Den nylige epidemien av Zika virus fremhever viktigheten av å etablere omvendt genetiske tilnærminger til å utvikle vaksiner og/eller terapeutiske strategier. Her beskriver vi protokollen for å redde en smittsom rekombinant Zika virus fra en full-lengde cDNA klone samlet i en bakteriell kunstig kromosom under kontroll av den menneskelige Cytomegalovirus umiddelbar-tidlig promoter.
Foreningen av Zika virus (ZIKV) infeksjon med nevrologiske komplikasjoner i løpet av de siste verdensomspennende utbrudd og mangelen på godkjente vaksiner og/eller antivirale midler har understreket det presserende behovet for å utvikle ZIKV reversere genetiske systemer for å lette studie av ZIKV biologi og utvikling av terapeutiske og/eller forebyggende tilnærminger. Men som med andre flaviviruses, har generasjonen av ZIKV full-lengde smittsomme cDNA kloner blitt hemmet på grunn av toksisitet av viral sekvenser under sin forsterkning i bakterier. For å overkomme dette problemet, har vi utviklet en utradisjonell tilnærming basert på bruk av bakteriell kunstig kromosomer (BACs). Ved hjelp av denne tilnærmingen, full-lengde cDNA kopi av ZIKV belastningen Rio Grande do Norte Natal (ZIKV-RGN) er generert fra fire syntetiske DNA fragmenter og samlet inn i single-kopi pBeloBAC11 plasmider under kontroll av den menneskelige Cytomegalovirus (CMV) umiddelbar-tidlig promoter. Den sammensatte BAC cDNA klone er stabil under forplantning i bakterier, og smittsomme rekombinant (r) ZIKV utvinnes i Vero celler etter transfeksjoner av BAC cDNA klone. Protokollen som beskrives her, gir en kraftig teknikk for generering av smittsomme kloner av flaviviruses, inkludert ZIKV, og andre positive-tråd RNA-virus, særlig de med store genomer som har stabilitetsproblemer under bakteriell og forplantning.
ZIKV er en mygg-borne medlem av Flavivirus slekten i hvilken familien som i dag utgjør en global folkehelsen beredskap1. I likhet med andre flaviviruses er ZIKV et innhyllet RNA-virus med en icosahedral struktur som inneholder en positiv følelse, enkelt-strandet RNA-molekyl på ca 10,8 KB (figur 1)2. Den virale Genova koder en stor polyprotein på ca 3 423 aminosyrer som er behandlet av viral og mobilnettet proteaser i tre strukturelle proteiner (kapsid [C], premembrane/membran [prM/M] og konvolutt [E]) som er involvert i dannelsen av viral partikler og syv nonstructural (NS) proteiner (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, og NS5) som deltar i Genova replikering, virus montering, og Evasion av verten immunrespons (figur 1)3.
Historisk har ZIKV infeksjon vært forbundet med en mild febersykdom4,5. Men den eksplosive nylige pandemi av ZIKV infeksjoner i hele Sør-og mellom-Amerika, Sør-Stillehavet, og Karibia6,7,8, og dens tilknytning til forekomsten av Guillain-Barré syndrom og microcephaly9,10,11,12,13, har endret den historiske oppfatningen og forsterket relevansen av ZIKV som en viktig menneskelig patogen. I denne forstand, utvikling av molekylære verktøy, slik som smittsomme cDNA kloner, vil lette studiet av viral patogenesen og utvikling av genetisk definerte vaksiner og identifisering av antivirale legemidler for behandling av ZIKV infeksjon. Som beskrevet for andre flaviviruses, generering av ZIKV smittsomme kloner er vanskelig på grunn av tilstedeværelsen av kryptiske bakterielle arrangører i viral Genova14 som gjør at Leaky uttrykk for giftige virus proteiner under utbredelsen av cDNA kloner i bakterier ved hjelp av standard High-Copy-nummer plasmider15,16,17. For å overkomme dette toksisitet problemet har flere utradisjonell tilnærminger blitt gjennomført i de siste to årene18. Disse inkluderer bruk av lav-kopi-nummer plasmider19,20, innsetting av introns å forstyrre de giftige regionene21,22,23, in vitro ligation av cDNA fragmenter 24 priser og , 25, mutational deaktivering av kryptiske bakterielle arrangører til stede i viral Genova26,27, smittsomme subgenomic amplicons (ISA)28,29, Gibson forsamlingen metode30 , og bruk av sirkulær polymerase forlengelse reaksjon (CPER)31.
