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Biochemistry

रजोनिवृत्ति के बाद हृदय रोग के Exogenous एस्ट्रोजन उपचार स्क्रीनिंग के लिए Vivo एस्ट्रोजन की कमी माउस मॉडल में

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59536
Automatic Translation
1, 2, 1
1Institute of Medicinal Plant Development (IMPLAD), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2Shandong University of Traditional Chinese Medicine

Summary

चिकित्सकीय रूप से, रजोनिवृत्ति महिलाओं में एस्ट्रोजन की कमी लिपिड व्यवधान और एथेरोस्क्लेरोसिस की घटनाओं को बढ़ा सकती है। हम apoE में एक डबल पृष्ठीय-पक्षीय चीरा के माध्यम से द्विपक्षीय अंडाशय उच्छेदन द्वारा एक में विवो एस्ट्रोजन की कमी मॉडल की स्थापनाकी - / माउस मॉडल रजोनिवृत्ति के बाद हृदय रोग के exogenous एस्ट्रोजन उपचार स्क्रीनिंग के लिए लागू है.

Abstract

रजोनिवृत्ति उपरांत महिलाओं को रजोनिवृत्ति पूर्व महिलाओं की तुलना में हृदय रोगों के विकास का अधिक खतरा होता है। मादा चूहों ovariectomized (OVX) weaning प्रदर्शन पर बरकरार डिम्बग्रंथि समारोह के साथ महिला चूहों के साथ तुलना में aorta में atherosclerotic घावों में वृद्धि हुई. हालांकि, एथेरोस्क्लेरोसिस-प्रवण स्थिति के साथ एस्ट्रोजन की कमी वाले चूहों को शामिल करने वाले प्रयोगशाला मॉडलों की कमी है। यह घाटा महत्वपूर्ण है क्योंकि रजोनिवृत्ति महिलाओं में नैदानिक एस्ट्रोजन की कमी पूर्व मौजूदा या चल रहे लिपिड व्यवधान और atherosclerosis की घटनाओं में बढ़ सकता है. इस अध्ययन में, हम एक द्वि पृष्ठीय-पक्षीय चीरा के माध्यम से द्विपक्षीय अंडाशय उच्छेदन द्वारा एक में विवो एस्ट्रोजन की कमी माउस मॉडल की स्थापना apolipoप्रोटीन ई (apoE)में - / फिर हम हेज़लनट स्प्रेड के माध्यम से प्रशासित 17"-एस्ट्राडियोल और स्यूडोप्रोटोडिओसिन (पीपीडी) (एक फाइटोएस्ट्रोजन) के प्रभावों की तुलना करते हैं। हम पाते हैं कि हालांकि पीपीडी OVX apoE में अंतिम शरीर के वजन और प्लाज्मा टीजी को कम करने पर कुछ प्रभाव डालती है-/- चूहों, यह विरोधी atherosclerotic और हृदय-सुरक्षा क्षमता है इसके साथ तुलनीय 17"-एस्ट्राडियोल समकक्ष. पीपीडी एक फाइटोएस्ट्रोजन है जिसे एंटी-ट्यूमर गुणों को लागू करने के लिए सूचित किया गया है। इस प्रकार, प्रस्तावित विधि postmenopausal महिलाओं में पारंपरिक हार्मोन रिप्लेसमेंट थेरेपी के लिए स्थानापन्न करने के लिए peroral प्रशासन के माध्यम से phytoestrogens स्क्रीनिंग के लिए लागू है, जो संभावित हानिकारक tumorigenetic है सूचित किया गया है क्षमता. अखरोट प्रसार के माध्यम से Peroral प्रशासन noninvasive है, यह व्यापक रूप से कई रोगियों के लिए लागू प्रतिपादन. इस लेख में द्वि-पृष्ठीय-पक्षीय चीरा के माध्यम से द्विपक्षीय अंडाशय के चरण-दर-चरण प्रदर्शन शामिल हैं-/- चूहे और पेओरल 17"-एस्ट्राडियोल या हेज़लनट स्प्रेस्ट के माध्यम से फाइटोएस्ट्रोजन हार्मोन प्रतिस्थापन। प्लाज्मा लिपिड और हृदय समारोह इकोकार्डियोग्राफी का पालन का उपयोग कर विश्लेषण करती है।

Introduction

महामारी विज्ञान और नैदानिक अध्ययनों से पता चला है कि रजोनिवृत्ति उपरांत महिलाओं को रजोनिवृत्ति पूर्व महिलाओं की तुलना में हृदय रोग का काफी अधिक खतरा होता है1,2. हार्मोन रिप्लेसमेंट थेरेपी (एचआरटी) हृदय रोग के सापेक्ष जोखिम को कम कर सकता है 0.37-0.793. अन्य जटिलताओं के अलावा, हृदय रोगों के कारण atherosclerosis दुनिया भर में मौत का प्रमुख कारण है4. हालांकि, एथेरोस्क्लेरोसिस प्रवण स्थिति पेश एस्ट्रोजन की कमी चूहों को शामिल प्रयोगशाला मॉडल की कमी है. इस प्रोटोकॉल रजोनिवृत्ति के बाद हृदय रोग के exogenous एस्ट्रोजन उपचार स्क्रीनिंग के लिए एक में विवो एस्ट्रोजन की कमी माउस मॉडल प्रदान करता है.

पिछले अध्ययनों से पता चलता है कि atherosclerotic कृन्तकों में OVX के आवेदन एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार खिलाया पोस्टमेनोपॉज़ल महिलाओं atherosclerosis से पीड़ित नकल कर सकते हैं5,6,7,8. रजोनिवृत्ति महिलाओं में एथेरोस्क्लेरोटिक राज्य के समान एक पुनरुत्पादक और सुविधाजनक पशु मॉडल exogenous एस्ट्रोजन अनुसंधान का आधार है। यहाँ, द्विपक्षीय अंडाशय के द्वि पृष्ठीय चीरा एथेरोस्क्लेरोसिस-प्रवण एपोलिपोप्रोटीन ई नॉकआउट (एपोई-/-) चूहों9,10में लागू किया गया था। मध्य पेट या पृष्ठीय चीरा के साथ तुलना में, डबल पृष्ठीय-पक्षीय चीरा एक आसान, कम समय लेने वाली विधि है जो गंभीर पेट गुहा आसंजन और सूजन से बच सकती है। अखरोट प्रसार के माध्यम से Peroral प्रशासन (सामग्री की तालिकादेखें) noninvasive और सुविधाजनक है, यह व्यापक रूप से एक दीर्घकालिक प्रशासन मोड11के रूप में लागू प्रतिपादन. धीमी गति से जारी गोली प्रत्यारोपण भी लोकप्रिय है6. हालांकि, प्रत्यारोपण विशेष रूप से OVX के अधीन चूहों में संक्रमण की घटनाओं बढ़ सकता है. अन्य noninvasive प्रशासन मोड, इस तरह के मौखिक gavage और पानी प्रशासन के रूप में, भी कई कमियां हैं. मौखिक gavage आम तौर पर तनाव चूहों और esophageal चोट का कारण हो सकता है. पीने के पानी के माध्यम से हार्मोन प्रशासन अत्यधिक फायदेमंद है; हालांकि, एक पायसीकारक के रूप में DMSO के जोड़ने के रूप में exogenous एस्ट्रोजन पानी में अघुलनशील हैं अपरिहार्य है. यहाँ, हम लंबी अवधि के प्रशासन के लिए अखरोट प्रसार के माध्यम से peroral 17"-एस्ट्राडियोल या phytoestrogen हार्मोन प्रतिस्थापन चुना है।

