Den senaste epidemi av zikavirus belyser vikten av att etablera omvända genetiska metoder för att utveckla vacciner och/eller terapeutiska strategier. Här beskriver vi protokollet för att rädda ett infektiöst rekombinant zikavirus från en fullängds cDNA-klon som samlats i en bakterie konstgjord kromosom under kontroll av det humana cytomegalovirusets omedelbara-tidiga promotor.
Association of zika virus (ZIKV) infektion med neurologiska komplikationer under det senaste världsomspännande utbrottet och avsaknaden av godkända vacciner och/eller antivirala läkemedel har underskattat det akuta behovet av att utveckla ZIKV omvända genetiska system för att underlätta studie av ZIKV biologi och utvecklingen av terapeutiska och/eller profylaktiska metoder. Men liksom med andra flavivirus, generationen av ZIKV fullängds infektiösa cDNA kloner har hämmats på grund av toxiciteten av virala sekvenser under dess amplifiering i bakterier. För att övervinna detta problem har vi utvecklat en icke-traditionell strategi som bygger på användning av bakteriella konstgjorda kromosomer (BACs). Med detta tillvägagångssätt genereras den fullängds cDNA-kopian av ZIKV-stammen Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) från fyra syntetiska DNA-fragment och monteras i en enda kopia pBeloBAC11 plasmid under kontroll av humant cytomegalovirus (CMV) omedelbar-tidigt promotor. Den sammansatta BAC cDNA klon är stabil under förökning i bakterier, och infektiösa rekombinant (r) ZIKV återvinns i Vero celler efter transfektion av BAC cDNA klon. Det protokoll som beskrivs här ger en kraftfull teknik för generering av infektiösa kloner av flavivirus, inklusive ZIKV, och andra positiva-strand RNA-virus, särskilt de med stora genom som har stabilitetsproblem under bakteriell förökning.
ZIKV är en mygg buren medlem av flavivirus släkte inom familjen Flaviviridae som för närvarande utgör en global folkhälsokris1. Liksom andra flavivirus, ZIKV är en höljeförsedda RNA-virus med en icosahedral-liknande struktur som innehåller en positiv känsla, enkelsträngad RNA-molekyl på ca 10,8 KB (figur 1)2. Den virala arvsmassan kodar en stor polyprotein av cirka 3 423 aminosyror som bearbetas av virala och cellulära proteaser i tre strukturella proteiner (Capsid [C], premembran/membran [prM/M], och kuvert [E]) som är involverade i bildandet av virala partiklar och sju icke-strukturella (NS) proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B och NS5) som deltar i genomreplikering, virus sammansättning och undvikande av värdens immunsvar (figur 1)3.
Historiskt har zikv-infektion förknippats med en mild febril sjukdom4,5. Men den explosiva senaste pandemin av zikv infektioner i hela Syd-och Central Amerika, södra Stilla havet, och Västindien6,7,8, och dess samband med förekomsten av Guillain-Barrés syndrom och mikrocefali9,10,11,12,13, har förändrat den historiska uppfattningen och potentierade relevansen av zikv som en viktig mänsklig patogen. I denna mening kommer utvecklingen av molekylära verktyg, såsom infektiösa cDNA-kloner, att underlätta studiet av viral patogenes och utvecklingen av genetiskt definierade vacciner och identifieringen av antivirala läkemedel för behandling av ZIKV-infektion. Som beskrivits för andra flavivirus, är generering av ZIKV infektiösa kloner svårt på grund av förekomsten av kryptiska bakteriella initiativtagare i viral Genome14 som gör att läckande uttryck av giftiga virala proteiner under spridningen av cDNA kloner i bakterier med hjälp av standard hög-kopia-nummer plasmider15,16,17. För att övervinna denna toxicitet problem, flera icke-traditionella metoder har genomförts framgångsrikt under de senaste två åren18. Dessa inkluderar användning av låg-Copy-nummer plasmider19,20, införandet av introner att störa de giftiga regionerna21,22,23, in vitro-ligering av cDNA fragment 24 , 25, Mutations ljuddämpnings av kryptiska bakteriella initiativtagare närvarande i viral Genome26,27, infektiösa subgenomic amplikonerna (ISA)28,29, den Gibson monteringsmetod30 , och användningen av cirkulär polymerasförlängning reaktion (CPER)31.
