Summary
Zika 바이러스의 최근 전염병은 백신 및/또는 치료 전략을 개발하기 위하여 역유전 접근을 확립의 중요성을 강조합니다. 여기서, 우리는 인간 시토메갈로바이러스의 제어하에 세균성 인공 염색체에 조립된 전신 cDNA 클론으로부터 전염성 재조합 Zika 바이러스를 즉각적으로 조기 프로모터로 구출하는 프로토콜을 기술한다.
Abstract
최근 전 세계적으로 발병하고 승인 된 백신 및 / 또는 항 바이러스의 부족 동안 신경 합병증과 지카 바이러스 (ZIKV) 감염의 협회는 이를 용이하게하기 위해 ZIKV 역 유전 시스템을 개발하는 긴급한 필요성을 강조하고있다 ZIKV 생물학의 연구 및 치료 및 / 또는 예방 접근법의 개발. 그러나, 다른 플라비바이러스와 마찬가지로, ZIKV 전신 전염성 cDNA 클론의 생성은 박테리아에서의 증폭 동안 바이러스 서열의 독성으로 인해 방해를 받고 있다. 이 문제를 극복하기 위하여는, 우리는 세균성 인공 염색체 (BACs)의 사용에 근거를 둔 비전통적인 접근을 개발했습니다. 이러한 접근법을 사용하여, ZIKV 균주 리오 그란데 도 노르테 나탈(ZIKV-RGN)의 전신 cDNA 사본은 4개의 합성 DNA 단편으로부터 생성되고 인간 시토메갈로바이러스(CMV)의 통제 하에 단일 카피 pBeloBAC11 플라스미드로 조립된다. 즉각적인 조기 프로모터. 조립된 BAC cDNA 클론은 박테리아에서 전파되는 동안 안정하며, 전염성 재조합(r)ZIKV는 BAC cDNA 클론의 형질전환 후 베로 세포에서 회수된다. 여기에 설명된 프로토콜은 ZIKV 및 기타 양성 가닥 RNA 바이러스, 특히 세균 중 안정성 문제가 있는 큰 게놈을 포함한 플라비바이러스의 전염성 클론 생성을 위한 강력한 기술을 제공합니다. 전파.
Introduction
ZIKV는 현재 글로벌 공중 보건 비상 사태를 구성하는 플라비리대 가족 내에서 플라비 바이러스속의 모기 매개 회원입니다 1. 다른 플라비바이러스와 마찬가지로, ZIKV는 약 10.8 kb의 양성 감각, 단일 가닥 RNA 분자를 포함하는 이코사헤드랄과 같은 구조를 가진 둘러싸인 RNA 바이러스이다(도1)2. 바이러스 게놈은 바이러스 및 세포 프로테아제에 의해 처리되는 약 3,423개의 아미노산의 큰 다단백질을 세 가지 구조 단백질(capsid [C], 전막/막 [prM/M], 및 봉투 [E]]로 인코딩합니다. 바이러스 입자 및 7개의 비구조적(NS) 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5)은 호스트 면역반응의 게놈 복제, 바이러스 조립 및 회피에 참여한다(도 1)3.
역사적으로, ZIKV 감염은 온화한 열성 병과 연관되었습니다4,5. 그러나, 남아메리카와 중미, 남태평양 및 카리브해 6,7,8,그리고 길랭-바레 증후군의 발생과의 연관성에 걸쳐 ZIKV 감염의 폭발적인 최근 전염병 그리고 소두증9,10,11,12,13,역사적 인식을 변경하고 중요한 인간 병원체로서 ZIKV의 관련성을 강화했다. 이러한 의미에서, 전염성 cDNA 클론과 같은 분자 도구의 개발은 바이러스 성 병인의 연구와 유전 정의 백신의 개발 및 ZIKV 감염의 치료를위한 항 바이러스 약물의 식별을 용이하게할 것입니다. 다른 플라비바이러스에 대해 설명한 바와 같이, ZIKV 감염성 클론의 생성은 바이러스 게놈(14)에서 비밀스러운 세균 프로모터의 존재로 인해 어려우며, 이는 전파 동안 독성 바이러스 단백질의 누설발현을 허용하는 바이러스 성 단백질의 유출을 허용한다. cDNA 클론 표준 높은 복사 번호 플라스미드를 사용 하 여 박테리아에15,16,17. 이 독성 문제를 극복하기 위해, 몇 가지 비 전통적인 접근 방식은 지난 2 년 동안 성공적으로 구현되었습니다18. 이들은 낮은 복사 수 의 플라스미드의사용을 포함 19,20,인트론의 삽입은 독성 영역을 방해21,22,23,cDNA 단편의 체외 결찰 24세 , 25,바이러스 게놈26,27,전염성 후유주 암플리칸 (ISA)28,29,깁슨 조립 방법30에 존재하는 비밀 박테리아 프로모터의 돌연변이 침묵 , 및 원형 폴리머라제 확장 반응(CPER)의사용(31)
본 명세서에서, 우리는 ZIKV 균주 ZIKV-RGN13의전신 cDNA 클론의 엔지니어링에 대한 상세한 프로토콜을 설명하고, BAC를 사용하여 독성 문제를 극복하고, BAC cDNA 클론을 베로로 직접 변형시킴으로써 감염성 rZIKV의 구출을 세포(32)는인간 백신의 개발을 위해 미국 식품의약국(FDA)에 의해 승인된 세포주(33)이다. 이 시스템에서, 바이러스 게놈의 전신 cDNA 카피는 BAC 플라스미드 pBeloBAC1134(도 2A), 대장균 F-인자(35)로부터 유래된 저카피수 플라스미드(세포당1~2개 사본)에 조립된다. 박테리아에서 플라비 바이러스 서열의 독성을 최소화합니다. ZIKV 게놈의 cDNA는 인간 CMV 의 제어하에 pBeloBAC11에서 즉시 조기 프로모터로 조립되어, 세포 RNA 폴리머라제 II에 의한 형질감염된 세포의 핵에서 바이러스(v)RNA의 발현을 허용하고, 간염에 의해 3'-말단에 측면으로 델타 바이러스(HDV) 리보자임(RZ)은 소 성장 호르몬(BGH) 종단 및 폴리아데닐화 신호의 서열에 이어 바이러스 게놈의 본격적인 5'----말단을 나타내는 합성 RNA를 각각 생성한다(도 2B). 이 cDNA 발사 시스템은 체외 전사 단계없이 전염성 ZIKV의 회복을 허용하는, 캡된 바이러스 성 RNA의 세포 내 발현을 초래한다. BAC 접근법은 다른 플라비바이러스뿐만 아니라 다른 양성 가닥 RNA 바이러스36,37, 및 안정적이고 완전한 기능의 전염성 cDNA 클론을 구성하는 데 적용할 수 있는 강력한 방법론을 제공합니다. 38,39,40,41.
