyonları araştırmak için kullanılabilir, daha yakından ne doğada oluşur üreterek. Görünüşte, basit büyüme gibi görünebilir rağmen, uygun yönergelere göre çalışmak önemlidir, doğruluk ve yeniden Üretilebilirlik45sağlanması. D. melanogaster 'da fertilite, gelişimsel zamanlama ve uzun ömürlülük, dış ve iç faktörlerden etkilenebilir. Photoperiod, sıcaklık, nem, beslenme, nüfus yoğunluğu, genetik yapı ve yaş dahil olmak üzere bu kritik faktörler, bildirilen protokollerin sonucu için dikkatle kontrol edilmelidir. Genetik değişkenlik bileşenini en aza indirmek için izojenik bir gerinim kullanılmalıdır. Bu gerinim dikkatli bir nemlendirici, sıcaklık kontrollü kuluçka, doğal 12 h ışık ile yetiştirilen gerekir: 12 h Dark fotoperiyodun 25 °c.

Kontrollü bir ortamın bakımını ek olarak, larva ve Fly aşırı kalabalık kaçınılmalıdır. Bu larva aşırı kalabalık gelişimsel zamanlaması etkileyebilir ve çeşitli genler ifade neden olduğunu bildirdi, Isı şok veya bağışıklık ile ilgili genler de dahil olmak üzere, Yetişkin sinekler toplam fitness etkisi46. Ayrıca, Yetişkin sinekleri yetişkin stres en aza indirmek için serbest hareket izin vermek için yeterli düşük bir yoğunlukta muhafaza edilmelidir. Ayrıca, bu sinekler her tedavi grubunda EDC karşılaştırılabilir miktarlarda tüketmek emin olmak önemlidir, göz önünde farklı konsantrasyonlarda bileşik tadı alarak, çünkü sinekler tatsız gıda önlemek eğilimindedir. Bu protokollerin bir diğer önemli yönü gıda kalitesidir; Gıda da iyi bakmak gerekir, kabarcıklar yoksun, bakteri çatlaklar, ve böylece47,48. Ayrıca, zihin senkronizasyonu, çiftleşme durumu ve sineklerin test edilmesi için cinsiyet yaşama devam etmesi gereklidir. Tüm bildirilen protokollerde, analiz altında paralel şişeleri çok benzer olması önemlidir; Aksi takdirde, maksimum dikkat ve iyi deneysel uygulama gereklidir böylece atmak anlamak zor olacaktır. Son olarak, seçilen EDCs endokrin etkilerini değerlendirmek için bu protokolleri kullanarak, metil 4-hidroxybenzoate veya plastik şişeleri BPA gibi, orta mevcut diğer EDCs ile olası etkileşimleri dikkate almak önemlidir. Bu anlamda, antifungal ajan değiştirmek için yararlı olabilir, cam şişeleri kullanmak, ya da mümkün kirleticiler ile hem de olmadan pilot algılama gerçekleştirmek.