Häri beskriver vi detaljerade protokoll för konstruktion av en fullängds cDNA klon av ZIKV stam ZIKV-RGN13, med hjälp av en BAC att övervinna toxicitet problemet, och räddning av infektiösa rZIKV genom direkt överföring av BAC cDNA klon till Vero celler32, en cellinjer som godkänts av Food and Drug Administration (FDA) för utveckling av humanvaccin33. I detta system är den fullständiga cDNA-kopian av virusgenomet monterad i BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2A), en Plasmid med låg kopia (en till två kopior per cell) som härrör från Escherichia coli F-Factor35. som minimerar toxiciteten av flavivirussekvenser under dess utbredning hos bakterier. Den cDNA av zikv genom är monterad i pBeloBAC11 under kontroll av den mänskliga CMV omedelbar-tidig promotor, att tillåta uttrycket av viral (v) RNA i kärnan av transfekterade celler av cellulära RNA-polymeras II, och flankerad vid 3 ‘-End av hepatit deltavirus (HDV) ribozym (RZ), följt av sekvenser av nötkreatur tillväxthormon (BGH) uppsägning och polyadenylering signaler att producera syntetiska rnas med autentiska 5 ‘-och 3 ‘-ändar av viral genomet, respektive (figur 2b). Detta cDNA-lanserade system resulterar i det intracellulära uttrycket av utjämnat virus-RNA, vilket möjliggör återhämtning av infektiösa ZIKV utan behov av en in vitro-transkription steg. Den BAC metoden ger en kraftfull metod som gäller för att konstruera stabila och fullt fungerande infektiösa cDNA kloner för andra flavivirus, liksom andra positiva-strandsatta RNA-virus36,37, 38,39,40,41.
Infektiösa cDNA-kloner utgör essentiella molekylära verktyg för grundforskning av RNA-virus och utveckling av vacciner och/eller identifiering av antivirala strategier. Men för många positiva-strandsatta RNA-virus, inklusive flavivirus, är generering av infektiösa cDNA-kloner svåra på grund av instabiliteten hos den klonade cDNAs när den sprids i bakterier med hjälp av standardiserade hög-kopieringsplasmider. När det gäller zikv och andra flavivirus beror denna instabilitet främst på det läckande uttrycket av giftiga virala proteiner från kryptiska bakteriella initiativtagare som finns i viral genomet14,15,16,17 . Här beskriver vi ett alternativt och kraftfullt protokoll för att generera en stabil ZIKV fullängds infektiös cDNA-klon som en enda plasmid, baserad på användningen av BAC plasmid pBeloBAC1134 (figur 2A) för att övervinna toxicitetsproblemet, användningen av CMV promotor att tillåta uttrycket av vRNA i kärnan av transfekterade celler, och HDV RZ att generera vrnas med exakt 3 ‘-ändar (figur 2b). Med den här metoden har vi framgångsrikt genererat en fullt stabil smittsam klon av ZIKV-stammen RGN som möjliggör effektiv och tillförlitlig återhämtning av infektiösa rZIKV efter direkt överföring av mottagliga Vero-celler (figur 3 och Figur 4).
En enorm ansträngning har gjorts under de senaste åren för att övervinna instabilitet problem i samband med ZIKV infektiösa cDNA kloner, och flera metoder har framgångsrikt genomförts18, inklusive in vitro-ligering av cDNA fragment24 ,25, låg-kopia plasmider19,20, inaktivering av kryptiska bakteriella initiativtagare genom införandet av tysta mutationer26,27, intron insättning21, 22 , 23, den Gibson monteringsmetod30, ISA metod28,29, och användningen av cper31. Även om dessa metoder övervinna toxicitet problemet och är användbara för att generera ZIKV infektiösa cDNA kloner, några av dem är mödosamma och uppvisar flera nackdelar, inklusive behovet av in vitro-ligering och transkription steg som minskar virus återhämtning effektivitet eller införandet av ett stort antal tysta mutationer för att inaktivera kryptiska bakteriell promotor som kan påverka viral Fitness, bland annat. Det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll innebär följande fördelar. i) den BAC plasmid pBeloBAC1134 har en strikt kontrollerad replikering, att hålla en eller två kopior av plasmid per cell, vilket minimerar toxicitet och möjliggör stabilt underhåll i bakterier av instabila cdnas. II) spridningen och modifieringen av BAC plasmider är nästan desamma som för konventionella plasmider, med tanke på de smärre modifieringar som beskrivs i detta protokoll för att manipulera stora BAC-DNA-fragment och lågkopieringsplasmider. I synnerhet kan BAC cDNA-klon också modifieras till E. coli genom homolog rekombination med hjälp av det röda rekombinations systemet42,43,44. III) användning av CMV-promotorn gör det intracellulära uttrycket av utjämnade ZIKV vRNA och återvinning av smittsamma virus utan att kräva en in vitro-transkription steg. IV) infektiös rZIKV genereras efter direkt transfektion av mottagliga celler (t. ex. Vero) med BAC cDNA-klon. Eftersom DNA-transfektion i däggdjursceller är effektivare än RNA-transfektion, är virusets återhämtnings effektivitet med BAC-metoden högre än den som observerats med hjälp av RNA-utskrifter, vilket minskar antalet passager i kultur celler för att generera en virusstam och, Följaktligen begränsar införandet av oönskade mutationer genom cellkultur anpassning.
Slutligen, potentialen i BAC strategi stöds av en framgångsrik användning av denna metod (med smärre ändringar) att iscensätta infektiösa cDNA kloner av andra flavivirus, inklusive denguefeber virus36, och flera coronaviruses av hög effekt i människors och djurs hälsa, såsom transmissibel gastroenterit coronavirus37 (tgev), felint infektiös peritonit-virus38 (fipv), humant coronavirus OC4339 (HCoV-OC43), svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus40 (Sars-CoV), och Mellanöstern respiratoriskt syndrom coronavirus41 (Mers-COV), bland annat.
I det protokoll som beskrivs här finns det två kritiska steg som bör övervägas. En viktig faktor är att identifiera lämpliga unika restriktioner platser i viral genomet som saknas i BAC plasmid. Om det inte finns några lämpliga begränsnings platser kan nya restriktionssajter genereras under klonings designen genom att tysta nukleotidmutationer införs. En annan viktig fråga är att BAC plasmider finns i endast en eller två kopior per cell, och därför, låg avkastning av BAC plasmider med en hög förorening av bakteriell genomisk DNA erhålls med hjälp av standardprotokoll avsedda för hög-och medel-kopiera-numrerar Plasmids. Detta potentiella problem är lätt att övervinna med hjälp av stora kultur volymer och rening av BAC Plasmid med en kommersiell kit speciellt utvecklad för BAC rening.
Sammanfattnings, har vi utvecklat en kraftfull ZIKV omvänd genetisk strategi som bygger på användning av en BAC som kan anpassas för att generera stabila och fullt fungerande infektiösa cDNA kloner av andra positiva-strandsatta RNA-virus för att underlätta studiet av biologi av dessa virus och utveckling av vacciner och/eller för att underlätta identifieringen av antivirala läkemedel.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Carla Gómez för hennes tekniska hjälp i BAC cDNA klon generationen och Snezhana Dimitrova för att hjälpa till med video förberedelse. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (MINECO, Grant Number BFU2016-79127-R) till F.A.T. och National Institutes of Health (NIH, Grant nummer 1R21AI120500) till L.M.S. och F.A.T.
1. Molecular Biology Reagents | |||
Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 units/mL |
AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 units/mL |
BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 units/mL |
BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 units/mL |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 units/mL |
Oligonucleotides | IDT | N/A | |
Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 units/mL |
Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/mL |
SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 units/mL |
2. Cell Culture Reagents | |||
6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
Agar Noble | VWR | 214230 | |
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
Cell Culture Dishes (100×21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
High-Speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
Vortexer | Varies | N/A |