Protocol
1. BAC에서 ZIKV 전염성 cDNA 클론의 건설
참고: BACs에서 ZIKV의 조립을 위한 전략은 RGN 균주 13(수탁 번호 KU527068)에 대해 설명된다(도 2).
- 플라스미드 pBeloBAC11(도 2A)에 없는 바이러스 게놈에적절히 이격된 독특한 제한 부위를 선택한다.
참고: ZIKV-RGN의 경우, 제한 부위Pml I, Afe I 및 BstB I(게놈 위치 3,347, 5,969 및 9,127)을 각각 선택하였다. 바이러스 게놈에서 적절한 제한 부위를 사용할 수 없는 경우, cDNA 단편 설계 동안 바이러스 게놈에 침묵하는 뉴클레오티드 돌연변이를 도입하여 새로운 제한 부위를 생성한다. - 화학 적 합성에 의해 생성 된 전신 게놈에 걸쳐 4 cDNA 조각 (Z1 에 Z4), 5'끝에서 CMV 프로모터에 의해 측면 및 HDV RZ, BGH 종단, 및 3'끝에서 폴리 아데닐화 서열 (그림 2B). 각 조각은 선택한 제한 사이트(1.1단계)에 의해 측면에 있어야 합니다.
참고: 조각 Z1은 pBeloBac11의 나머지 조각을 복제하기 위한 백본으로 사용됩니다. 이를 위해, 인간 CMV 프로모터를 포함해야 하며, ApaL I(pBeloBAC11에서 이 단편을 복제하기 위해)와 Asc I(바이러스 게놈에 결석함)에 의해 5'-끝에서 측면으로 측면화되어야 하며, 3'-끝에서 감염성 클론의 조립을 위해 선택된 제한 부위(Pml I)에 의해 선택되어야 합니다. , Afe I, 및 BstB I)는 Mlu I(바이러스 게놈에 결석) 및 BamH I(pBeloBAC11에서 이 단편을 복제하기 위해)를 따랐다. Z4 단편은 선택된 마지막 제한 부위(BstB I)로부터 바이러스 게놈의 끝까지, HDV RZ, BGH 종단 및 폴리아데닐화 서열, 및 Mlu I 제한 부위(도2B)를포함해야 한다. 대안적으로, cDNA 단편(Z1-Z4)은 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표준 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 및 중첩된 PCR의 조합에 의해 생성될 수 있다. - pBeloBAC11 (그림2B)에Z4 단편 Z1의 순차적 복제에 의해 전염성 cDNA 클론을 조립한다.
- pBeloBAC11 플라스미드 및 Z1 단편을 ApaL I 및 BamH I로 소화한다. 이를 위해 pBeloBAC11 플라스미드 2 μg 또는 Z1 단편 1 μg를 10x 반응 완충액, 각 효소의 20 단위, 물 100 μL의 최종 부피에 도달하도록 2 μg의 2 μg를 2 시간 동안 37°C에서 배양합니다.
- 새우 알칼리성 인산염(SAP)을 이용하여 BAC 벡터를 배분한다. 이를 위해, 소화된 BAC에 SAP 2.5 μL(2.5 단위)을 넣고 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하여 75°C에서 15분 동안 인큐베이션하여 SAP를 불활성화시다.
- 10 kb보다 큰 DNA 단편의 정제에 최적화된 상용 겔 클렌징 키트를 사용하여 아가로즈 겔 전기영동에 의한 탈인성 BAC 벡터 및 단편 Z1을 정제한다(재료표 참조).
- 결찰 반응을 수행하여 플라스미드(p)BAC-Z1을 생성한다. 이를 위해, 정제된 BAC 벡터의 150 ng를 정제된 BAC 벡터와 혼합하여 벡터 대 삽입의 몰 비를 사용하여 1:3, 10x T4 DNA 리가제 완충액의 10mM ATP, 1단위의 T4 DNA 리가제, 및 15 μL의 최종 부피로 물을 삽입한다.