Bildirilen Drosophila çeşitli kimyasallar veya kimyasalların karışımı, EDCs gibi, hormonal olarak düzenlenmiş yaşam özellikleri, üreme, geliştirme gibi potansiyel etkileri değerlendirerek değerlendirilmesi için çok etkili olabilir ve ömrü. Ancak, bu açıklar, EDC yan etkilerinden sorumlu endokrin mekanizması açıkça tanımlamak için hizmet edemez. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, böcek endokrin sistemindeki belirli bir eylem modunun yanıtını uyandıren referans EDCs kullanarak aynı protokolleri gerçekleştirmek mümkündür (örneğin, JH veya ecdysteroid olarak çalışan üçüncü nesil böcek öldürücüler agonist/antagonist)22. Alternatif olarak, moleküler uç noktalar kullanmak da mümkündür, hormonal olarak düzenlenmiş ve endokrin Bozulması34için öngörü ve spesifik Biyomarkörler olarak kabul edilir belirli genler üzerinde moleküler analiz yürüten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar teknik destek için Orsolina Petillo teşekkür ederiz. Yazarlar, bibliyografik destek için Dr. mariarosaria Aletta 'ya (CNR) teşekkür ederler. Yazar, Dr. Gustavo Damiano Mita 'ya onları EDC dünyasına takdim etmesi için teşekkür ederler. Yazarlar yardım için Leica Microsystems ve Pasquale Romano teşekkür ederiz. Bu araştırma proje PON03PE_00110_1 tarafından destekleniyordu. "Sviluppo di nanotecnologie orientate Alla rigenerazione e ricostruzione tissutale, odontoiatria/oculistica içinde implantologia e sensoristica" tanıtıldı "Sorriso"; Committente: PO FESR 2014-2020 CAMPANIA; Proje PO FESR Campania 2007-2013 "NANOTECNOLOGIE BAŞıNA Il RILASCIO CONTROLLATO DI moleküler BIO-ATTIVE NANOTECNOLOGIE".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17α-Ethinylestradiol Sigma E4876-1G
Agar for Drosophila medium BIOSIGMA 789148
Bisphenol A Sigma 239658-50G
Bisphenol AF Sigma 90477-100MG
Cornmeal CA' BIANCA
Diethyl ether Sigma
Drosophila Vials BIOSIGMA 789008 25 mm x 95 mm
Drosophila Vials BIOSIGMA 789009 29 mm x 95 mm
Drosophila Vials Kaltek 187 22 mm x 63 mm
Embryo collection cage Crafts Plexiglass cylinder (12.5 mm x7 cm) with an open end and the other end closed by a rectangular base in which a slot allows the insertion of special trays for laying
Ethanol FLUKA 2860
Etherizer Crafts cylindrical glass container with a cotton plug
Glass Bottle 250 mL Bottles
Glass Vials Microtech ST 10024 Flat bottom tube 100 x 24
Hand blender Pimmy Ariete food processor
Instant Success yeast ESKA Powdered yeast
Laying tray Crafts plexiglass trays (11 cm x 2.6 cm) in which to pour medium for laying
Methyl4-hydroxybenzoate SIGMA H5501
Petri Dish Falcon 351016 60x5
Red dye no. 40 SIGMA 16035
Stereomicroscope with LED lights Leica S4E
Sucrose HIMEDIA MB025
Tomato sauce Cirio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kareiva, P. M., Marvier, M. Managing fresh water for people and nature. Conservation Science: Balancing the Needs of People and Nature. Kareiva, P. M., Marvier, M. , Roberts and Company Publishers. Greenwood Village, CO. 460-509 (2011).
  2. Zoeller, R. T., et al. Endocrine-disrupting chemicals and public health protection: a statement of principles from The Endocrine Society. Endocrinology. 153 (9), 4097-4110 (2012).
  3. Guillette, J., Gunderson, M. P. Alterations in development of reproductive and endocrine systems of wildlife populations exposed to endocrine-disrupting contaminants. Reproduction. 122, 857-864 (2001).
  4. Guillette, L. J. Endocrine disrupting contaminants-beyond the dogma. Environmental Health Perspectives. 114, 9-12 (2006).
  5. Liao, C. S., Yen, J. H., Wang, Y. S. Growth inhibition in Chinese cabbage (Brassica rapa var. chinensis) growth exposed to di-n-butyl phthalate. Journal of Hazardous Materials. 163, 625-631 (2009).
  6. Qiu, Z., Wang, L., Zhou, Q. Effects of Bisphenol A on growth, photosynthesis and chlorophyll fluorescence in above-ground organs of soybean seedlings. Chemosphere. 90, 1274-1280 (2013).
  7. Wang, S., et al. Effects of Bisphenol A, an environmental endocrine disruptor, on the endogenous hormones of plants. Environmental Science and Pollution Research. 22, 17653-17662 (2015).