Heri beskriver vi den detaljerte protokollen for prosjektering av en full-lengde cDNA klone av ZIKV belastningen ZIKV-RGN13, ved hjelp av en BAC å overvinne toksisitet problemet, og redning av smittsomme rZIKV ved direkte TRANSFEKSJONER av BAC cDNA klone i Vero celler32, en cellelinje godkjent av Food and Drug ADMINISTRATION (FDA) for utvikling av menneskelige vaksiner33. I dette systemet, full lengde cDNA kopi av viral Genova er samlet i BAC plasmider pBeloBAC1134 (figur 2a), en lav-kopi-nummer plasmider (en til to eksemplarer per celle) avledet fra Escherichia coli F-Factor35, som minimerer toksisitet av Flavivirus sekvenser i løpet av sin forplantning i bakterier. Den cDNA av ZIKV Genova er samlet i pBeloBAC11 under kontroll av den menneskelige CMV umiddelbare-tidlig promoter, for å tillate uttrykk for viral (v) RNA i kjernen av transfekterte celler av mobilnettet RNA polymerase II, og flankert på 3 ‘-end av hepatitt delta virus (HDV) ribozyme (RZ), etterfulgt av sekvenser av storfe veksthormon (BGH) oppsigelse og polyadenylation signaler til å produsere syntetiske RNAs peiling autentiske 5 ‘-og 3 ‘-endene av viral Genova, henholdsvis (figur 2b). Dette cDNA-lanserte systemet resulterer i intracellulære uttrykk for avkortet viral RNA, slik at utvinning av smittsomme ZIKV uten behov for en in vitro transkripsjon trinn. BAC tilnærmingen gir en kraftig metodikk som gjelder for å konstruere stabile og fullt funksjonell smittsomme cDNA kloner for andre flaviviruses, samt andre positive-strandet RNA virus36,37, 38,39,40,41.
Smittsomme cDNA kloner utgjør essensielle molekylære verktøy for grunnleggende forskning av RNA-virus og utvikling av vaksiner og/eller identifisering av antivirale strategier. Men for mange positive-strandet RNA virus, inkludert flaviviruses, generering av smittsomme cDNA kloner er vanskelig på grunn av ustabilitet av klonet cDNAs når spres i bakterier ved hjelp av standard High-Copy-nummer plasmider. I tilfelle av ZIKV og andre flaviviruses, er dette ustabilitet hovedsakelig på grunn av Leaky uttrykk for giftige viral proteiner fra kryptiske bakteriell arrangører til stede i viral Genova14,15,16,17 . Her beskriver vi en alternativ og kraftig protokoll for å generere en stabil ZIKV full-lengde smittsomme cDNA klone som en enkelt plasmider, basert på bruk av BAC plasmider pBeloBAC1134 (figur 2a) for å overkomme toksisitet problemet, bruk av CMV promoter å tillate uttrykk for vRNA i kjernen av transfekterte celler, og HDV RZ å generere vRNAs med nøyaktig 3 ‘-ender (figur 2b). Ved hjelp av denne metoden, har vi lykkes generert en helt stabil smittsomme klone av ZIKV belastningen RGN som gjør at effektiv og pålitelig utvinning av smittsomme rZIKV etter direkte transfeksjoner av mottakelige Vero celler (Figur 3 og Figur 4).
En stor innsats har blitt gjort i de siste årene for å overvinne ustabilitet problemer forbundet med ZIKV smittsomme cDNA kloner, og flere tilnærminger har blitt implementert med hell18, inkludert in vitro ligation av cDNA fragmenter24 ,25, lav kopi plasmider19,20, den inaktive av kryptiske bakterielle arrangører ved innføringen av tause mutasjoner26,27, Intronets opprinnelse innsetting21, 22 av , 23, Gibson forsamlingen metode30, ISA metoden28,29, og bruk av CPER31. Selv om disse tilnærmingene overvinne toksisitet problemet og er nyttige for å generere ZIKV smittsomme cDNA kloner, noen av dem er arbeidskrevende og presentere flere ulemper, inkludert behovet for in vitro ligation og transkripsjon trinn som reduserer virus utvinning effektivitet eller innføring av et høyt antall tause mutasjoner å deaktivere kryptiske bakteriell promoter som kan påvirke viral fitness, blant andre. Tilnærmingen som er beskrevet i denne protokollen, gir følgende fordeler. i) BAC plasmider pBeloBAC1134 har en strengt kontrollert replikering, holde en eller to eksemplarer av plasmider per celle, som minimerer toksisitet og gir stabil vedlikehold i bakterier av ustabil cDNAs. II) forplantning og modifisering av BAC plasmider er nesten lik de konvensjonelle plasmider, vurderer liten modifikasjoner som er beskrevet i denne protokollen til å manipulere store størrelse BAC-DNA fragmenter og lav-kopi plasmider. Spesielt kan BAC cDNA klone også endres til E. coli av homologe rekombinasjon bruker den røde rekombinasjon system42,43,44. III) bruk av CMV promoter tillater intracellulære uttrykk for avkortet ZIKV vRNA og utvinning av smittsomme virus uten å kreve en in vitro transkripsjon trinn. IV) smittsomme rZIKV genereres etter direkte transfeksjoner av mottakelige celler (for eksempel Vero) med BAC cDNA klone. Siden DNA-transfeksjoner i pattedyrceller er mer effektiv enn RNA-transfeksjoner, er virus utvinnings effektiviteten med BAC-tilnærmingen høyere enn det som er observert ved bruk av RNA-transkripsjoner, noe som reduserer antall passasjer i kultur celler for å generere en viral lager og, Følgelig begrense innføringen av uønskede mutasjoner av cellekultur tilpasning.
Til slutt, potensialet i BAC tilnærmingen er støttet av vellykket bruk av denne metoden (med liten modifikasjoner) til ingeniør smittsomme cDNA kloner av andre flaviviruses, inkludert Dengue virus36, og flere coronaviruses av høy effekt i mennesker og dyr helse, for eksempel smittsomme gastroenteritt coronavirus37 (TGEV), feline smittsomme peritonitt virus38 (FIPV), menneskelige coronavirus OC4339 (HCoV-OC43), alvorlig akutt åndedretts syndrom coronavirus40 (Sars-og Midtøsten-coronavirus41 (MERS-pakter), blant andre.
I protokollen som er beskrevet her, er det to viktige trinn som bør vurderes. Ettall betydelig betraktning er identifisering passende enestående begrensning steder inne det viral Genova det er fraværende inne det BAC plasmider. Hvis ingen tilstrekkelig begrensning nettsteder er tilgjengelige, ny begrensning nettsteder kan genereres under kloning design ved innføringen av tause nukleotid mutasjoner. En annen viktig sak er at BAC plasmider er til stede i bare ett eller to eksemplarer per celle, og derfor lav avkastning på BAC plasmider med høy forurensning av bakteriell genomisk DNA er innhentet ved hjelp av standardprotokoller utformet for høy-og medium-Copy-nummer plasmider. Dette potensielle problemet er lett overvinnes ved hjelp av store kultur volumer og rensing av BAC plasmider med et kommersielt Kit spesielt utviklet for BAC rensing.
Oppsummert har vi utviklet en kraftig ZIKV omvendt genetisk tilnærming basert på bruk av en BAC som kan tilpasses til å generere stabile og fullt funksjonell smittsomme cDNA kloner av andre positive-strandet RNA virus for å lette studiet av biologi av disse virus og utvikling av vaksiner og/eller for å lette identifisering av antivirale legemidler.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Carla Gómez for sin tekniske assistanse i BAC cDNA klone generasjon og Snezhana Dimitrova for å hjelpe til med video forberedelse. Dette arbeidet ble støttet delvis av tilskudd fra det spanske departementet for økonomi og konkurranseevne (MINECO, gi nummer BFU2016-79127-R) til fat og National Institutes of Health (NIH, gi nummer 1R21AI120500) til L.M.S. og fat
1. Molecular Biology Reagents | |||
Afe I | New England BioLabs | R0652S | 10,000 units/mL |
AmpliTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | N8080161 | 5,000 Units/mL |
ApaL I | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/mL |
Asc I | New England BioLabs | R0558S | 10,000 units/mL |
BamH I | New England BioLabs | R0136S | 10,000 units/mL |
BstB I | New England BioLabs | R0519S | 20,000 units/mL |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
ElectroMAX DH10B Cells | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 18290015 | Electocompetent DH10B cells |
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm | Bio-Rad | 165-2086 | |
Ethanol | Merck | 100983 | Flamable |
Isopropanol | Merck | 109634 | Flamable |
Large-Construct Kit (10) | QIAGEN | 12462 | For high-purity BAC preparation |
LB Broth | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 12780029 | Can be homemade as well |
LB with Agar | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 22700041 | Can be homemade as well |
Methanol | Merck | 106009 | Flamable |
Mlu I | New England BioLabs | R0198S | 10,000 units/mL |
Oligonucleotides | IDT | N/A | |
Plasmid pBeloBAC11 | New England BioLabs | ER2420S (E4154S) | |
Plasmid Midi Kit (25) | QIAGEN | 12143 | For midle-scale preparation of BAC plasmids |
Pml I | New England BioLabs | R0532S | 20,000 units/mL |
Polypropylene tubes (10 mL) | DeltaLab | 175724 | Other commercial sources are acceptable |
QIAEX II Gel Extraction Kit (150) | QIAGEN | 20021 | Gel-clean-up kit optimized for DNA fragments larger than 10 kb |
Shrimp AlKaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/mL |
SOC Medium | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 15544034 | Can be homemade as well |
Synthesis of cDNA fragments | Bio Basic | N/A | |
T4 DNA Ligase | Sigma-Aldrich (Roche) | 10481220001 | 1,000 units/mL |
2. Cell Culture Reagents | |||
6-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 140675 | |
12-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 150628 | |
24-Well Plates | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 142485 | |
Agar Noble | VWR | 214230 | |
Alexa Fluor 488 Conjugate ant-mouse secondary antibody | Varies | N/A | |
Biotinylated Anti-Mouse Secondary Antibody | Varies | N/A | |
Cell Culture Dishes (100×21 mm) | ThermoFisher Scientific (Nunc) | 172931 | |
Conical Tubes (15 mL) | VWR | 525-0150 | |
Conical Tubes (50 mL) | VWR | 525-0155 | |
Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Toxic and carcinogenic |
DEAE-Dextran | Sigma-Aldrich | D9885 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11995065 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific (HyClone)) | SV30160.03 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Toxic and carcinogenic |
L-Glutamine | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 25030081 | |
Lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | 11668019 | Transfection reagent |
Nonessential amino acids | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 11140035 | |
Opti-MEM I Reduced Serum Medium | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 31985070 | Transfection medium |
Pan-flavivirus E protein mAb 4G2 | BEI Resources | NR-50327 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | Toxic and carcinogenic |
PBS | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 14190144 | |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific (Gibco) | 15140122 | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific (Invitrogen) | P10144 | |
Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories Inc | PK-4010 | Avidin/biotin-based peroxidase kit |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | |
ZIKV E Protein mAb 1176-56 | BioFront Technologies | BF-1176-56 | |
3. Equipment | |||
Agarose Gel Electrophoresis System | Bio-Rad | 1704468 | Other commercial sources are acceptable |
Class II Biosafety CO2 Cabinet | Varies | N/A | Other commercial sources are acceptable |
Desktop Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
Fluorescence Microscope | Varies | N/A | |
High-Speed Refrigrated Centrifuge | Varies | N/A | |
MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | Other machines are acceptable |
SimpliAmp Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific (Applied Biosystems) | A24811 | Other machines are acceptable |
Vortexer | Varies | N/A |