- 16 °C에서 20 시간 동안 결찰 혼합물을 배양합니다. 결찰 반응의 제어로서, 인서트가 없는 결찰 반응을 병렬로 수행한다. 열-15 분 동안 65 °C에서 배양하여 리가아를 비활성화합니다.
참고: 무딘 말다이드 DNA의 경우, 14°C에서 20시간 동안 결찰 반응을 배양한다. BAC 벡터(도 2A)의크기가 크기 때문에, 결찰 효율을 높이기 위해서는 기존의 플라스미드를 이용한 결찰보다 더 많은 양의 벡터 및 삽입물을 사용하는 것이 필수적이다. - 0.2 간격으로 이격된 전극이 장착된 전기 포출 큐벳을 사용하여 전기 간화(25 μF 커패시턴스, 2.5 kV 및 100Ω 저항)에 의한 결찰 반응(단계 1.3.5)의 2 μL로 대장균 DH10B 전기 적격 세포 50 μL 변환 cm, 표준 프로토콜을 따르십시오.
- SOC 배지 1 mL (2% 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.05 % NaCl, 2.5 mM MgCl, 10mM MgCL 2, 10 mM MgSO4,20 mM MM 포도당 [pH 7.0])을 가진 폴리 프로필렌 튜브로 세포를 옮기고 1 시간 동안 37 ° C에서 20 h로 배양하십시오 (20 h). 12.5 μg/mL 클로람페니콜을 함유한 루리아 국물(LB) 한천 접시에 세포를 플레이트하고 16시간 동안 37°C에서 배양합니다.
- 8~12개의 세균 성 콜로니를 선택하고, 12.5 μg/mL 클로람페니콜을 함유한 신선한 LB 한천 접시에 복제하고, 특정 올리고뉴클레오티드를 사용하여 직접 PCR 분석을 통해 올바른 삽입을 포함하고 있는지 테스트합니다.
- 복제판에서 양성 콜로니를 선택하고, 클로람페니콜 12.5 μg/mL을 함유하는 LB의 100 mL에서 성장시키고, 상업용 플라스미드 미디 키트를 사용하여 알칼리성 용해 방법으로 BAC cDNA를 분리하고, 대형 정제를 위한 권고에 따라 낮은 복사 플라스미드(재료 표참조).
참고: 이 방법에 의해 제조된 BAC cDNA는 세균 게놈 DNA의 최대 30%로 오염될 수 있지만, 제한 분석, 시퀀싱 및 복제를 수행하는 데 품질에 적합하다. BAC 크기에 따라, BAC 플라스미드의 4-6 μg의 수율을 얻을 수 있다. - 제한 분석을 통해 복제된 cDNA의 유전적 무결성을 확인합니다. pBAC-Z1 플라스미드의 500 ng를 Asc I 및 Pml I와 함께 37°C에서 1시간 동안 소화하고 겔 전기영동에 의한 Z1 단편의 존재를 확인하였다. 원치 않는 돌연변이가 도입되지 않았다는 것을 추가로 확인하기 위해, 특정 올리고뉴클레오티드로 삽입을 서열화한다.
- 선택된 제한 부위(Pml I, Afe I, BstB I 및 Mlu I)를 포함하는 플라스미드 pBAC-Z1로부터 시작하여, 순차적으로 Z2를 Z4로 복제하여전신 전염성 cDNA 클론 pBAC-ZIKV(그림 2B)를 생성하고, 유사한 실험을 하였다. 조각 Z1에 대해 위에서 설명한 대로 접근 방식입니다(단계 1.3.1-1.3.10).
2. 전염성 rZIKV의 구조에 대한 고순도 pBAC-ZIKV의 준비
참고: 감염성 바이러스의 형질 감염 및 구조에 적합한 초순수 pBAC-ZIKV 감염 클론의 대규모 제제는 BAC 정제를 위해 특별히 개발 된 상용 키트로 알칼리 성 용해로 수행됩니다 (표 참조 재료)를 참조하십시오. 키트는 세균성 게놈 DNA 오염을 제거하는 ATP 의존성 외핵성 소화 단계를 포함해야 하며, 염화 세슘 방법으로 얻은 것과 유사한 순도등급으로 BAC cDNA를 분리할 수 있도록 한다.
- 37°C에서 12.5 μg/mL의 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 의 5 mL에서 pBAC-ZIKV 전염성 클론을 운반하는 대장균 DH10B의 단일 콜로니를 8시간 동안 부드럽게 흔들어 (200-250 rpm).
- 2L 플라스크에 클로람페니콜 12.5 μg/mL로 LB의 500 mL에 1 mL의 세균 배양(단계 2.1)을 추가하고 14-16시간 동안 37°C에서 세포를 성장시다(OD600 0.6-0.8).
참고: 훌륭한 국물 (TB)과 같은 풍부한 국물은 매우 높은 세포 밀도를 생성하여 BAC cDNA의 수율이 낮고 순도가 낮습니다. - BAC 정제를 위해 특별히 개발된 상용 키트를 사용하여 알칼리성 용해로 BAC 전염성 cDNA 클론을 정제하고, 제조사의 사양에 따라(재료표 참조). 정제된 BAC cDNA를 4°C에서 유지합니다. BAC 크기에 따라, 30 μg의 초순수 BAC cDNA 클론의 수율을 얻을 수 있다.