  8. Quesada-Calderón, S., et al. The multigenerational effects of water contamination and endocrine disrupting chemicals on the fitness of Drosophila melanogaster. Ecology and Evolution. 7, 6519-6526 (2017).
  9. Bergman, A., Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. The State of the Science of Endocrine Disrupting Chemicals - 2012. , United Nations Environment Programme and the World Health Organization. (2013).
  10. Bachega, T. A. S. S., Verreschi, I. T., Frade, E. M. C., D’Abronzo, F. H., Lazaretti-Castro, M. The environmental endocrine disruptors must receive the attention of Brazilian endocrinologists. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 55, 175-176 (2011).
  11. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127, 204-215 (2011).
  12. Lee, S. B., Choi, J. Effects of Bisphenol A and Ethynyl estradiol exposure on enzyme activities, growth and development in the fourth instar larvae of Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Ecotoxicology and Environmental Safety. 68, 84-90 (2007).
  13. Vos, J. G., et al. Health effects of endocrine-disrupting chemicals on wildlife, with special reference to the European situation. Critical Reviews in Toxicology. 20, 71-133 (2000).
  14. Costa, E. M. F., Spritzer, P. M., Hohl, A., Bachega, T. A. S. S. Effects of endocrine disruptors in the development of the female reproductive tract. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia. 58 (2), 153-161 (2014).
  15. Thummel, C. S. From embryogenesis to metamorphosis: the regulation and function of Drosophila nuclear receptor superfamily members. Cell. 83, 871-877 (1995).
  16. Schwedes, C. C., Carney, G. E. Ecdysone signaling in adult Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 58, 293-302 (2012).
  17. Flatt, T., Kawecki, T. J. Pleiotropic effects of methoprene-tolerant (Met), a gene involved in juvenile hormone metabolism, on life history traits in Drosophila melanogaster. Genetica. 122, 141-160 (2004).
  18. Nassel, D. R., Winther, A. M. E. Drosophila neuropeptides in regulation of physiology and behavior. Progress in Neurobiology. 92, 42-104 (2010).
  19. Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annual Review of Entomology. 47, 467-500 (2002).
  20. Gáliková, M., Klepsatel, P., Senti, G., Flatt, T. Steroid hormone regulation of C. elegans and Drosophila aging and life history. Experimental Gerontology. 46, 141-147 (2011).
  21. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in Drosophila. Trends in Endocrinology & Metabolism. 11, 276-280 (2000).
  22. Weltje, L. Techniques for Measuring Endocrine Disruption in Insects. Endocrine Disrupters: Hazard Testing and Assessment Methods. Matthiessen, P. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 100-115 (2013).
  23. Zou, Z., et al. Juvenile hormone and its receptor, methoprene-tolerant, control the dynamics of mosquito gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (24), E2173-E2181 (2013).
  24. Zhao, W. L., et al. Methoprene-tolerant 1 regulates gene transcription to maintain insect larval status. Journal of Molecular Endocrinology. 53 (1), 93-104 (2014).
  25. Mangelsdorf, D. J., et al. The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell. 83, 835-839 (1995).
  26. Bate, M., Martinez Arias, A. Hormones and Drosophila development. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 899-939 (1993).
  27. Watts, M. M., Pascoe, D., Carroll, K. Chronic exposure to 17a-ethinylestradiol and bisphenol A-effects on development and reproduction in the freshwater invertebrate Chironomus riparius (Diptera: chironomidae). Aquatic Toxicology. 55, 113-124 (2001).
  28. Atli, E. The effects of dibutyl phthalate (DBP) on the development and fecundity of Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 93, 164-171 (2010).
  29. Atli, E. The effects of three selected endocrine disrupting chemicals on the fecundity of fruit fly, Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 9, 433-437 (2013).
  30. Gu, W., Xie, D. J., Hou, X. W. Toxicity and estrogen effects of methylparaben on Drosophila melanogaster. Food Science. 30, 252-254 (2009).