हाल ही में, रजोनिवृत्ति उपरांत महिलाओं के हृदय प्रणाली पर एचआरटी के लाभकारी प्रभाव महिलाओं के स्वास्थ्य पहल (WHI) परीक्षण12में लड़ा गया है. एक तरफ, exogenous एस्ट्रोजन अकेले हृदय प्रणाली पर एक लाभदायक प्रभाव डालती है; दूसरी ओर, यह हृदय की घटनाओं के जोखिम को बढ़ाने के लिए मेटोहाइड्रॉक्सीप्रोजेस्टेरोन एसीटेट के साथ गठबंधन कर सकते हैं। अधिक गंभीरता से, एचआरटी स्तन और गर्भाशय ट्यूमर प्रगति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और इस प्रभाव को स्पष्ट रूप से इसके उपयोग13,14सीमित है. अधिक रुचि ट्यूमर कोशिकाओं में माइटोटिक गतिविधि की कमी exogenous एस्ट्रोजेन के हृदय सुरक्षात्मक प्रभाव पर ध्यान केंद्रित किया गया है15,16,17. मनुष्यों और पशुओं में अनेक अध्ययनों से पता चलता है कि एस्ट्रोजेन ों के समान संरचनाओं वाले फाइटोएस्ट्रोजन हृदयसंरक्षणमें लाभकारी भूमिका निभा सकते हैं.

इस प्रकार, वर्तमान कार्य का उद्देश्य (i) एपो में एक डबल पृष्ठीय-पक्षीय चीरा के माध्यम से द्विपक्षीय अंडाशय-उच्छेदन द्वारा एक इन विवो एस्ट्रोजन की कमी माउस मॉडल का निर्माण करने के लिए कर रहे हैं- / हेज़लनट प्रसार के माध्यम से 17"-एस्ट्राडियोल और स्यूडोप्रोटोडिओसिन (पीपीडी) प्रशासित। 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल एक प्रकार का बहिर्जात एस्ट्रोजन है जो महिला यौन हार्मोन6,11,19 सेसंबंधित है। पीपीडी, एक स्टेरॉयड saponin और Dioscorea पौधों से phytoestrogen, पहले विरोधी ट्यूमर गुण लागू करने के लिए सूचित किया गया है20.

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Protocol

सभी पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल संस्थागत पशु देखभाल और चिकित्सा विज्ञान और पेकिंग यूनियन मेडिकल कॉलेज की चीनी अकादमी के उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (अनुमति संख्या: SYXK (बीजिंग) 2013-0023). apoE की उत्पत्ति- / - चूहों C57BL/6J9,10है.

1. द्विपक्षीय Ovariectomy apoE में एक डबल डोर्सल-पक्षीय चीरा के माध्यम से- /

  1. weaning में (आयु 28 दिन), एनेस्थेटाइज महिला apoE-/- C57BL/6J चूहों avertin के साथ (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally).
    नोट: 32 apoE-/- चूहों बेतरतीब ढंग से 4 समूहों में विभाजित किया गया: SHAM, OVX, OVX/E2, और OVX/PPD समूह (n $ 8 प्रति समूह).
  2. एक हीटिंग पैड पर प्रवण स्थिति में जानवर प्लेस. संज्ञाहरण के दौरान आंख की सुरक्षा के लिए आंख स्नेहक लागू करें।
  3. 36 के भीतर शरीर के तापमान को बनाए रखें - 0.5 डिग्री सेल्सियस। माउस की गर्दन के पार्श्व पहलू के लिए एनाल्जेसिक कार्प्रोफेन के 5 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन को कम कर के लिए प्रशासित करें।
  4. iliac शिखर से एक 3 x 5 सेमी2 माउस क्षेत्र शिरस्य दाढ़ी. एक 3 x 5 सेमी2 एपर्चर सर्जिकल शीट के साथ पशु को कवर करने से पहले, आयोडीन और फिर 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से मुंडा क्षेत्र को साफ करें। प्रयोग के दौरान बाँझ उपकरणों और दस्ताने का प्रयोग करें.
  5. एक चीरा बनाने के लिए कैंची और बल के साथ प्रयोग करें 1 सेमी पार्श्व midline करने के लिए और 1 सेमी पार्श्व लागत पसलियों के लिए.
  6. बलप्स का उपयोग करके अधश्त्विक ऊतक को बुरी तरह से विभाजित करें.
  7. उदर गुहा में सफेद वसा ऊतक की पहचान करने के लिए विच्छेदन काले चश्मे (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें।
  8. जब तक पेट की गुहा तक पहुंच नहीं जाता, तब तक फासिया के माध्यम से 0.5-1 सेमी चीरा बनाने के लिए माइक्रोसाइज़र और माइक्रोफोर्स का उपयोग करें।
    नोट: शम-संचालित समूह के लिए, घावों को सीधे बंद करें। एक मोनोफिलामेंट सीवन का उपयोग करके मांसपेशियों की परत और त्वचा को अलग से सीवन करें।
  9. जब पेट की गुहा में सफेद वसा ऊतक देखा जा सकता है, microforceps का उपयोग कर वसा ऊतक हड़पने और धीरे इसे बाहर खींच. एक गुलाबी शहतूत के आकार का अंडाशय जो उदर गुहा में वसा ऊतक द्वारा लपेटा जाता है, देखा जा सकता है।
  10. एक मोनोफिलामेंट सीवन का उपयोग करके 0.5-1 सेमी प्रोक्सिमल वाहिका और गर्भाशय सींग को लिगेट करें। माइक्रोसेस्टर का उपयोग करके अंडाशय को निकालें और शेष ऊतक को पेट की गुहा में वापस रखें।
    नोट: OVX आपरेशन के लिए मुख्य प्रतिकूल लक्षण मूत्र-लिगेशन है जो OVX संचालित चूहों में उच्च मृत्यु दर की ओर जाता है। यह एक विच्छेदन काले चश्मे का उपयोग कर ऊतकों की पहचान करके बचा जा सकता है.
  11. घावों को बंद करें। एक मोनोफिलामेंट सीवन का उपयोग करके मांसपेशियों की परत और त्वचा को अलग से सीवन करें।
  12. एक और चीरा बनाने के लिए कैंची और बलकाप का उपयोग करें 1 सेमी पार्श्व midline करने के लिए और 1 सेमी पार्श्व दूसरी तरफ लागत पसलियों के लिए. उपरोक्त प्रक्रिया दोहराएँ (1.5 से 1.11)।
  13. पशु संज्ञाहरण से जाग चलो. सर्जरी के बाद पहले दिन चूहे को अलग रखें।
  14. वसूली चरण के दौरान अक्सर पिंजरे को साफ या बदलें।
  15. लगभग 24 ज सर्जरी के बाद, एनाल्जेसिक कार्प्रोफेन के शरीर के वजन को एक और 5 मिलीग्राम/किलोग्राम वजन का प्रशासन करें।

2. हेज़लनट स्प्रेड के माध्यम से 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी का पेरल ल प्रशासन

  1. तिल के तेल में 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी को अच्छी तरह से भंग करें, और फिर तिल के तेल को हेज़लनट स्प्रेड के साथ मिलाएं (सामग्री की तालिकादेखें)। प्रत्येक 30 ग्राम माउस के लिए एक दैनिक भाग में 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी के 15 डिग्री ग्राम, तिल के तेल के 4 डिग्री एल, और 60 मिलीग्राम हेज़लनट फैल होता है। प्रत्येक 30 ग्राम माउस के लिए एक placebo तैयार तिल के तेल के 4 डिग्री एल और 60 मिलीग्राम अखरोट के प्रसार होता है.
    नोट: 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी का दैनिक प्रशासन भाग पिछले अध्ययनों पर आधारित था6,11 और प्रारंभिक प्रयोगों।
  2. OVX के बाद एक सप्ताह, एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के साथ चूहों फ़ीड (1.25% कोलेस्ट्रॉल, 0% cholate) के लिए 12 सप्ताह. इस अध्ययन में प्रयुक्त एक विशिष्ट प्रायोगिक उपचार योजना चित्र 1में दर्शाए गए हैं।
  3. सप्ताह में फैले अखरोट के peroral प्रशासन से पहले 5 दिन, चूहों को प्रशिक्षित करने के लिए लगभग युक्त placebo खाने के लिए 30 मिलीग्राम अखरोट 5 दिनों के लिए 2-5 चूहों के लिए फैल गया. पहले 3 दिनों के दौरान अपने घर पिंजरों में समूहों में चूहों को प्रशिक्षित. चूहों को प्रशिक्षण के चौथे और पांचवें दिन अलग-अलग पिंजरों में रखें और प्रयोगात्मक स्थिति के समान करने के लिए दैनिक भाग की सेवा करें।
  4. पिछले 9 हफ्तों के दौरान, चूहों को अलग-अलग पिंजरों में रखें और फिर हर भोजन के अवसर के लिए एक दैनिक भाग हेज़लनट प्रसार भाग की सेवा करें।
    नोट: OVX/E2 और OVX/PPD समूह में हेज़लनट स्प्रेड के माध्यम से17 डिग्री-एस्ट्राडियोल (0.1 मिलीग्राम-1) या पीपीडी (0.5 मिलीग्राम -1 ) वाले दैनिक भाग की सेवा करें; SHAM और OVX समूह में हार्मोन मुक्त अखरोट फैल युक्त एक दैनिक भाग की सेवा.

3. एक Microultrasound प्रणाली का उपयोग Intima मीडिया मोटाई और कार्डिएक रोग का निर्धारण

  1. अल्ट्रासोनोग्राफिक बायोमाइक्रोस्कोपी
    1. समाप्ति से एक दिन पहले, एक माइक्रोअल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग करके इंटीमा-मीडिया मोटाई और हृदय रोग की जांच करें (सामग्री की तालिकादेखें) जैसा कि पहले 21 वर्णित किया गया था।
    2. परीक्षा से पहले, प्रत्येक माउस को एवर्टिन (ट्राइब्रोमेनोलन) का 200 मिलीग्राम/किलोग्राम इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन संज्ञाहरण (एन $ 8 चूहे प्रति समूह) के रूप में दें।
    3. प्रत्येक माउस की गर्दन बाल सावधानी से दाढ़ी. इष्टतम छवि गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए गर्म अल्ट्रासाउंड ट्रांसमिशन जेल उदारता से लागू करें।
    4. महाधमनी जड़ की आधारभूत अल्ट्रासोनोग्राफिक छवियों को प्राप्त करें और एक 12.7 मिमी फोकस और 40 डिग्री मीटर के एक संकल्प पर 30 मेगाहर्ट्ज स्कैन सिर के साथ आरोही महाधमनी।
    5. निगरानी के लिए एक लीड द्वितीय विन्यास के साथ इलेक्ट्रोकार्डियोग्राफी का उपयोग करें।
    6. सिस्टोल में एक तल में आरोही महाधमनी, महाधमनी चाप और बाचीओसेफेलिक धमनी शाखा के दाहिने पैरास्टेरिनल दीर्घ अक्ष छवियों को कैप्चर करें (चित्र 3)।
  2. इंटीमा-मीडिया और अधिकतम पट्टिका मोटाई के मापन
    1. स्पष्ट छवियों को प्राप्त करने के लिए आसानी से ट्रांसड्यूसर और धमनी साइट के बीच की दूरी को समायोजित करें।
    2. एक छवि विश्लेषण प्रणाली पर ऑफ़लाइन परीक्षा के लिए डिजिटल रूप से एक 10 s cine पाश स्टोर.
    3. आगे माप के लिए मैन्युअल रूप से एक इष्टतम फ्रीज फ्रेम ultrasonographic छवि चुनें. आरोही aorta की मामूली वक्रता में छवियों की जाँच करें. यदि आरोही वावरा में पट्टिका देखी जा सकती है, तो अधिक से अधिक पट्टिका मोटाई मापें। यदि आरोही वाता में पट्टिका नहीं देखी जा सकती है, तो अधिकतम आईएमटी को मापें।
    4. आईएमटी को मापने (संवहनी luminal-intimal इंटरफ़ेस और मध्यस्थ-Adventitial इंटरफ़ेस के बीच दूरी). अधिकतम पट्टिका मोटाई को मापने (संवहनी लुमेन और आगमनात्मक परत की सीमा के बीच सबसे मोटी दूरी)।
    5. तीन घाव साइटों से औसत डेटा (चित्र 3)।
  3. इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग कर हृदय रोग का निर्धारण
    नोट:     एक microultrasound प्रणाली का उपयोग इकोकार्डियोग्राफी के माध्यम से हृदय समारोह की जांच, के रूप में पहलेवर्णित 22.
    1. दिल की ओर एक अल्ट्रासाउंड बीम प्रत्यक्ष, papillary मांसपेशियों के पास.
    2. दो आयामी इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम आधारित किलोहर्ट्ज दृश्य प्राप्त करें।
    3. एक 30 मेगाहर्ट्ज स्कैन सिर का उपयोग कर बाएं निलय के विवो ट्रांसथोरेसिक इकोकार्डियोग्राफी में प्रदर्शन करते हैं।
    4. एम-मोड अनुरेखण से डिजिटल कार्डियक फ़ंक्शन से जुड़े पैरामीटर मापें.
    5. तीन से पांच हृदय चक्रों का औसत डेटा (तालिका 1)।
  4. अंतर-और अंतराobserver परिवर्तनशीलता
    1. इंट्राऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता के सत्यापन के लिए, दो अलग-अलग अवसरों पर एक प्रचालक द्वारा डेटा का विश्लेषण करें।
    2. अंतरा-ऑब्जर्वर परिवर्तनशीलता के मूल्यांकन के लिए, किसी भिन्न प्रचालक द्वारा डेटा का विश्लेषण की जाती है।

4. साप्ताहिक शारीरिक वजन मापन और प्लाज्मा कुल कोलेस्ट्रॉल (टीसी) और Triglyceride (टीजी) निर्धारण

  1. साप्ताहिक शरीर के वजन का माप
    1. सप्ताह -1 से सप्ताह 12 तक सप्ताह में एक बार शरीर के वजन को मापें।
      नोट: n $ 8 चूहों प्रति समूह.
  2. प्लाज्मा तैयारी
    1. इंट्राकार्डिक पंचर के माध्यम से रक्त के नमूने इकट्ठा करने से पहले, सिरिंज और ट्यूब तैयार करें। एक anticoagulant के रूप में EDTA का प्रयोग करें. प्रत्येक 2 एमएल सिरिंज में 0.5 एम EDTA के 10 $L जोड़ें, और प्रत्येक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए 0.5 एम EDTA के 8 $L जोड़ें।
    2. सप्ताह 12 में, एक रात के उपवास के बाद, avertin के साथ चूहों एनेस्थेटाइज (ट्राइब्रोमोएथेनोल; 200 मिलीग्राम/kg; इंट्रापर्टोनली)।
      नोट: n $ 3 समूह प्रति चूहों.
    3. 70% इथेनॉल के साथ अधर छाती क्षेत्र तैयार करें।
    4. वक्ष गुहा खोलने के लिए कैंची और संदंश का प्रयोग करें और पसलियों को तब तक काटें जब तक कि धड़कन दिल उजागर न हो जाए।
    5. 25 जी सुई को दाएं वेंट्रिकल में डालें। जब तक रक्त सिरिंज में प्रवाह शुरू नहीं होता है, तब तक धीरे-धीरे प्रेरित करें।
      नोट: हम 25 जी सुइयों के साथ बाँझ हालत में डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करें (सामग्री की मेजदेखें).
    6. स्थिर, यहां तक कि दबाव के साथ aspirate करने के लिए जारी रखें। यदि कोई रक्त नहीं देखा जाता है, तो सुई की स्थिति और आकांक्षा को दोहराएँ।
    7. आवश्यक रक्त मात्रा इकट्ठा करने से पहले चूहों को गहराई से एनेस्थेटाइज़ रखें। आम तौर पर, 1 एमएल तक रक्त एकत्र किया जा सकता है। इस गहरी संवेदनाहारी स्थिति के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को यूथेनाइज करें।
    8. पिपेट े 1.5 एमएल ट्यूबों में रक्त के नमूने और रक्त में EDTA मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से रक्त पलटना. फिर तुरंत बर्फ पर रक्त के नमूने रखें।
    9. संग्रह के 30 मिनट के भीतर 4 डिग्री सेल्सियस पर 400 x ग्राम पर 20 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज नमूने।
    10. अतिनिशांत को सावधानी से लीजिए। अलीकोट और स्टोर प्लाज्मा नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर।
  3. टीसी या टीजी सामग्री माप के लिए मानक घटता का निर्माण
    1. टीसी मानक वक्र के लिए, कोलेस्ट्रॉल मानकों के विभिन्न सांद्रता तैयार: 0 mmol/L, 0.52 mmol/L, 1.03 mmol/L, 2.07 mmol/L, 4.14 mmol/L, 6.20 mmol/L, 8.27 mmol/L और 10.34 mmol/L. उपाय प्रत्येक कोलेस्ट्रॉल के लिए O.D. प्रत्येक कोलेस्ट्रॉल मानक के लिए औसत O.D. सेट करें। ऊर्ध्वाधर (Y) अक्ष मान के रूप में, क्षैतिज (X) अक्ष मान के रूप में एकाग्रता सेट करें। सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक मानक वक्र बनाएँ.
    2. टीजी मानक वक्र के लिए, टीजी मानकों के विभिन्न सांद्रता तैयार करें: 0 mmol/L, 0.45 mmol/L, 0.90 mmol/L, 1.81 mmol/L, 3.62 mmol/L, 5.42 mmol/L, 7.23 mmol/L और 9.04 mmol/L उपाय O.D. अनुलंब (Y) अक्ष मान के रूप में प्रत्येक TG मानक के लिए औसत O.D. सेट करें; क्षैतिज (X) अक्ष मान के रूप में एकाग्रता सेट करें। सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक मानक वक्र बनाएँ.
      नोट: एक चार पैरामीटर लॉजिस्टिक वक्र फिटिंग (4-pl) वर्तमान अध्ययन में मानक वक्र निर्माण के लिए इस्तेमाल किया गया था. प्लाज्मा नमूनों को मापने से पहले मानक वक्र की जाँच करें और सुनिश्चित करें कि r2 से अधिक है 0.995.
  4. टीसी सामग्री मापन
    1. टीसी परख किट से रंग अभिकर्मक (25 एमएल) की बोतल को "टीसी वर्किंग सोल्यूशन" के रूप में लेबल करें।
    2. फ्रिज में लिए गए नमूनों को संक्षेप में भंवर करें। तनुता की तैयारी की तैयारी की: आसुत जल के 80 डिग्री एल में प्लाज्मा का 20 डिग्री सेल्सियस। संक्षेप में भंवर कमजोर पड़ने.
    3. एक 96 अच्छी तरह से थाली के उपयुक्त कुओं में 2.5 डिग्री कोलेस्ट्रॉल मानकों (5.17 mmol/L) या पतला प्लाज्मा या 2.5 डिग्री सेल्सियस आसुत पानी (रिक्त) के 2.5 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। Triplication की सिफारिश की है.
    4. सभी कुओं के लिए, रंग अभिकर्मक के 250 $L जोड़ें.
    5. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. पर microplate पाठक मुड़ें और एक 10 मिनट गर्म अनुमति देते हैं.
    7. इनक्यूबेटर से प्लेट (एस) निकालें और 510 एनएम पर माइक्रोप्लेट रीडर पढ़ें। सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले या धूल microtiter कुओं में या थाली के तल पर मौजूद हैं, क्रमशः.
    8. टीसी एकाग्रता की गणना निम्नानुसार करें:
      TC cont. [ कोलेस्ट्रॉल मानकों cont. ] (प्लाज्मा नमूना O.D.-blank O.D)/(कोलेस्टेरॉल मानक O.D.-blank O.D)
  5. टीजी सामग्री माप
    1. टीजी परख किट से रंग अभिकर्मक (25 एमएल) की बोतल को "टीजी वर्किंग सोल्यूशन" के रूप में लेबल करें।
    2. फ्रिज में लिए गए नमूनों को संक्षेप में भंवर करें।
    3. 96-वेल प्लेट के उपयुक्त कुओं में 2.5 डिग्री सेल्सियस टीजी मानकों (2.26 एममोल/एल) को या 2.5 डिग्री सेल्सियस पतला प्लाज्मा या 2.5 डिग्री सेल्सियस आसुत जल (रिक्त) को जोड़ें। Triplication की सिफारिश की है.
    4. सभी कुओं के लिए, रंग अभिकर्मक के 250 $L जोड़ें.
    5. 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    6. पर microplate पाठक मुड़ें और एक 10 मिनट गर्म अनुमति देते हैं.
    7. इनक्यूबेटर से प्लेट (एस) निकालें और 510 एनएम पर माइक्रोप्लेट रीडर पढ़ें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले या धूल microtiter कुओं में या थाली के तल पर मौजूद हैं.
    8. निम्नानुसार टीजी एकाग्रता की गणना करें:
      TG cont. [ TG मानक cont. ] (प्लाज्मा नमूना O.D.-blank O.D)/(TG मानक O.D.-blank O.D)

5. महाधमनी एथेरोस्क्लेरोटिक लेसिस का एन फेस विश्लेषण

  1. Aorta अलगाव और चीरा
    1. सप्ताह 12 में, एक रात के उपवास के बाद, avertin के साथ चूहों एनेस्थेटाइज (ट्राइब्रोमोएथेनोल; 200 मिलीग्राम/kg; इंट्रापर्टोनली)। इस गहरी संवेदनाहारी स्थिति के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को यूथेनाइज करें।
      नोट: हम प्रति समूह 3 चूहों का इस्तेमाल किया.
    2. 70% इथेनॉल के साथ अधर छाती क्षेत्र तैयार करें। वक्ष गुहा खोलने के लिए कैंची और संदंश का प्रयोग करें और पसलियों को तब तक काटें जब तक कि धड़कन दिल उजागर न हो जाए।
    3. पीएच 7.4 पर फॉस्फेट बफर नमकीन के साथ एक 50 एमएल सिरिंज भरें (सामग्री की तालिकादेखें )। बाएं वेंट्रिकल में सुई का 25 ग्राम डालें और भ्रम से उच्च दबाव से बचने के लिए दाएं एट्रियम को काटें।
    4. ऊतकों के साथ अवशोषण भ्रम तरल पदार्थ 0.05-0.08 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर situ perfusion में प्रदर्शन करें।
    5. कैंची और संदंश के साथ वक्ष गुहा में पसलियों और फेफड़ों को निकालें। फिर, पेट की गुहा खोलें और वार्ता के बेहतर दृश्य के लिए अंदर के अंगों को हटा दें।
    6. माइक्रोफोर्स के साथ दिल को पकड़े हुए और श्रोणि विभाजन तक माइक्रोस्सी से डोर्सली के साथ रीढ़ की हड्डी से ओर्टा को अलग करके माओटा को निकालें।
      नोट: गुर्दे एट्रियल शाखाओं के पास विच्छेदन करते समय, आरोटा क्षति से बचने के लिए माइक्रोस्क्यूर्स का उपयोग करके गहराई से काट लें।
    7. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में 48 एच के लिए दिल और वारोटा को ठीक करें। कमरे के तापमान पर या कुछ घंटों के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर नमकीन में aortas स्टोर।
      नोट: इस प्रक्रिया से सफाई में सुविधा होगी।
  2. ओर्टा की तैयारी
    1. दिल को हटा दें. ध्यान से एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत microforceps और microscisssors का उपयोग कर aortas से adventitial ऊतकों को हटा दें। सफाई के दौरान ऊतक को नम रखने के लिए नमक का प्रयोग करें।
      नोट: सावधान रहें कि महाधमनी और कुछ महत्वपूर्ण शाखाओं को फाड़या या न निक करें, जैसे कि इननॉट धमनी, सामान्य ग्रीवा धमनी छोड़ दी गई, और छोड़ दिया गया सबक्लेवियन धमनी।
    2. 1 मिमी अनाकलन और छोड़ दिया आम ग्रीवा धमनियों छोड़ दो और पूरे बाएँ subclavian धमनी काट दिया.
    3. कट innominate धमनी के माध्यम से बाहरी वक्रता खुला, फिर बाईं आम ग्रीवा धमनी के लिए, और फिर बाईं subclavian धमनी के लिए.
    4. उदर भाग के नीचे आरोही भाग की आंतरिक वक्रता के साथ खुला कट।
    5. एक काले प्लास्टिक की चादर पर aorta फ्लैट पिन और सुखाने से aortas रखने के लिए नमकीन लागू होते हैं।
  3. ओर्टा के आंत क्षेत्र की छवि
    1. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के साथ एन चेहरा aortas की तस्वीरें ले लो. माप जांचना करने के लिए छवियों में एक मिलीमीटर पैमाने पर शासक शामिल करें।
    2. एक ही छवि में मेहराब और वक्ष क्षेत्रों और दूसरे में पेट क्षेत्र शामिल करें. छवियों को JPEG या TIFF के रूप में सहेजें.
      नोट: चाप क्षेत्र मायोकार्डियम के जंक्शन से 3 मिमी दूर बाएं सबक्लेवीधमनी धमनी से है, थोरैसिक क्षेत्र अंतिम इंटरकोस्टल धमनी के लिए बाएं उपक्लेव धमनी के लिए 3 मिमी डिटेल है, और पेट क्षेत्र iliac करने के लिए अंतिम इंटरकोस्टल धमनी है द्विशाखन.
  4. एथेरोस्क्लेरोटिक घाव-एन फेस विधि का परिमाणीकरण
    1. अंशांकन
      1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ छवि खोलें (सामग्री की तालिकादेखें), स्थानिक अंशांकन के लिए जाना है और निर्देशों का पालन करें.
      2. पंक्ति पर मापनी को स्थित करके संदर्भ इकाइयों को मिमी में परिवर्तित करें.
    2. माप
      1. प्रत्येक छवि के लिए सही अंशांकन सेट करें।
      2. शासक पर 3 मिमी उपाय.
      3. आर्क और वक्ष क्षेत्र माप: मायोकार्डियम के जंक्शन से 3 मिमी डिस्टल तक के चाप क्षेत्र को बाएं सबक्लेवियन धमनी और वक्ष क्षेत्र से 3 मिमी दूर से बाएं सबक्लेवीन धमनी को अंतिम इंटरकोस्टल धमनी तक रेखांकित करें। मेहराब और वक्ष क्षेत्र में घावों का पता लगाने और माइक्रोस्कोप के माध्यम से aorta को देखो.
      4. पेट क्षेत्र माप: वक्ष क्षेत्र के अंत से श्रोणि विभाजन के लिए पेट क्षेत्र रूपरेखा. पेट क्षेत्र में घावों का पता लगाने और माइक्रोस्कोप के माध्यम से aorta को देखो.
      5. माओत्से की भीतरी सतह के सापेक्ष घाव क्षेत्र की गणना कीजिए।
      6. अध्ययन समूहों के लिए अंधा है, जो एक दूसरे पर्यवेक्षक के माध्यम से परिमाणीकरण सत्यापित करें।

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Representative Results

इस अध्ययन में प्रयुक्त एक विशिष्ट प्रायोगिक उपचार योजना चित्र 1में दर्शाए गए हैं। weaning में (आयु 28 दिन), महिला apoE-/- C57BL/6J चूहों aesthetized के साथ एनेस्थेटाइजकिया गया (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). चूहे द्विपक्षीय OVX या शर्म एक 1 सेमी पृष्ठीय चीरा के माध्यम से संचालित किया गया. द्विपक्षीय OVX के बाद एक सप्ताह, चूहों एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार खिलाया गया (1.25% कोलेस्ट्रॉल, 0% cholate) के लिए 12 सप्ताह. 17 डिग्री-एस्टेरिल (0.1 मिलीग्रामकिलो -1) या पीपीडी (0.5 मिलीग्राम-1) उपचार के अंतिम 9 सप्ताह के दौरान हेज़लनट स्प्रेड के माध्यम से समानांतर रूप से प्रशासित किया गया था। सभी चूहों साप्ताहिक तौला गया. चित्रा 2में दिखाया गया है के रूप में , दोनों exogenous एस्ट्रोजेन के प्रभाव (17"-एस्ट्राडियोल और पीपीडी) प्लाज्मा लिपिड और apoE के साप्ताहिक शरीर के वजन पर- / एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के 12 सप्ताह के बाद, OVX चूहों प्लाज्मा टीसी और टीजी सांद्रता में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाई. OVX चूहों perorally के साथ प्रशासित 17 "एस्ट्राडियोल या पीपीडी के माध्यम से हेज़लनट प्रसार शम संचालित चूहों की तुलना में काफी कम प्लाज्मा टीसी सांद्रता का प्रदर्शन किया (चित्र 2A). प्लाज्मा टीजी के स्तर में OVX चूहों perorally 17 "एस्ट्राडियोल के साथ प्रशासित लेकिन पीपीडी के साथ नहीं में कमी आई (चित्र 2B) . के रूप में चित्र ादोलना 2Cमें दिखाया गया है , जबकि शरीर के वजन में वृद्धि की ओर एक प्रवृत्ति (BW) OVX चूहों में शम संचालित चूहों के साथ तुलना में मनाया गया था, OVX चूहों में BW perorally के साथ प्रशासित 17"-estradiol या पीपीडी के माध्यम से एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के बाद अखरोट फैल OVX चूहों में विपरीत एक प्रवृत्ति दिखाई. हालांकि, विभिन्न समूहों में चूहों के अंतिम शरीर के वजन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखाया.

हृदय समारोह इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था. जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, आरोही आरोही आरोढ़ की अधिकतम पट्टिका या आईएमटी को ओवीएक्स चूहों में मापा गया था, जिसे हेज़लनट स्प्रेड के माध्यम से 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी के साथ प्रशासित किया गया था। बी-मोड इकोकार्डियोग्राफी द्वारा उच्च कोलेस्ट्रॉल-डाइट-फेड एपो-/ आरोही आरोटा के प्रतिनिधि अनुदैर्घ्य छवियों ultrasonographic biomicroscopy द्वारा कब्जा कर लिया गया. लाल तीर प्लेक को इंगित करते हैं। OVX चूहों ने शम-संचालित चूहों की तुलना में आरोही आरोटा की बढ़ी हुई अधिक से अधिक पट्टिका या आईएमटी का प्रदर्शन किया। हेज़लनट स्प्रेड के माध्यम से 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी के peroral प्रशासन के बाद, बढ़ते ओर्टा की अधिकतम पट्टिका या आईएमटी में OVX चूहों की तुलना में उल्लेखनीय कमी आई है। (चित्र 3)। हमने ओवीई में OVX के जवाब में कार्डियक डिसहिक्षकको 12 सप्ताह के उच्च कोलेस्ट्रोल आहार भोजन (तालिका 1) के बाद चूहों को भी देखा। इकोकार्डियोग्राफी के माध्यम से कार्डिएक समारोह की जांच की गई। OVX चूहों में, हेज़लनट प्रसार के माध्यम से 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी के peroral प्रशासन आंशिक रूप से हृदय रोग दिखा मानकों को कम कर सकता है।

इसके बाद, हमने महाधमनी एथेरोस्क्लेरोटिक घावों को निर्धारित करने के लिए एन फेस विश्लेषण का उपयोग किया। जैसा कि पहले बताया गया है, 12 सप्ताह के बाद, एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार महाराटा की चमकदार सतह पर atherosclerotic पट्टिका गठन के लिए नेतृत्व किया. जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है , ओवीएक्स चूहों में पूरे महाधमनी क्षेत्र के सापेक्ष महाधमनी घाव क्षेत्र का औसत प्रतिशत काफी बढ़ गया है। अखरोट प्रसार के माध्यम से 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी के साथ peroral प्रशासन के बाद, महाधमनी घाव क्षेत्र उल्लेखनीय OVX चूहों समकक्ष की तुलना में कमी आई। यह परिणाम चित्र 3में प्रस्तुत एथेरोस्क्लेरोसिस के विकास से 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल या पीपीडी के संरक्षण के अनुरूप है।

अंत में, प्रस्तावित प्रक्रिया, जो एक डबल पृष्ठीय-पक्षीय चीरा के माध्यम से द्विपक्षीय अंडाशय उच्छेदन का उपयोग करता है- चूहों, रजोनिवृत्ति के बाद हृदय रोग के noninvasive exogenous एस्ट्रोजन उपचार स्क्रीनिंग के लिए लागू है. यह भी हानिकारक tumorigenetic क्षमता से बचने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है.

Figure 1
चित्र 1. माउस उपचार योजना. weaning में (आयु, 28 दिन), महिला apoE-/- C57BL/6J चूहों avertin के साथ एनेस्थेटाइजकिया गया (tribromoethanol; 200 mg/kg; intraperitoneally). चूहे द्विपक्षीय रूप से ovariectomized (OVX) या एक 1 सेमी पृष्ठीय चीरा के माध्यम से संचालित शर्म थे. OVX के बाद एक सप्ताह, चूहों एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार खिलाया गया (1.25% कोलेस्ट्रॉल, 0% cholate) के लिए 12 सप्ताह. 17 डिग्री-एस्टेरिल (0.1 मिलीग्रामकिलो -1) या पीपीडी (0.5 मिलीग्राम-1) उपचार के अंतिम 9 सप्ताह के दौरान हेज़लनट स्प्रेड के माध्यम से समानांतर रूप से प्रशासित किया गया था। सभी चूहों हर हफ्ते तौला गया. 12 सप्ताह में, हृदय समारोह विश्लेषण इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था. एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के 12 सप्ताह के बाद, सभी चूहों ethanized थे, और रक्त के नमूने और ऊतकों आगे की जांच के लिए काटा गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. प्लाज्मा लिपिड और apoE में साप्ताहिक शरीर के वजन पर विभिन्न exogenous एस्ट्रोजेन के प्रभाव-/ शाम चूहों एक नकली ऑपरेशन किया और एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार प्राप्त किया. OVX चूहों द्विपक्षीय अंडाशय उच्छेदन लिया और फिर बेतरतीब ढंग से निम्नलिखित समूहों में विभाजित: OVX समूह, जो एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार के साथ इलाज किया गया था; OVX/E2 (17 डिग्री-एस्ट्राडियोल) समूह, जो 12 सप्ताह के लिए एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार प्राप्त किया प्लस 0.1 मिलीग्राम /kg E2 उपचार के पिछले 9 सप्ताह के लिए फैल अखरोट के माध्यम से peroral प्रशासन के माध्यम से; और OVX/PPD समूह, जो 12 सप्ताह के लिए एक उच्च कोलेस्ट्रॉल आहार प्राप्त प्लस 0.5 मिलीग्राम / किलो PPD उपचार के पिछले 9 सप्ताह के लिए अखरोट प्रसार के माध्यम से peroral प्रशासन के माध्यम से. प्लाज्मा के कुल कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड के स्तर एंजाइमी तरीकों(ए-बी)के माध्यम से मापा गया था। डेटा को इस प्रकार व्यक्त किया जाता है - प्रति समूह द के SEM $ 5 चूहे। साप्ताहिक शरीर के वजन को सप्ताह -1 से 12 सप्ताह (सी) मापा गया . डेटा को प्रति समूह द के SEM - 8 चूहों के साधन के रूप में व्यक्त किया जाता है। एक तरह से ANOVA Dunnett के बाद तदर्थ परीक्षण के बाद कई तुलना के लिए आयोजित किया गया था. *पी और 0.05 शर्म समूह के साथ तुलना में; # OVX समूह की तुलना में p;lt; 0.05. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. IMT या अधिकतम पट्टिका मोटाई माप apoEमें -/- चूहों. बी-मोड छवियों apoE के महाधमनी चाप दिखा-/- चूहों प्रस्तुत कर रहे हैं. आरोही आरोटा की अनुदैर्घ्य छवियों ultrasonographic biomicroscopy द्वारा प्राप्त किया गया. आरोही आरोटा (मिमी) की अधिकतम पट्टिका या आईएमटी को मापा गया था। अल्ट्रासोग्राफिक छवियों आरोही aorta की मामूली वक्रता में पट्टिका दिखाने; लाल तीर प्लेक को इंगित करते हैं। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है - प्रति समूह द के SEM $ 8 चूहे। एक तरह से ANOVA Dunnett के बाद तदर्थ परीक्षण के बाद कई तुलना के लिए आयोजित किया गया था. *पी और 0.05 शर्म समूह के साथ तुलना में; # OVX समूह की तुलना में p;lt; 0.05. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. एपोई में महाधमनी एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का विश्लेषण-/- चूहों का सामना करना। सभी समूहों में संपूर्ण महाधमनी क्षेत्र के सापेक्ष महाधमनी घाव क्षेत्र का औसत प्रतिशत निर्धारित किया गया था। आवरा के अंतर्मुख घावों (चेहरे का चेहरा) के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ दिखाए जाते हैं। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है - प्रति समूह द 3 चूहों का SEM। एक तरह से ANOVA Dunnett के बाद तदर्थ परीक्षण के बाद कई तुलना के लिए आयोजित किया गया था. *पी और 0.05 शर्म समूह के साथ तुलना में; # OVX समूह की तुलना में पी एंड 0.05. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नकली OVX OVX/E2 ओवीएक्स/पीपीडी
LVIDd (मिमी) 3.72 ] 0.10 3.74 $ 0. 24 3.68 ] 0.16 3.88 ] 0.16
एलवीआईडी (मिमी) 2.34 ] 0.11 २.१.१९९ २.२२ २.१२ ] 0.13 2.55 [ 0.12]
आईवीएसडी (मिमी) 0.83 ] 0.09 0.84 ] 0.07 0.91 ] 0.05 0.74 [ 0.06]
आईवीएसएस (मिमी) १.२९ ] 0.02 1.35 $ 0.06* 1.45 [ 0.04] १.०९[ ०.०९]
PWTd (मिमी) 0.7] 0.10 0.68 ] 0.04 0.72 ] 0.07 0.58 [ 0.07]
PWTs (मिमी) १.१०] 0.12 १.१.१९ ९००.०९ १.२९ ] 0.04 0.98 [ 0.08]
ईडीवी (मिमी3) 58.89 ] 3.74 59.88 ] 9.02 57.39 ] 5.79 65.11 ] 6.13
ESV (मिमी3) 18.86 ] 2.17 15.75 ] 4.00 14.85 ] 2.37 23.45 [ 2.64]
EF (%) 67.84 ] 1.52 73.91 $3 .63* 74.23 ] 1.50 63.91 [ 3.61]
एफएस (%) 37.19 ] 1.53 42.22 ] 1.17* 42.36 ] 1.21 34.28 [ 2.69]
LVIDd - diastole के दौरान LV आंतरिक व्यास; LVIDs - lv आंतरिक व्यास systole के दौरान; आईवीएसडी - डायस्टोल के दौरान आंतरिक वेंट्रिकुलर पट; आईवीएस ] सिस्टोल के दौरान आंतरिक वेंट्रिकुलर पट; PWTd - diastole के दौरान पीछे दीवार मोटाई; PWTs - पीछे दीवार मोटाई systole के दौरान; EF [ निष्कासन भिन्न; FS ] आंशिक लघुन; EDV ] अंत-डायस्टोलिक मात्रा; ESV - अंत-systolic मात्रा.

तालिका 1: इकोकार्डियोग्राफी का उपयोग करके कार्डिएक समारोह मूल्यांकन। एम-मोड अनुरेखण से डिजिटल रूप से कार्डियक फ़ंक्शन से जुड़े पैरामीटर ों को सभी समूहों में मात्रा निर्धारित किया गया था। डेटा को माध्य के रूप में व्यक्त किया जाता है - प्रति समूह द के SEM $ 8 चूहे। एक तरह से ANOVA Dunnett के बाद तदर्थ परीक्षण के बाद कई तुलना के लिए आयोजित किया गया था. *पी और 0.05 शर्म समूह के साथ तुलना में; # OVX समूह की तुलना में p;lt; 0.05.

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Discussion

यहाँ वर्णित पद्धति लिपिड व्यवधान और atherosclerosis रजोनिवृत्ति महिलाओं में देखा जैसा एक माउस मॉडल है. यह अच्छी तरह से प्रलेखित है कि रजोनिवृत्ति उपरांत महिलाओं में एस्ट्रोजन की कमी उत्तरोत्तर जटिल और व्यापक एथेरोस्क्लेरोस्टिक घावों1के साथ पूर्व-मौजूदा या चल रहे हाइपरकोलेस्टेरॉलेमिया की घटनाओं को बढ़ा सकती है। क्लिनिक में एथेरोस्क्लेरोसिस-प्रवण स्थिति की नकल करने के लिए, एपो-कम-कम चूहे, जानवरों के एक पुनरुत्पादक और सुविधाजनक स्रोत, जिसके साथ एथेरोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए23,24,25, लागू किए गए थे। जैसा कि वर्तमान अध्ययन में दिखाया गया है, मादा OVX apoE-/- चूहों weaning में महिला apoE के साथ तुलना में atherosclerotic घावों में वृद्धि प्रदर्शित- / इस पशु मॉडल में, हम भी एक नियंत्रित आहार हालत के तहत atherosclerotic घाव आकार पर विभिन्न exogenous एस्ट्रोजन प्रतिस्थापन उपचार के प्रभाव की तुलना में.

इस लेख में प्रस्तुत द्विपक्षीय अंडाशय के द्विपृष्ठीय चीरा तकनीकी रूप से आसान है, कम समय लगता है, और सुरक्षित मध्य पृष्ठीय-पक्षीय चीरा या द्विपक्षीय अंडाशय के मध्य पेट चीरा के साथ तुलना में apoEमें / चूहों. मध्य पेट चीरा के माध्यम से द्विपक्षीय अंडाशय उच्छेदन एक प्रमुख दोष प्रस्तुत करता है: यह गंभीर पेट गुहा आसंजन का कारण बन सकता है, जो, बदले में, दवा के अवशोषण को प्रभावित कर सकता है। हाल की रिपोर्टों से पता चलता है कि कम खुराक के peroral प्रशासन 17 "एस्टरेडियोल मस्तिष्क इस्किमिया26के खिलाफ की रक्षा करता है. इस प्रकार, हम वर्तमान अध्ययन में अखरोट प्रसार के माध्यम से peroral प्रशासन का चयन किया. वाणिज्यिक धीमी गति से जारी छर्रों एक माउस मॉडल में औषधीय प्रभाव के परीक्षण के लिए एक बार बार इस्तेमाल किया प्रशासन मोड रहे हैं, लेकिन हानिकारक मस्तिष्क क्षति के कारण हो सकता है27. प्रत्यारोपण संक्रमण से ग्रस्त हैं, खासकर अगर चूहों एक डबल पृष्ठीय पार्श्व चीरा के माध्यम से द्विपक्षीय OVX के अधीन हैं. हालांकि चीरा से पहले त्वचा का सावधान कीटाणुशोधन किया जाता है, संक्रमण से बचने के लिए मुश्किल है। जल प्रशासन और मौखिक gavage दो कम बार इस्तेमाल किया तरीकों है कि परीक्षण किया गया है. पीने के पानी के माध्यम से हार्मोन प्रशासन अत्यधिक इसके अत्यंत noninvasive होने के कारण फायदेमंद है क्योंकि लगभग कोई पशु हैंडलिंग की आवश्यकता है. हालांकि, 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल एक पायसीकारक के बिना पानी में घुलनशील नहीं है। इस प्रकार, हम पीने के पानी में इसके समाधान की सुविधा के लिए कम से कम 0.5% की एकाग्रता पर DMSO इस्तेमाल किया. हालांकि, कम खुराक DMSO की लंबी अवधि के प्रशासन के लिए इस दृष्टिकोण को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है और चूहों या मनुष्यों के लिए विषाक्त. चूहे भी निगरानी के पूरे 24 एच पर पानी पी सकते हैं, जो वास्तविक दवा की खपत को निर्धारित करने के लिए मुश्किल बना देता है. इस दृष्टिकोण का एक और नुकसान यह है कि व्यक्ति के पानी का सेवन को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है. मौखिक gavage का सबसे बड़ा नुकसान यह है कि यह जानवरों के लिए तनावपूर्ण है और esophageal चोट का कारण हो सकता है और खाने के व्यवहार को प्रभावित. यहाँ वर्णित पद्धति में, प्रयोग से पहले हार्मोन मुक्त अखरोट के प्रसार के खाने का 5 दिवसीय प्रशिक्षण आयोजित किया गया था। लगभग अधिक से अधिक 95% चूहों अखरोट प्रसार स्वीकार करेंगे अगर क्या प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख के रूप में प्रशिक्षित किया जा रहा है. एक बार पूरी तरह से आदत है, चूहों के अधिकांश सेकंड के भीतर यह उपभोग करेगा. एक पिछले अध्ययन के साथ संगत6,11, प्लाज्मा E2 स्तर OVX चूहों में कमी आई सप्ताह में शर्म से संचालित समकक्ष के साथ तुलना में 4 (डेटा नहीं दिखाया). दृढ़ संकल्प के बाद 12 सप्ताह में, हमने OVX संचालित चूहों में गर्भाशय शोष देखा। तथापि, वर्तमान अध्ययन में ओवीएक्स के बाद घूम रहे एस्ट्रोजन के स्तर की निगरानी नहीं की गई थी।

आरोही महाधमनी में एथेरोस्क्लेरोटिक घावों का पता लगाने के अभाव में, महाधमनी आईएमटी का मूल्यांकन लुमेन-इंटीमल इंटरफेस और मध्य-एडवांटेजियल इंटरफ़ेस के बीच की दूरी को मापने के माध्यम से किया जा सकता है। यह माप मानव28में पहले से मान्य प्रोटोकॉल पर आधारित है. तीन साइटों का औसत डेटा जो एक-दूसरे से लगभग 100 डिग्री सेल्सियस अलग हैं. ओवीई में OVX के बाद कार्डियक वर्कलोड बढ़ता है-- चूहे व्यक्तिगत कार्डियोमायोसाइट्स के प्रतिपूरक हाइपरट्रॉफिक वृद्धि के कारण हो सकते हैं जिससे अंततः हृदय उत्पादन में वृद्धि हो सकती है (तालिका 1)। जबकि, 9 सप्ताह के लिए पीपीडी के peroral प्रशासन पर, प्रतिपूरक हृदय अतिवृद्धि एक EF% के साथ क्षीण किया गया था शर्म समकक्ष के बराबर. अंतर- या अंतर-observer परिवर्तनशीलता के सत्यापन के लिए, दो अलग अलग अवसरों पर या एक अलग ऑपरेटर द्वारा एक ऑपरेटर द्वारा हृदय समारोह के साथ जुड़े atherosclerotic मोटाई माप और पैरामीटर के लिए भिन्नता के गुणांक का विश्लेषण.

हमारे अध्ययन में प्रस्तुत के रूप में, OVX चूहों perorally के साथ प्रशासित 17 "एस्ट्रोऑल या पीपीडी के माध्यम से अखरोट प्रसार शरीर के वजन को रोकने के लिए और एस्ट्रोजन की कमी से जुड़े लिपिड व्यवधान को कम करने के लिए प्रवृत्त, हालांकि अंतिम शरीर के वजन में कोई महत्वपूर्ण अंतर थे मनाया. पिछले अध्ययनों से यह भी पता चला है कि लिपिड पैरामीटर भिन्नता हार्मोन के एंटीएथेरोस्क्लेरोटिक प्रभावों को समझाने के लिए बहुत कम हो सकती है29. एस्ट्रोजन के लाभकारी प्रभाव लिपिड प्रोटीन गुणों में परिवर्तन करने के लिए सीमित नहीं हैं. एस्ट्रोजन के कुछ nonlipid प्रभाव30,31, जैसे सूजन, endothelial रोग, और हेमोडायनामिक स्टेसिस, मानव रोग में हृदय सुरक्षा की सुविधा कर सकते हैं. वर्तमान अध्ययन में देखे गए परिणामों को ध्यान में रखते हुए, एथेरोस्क्लेरोसिस विकास से exogenous एस्ट्रोजन की सुरक्षा प्रणालीगत लिपिड स्तर से आंशिक रूप से स्वतंत्र है। एंडोथेलियल कोशिकाओं में, पीपीडी आसंजन अणु और भड़काऊ मध्यस्थों (डेटा नहीं दिखाया गया) की अभिव्यक्ति को बाधित करता है। इसके अलावा, पीपीडी पेरिवास्कुलर वसा निर्माण को दबा सकता है जो एंडोथेलियल विरोधी अनुबंधता के साथ निकटता से संबंधित है। इस प्रकार, पीपीडी और 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल की कार्रवाई अलग थी और अंतर्निहित तंत्र का और पता लगाया जाना है। निस्संदेह, ऊर्जा से भरपूर भोजन की अत्यधिक खपत, जैसे हेज़लनट स्प्रेड, वजन बढ़ा सकता है। तथापि, वर्तमान अध्ययन में उल्लिखित अखरोट के प्रसार (200 मिलीग्राम-1दिन-1)की छोटी मात्रा केवल पशुओं के दैनिक ऊर्जा सेवन के 5% से कम के लिए जिम्मेदार हो सकती है। इसके अलावा, अखरोट के प्रसार की इस मात्रा का उपयोग करके कोई स्पष्ट वजन का पता लगाया गया था। 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल और पीपीडी का उपयोग मुख्य रूप से हृदय रोग के उपचार के लिए था। क्योंकि, OVX में atherosclerosis की प्रगति के दौरान संचालित aopE-/- चूहों, सप्ताह 4 से सप्ताह 12, 17-एस्ट्राडियोल या पीपीडी perorally प्रशासित किया गया था.

एचआरटी के नैदानिक उपयोग का एक गैर-अनिवार्य बिंदु इसके हानिकारक दुष्प्रभाव हैं, जिसमें डिम्बग्रंथि और स्तन कैंसर13,14शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन में परीक्षण phytoestrogen एक स्टेरॉयड saponin यौगिक Dioscorea पौधों में पाया जाता है. बताया गया है कि पीपीडी का कैंसर कोशिका की कुछ लाइनों पर निरोधात्मक प्रभावपड़ाहै . इसके अलावा, पीपीडी एंटीएथेरोस्क्लेरोटिक गुणों को 17 डिग्री-एस्ट्राडियोल के साथ तुलनीय दिखाता है। मॉडल हम यहाँ मौजूद स्क्रीन संभावित उम्मीदवार यौगिकों में मदद कर सकते हैं, phytoestrogen सहित, जो ट्यूमर प्रसार पर एक न्यूनतम प्रभाव डालती.

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81202526 से J.X.), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81302769 से B.S.), बीजिंग नगर प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (47144226 से B.S.), चीनी Postdoctoral द्वारा समर्थित किया गया था विज्ञान फाउंडेशन (20110490325 से J.X.), और पीएच.डी. कार्यक्रम चीन के शिक्षा मंत्रालय के फाउंडेशन (20121106120031 से बी.एस.) के लिए.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
17β-estradiol, >98% Sigma-Aldrich E8875-250MG Estrogen
Disposable syringes (with 25 G needles) Hunan Luzhou Huikang Development Co., Ltd 0.5*19TWLB Cardiac bleeding
High-cholesterol mouse diet Huafukang Bio-Technology N/A 1.25% cholesterol, 0% cholate
High-Resolution In Vivo Micro-Imaging System VisualSonics Vevo®770 Measurements of intima-media thickness and cardiac dysfunction
2-Methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463-250ML Preparation of avertin
Micro Dissecting forceps, Curved 8mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting forceps, Straight 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Curved/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Micro Dissecting Scissors, Straight/Sharp 8 mm Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Monofilament suture 4-0 1/2 5 x 12 19 mm Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., Ltd R413 Suture and ligation of the tissues
Nut cream (Nutella) Ferrero N/A Medium for peroral 17β-estradiol or PPD
OptiVisor optical glass binocular magnifier Dohegan Optical Company Inc. N/A Assistant of identifying the tissues during ovariectomy
Phosphate-buffered saline at pH 7.4 SIGMA P3813 Preparing 1 L saline
Pro MultiLabel Microplate Reader Tecan Infinite M1000 Plasma TC and TG determination
Pseudoprotodioscin Shanghai Winherb Medical S & T Development W-0427 CAS registry no. 102115-79-7
Rimadyl, 50 mg/mL Pfizer Pharma GmbH 462986 Postoperative analgesia after ovariectomy
Sesame oil Sigma-Aldrich S3547-1L Dissolving the 17β-estradiol or PPD
Solcoseryl Eye-Gel Menarini, Solco Basle Ltd. Eye protection during anesthesia
Stereo microscope MCALON MCL-6STV Image of the intimal region of aorta
Table model high speed centrifuge SIGMA 1-14K Preparation of plasma
Scissors, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Scissors, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, slight Curve (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tissue forceps, serrated, straight Flat (14 cm) Kanghua Medical Equipment Co., Ltd Surgical tools
Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-5G Preparation of avertin
Triglycerides (TG) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A110-1 Plasma TG determination
Total cholesterols (TC) assay kit Institute of Nanjing Jiancheng Biology Engineering A111-1 Plasma TC determination

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References

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Sun, B., Yin, Y. z., Xiao, J. An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause. J. Vis. Exp. (150), e59536, doi:10.3791/59536 (2019).

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