참고: DNA 펠릿을 5분 이상 건조시키지 마십시오. BAC cDNA 클론의 크기가 크기 때문에, 플라스미드 전단을 방지하기 위해 와류 또는 파이펫팅을 피하십시오.
3. 베로 세포의 형질 감염에 의한 BAC cDNA 클론에서 전염성 rZIKV의 구조
참고: 전염성 rZIKV는 pBAC-ZIKV cDNA 클론을 사용한 베로 세포의 형질감염에 의해 회수되고, 상업적 인 양이온 지질 형질전환 시약을 사용한다(물질표 참조; 그림3).
- 형질감염 하루 전, 6웰 플레이트에 접시 5 x 105 베로 세포/성장 배지에서 잘 (덜베코의 수정 된 독수리의 매체 [DMEM] 5% 태아 소 혈 청으로 보충 [FBS], 2 mM L-글루타민, 그리고 1% 비필수 아미노산) 항생제 없이 90% 동시 세포 단층을 올릴 수 있습니다.
참고: 우리는 삼중에서 바이러스 복구를 수행하는 것이 좋습니다. -
상온에서 혈청 감소 배지(재료 표 참조)를 평형화하고 각 형질감염 샘플에 대해 멸균 마이크로퍼지 튜브에 형질전환 혼합물을 제조한다.
- 혈청 환원 배지 250 μL에 BAC cDNA 클론 4 μg를 추가하고 조심스럽게 섞어서 플라스미드 전단을 방지합니다.
- 별도의 튜브에서 12 μL의 형질감염 시약 (1 mg / mL)을 희석 (재료 표참조)에서 혈청 감소 배지의 250 μL에서, 와르싱으로 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 희석 된 BAC cDNA와 형질 감염 시약 (DNA : 형질 감염 시약의 1 : 3 비율)을 결합하고 소용돌이를 피하면서 조심스럽게 혼합하고 실온에서 20-30 분 동안 배양하십시오.
- BAC cDNA /형질 감염 시약 혼합물의 잠복기 동안 항생제없이 성장 배지로 Vero 세포를 씻어 내고 항생제없이 신선한 배지의 1 mL에 세포를 둡니다.
참고: 형질감염 과정 동안 항생제를 첨가하면 형질감염 효율이 저하될 수 있다. - BAC cDNA/형질감염 시약 혼합물의 500 μL을 베로 세포 상에 분배하고, 플레이트를 앞뒤로 흔들어 혼합하고, 6시간 동안 37°C에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 인큐베이터화한다.
- 형질감염 배지를 제거하고, 항생제(100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신)로 2 mL의 신선한 성장 배지를 추가하고, 37°C에서 5% CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 세포병증 효과(CPE)의 유도를 매일 확인합니다. ).
참고: ZIKV CPE는 베로 세포에서 매우 두드러지며 조직 배양 상수에서 분리되고 부유하는 둥근 및 이중 성 세포의 존재를 특징으로합니다. - 베로 세포 조직 배양 과자(단계 3.5)의 aliquots(100 μL)를 매 24시간마다 수집하여 신선한 베로 세포에 대한 표준 플라크분석(도 4A)을 사용하여 ZIKV의 존재를 평가함으로써 바이러스 회복의 효율을 결정한다(도 4A).
- 4 내지 6일간의 형질전환 후, CPE가 약 50%-75%(도4B)일때, 세포 이물질을 제거하기 위해 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 15 mL 원엽관 및 원심분리기에서 조직 배양 과식제를 수집한다.
- rZIKV를 함유한 상피제를 수확하고 세포 펠릿을 버린다. 저온화에 상온자를 알리쿼트하고 -80°C에 저장하여 구조된 rZIKV의 존재를 추가로 확인하였다.
4. 복구 된 rZIKV의 적정
- 적정 전날, 12웰 플레이트에 2.5 x 105 베로 세포/잘 성장 배지에 시드를 올려 적정시에 의해 90% 동시 세포 단층을 올립니다.
참고: 우리는 삼중에서 회수 된 rZIKV의 적정을 수행하는 것이 좋습니다. - 냉동고에서 상급물의 알리쿼트(단계 3.8)를 제거하고 FBS 없이 성장 배지에서 직렬 10배 희석을 합니다.
- 인산염 완충 식염수(PBS)로 베로 세포를 2x 세척하고 각 바이러스 희석액을 3배로 희석시 200 μL/well을 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 5%CO2 가습 인큐베이터에 놓고 90분 동안 매 15분마다 바위를 채취합니다.
- 바이러스 성 접종을 제거하고, 2% FBS, 1% DEAE-dextran 및 0.6% 한천 노블을 함유하는 성장 배지의 2 mL로 세포를 중첩시키고, 3-4일 동안 5% CO2 미만에서 37°C에서 배양한다.
참고: 아가로즈, 메틸셀룰로오스 또는 기타 오버레이 미디어를 사용할 수 있다. 적절한 플라크 형성 시간은 사용되는 오버레이 및 ZIKV 변형에 따라 달라집니다. -
1 시간 동안 실온에서 PBS에서 희석 된 1 mL / 4 % 포름 알데히드로 ZIKV 감염 세포를 수정하고 오버레이를 제거하고 실온에서 20 % 메탄올에서 0.1 % 크리스탈 바이올로 염색하여 바이러스 성 플라크를 15 분 동안 시각화하십시오.
- 크리스탈 바이올렛을 버리고 물로 3 x를 씻고 판을 건조시키고 플라크를 수동으로 계산하십시오 (그림4C, 왼쪽 패널). 바이러스 성기는 밀리리터 당 플라크 형성 단위로 계산됩니다 (PFU / ml).
-
대안적으로, 바이러스 플라크는 팬 플라비바이러스 E 단백질 마우스 단클론 항체(mAb) 4G2(도4C,우측 패널)로 면역염색함으로써 가시화될 수 있다.
- 면역 염색에 의해 ZIKV 플라크를 평가하기 위해, 위에서 설명한 바와 같이 오버레이 한천을 고정 및 제거한 후(단계 4.5에서) 세포를 PBS로 2배 세척하고 실온에서 15분 동안 PBS에서 0.5% 트리톤-X100의 200 μL/well로 배양하여 이를 투과시한다.
- 투과 용액을 제거하고, PBS로 세포를 3배 세척하고, 실온에서 1시간 동안 차단 용액(PBS에서 10% FBS)의 200 μL/well으로 차단합니다.
참고: 다른 표준 차단 솔루션(예를 들어, PBS에서 2.5% BSA)을 이 단계에서 사용할 수 있다. - 차단 용액을 제거하고 37 °C에서 1 시간 동안 차단 용액 (1 μg / mL)에서 희석 된 팬 플라비 바이러스 E 단백질 mAb 4G2의 200 μL / well로 세포를 배양하십시오.
참고: 다른 mAb 또는 폴리클로날 항체(pAb)는 바이러스 플라크의 면역 염색 및 검출을 위해 4G2 대신에 사용될 수 있다. - 세포를 PBS로 3x 세척하고 37 °C에서 1 시간 동안 차단 용액에서 200 μL의 생체 티닐화 된 항 마우스 보조 항체희석 (제조업체의 권고에 따라)으로 배양하십시오.
- 이차 항체를 제거하고, PBS로 세포를 4x 세척하고, 제조업체의 사양에 따라 아비딘/비오틴 계 퍼옥시다아제 키트를 사용하여 바이러스 성 플라크를 시각화합니다(재료 표참조).
5. 성공적인 rZIKV 구조 확인
참고: 구조된 바이러스의 동일성을 더욱 확인하기 위해, ZIKV E 단백질 발현은 ZIKV E 단백질에 특이적인 마우스 mAb1176-56을 사용하여 면역형광에 의해 분석된다(도 4D). 이러한 mAb는 PAN-플라비바이러스 E 단백질 mAb 4G2(단계 4.6.3)의 상황과는 반대로 ZIKV E 단백질에 특이적이다. 대안적으로, 바이러스 ID는 시퀀싱을 통해 확인할 수 있다.
- 면역형광 분석 하루 전에, 종자는 감염 시 90%의 동량 세포 단층을 올리기 위해 성장 배지에서 1 x 105 Vero 세포를 함유하는 24웰 플레이트에 입술을 덮는다.
- 세포를 PBS로 2x 세척하고 FBS (100 μL / well)없이 성장 배지에서 구조 된 바이러스의 0.5 PFU / 세포의 감염 (MOI)의 복합성으로 감염시 면 삼중 플레이트를 37°C에서 90분 동안 배양합니다.
- 바이러스 흡착 후, 바이러스 접종을 제거하고, 2% FBS로 신선한 성장 배지0.5 mL를 첨가하고, 37°C에서 37°C에서 48시간 동안 5%CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
- 조직 배양 상류를 제거하고 실온에서 20 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드의 150 μL / well로 세포를 고정하고 실온에서 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤 -X100의 150 μL / well로 세포를 투과시하십시오.
- 투과 용액을 제거하고 PBS로 세포를 3배 세척한 후 실온에서 1시간 동안 150 μL/well의 차단 용액으로 세포를 차단합니다.
참고: 세포 검사는 대체 차단 솔루션(예를 들어, PBS에서 2.5% BSA)으로 차단됩니다. - 차단 용액을 제거하고 37 °C에서 1 시간 동안 차단 용액 (1 μg / mL)에서 희석 된 ZIKV E 단백질에 특화 된 mAb 1176-56의 100 μL / well으로 세포를 배양하십시오.
- PBS로 세포를 3배 세척하고, 알렉사 플루어 488-컨쥬게이트 항마우스 이차 항체를 차단 용액으로 100 μL/well으로 실온에서 1시간 동안 배양하고, 차단 용액으로 세포를 광범위하게 세척하고, 150 μL/well of 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1 mg/mL)으로 배양하여 실온에서 1:200을 10분 동안 PBS에서 희석시.
- PBS로 세포를 3배 세척하고, 안티페이드 장착 매체에 커버슬립을 장착하고(재료 표참조) 형광 현미경으로 샘플을 분석합니다.
참고: 장기 보관을 위해 시료를 4°C로 저장하여 빛으로부터 보호하십시오.
6. 바이러스 성 주식의 증폭 및 생성
참고: 일단 구조된 바이러스의 신원이 확인되면 (섹션 5), Vero 세포에 바이러스를 증폭시키고 추가 연구를 위한 바이러스 성 주식을 생성합니다.
- 90% 합류에서 100 mm x 21 mm 플레이트에서 베로 세포를 성장시키고 앞서 설명한 바와 같이 0.1 PFU/세포의 MOI로 감염시다.
- CPE가 약 75%(약 48-72h 감염 후)인 경우, 세포 이물질을 제거하기 위해 4°C에서 10분 동안 2,000 x g에서 50 mL 원원관 및 원심분리기에서 조직 배양 상급체를 수집한다.
- rZIKV를 함유한 상급물질을 수확하고 세포 펠릿을 버린다. 상온액을 저온중구에 저장하여 -80°C에 보관합니다.
- 냉동고에서 바이러스 알리쿼트를 제거하고 앞서 설명한 바와 같이 플라크 분석법으로 바이러스 역가를 결정한다(섹션 4).
Representative Results
여기서 설명된 프로토콜은 여러 플라비바이러스 서열과 관련된 독성 문제를 최소화하기 위해 BAC를 사용하여 안정적인 ZIKV 전신 cDNA 감염 클론의 생성을 허용한다. BAC cDNA 클론으로부터의 전염성 rZIKV의 효율적인 회복은 감수성 있는 베로세포의 형질전환 후에 용이하게 달성될 수 있다(도 2). 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 기존의 복제 방법과 독특한을 사용하여 BAC 플라스미드 pBeloBAC1134에 4 개의 중첩 cDNA 조각을 순차적으로 복제하여 ZIKV 균주 RGN32의 안정적인 전신 cDNA 클론을 생성했습니다. 바이러스 게놈에 존재하는제한 부위(도 2). 전신 cDNA 클론을 형질감염된 세포의 핵에서 vRNA의 발현을 허용하기 위해 인간 CMV 프로모터에 의해 5'-끝에서 측면화되었고, HDV RZ에 의한 3'-말단에서 BGH 폴리아데닐화 및 종단 서열을 이어서, 함유하는 RNA를 생성하였다. 바이러스 게놈의 정확한 3'-끝(그림 2). 생성된 BAC cDNA 클론의 박테리아의 안정성은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 쉽게 조작할 수 있으며, 안정적인 전신 cDNA 클론의 신속하고 신뢰할 수 있는 생성을 위한 BAC cDNA 접근법의 잠재력을 강조합니다. 불안정한 바이러스 게놈을 가진 ZIKV 및 그밖 flaviviruses 또는 양성 가닥 RNA 바이러스.
일단 BAC cDNA 클론이조립되면 (도 2), 감염성 바이러스는 양이온 성 리포솜을 사용하여 BAC cDNA 클론을 사용하여 취약한 베로 세포의 직접 형질감염 후 용이하게 회복될 수 있었다(도3). 이 cDNA 발사 시스템은 체외 전사 단계없이 전염성 바이러스의 회복을 허용, 캡된 vRNA의세포 내 발현을 허용했다. 이 접근법을 사용하여, 우리는 5일 후 변환 후 106 PFU/mL 보다 높은 역가로 rZIKV-RGN을 구출할 수 있었습니다(그림4A). 또한, 구조된 바이러스는 명확한 CPE(도4B)를유도하고, 약 2mm 크기의 균질한 플라크를 생성(도4C),및 그 신원은 mAb 특이적 mAb를 이용한 시퀀싱(데이터 미도시) 및 면역형광 분석에 의해 확인되었다. ZIKV E 단백질, 1176-56 (그림4D). 시험관 내 데이터는 회수된 rZIKV-RGN이 베로 세포에서 효율적으로 복제되었음을 나타내고 자연 ZIKV 분리32와 비교한 수준(데이터는 도시되지 않음). 전반적으로, 이러한 결과는 전염성 rZIKV가 BAC에 조립된 전신 cDNA 클론으로부터 구출될 수 있음을 보여준다.
그림 1 : ZIKV 게놈 조직 및 비리온 구조. (a) 게놈 조직: ZIKV는 단일 다단백체로서 번역되는 양성 단일 가닥 RNA를 함유하고 있다. 번역된 다단백질은 바이러스(화살표) 및 숙주(다이아몬드) 프로테아제에 의해 갈라진 구조단백질 캡시드(C, blue), 매트릭스(M, brown), 및 엔벨로프(E, green), 및 7개의 비구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5)을 생성하였다. 바이러스 게놈의 끝에 있는 5' 및 3' 번역되지 않은 지구 (UTR)는 검은 선으로 표시됩니다. (B) 비리온 구조: ZIKV 비리온은 E 및 M 단백질로 장식하였고, 이케사헤드랄과 같은 구조를 가진 지질 이중층에 고정되었다. 바이러스 성 포획 하에서 바이러스 성 게놈 RNA와 관련된 C 단백질로 구성된 바이러스 뉴클레오캡시드가 있었다. 이 그림은 아빌라 페레스 외18에서적응되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : BAC에서 ZIKV 전신 전염성 cDNA 클론의 조립. (A) pBeloBAC11 BAC의 개략적 표현:조절 유전자 parA, parB, parC및 repE,F-인자 복제 기원(OriS),클로람페니콜 내성 유전자(Cmr),및 lac Z 유전자가 표시된다. 전염성 ZIKV cDNA 클론을 조립하는 데 사용되는 관련 제한 부위는 밑줄이 그어져 있다. (B) ZIKV 의 전체 길이 전염성 cDNA 클론을 pBeloBAC11 BAC:4개의 중첩된 DNA 단편(Z1-Z4)으로 조립하고, 전체 ZIKV 게놈(그림1)을덮고 표시된 제한 부위에 의해 측면에, 화학물질에 의해 생성되었다. 합성 및 순차적으로 pBeloBAC11로 복제하여 전염성 ZIKV cDNA 클론 pBAC-ZIKV를 생성한다. 전신 ZIKV 감염성 cDNA는 인간 시토메갈로바이러스 즉각적인 조기 프로모터(CMV)의 제어하에 조립되었고 HDV 리보자임(RZ) 및 소 성장 호르몬(BGH) 종단 및 폴리아데닐화 서열에 의해 3'-말단에 측면으로 이동하였다. 바이러스 유전자 및 조절 요소에 대한 약어는 도1에 기재되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : BAC cDNA 클론에서 rZIKV를 생성하는 워크플로우. 합류의 90%에서 베로 세포는 양이온리포솜을 사용하여 ZIKV 전도 전염성 cDNA 클론pBAC-ZIKV(도 2)를 사용하여 단층으로 형질감염되었다. 4-6일 후, CPE가 명백했을 때, rZIKV를 함유하는 조직 배양 과민제는바이러스의 존재를 수집하고 평가하였다(도 4) 베로 세포에서 바이러스 증폭에 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : rZIKV의 회복 및 체외 특성화. (A) BAC cDNA 클론으로부터의 전염성 rZIKV 의 구조: 합류의 90%에서 베로 세포(6-well plate format, triplicates)를 모의형형으로 형질감염또는 pBAC-ZIKV의 4 μg/well으로 형질감염(그림3),및 지시된 일 후 트랜스펙션, 조직 배양 중의 바이러스 적규자는 플라크 분석(PFU/mL)에 의해 결정되었다. 오류 막대는 세 가지 다른 형질 전환 실험의 표준 편차를 나타냅니다. 점선 검은 색 선은 검출 한계(50 PFU/mL)를 나타냅니다. (B) 바이러스 성 CPE:베로 세포90% 합류(6-well plate format, triplicates)에서 rZIKV를 가진 모의 감염(top) 또는 감염(0.5 PFU/세포의 MOI)을, 48h 감염 후, CPE의 존재를 경검사검사로 평가하였다. 스케일 바 = 100μm. (C) 바이러스 성 플라크 분석 및 면역 염색: 90% 합류 (12-웰 플레이트 포맷)에서 베로 세포는 rZIKV에 감염되었고, 72 h 후 감염에서, 바이러스 성 플라크는 크리스탈 바이올렛 염색 (왼쪽) 또는 면역 염색에 의해 가시화되었다 ( 팬 플라비바이러스 E 단백질 mAb 4G2를 사용한다. 스케일 바 = 5mm. (D) 면역 형광 : 90 % 합류 (24 웰 플레이트 형식, 삼중 항체)에서 Vero 세포가 rZIKV로 감염 (0.5 PFU / 세포의 MOI)을 감염시켰고, 48 시간 후 감염에서 mAb 1176-56을 사용하여 면역 형광에 의해 분석되었으며, ZIV에 대한 특정 E 단백질. 세포 핵을 DAPI로 염색시켰다. ZIKV에 감염된 Vero 세포의 대표적인 병합 이미지가 도시됩니다. 오른쪽 상단의 흰색 사각형은 ZIKV에 감염된 Vero 세포의 확대 된 이미지를 나타냅니다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
전염성 cDNA 클론은 RNA 바이러스의 기본 연구 및 백신 개발 및/또는 항 바이러스 전략의 식별을 위한 필수 분자 도구를 구성합니다. 그러나, 플라비바이러스를 포함한 많은 양성 가닥 RNA 바이러스의 경우, 표준 고카피-넘버 플라스미드를 사용하여 박테리아에서 전파될 때 감염성 cDNA 클론의 생성은 복제된 cDDNA의 불안정성으로 인해 어렵다. ZIKV 및 기타 플라비바이러스의 경우, 이러한 불안정성은 주로 바이러스 게놈14,15,16,17에 존재하는 비밀 박테리아 프로모터로부터 독성 바이러스 단백질의 누설 발현에 기인한다. . 여기서, 우리는 독성 문제를 극복하기 위해 BAC 플라스미드 pBeloBAC11(도2A)의사용에 기초하여, 단일 플라스미드로서 안정적인 ZIKV 전도 전염성 cDNA 클론을 생성하는 대안적이고 강력한 프로토콜을 설명하고, CMV 프로모터는 형질감염된 세포의 핵에서 vRNA의 발현을 허용하고, HDV RZ는 정확한 3'-말단으로 vRNA를 생성한다(도2B). 이 방법을 사용하여, 우리는 성공적으로 감염성 Vero 세포의 직접 형질 감염 후 감염성 rZIKV의 효율적이고 신뢰할 수있는 복구를 할 수 있습니다 ZIKV 균주 RGN의 완전히 안정적인 감염 클론을 생성했다 (그림3 및 그림4).
ZIKV 전염성 cDNA 클론과 관련된 불안정성 문제를 극복하기 위해 지난 몇 년 동안 엄청난 노력이 이루어졌으며, cDNA 단편 24의 체외 결찰을 포함하여여러가지 접근법이 성공적으로 구현되었습니다. ,25,저카피 플라스미드19,20,침묵 돌연변이26,27,인트론 삽입21의 도입에 의한 비밀 박테리아 프로모터의 불활성화 22세 , 도 23,깁슨 조립 방법(30) 및 ISA 방법28,29,및 CPER(31)의 사용. 이러한 접근법은 독성 문제를 극복하고 ZIKV 전염성 cDNA 클론을 생성하는 데 유용하지만, 그 중 일부는 힘들고 바이러스를 감소시키는 시험관 내 결찰 및 전사 단계에 대한 필요성을 포함하여 몇 가지 단점을 제시합니다. 복구 효율 또는 바이러스 성 적합성에 영향을 미칠 수 있는 비밀 박테리아 프로모터를 비활성화 하는 침묵 돌연변이의 높은 수의 도입, 다른 사람의 사이에서. 이 프로토콜에 설명된 접근 방식은 다음과 같은 이점을 제시합니다. i) BAC 플라스미드 pBeloBAC1134는 세포당 플라스미드 1개 또는 2개 사본을 보관하여 독성을 최소화하고 불안정한 cDNAs 박테리아에서 안정적인 유지보수를 허용하는 엄격하게 제어된 복제를 가지고 있습니다. ii) BAC 플라스미드의 전파 및 변형은 대형 BAC-DNA 단편 및 저카피 플라스미드를 조작하기 위해 본 프로토콜에 기술된 약간의 변형을 고려하여 기존의 플라스미드와 거의 유사하다. 특히, BAC cDNA 클론은 또한 적색 재조합 시스템42,43,44. iii를 사용하여 상동 재조합에 의해 대장균으로 변형될 수 있으며, CMV 프로모터의 사용은 체외 전사 단계를 필요로하지 않고 덮인 ZIKV vRNA및 감염성 바이러스의 회복의 세포내 발현. iv) 전염성 rZIKV는 BAC cDNA 클론을 가진 감염성 세포(예를 들어, Vero)의 직접 형질감염 후에 생성된다. 포유류 세포에서의 DNA 형질감염은 RNA 형질감염보다 효율적이기 때문에, BAC 접근법을 이용한 바이러스 회수 효율은 RNA 전사체를 사용하여 관찰된 것보다 높으며, 배양 세포에서 의 대패수를 감소시켜 바이러스 스톡을 생성하고, 결과적으로, 세포 배양 적응에 의한 원치 않는 돌연변이의 도입을 제한한다.
마지막으로, BAC 접근법의 잠재력은 뎅기열 바이러스36및높은 충격의 몇몇 코로나바이러스를 포함하여 그밖 flaviviruses의 감염성 cDNA 클론을 설계하기 위하여 이 방법 (약간의 수정으로) 성공적으로 사용에 의해 지원됩니다 투과성 위장염 코로나바이러스 37(TGEV), 고양이 감염성 복막염 바이러스 38(FIPV), 인간 코로나바이러스 OC4339(HCoV-OC43), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 40 등 인간 및 동물 건강 (SARS-CoV), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스41 (MERS-CoV), 그 외의 사이에서.
여기에 설명된 프로토콜에는 고려해야 할 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 한 가지 중요한 고려 사항은 BAC 플라스미드에 없는 바이러스 게놈에서 적절한 고유 제한 부위를 식별하는 것입니다. 적절한 제한 부위를 사용할 수 없는 경우, 침묵하는 뉴클레오티드 돌연변이의 도입에 의해 복제 설계 중에 새로운 제한 부위가 생성될 수 있다. 또 다른 중요한 문제점은 BAC 플라스미드가 세포 당 단지 1개 또는 2개의 사본에 존재한다는 것입니다, 그러므로, 세균성 게놈 DNA의 높은 오염을 가진 BAC 플라스미드의 낮은 수율은 높고, 중간 복사 번호 플라스미드. 이러한 잠재적인 문제점은 대량 배양량을 사용하여 쉽게 극복하고 BAC 정제를 위해 특별히 개발된 상용 키트로 BAC 플라스미드를 정제한다.
요약하면, 우리는 이들의 생물학의 연구 연구를 촉진하기 위하여 그밖 양성 가닥 RNA 바이러스의 안정적이고 완전하게 기능적인 전염하는 cDNA 클론을 생성하기 위하여 적응될 수 있는 BAC의 사용에 근거를 둔 강력한 ZIKV 역유전 접근을 개발했습니다 바이러스 및 백신 의 개발 및 / 또는 항 바이러스 약물의 식별을 용이하게하기 위해.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 비디오 준비를 도와 BAC cDNA 클론 세대와 스네자나 디미트로바에 그녀의 기술 지원에 대한 칼라 고메즈에게 감사드립니다. 이 작품은 F.A.T.와 국립 보건원 (NIH, 보조금 번호 1R21AI120500)에 스페인 경제 및 경쟁력부 (MINECO, 보조금 번호 BFU2016-79127-R)에서 L.M.S. 및 F.A.T.에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Molecular Biology Reagents | |||
| Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 Units/mL |
| AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
| ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
| Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 Units/mL |
| BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 Units/mL |
| BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 Units/mL |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
| Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
| Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
| LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
| LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
| Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
| Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 Units/mL |
| Oligonucleotides | IDT | N/A | |
| Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
| Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
| Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 Units/mL |
| Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
| Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 Units/mL |
| SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
| Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
| T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 Units/mL |
| 2. Cell Culture Reagents | |||
| 6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
| 12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
| 24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
| Agar Noble | VWR | 214230 | |
| Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
| Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
| Cell Culture Dishes (100 mm x 21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
| Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
| Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
| DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
| L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
| Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
| PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
| ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
| 3. Equipment | |||
| Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
| Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
| Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
| High-speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
| SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
| Vortexer | Varies | N/A |
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