  31. Liu, T., Li, Y., Zhao, X., Zhang, M., Gu, W. Ethylparaben affects lifespan, fecundity, and the expression levels of ERR, EcR and YPR in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Physiology. 71, 1-7 (2014).
  32. Chen, Q., Pan, C., Li, Y., Zhang, M., Gu, W. The Combined Effect of Methyl- and Ethyl-Paraben on Lifespan and Preadult Development Period of Drosophila melanogaster (Diptera: Drosophilidae). Journal of Insect Science. 16 (1), 1-8 (2016).
  33. Cao, H., Wiemerslage, L., Marttila, P. S., Williams, M. J., Schioth, H. B. Bis-(2-ethylhexyl) Phthalate Increases Insulin Expression and Lipid Levels in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 119, 309-316 (2016).
  34. Bovier, T. F., Rossi, S., Mita, D. G., Digilio, F. A. Effects of the synthetic estrogen 17-α-ethinylestradiol on Drosophila T melanogaster: Dose and gender dependence. Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 625-632 (2018).
  35. Tanimura, T., Isono, K., Takamura, T., Shimada, I. Genetic dimorphism in the taste sensitivity to trehalose in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology. 147, 433-437 (1982).
  36. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and non- monotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33, 378-455 (2012).
  37. Abolaji, A. O., Kamdem, J. P., Farombi, E. O., Rocha, J. B. T. Mini Review: Drosophila melanogaster as a Promising Model Organism in Toxicological Studies. Archives of Basic and Applied. 1, 33-38 (2013).
  38. Yesilada, E. Genotoxic Activity of Vinasse and Its Effect on Fecundity and Longevity of Drosophila melanogaster. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 63, 560-566 (1999).
  39. Atli, E., Ünlü, H. The effects of microwave frequency electromagnetic fields on the fecundity of Drosophila melanogaster. Turkish Journal of Biology. 31, 1-5 (2007).
  40. Flatt, T., Tu, M., Tatar, M. Hormonal pleiotropy and the juvenile hormone regulation of Drosophila development and life history. BioEssays. 27, 999-1010 (2005).
  41. Rand, M. D., Montgomery, S. L., Prince, L., Vorojeikina, D. Developmental Toxicity Assays Using the Drosophila Model. Current Protocols in Toxicology. 59, 1-27 (2015).
  42. Fletcher, J. C., Burtis, K. C., Hogness, D. S., Thummel, C. S. The Drosophila E74 gene is required for metamorphosis and plays a role in the polytene chromosome puffing response to ecdysone. Development. 121, 1455-1465 (1995).
  43. Giordano, E., Peluso, I., Senger, S., Furia, M. minifly, A Drosophila Gene Required for Ribosome Biogenesis. The Journal of Cell Biology. 144 (6), 1123-1133 (1999).
  44. Tower, J., Arbeitman, M. The genetics of gender and life span. The Journal of Biology. 8, 38 (2009).
  45. Digilio, F. A., et al. Quality-based model for Life Sciences research guidelines. Accreditation and Quality Assurance. 21, 221-230 (2016).
  46. Sorensen, J. G., Loeschcke, V. Larval crowding in Drosophila melanogaster induces Hsp70 expression, and leads to increased adult longevity and adult thermal stress resistance. Journal of Insect Physiology. 47, 1301-1307 (2001).
  47. Linford, N. J., Bilgir, C., Ro, J., Pletcher, S. D. Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (71), e50068 (2013).
  48. Weltje He, Y., Jasper, H. Studying aging in Drosophila. Methods. 68, 129-133 (2014).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı 149 Drosophila melanogaster endokrin bozucu kimyasalları gelişimsel fertilite gelişim ömür
<em>Drosophila melanogaster</em> endokrin bozulma test yöntemleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bovier, T. F., Cavaliere, D.,… More

Bovier, T. F., Cavaliere, D., Colombo, M., Peluso, G., Giordano, E., Digilio, F. A. Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (149), e59535, doi:10.3791/59535 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter